文档文本内容
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
考点49 基因工程的工具及操作程序
一、基因工程的基本工具
1. 限制性内切核酸酶（简称 限制酶 ）——分子手术刀
（1）存在：主要存在于 原核细胞 中。
（2）作用：识别 双链 DNA 分子的特定 核苷酸序列 ，并且使每一条链中特定部位的 磷酸二酯键
断开。
（3）特点：具有 特异性 。
（4）结果：形成 黏性末端 或 平末端 。
原核生物容易受到自然界外源DNA 的入侵。限制酶作为一种防御工具，可切割外源DNA，使之失效，进行保证原核生物的
安全。
原核生物中不存在相应限制酶的识别序列或识别序列已被修饰，故限制酶不切割自身的DNA。
2. DNA 连接酶——分子缝合针
（1）作用：连接两个DNA 片段。
（2）主要种类：
① E·coli DNA
连接酶
：从大肠杆菌中分离得到，只能连接具有互补 黏性末端 的DNA 片段。
② T4 DNA
连接酶
：从T4 噬菌体中分离出来，可以“缝合”双链DNA 片段互补的 黏性末端 和双
链DNA 片段的 平末端 。
T4DNA 连接酶虽然两种末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。
（3）DNA 连接酶和限制酶的区别与联系
项目
类型
限制酶
DNA 连接酶
作用
使特定部位的磷酸二酯键 断裂
在DNA 片段之间重新 形成 磷酸二酯键
1
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
应用
用于 提取 目的基因和 切割 载体
用于目的基因片段与载体的 拼接
联系
3. 基因进入受体细胞的载体——分子运输车
（1）质粒：一种 裸露的 、结构简单、独立于真核细胞 细胞核 或原核细胞 拟核
DNA
之外，并
具有 自我复制 能力的 环状 双链DNA 分子。
（2）其他载体： 噬菌体 和 动植物病毒 等。
（3）载体必需的条件（以质粒为例）
①有一个至多个 限制酶 切割位点，供外源DNA 片段（基因）插入其中。
②能在受体细胞中进行 自我复制 ，或整合到 受体
DNA
上，随受体DNA 同步复制。
③有特殊的 标记基因 ，便于重组DNA 分子的筛选。
易错提醒：
工具包括3 种：限制酶（限制性内切核酸酶）、DNA 连接酶、载体；工具酶包括2 种：限制酶（限制性内切核酸
酶）、DNA 连接酶。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
二、基因工程的基本操作程序
1. 目的基因的筛选与获取
（1）筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指
编码蛋白质 的基因，如Bt 抗虫蛋白基因。
②筛选方法：
a.从相关的已知 结构 和 功能 清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。如培育转基因抗虫棉
中用到的苏云金杆菌的Bt 抗虫蛋白基因。
b.通过构建基因文库来获取目的基因。
（2）利用PCR 获取和扩增目的基因
①PCR：即聚合酶链式反应，是一项根据
DNA
半保留复制
的原理，在体外提供参与DNA 复制的各种
组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
②条件
缓冲溶液
维持溶液的pH
DNA 母链
提供DNA 复制的模板
2 种引物
使DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
耐高温的DNA 聚合酶
催化合成DNA 子链
2
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
4 种脱氧核苷酸
合成DNA 子链的原料
耐高温的DNA 聚合酶——Taq DNA 聚合酶。
③步骤
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链
复性
温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条
DNA 单链结合
延伸
72℃左右时，在耐高温的DNA 聚合酶的作用下，可使DNA
新链有5’端向3’端延伸
每次循环一般可以分为 变性、复性和延伸 三步。
目的基因的数量：目的基因的数量呈指数形式增长，扩增循环n 次，DNA 的数量约为2n。
仪器：PCR 扩增仪
PCR 产物鉴定：常用琼脂糖凝胶电泳。
2. 基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中 稳定 存在，并且 遗传 给下一代，同时使其能够 表达 和
发挥 作用。
（2）基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子、复制原点以及标记基因等。
组成
功能
启动子
一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起
始位点，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出
mRNA。
终止子
一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的下游，使转录在所需
要的地方停下来。
标记基因
一般是抗生素抗性基因，还有发光基因、产生特定颜色的表达产物的
基因等，用来筛选、鉴别受体细胞是否含有目的基因。
（3）基因表达载体的构建模式图
3
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
3. 将目的基因导入受体细胞
（1）导入植物细胞常用的方法
① 花粉管通道 法
② 农杆菌转化 法
a.转化： 目的基因 进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持 稳定 和 表达 的过程。
b.农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA（可转移的
DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 染色体
DNA
上。
c.原理：将目的基因插入
Ti
质粒
的
T-DNA
中，通过 农杆菌 的转化作用，使目的基因进入细
胞。
d.转化过程
（2）导入动物细胞的方法
①受体细胞： 受精卵
②常用方法： 显微注射法
③程序
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成具有
新性状的动物
4
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
（3）导入原核细胞的方法
①方法：
Ca
2+ 转化法
②程序
4. 目的基因的检测与鉴定
（1）分子水平的检测
①检测目的基因是否插入或是转录出mRNA：
PCR
或分子杂交技术
等技术。
②检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质：提取受体中的蛋白质，用相应的抗体进行 抗原
- 抗体杂交
。
（2）个体生物学水平的鉴定
对目标性状进行鉴定，如进行 抗性实验 。如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt 基因是否赋予
了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
三、DNA 的粗提取与鉴定
1. 实验原理
（1）DNA 不溶于 酒精 ，但某些蛋白质溶于 酒精 ，利用这一原理，可初步分离DNA 与蛋白质。
（2）DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中 溶解度 不同，它能溶于
2mol/L
的NaCl 溶液。
（3）DNA+ 二苯胺试剂
蓝色。
2. 实验步骤
【微点拨】
Ca2+处理细胞，使细胞膜的通透性发生改变。
5
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
3. 实验注意事项
（1）破碎细胞应彻底、充分。
（2）酒精必须经过充分 预冷 后才能使用。
（3）实验过程中，搅拌时玻璃棒 不能 直插烧杯底部，并且搅拌要 轻缓 ，并沿 一个方向 搅拌
以便获得较完整的DNA 分子。
（4）将丝状物溶于2mol/L 的NaCl 溶液中时，需要不断搅拌以增加溶解的DNA 的量。
（5）二苯胺试剂要 现配现用 ，否则会影响鉴定的效果。
考法1 基因工程及基本操作程序
1. 对基因工程概念的理解
基因工程的别名
重组DNA 技术
操作对象
基因
操作水平
分子水平
原理
基因重组
【微点拨】
研磨液中的部分成分及功能
1. SDS（十二烷基硫酸钠）：可使细胞核内的蛋白质变性与DNA 分离。
2. EDTA（乙二胺四乙酸）：一种DNA 酶抑制剂，防止细胞破碎后DNA 酶降解DNA。
3. Tris（三羟甲基氨基甲烷）：提供使DNA 呈稳定状态的缓冲体系。
提取DNA：玻璃棒上卷着的丝状物是用冷却的酒精析出的DNA。
6
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
优点
能克服远缘杂交不亲和的障碍，能定向改造生物性状
2. 几组概念的辨析
（1）黏性末端和平末端
（2）限制酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶等相关酶的分析比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA 切开
DNA 连接酶
磷酸二酯键
DNA 片段
将两个DNA 片段连接为一个DNA 分子
DNA 聚合酶或耐高
温的DNA 聚合酶
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA 单链3’末端
DNA（水解）酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA 片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA 分子局部解旋为单链
RNA 聚合酶
磷酸二酯键和氢键
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到单链RNA3’端
3. 关于限制酶的分析
（1）切割目的基因和载体时用同种限制酶的原因：产生相同的黏性末端。也可用不同的限制酶切割，但
产生的黏性末端必须互补。
（2）作为载体必须具有多个限制酶切位点，而且每种酶的切点最好只有一个，原因是一种限制酶一般只
能识别单一酶切位点，若载体上有一个以上的同种酶切位点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的
片段含复制原点，则基因表达载体进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有限制酶的一个酶切位
点，则酶切后既能把环打开以接纳外源DNA 片段，又不会丢失自己的片段。
（3）要获取一个目的基因，需用限制酶剪切目的基因的两端，共产生4 个黏性末端或平末端。
（4）限制酶的选择依据
①根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
7
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
a. 应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，可选择图中的Pst I。
b. 不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，故不能选择图中的Sma I。
c. 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因及质粒，如图中的
Pst I 和EcoR I。
②根据质粒的特点确定限制酶的种类
③根据Ti 质粒的T-DNA 片段确定限制酶的种类（设切割目的基因的限制酶为Xba I 和Sac I）
图中甲、乙、丁Ti 质粒均不宜选取，而丙Ti 质粒宜选取。
【典例1】（2023•云南二模）下列有关重组DNA 技术的基本工具的叙述，正确的是（ ）
A．限制酶能够识别RNA 分子的特定核苷酸序列
B．携带外源DNA 片段的质粒可在受体细胞中进行复制
C．DNA 连接酶不能连接双链DNA 片段的平末端
D．DNA 连接酶能连接DNA 分子双链碱基对之间的氢键
【分析】基因工程中的操作工具及其作用：①分子手术刀——限制性内切核酸酶（限制酶），能够识
别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯
键断开，因此具有专一性。②分子缝合针——DNA 连接酶，E•coliDNA 连接酶，只能将双链DNA 片段
8
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA 连接酶能缝合黏性末端和平末端。③分子运输
车——载体。
【解答】解：A、限制酶能够识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并在特定的碱基之间切开磷酸二
酯键，A 错误；
B、携带外源DNA 片段的质粒可在受体细胞中进行复制，质粒可以作为目的基因的运载体，B 正确；
C、T4DNA 连接酶能连接双链DNA 片段的平末端，C 错误；
D、DNA 连接酶能够连接双链DNA 片段，形成磷酸二酯键，氢键自动生成，D 错误。
故选：B。
【点评】本题主要考查基因工程的基本工具的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题
干信息和所学知识进行分析应用。
【典例2】（2023•古冶区校级一模）载体是基因工程中携带外源DNA 片段（目的基因）进入受体细胞的重
要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。如图是利用细菌生产人胰岛素的基本
流程示意图，下列相关叙述正确的是（ ）
A．重组载体A、重组载体B 分别是基因表达载体和基因克隆载体
B．载体A 和载体B 都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间
D．培养细菌A 和细菌B 的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
【分析】分析题图：图中重组载体A 导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，
而重组载体B 导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体。
【解答】解：A、重组载体A 导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载
体B 导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A 错误；
B、作为运载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点（便于目的基因的插入）、复制原点（便
于目的基因的扩增）及标记基因（便于筛选含有目的基因的受体细胞）等，因此载体A 和载体B 都必
须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B 正确；
C、必须把目的基因插入载体B 的启动子和终止子之间，C 错误；
9
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
D、培养细菌A 的目的是扩增目的基因，培养细菌B 的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营
养成分和功能上有区别，D 错误。
故选：B。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤等，掌握
各操作工具的作用及各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
【典例3】（2023•厦门模拟）如表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置（箭头所指），下
列叙述正确的是（ ）
限制酶种类
序列及切点
限制酶种类
序列及切点
①：EcoRⅠ
5′
G↓AATTC
3′
﹣
﹣
3′
CTTAA↑G
5′
﹣
﹣
③：BglⅡ
5′
A↓GATCT
3′
﹣
﹣
3′
TCTAG↑A
5′
﹣
﹣
②：BamHⅠ
5′
G↓GATCC
3′
﹣
﹣
3′
CCTAG↑G
5′
﹣
﹣
④：NotⅠ
5′
GC↓GGCCGC
3′
﹣
﹣
3′
CGCCGG↑CG
3′
﹣
﹣
A．①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端
B．①切出的DNA 片段，只有用E.coli 连接酶才能连接起来
C．②、③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割
D．构建基因表达载体时，用②、③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接
【分析】1、限制性核酸内切酶是基因工程中切割DNA 分子的工具，能识别双链DNA 分子的特定序列，
并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2、根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA 连接酶、T4DNA 连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外
T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
【解答】解：A、①②③④均为限制酶，它们可催化磷酸二酯键断裂，但不能催化氢键断裂，且均形
成黏性末端，A 错误；
B、①切出的DNA 片段带有黏性末端，用E.coli 连接酶和T4DNA 连接酶均能连接起来，B 错误；
C、②、③切出的黏性末端相同，用DNA 连接酶连接后形成的片段的碱基序列为﹣GGATCT﹣，不能
再被②或③识别切割，C 正确；
D、构建基因表达载体时，用②、③进行双酶切，不能防止目的基因与载体的反向连接，因为这两种
限制酶切出的黏性末端是相同的，D 错误。
故选：C。
【点评】本题考查基因工程的操作工具，要求考生识记限制酶和DNA 连接酶的作用，能正确分析表格，
再结合所学的知识准确判断各选项。
【典例4】（2023•杭州模拟）研究人员用EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ两种限制酶处理某DNA 分子，图1 为EcoR Ⅰ
10
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
切割该DNA 分子后的结果；图2 是酶切后的凝胶电泳图谱，其中1 号泳道是DNA Marker，2 号、3 号、4
号分别是EcoR Ⅰ单独处理、Sma Ⅰ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（
）
A．据图1 可知EcoR Ⅰ的识别序列为﹣GAATTC﹣，切割位点在G 和A 之间
B．据图2 可知琼脂糖凝胶的加样孔在B 端，且连着电泳槽的负极
C．据图2 可知该DNA 分子最可能是含1000 个碱基对的环状DNA
D．据图2 可知该DNA 分子中两种限制酶的酶切位点各有一个
【分析】切割DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯
化出来的。它们能够识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸
之间的磷酸二酯键断开。
【解答】解：A、图1 中DNA 双链片段被切割成两段，该片段序列是—GAATTC—，断开的部位是在G
和A 碱基之间，A 正确；
B、相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA 片段相对分子质量越大，迁移就越慢，分
子量越小，迁移速度越快，据图2 可知琼脂糖凝胶的加样孔在A 端，B 错误；
C、2 号、3 号、分别是EcoRI 单独处理、Smal 单独处理后的电泳结果，两个泳道均只出现一个DNA 片
段，且分子量是1000，说明该DNA 分子最可能是含1000 个碱基对的环状DNA，C 正确；
D、图2 中4 号是EcoRI 和Smal 两种酶共同处理后的电泳结果，显示800bp 和200bp 两个条带，说明在
该DNA 分子中，两种限制酶的酶切位点各有一个，D 正确。
故选：B。
【点评】本题考查DNA 分子电泳的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综
合分析问题的能力是解答本题的关键。
【典例5】（2023•福建模拟）2022 年1 月7 日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57 岁的心脏病患
者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2 个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低
免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9 技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9 系统主要由
向导RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，sgRNA 可引导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制
11
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．若要对一个基因进行编辑，则通常至少需要设计两个序列不同的sgRNA
B．sgRNA 可以特异性识别目标DNA 分子，Cas9 蛋白作用于磷酸二酯键
C．有时sgRNA 会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA 序列越短，脱靶率越低
D．为降低免疫排斥反应，可通过CRISPR/Cas9 技术敲除相关抗原蛋白基因
【分析】分析题文：CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，sgRNA 可
引导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其作用类似于限制酶。
【解答】解：A、一个“CRISPR/Cas9 系统”只能在DNA 分子上切开一个切口。去除某段DNA，需在
该DNA 两端各有一个切口，需要设计两个“CRISPR/Cas9 系统”，其sgRNA 的序列不同，A 正确；
B、sgRNA 可以特异性识别目标DNA 分子，Cas9 蛋白切割DNA，作用于磷酸二酯键，B 正确；
C、有时sgRNA 会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA 序列越短，其特异性越差，脱靶率越
高，C 错误；
D、抗原蛋白基因表达会引起免疫排斥反应，因此为降低免疫排斥反应，可通过CRISPR/Cas9 技术敲除
相关抗原蛋白基因，D 正确。
故选：C。
【点评】本题结合模式图，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作步骤，掌握各操作
步骤中需要注意的细节，能正确分析题干信息，再结合所学的知识准确答题。
【典例6】（2023•南充模拟）大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程、细胞工程等现代生物技术，培
育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻，改良了大米的营养品质。如图为培育转基因水稻过程示意
图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ，HindⅢ，BamHⅠ为限制酶。
12
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
（1）完成图中①过程需选用
限制酶处理Ti 质粒和含目的基因的DNA。
（2）②过程中用
处理农杆菌，使其成为感受态细胞。农杆菌转化法的原理是：在农杆菌的
Ti 质粒上存在
片段，它具有可以整合到受体细胞
上的特点，使目的基因进入
植物细胞并稳定存在和表达。为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1 号培养基需要加入
。
（3）图中
过程，属于植物组织培养技术，该技术依据的基本原理（理论基础）是
。
【分析】分析题图：图中①为基因表达载体的构建，②为将重组质粒导入农杆菌，③为筛选目的基因
过程，④为脱分化，⑤为再分化，⑥为培育为转基因水稻的过程。
【解答】解：（1）图中①过程为基因表达载体的构建，若选用EcoRI，会破坏目的基因；由于目的基
因两侧的酶切位点被HindⅢ、BamHⅠ识别，且质粒中也存在同样的酶切位点，则所选用的限制酶为
BamHⅠ和HindⅢ。
（2）农杆菌是微生物，需要用Ca2+处理使其成为感受态细胞；农杆菌转化法的原理是：在农杆菌的Ti
质粒上存在T
DNA
﹣
片段，它具有可以整合到受体细胞染色体DNA 的特点，使目的基因进入植物细胞
并稳定维持和表达；质粒中的标记基因是潮霉素抗性基因，所以成功导入重组质粒的农杆菌能够抗潮霉
素，则1 号培养基需要加入潮霉素。
（3）据图分析，④⑤⑥过程属于植物组织培养，依据的原理是植物细胞的全能性。
故答案为：
（1）BamHⅠ和HindⅢ
（2）Ca2+；T
DNA
﹣
；染色体DNA；潮霉素
（3）④⑤⑥；植物细胞的全能性
【点评】本题主要考查基因工程的相关知识，解答本题的关键是识记基因工程的原理、工具和操作步骤；
掌握植物组织培养技术的过程，再结合所学知识正确答题。
【变式1】（2023•平度市模拟）北极比目鱼体内有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11 个氨基酸的重复序
列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图。下列有关叙述
错误的是（ ）
A．过程①获取的目的基因含有启动子和终止子
B．过程②涉及磷酸二酯键的断裂与形成
13
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
C．农杆菌Ti 质粒中T
DNA
﹣
可将抗冻基因导入番茄细胞
D．抗冻番茄植株中抗冻基因与比目鱼体内抗冻基因碱基序列可能不同
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和
标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞
的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射
法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因
是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：A、过程①表示用逆转录法获取的目的基因，不含有启动子和终止子，A 错误；
B、过程②指限制酶切割目的基因和质粒后用DNA 连接酶连接，主要涉及的是磷酸二酯键的断裂与形
成，B 正确；
C、农杆菌Ti 质粒中T
DNA
﹣
可将抗冻基因导入番茄细胞并整合到番茄细胞的染色体上，C 正确；
D、抗冻番茄植株中的抗冻基因是比目鱼体内抗冻基因经mRNA 逆转录形成，少了启动子和终止子即内
含子等，碱基列可能不同，D 正确。
故选：A。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作工具及操作步骤，掌握各操作工
具的作用及操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
【变式2】（2023•辽宁二模）为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因
数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小为0.9kb（1kb＝1000 碱基对），利用大
肠杆菌表达该蛋白。图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点如表，phb2 基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物
经电泳分离，结果如图2。下列叙述错误的是（ ）
14
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点）
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTTTTCGA↑A
EcoRⅠ
G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTGGTC↑GAC
PstⅠ
GA↑CGTCGA↑CGTC
KpnⅠ
G↓GATCCCCATG↑G
BamHⅠ
G↓GATCCCCTAG↑G
A．需设计特异性的引物通过PCR 技术扩增phb2 基因
B．为使phb2 基因与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的
识别序列
C．经过两种限制酶酶切的phb2 基因与载体进行连接时，可选用T4DNA 连接酶
D．图2 中3 号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒
【分析】基因工程的基本操作程序：
第一步：目的基因的获取；
第二步：基因表达载体的构建（核心）
1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作
用。
2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2、常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术，方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入细菌：感受态细胞法：用Ca2+处理细胞使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA
分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA 分子，完成转化过程。
第四步：目的基因的检测和表达
15
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
1、首先要检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用DNA 分子杂交技术。
2、其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用分子杂交（DNA
RNA
﹣
）技术。
3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
【解答】解：A、通过PCR 技术扩增phb2 基因时需设计根据phb2 基因特异性的引物，A 正确；
B、目的基因应导入启动子和终止子之间，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不
止一个酶切位点，所以应该选择EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列，B 错误；
C、T4DNA 连接酶既可以“缝合”双链 DNA 片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA 片段的
平末端，但连接平末端的效率相对比较低，可以用T4DNA 连接酶连接，C 正确；
D、由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基
因和质粒，如果用EcoRⅠ和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得质粒和目的基因两条条带，由于
phb2 基因大小为0.9kb，对应菌落3 的电泳图，所以图2 中3 号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒，
D 正确。
故选：B。
【点评】本题考查基因工程的知识，意在考查考生能识图并理解所学知识的要点，把握知识间的内在联
系，形成一定知识网络的能力，并且具有一定的分析能力和理解能力。
31．（2023•广东二模）二倍体马铃薯受核糖核酸酶基因（S
RNase
﹣
）影响，普遍存在自交不亲和的现象
一一自交不产生种子，我国科研人员通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除了马铃薯的S
RNase
﹣
基因，
获得自交亲和的二倍体马铃薯如图示该技术的原理：由一条单链向导RNA 引导内切核酸酶Cas9 蛋白到
一个特定的基因位点进行切割。下列叙述错误的是（ ）
A．向导RNA 和S
RNase
﹣
基因识别结合的碱基互补配对方式与目标DNA 双链中的碱基互补配对方式
相同
B．Cas9 蛋白可催化磷酸二酯键水解，剪切特定DNA 片段
C．可让马铃薯自交看能否产生种子，从个体水平上检测该基因编辑技术是否成功
D．向导RNA 的序列越短，该基因编辑技术在编辑对象时出错的概率就越高
16
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【分析】由图分析可知，向导RNA 可识别S
RNase
﹣
基因一条链并与之配对，引导内切核酸酶Cas9 蛋
白到特定的基因位点进行切割，以敲除马铃薯的S
RNase
﹣
基因。
【解答】解：A、向导RNA 和S
RNase
﹣
基因识别结合的碱基互补配对方式存在U
A
﹣，而目标DNA 双
链中的碱基互补配对方式为T
A
﹣，A 错误；
B、Cas9 蛋白为内切核酸酶，可催化磷酸二酯键水解，以剪切特定DNA 片段，B 正确；
C、二倍体马铃薯原本自交不产生种子，该基因编辑技术成功后可产生种子。故可让马铃薯自交看能否
产生种子从个体水平上检测该基因编辑技术是否成功，C 正确；
D、向导RNA 的序列越短，与其他基因片段结合的概率越大，该基因编辑技术在编辑对象时出错的概
率就越高，D 正确。
故选：A。
【点评】本题主要考查的是基因工程的应用的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适
中。
33．（2023•通许县三模）研究表明，服用α﹣干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。
人参是一种名贵药材，具有较好的滋补作用。限制酶的发现为DNA 的切割和功能基因的获得创造了条
件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。
含干扰素基因的DNA 片段如图1 所示，图2 为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程
图，①～④表示相关的操作。请回答下列问题：
17
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
（1）结合上图，在构建基因表达载体时，为克服目的基因和农杆菌Ti 质粒的自身环化以及目的基因与
质粒的任意连接等，应选择用限制酶
处理含某目的基因的DNA 和质粒。
（2）DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是
。
（3）图2 操作①常利用PCR 技术获取和扩增干扰素基因，除含有干扰素基因的DNA 片段之外，该过
程需要提供
以及与干扰素基因两端两条模板链结合的两种
引物。设计引物时，为了保证目的基因与质粒顺利连接，防止出现自身环化连接，需要在两种引物的一
端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列
。
（4）图2 步骤②除EcoRⅠ、BamHⅠ两种酶外，还需要用
酶。构建的基因表达载体除含
有目的基因片段以外，还必须有
，以保证干扰素基因能在人参愈伤组织细胞中稳定
存在和表达。同时，还应含有标记基因以便于
。
（5）图2 操作④常用
技术检测干扰素基因是否成功表达出干扰素。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和
标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞
的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射
法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因
是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
18
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【解答】解：（1）用限制酶Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA 片段会破坏目的基因，质粒含有限制酶
EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，且目的基因的两端也有着两种限制酶的切割位点，因此获取目的基因可以
用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ进行双酶切，这样可以保证目的基因和质粒的正向连接，防止目的基因或质粒
自身环化，即可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒和目的基因。
（2）DNA 连接酶可通过催化磷酸二酯键的形成将两个DNA 片段进行连接。
（3）步骤①为PCR 扩增过程，利用PCR 技术扩增干扰素基因时，除含有干扰素基因的DNA 片段（模
板）外，该过程需要提供四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA 聚合酶（dNTP 和Taq 酶）以及与干扰素基因
两端两条模板链结合的两种引物。设计引物时，为了保证目的基因与质粒顺利连接，防止出现自身环化
连接，需要在两种引物的一端分别加上GAATTC 和CGATCC 序列。
（4）步骤②为构建目的基因表达载体的过程，除EcoRⅠ、BamHⅠ两种酶外，还需要用DNA 连接酶。
基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点，以保证干扰素基因能在人
参愈伤组织细胞中稳定存在和表达。同时，还应含有标记基因以便于筛选含有重组DNA 分子的受体细
胞。
（5）步骤④常用抗原—抗体杂交技术检测干扰素基因是否成功表达出干扰素，检测出干扰素意味着转
基因成功。
故答案为：
（1）EcoRⅠ和BamHⅠ
（2）磷酸二酯键
（3）4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA 聚合酶（dNTP 和Taq 酶） GAATTC 和CGATCC
（4）DNA 连接 启动子和终止子 筛选含有重组DNA 分子的受体细胞
（5）抗原—抗体杂交
【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作工具及操作步骤，掌握各操作工
具的作用及各操作步骤中需要注意的细节，能正确分析题图，再结合所学的知识准确答题。
考法2 （实验）DNA 的粗提取与鉴定
【典例1】（2023•上虞区模拟）关于“DNA 的粗提取和鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．研磨时倒入的研磨液，是为了破坏细胞壁
B．离心研磨液是为了加速DNA 的沉淀
C．在DNA 提取物中加入二苯胺，迅速呈现蓝色
D．提取DNA 时要用玻璃棒沿一个方向缓缓搅动
19
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理：①DNA 在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度
变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L 时，DNA 的溶解度最低。利用这一原理，可以使
溶解在氯化钠溶液中的DNA 析出；②DNA 不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精
溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA；③洗涤剂能瓦解细胞膜但是对DNA 没
有影响；④蛋白质不能耐受较高温度，在80℃条件下会变性，而DNA 对温度的耐受性较高；⑤DNA
遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。
【解答】解：A、研磨液是用于破坏细胞结构和细胞膜的试剂，其作用是将细胞破坏，释放出细胞内的
DNA，A 错误；
B、离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B 错误；
C、需要沸水浴加热才可以看到蓝色，C 错误；
D、提取DNA 时要用玻璃棒沿一个方向缓缓搅动是为了使DNA 分子不断裂，D 正确。
故选：D。
【点评】本题主要考查的是DNA 的粗提取与鉴定的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，
难度适中。
【变式1】（2023•山东模拟）下列与DNA 粗提取和鉴定有关的叙述，错误的是（ ）
A．预冷的酒精容易使DNA 析出
B．DNA 能溶于2mol/L 的NaCl 溶液中
C．若提取出白色丝状物，说明DNA 中杂质少
D．可用碱性染料甲紫鉴定提取出来的DNA
【分析】DNA 粗提取和鉴定的过程：
（1）实验材料的选取：凡是含有DNA 的生物材料都可以考虑，但是使用DNA 含量相对较高的生物组
织，成功的可能性更大。
（2）破碎细胞，获取含DNA 的滤液：
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，
过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的
DNA 时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
（3）去除滤液中的杂质：DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同。
（4）DNA 的析出与鉴定
①将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝
状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
②取两支20ml 的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L 的NaCl 溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管
20
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml 的二苯胺试剂。混合均匀后，将试
管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA 的溶液是否
变蓝。
【解答】解：A、DNA 不溶于酒精，预冷的酒精容易使DNA 析出，A 正确；
B、DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中的溶解度不同，其能溶于2mol/L 的NaCl 溶液中，且溶解度较高，B
正确；
C、提取出的含杂质少的DNA 应是白色丝状物，因此若提取出白色丝状物，说明DNA 中杂质少，C 正
确；
D、应该用二苯胺鉴定提取出来的DNA，染色体可被碱性染料甲紫染成深色，D 错误。
故选：D。
【点评】本题比较基础，考查DNA 的粗提取和鉴定，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实
验的原理、实验采用的试剂及试剂的作用、实验现象等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。．
考法3 PCR 的基本操作和应用
1. 物质条件
（1）引物：PCR 所用的引物是一小段单链RNA 或单链DNA，它能与DNA 母链的一段碱基序列互补配
对。DNA 复制之所以需要引物，是因为DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3’端延伸
DNA 链。PCR 的引物通常由20~30 个核苷酸聚合而成，引物的量需保证满足几十次循环反应的需要。
（2）DNA 聚合酶：PCR 中所用的酶是一种从嗜热菌中分离得到的耐高温的DNA 聚合酶，高温条件下不
会失活。反应体系中加入Mg2+，可以使酶催化的活化能更加降低，使得反应能够进行得更加容易。
2. PCR 扩增与DNA 复制的比较
PCR 扩增
DNA 复制
不
同
点
场所
在体外的反应缓冲液中进行
在体内的活细胞内进行
解旋方式
高温变性解聚
解旋酶解旋
扩增过程
完全解聚再复制，分为变性、复性（或退火）
和延伸三个步骤
边解旋边复制
引物
DNA 或RNA
RNA
结果
短时间内形成大量的DNA 片段
形成的是整个DNA 分子
相同点
①都需要DNA 模板、DNA 聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸等成分；
②都遵循碱基互补配对原则，有解聚和延伸过程，子链延伸的方向都是从5’端到3’端；
③都属于半保留复制；
④结果都使DNA 数量呈2n的指数式扩增
3. PCR 的应用
（1）分析人的血液，对细菌、病毒感染情况进行早期诊断。
21
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
（2）用于遗传病的基因诊断与基因治疗。
（3）用于鉴别犯罪嫌疑人、亲子鉴定。
（4）分析生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。
（5）检测目的基因是否已经插入目标生物染色体DNA 和目的基因是否转录出mRNA。
（6）PCR 产物的电泳鉴定：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
①电泳概念：DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场
作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
②电泳原理：在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。
【典例1】（2023•沧县校级模拟）基于聚合酶制造的PCR 仪实际上是一个温控设备，能在变性温度、复性
温度、延伸温度之间很好地进行切换，主要过程如图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A．实施上述过程的前提是已知目的基因的一段核苷酸序列
B．图中a、b、c 过程控制的温度由高到低依次是过程a、c、b
C．耐高温的DNA 聚合酶沿着5'→3'的方向合成互补子链
D．c 延伸过程中需要缓冲溶液、ATP 和四种核糖核苷酸
【分析】PCR 原理：在高温作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是
从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。
【解答】解：A、在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，故PCR 技术的前提是已知
目的基因的一段核苷酸序列，并以此设计引物进行扩增，A 正确；
B、PCR 的基本环节包括变性a、复性b 和延伸c，其中高温变性使DNA 双链解开，温度为90～95°C；
复性使氢键形成，温度为55～60°C；延伸合成子代DNA 时温度为70～75°C，故图中a、b、c 过程控制
的温度由高到低依次是a、c、b，B 正确；
C、引物与模板的3'端结合，耐高温的DNA 聚合酶进行DNA 复制时会沿着子链的5'→3'方向延伸，C 正
确；
D、PCR 过程不需要额外添加ATP，所需能量来自dNTP 的水解，D 错误。
故选：D。
22
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【点评】本题主要考查PCR 技术的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点，把握知识间内在联系
的能力，能够运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。
【典例2】（2023•肥城市模拟）通过设计引物，运用PCR 技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因
工程中获取突变基因的过程，其中引物1 序列中含有一个碱基T 不能与目的基因片段配对，但不影响引物
与模板链的整体配对，反应体系中引物1 和引物2 的5′端分别设计增加限制酶a 和限制酶b 的识别位点。
有关叙述正确的是（ ）
A．在PCR 反应体系中还需要加入4 种游离核苷酸、解旋酶、Taq 酶等
B．第2 轮PCR，引物1 能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入运载体
D．第3 轮PCR 结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA 占
【分析】采用PCR 技术扩增DNA 的过程为：变性、退火、延伸。根据PCR 过程的特点绘制PCR 过程
示意图如图所示：
【解答】解：A、PCR 反应体系中还需要加入4 种游离核苷酸、Taq 酶等，但不需要加入解旋酶，A 错
误；
B、第3 轮PCR，引物1 能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因，B 错误；
C、在引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入到运载体上，C 正确；
D、由以上分析可知，第3 轮PCR 结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA 占
，D 错误。
23
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
故选：C。
【点评】本题考查PCR 技术的相关知识，要求考生识记PCR 技术扩增的条件、过程等基础知识，能结
合图中信息准确判断各选项，属于考纲识记和理解层次的考查。
【典例3】（2023•湖北模拟）乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质
和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因
（L
PG
﹣
），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如图所示。下列说法不正确的是（ ）
A．可借助序列数据库（GenBank）等查询L
PG
﹣
基因的序列和功能
B．可以利用PCR 技术筛选导入了L
PG
﹣
基因的受体细胞
C．酵母菌PD 基因被替换为L
PG
﹣
基因的过程中发生了基因重组
D．电泳鉴定L
PG
﹣
基因时，当观察到核酸染料迁移至凝胶边缘时，停止电泳
【分析】分析题图：图示是采用基因工程技术将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（ PD ）替换为
植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L
PG
﹣
），从而获得乳酸乙酯高产菌株。
【解答】解：A、GenBank 是一个包含了目前所有公开了的核酸序列和蛋白序列的大型公共数据库，可
借助其查询L
PG
﹣
基因的序列和功能，A 正确；
B、PCR 技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L
PG
﹣
基因的受
体细胞，B 正确；
C、酵母菌PD 基因被替换为L
PG
﹣
基因的过程采用了基因工程技术，该过程中发生了基因重组，C 正
确；
D、电泳鉴定L
PG
﹣
基因时，电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时，停止电泳，
D 错误。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作
步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
【典例4】（2023•博白县模拟）细菌病的防治一直是困扰人类的难题之一，特别是长期使用抗生素，许多
细菌产生了明显的耐药性。通过基因工程和胚胎工程生产抗菌肽，是研制新型抗菌药物的有效途径。回答
下列问题：
（1）生产抗菌肽所需的抗菌肽基因，可用
技术大量扩增。扩增过程中需要将温度冷却至55～
24
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
60℃，这步叫复性，目的是
。获得大量抗菌肽基因后，为了使其和
质粒能正确地成功拼接，一般操作方法是用
切割含抗菌肽基因的DNA
片段和质粒。
（2）抗菌肽基因导入受体细胞后，可利用放射性同位素标记的目的基因的DNA 片段作为
，
目的是检测
。
（3）一般科学家将抗菌肽基因导入受精卵，以培育出能产生抗菌肽的转基因动物，请分析选择受精卵
作为受体细胞的原因是
。
（4）受精卵在体外培养到早期胚胎过程中，需用
培养液培养。早期胚胎发育到适宜的时期再
将胚胎移植到代孕母体的子宫里，用这种方法得到的动物称为
（填“克隆动物”或
“试管动物”）。
【分析】PCR 技术：
（1）概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。
（2）原理：DNA 复制。
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA 解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：
合成子链。PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
【解答】解：（1）PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术，
生产抗菌肽所需的抗菌肽基因，可用PCR 技术大量扩增。扩增过程中需要将温度冷却至55～60℃，目
的是进行复性，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合。为了使抗菌肽基因和质粒能正确地
成功拼接，需要使用两种不同的限制性内切核酸酶，目的基因和质粒均使用两种酶切割，使得获得的片
段自身不能环化，但两者之间能够拼接，最后再使用DNA 连接酶将抗菌肽基因和质粒连接起来。
（2）抗菌肽基因导入受体细胞后，可利用放射性同位素标记的目的基因的DNA 片段作为基因探针，目
的是检测抗菌肽基因是否导入受体细胞和是否转录出了相应的mRNA，如果出现杂交带，说明抗菌肽基
因转录出了相应的mRNA，反之没有。
（3）受精卵的全能性最大，而一般的动物体细胞全能性不易表达，因此常使用受精卵作为受体细胞。
（4）受精卵在体外需用发育培养液培养。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。早期胚胎发育到
适宜的时期再将胚胎移植到代孕母体的子宫里，用这种方法得到的动物称为试管动物。
故答案为：
（1）PCR 使引物与单链相应互补序列结合 两种不同的限制酶
（2）探针 抗菌肽基因是否导入受体细胞和是否转录出了相应的mRNA
25
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
（3）受精卵的全能性最大，而一般的动物体细胞全能性不易表达
（4）发育 试管动物
【点评】本题主要考查PCR 计数、胚胎工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点，把握知识
间内在联系的能力，能够运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。
【变式1】（2023•厦门模拟）如图表示PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，
L、R 表示方向。下列叙述正确的是（ ）
A．②链从L 到R 的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B．PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C．以1 个DNA 为模板经 3 次循环需消耗8 个引物③
D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经2 次循环才可获得该序列的双链产物
【分析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。条件：模板
DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）；过程：①高温变性：DNA 解旋过
程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互
补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【解答】解：A、根据DNA 分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，
图中①②链均可作为子链合成的模板，A 错误；
B、PCR 过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链
结构，而后调节温度是子链沿着引物的3’端延伸，B 错误；
C、以1 个DNA 为模板经3 次循环产生的DNA 分子数目为23＝8，则需消耗 引物③的数目为（8×2﹣
2）÷2＝7，C 错误；
D、物质③的 5′端添加了某序列，至少需经2 次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA 产物，
D 正确。
故选：D。
【点评】本题考查PCR 的相关知识，熟记PCR 的基础，才能顺利作答。
【变式2】（2023•滨州二模）巢式PCR 是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目
的基因大的DNA 片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩
增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是（ ）
26
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．PCR 反应缓冲液中Mg2+的作用是激活DNA 聚合酶
B．与传统PCR 相比，巢式PCR 能有效提高产物中目的基因的比例
C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
【分析】PCR 技术的原理是细胞内DNA 复制，需要模板、原料、能量、酶、引物等条件。PCR 一般要
经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物
也作为模板参与反应。引物是一小段DNA 或RNA，它能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对。
【解答】解：A、PCR 技术的原理是细胞内DNA 复制，需要Mg²+、模板、原料、能量、酶、引物等条
件，PCR 反应缓冲液中Mg²+的作用是激活DNA 聚合酶，A 正确；
B、与传统PCR 相比，巢式PCR 用外引物扩增后获得含有目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产
物为模板，能有效提高产物中目的基因的比例，B 正确；
C、由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性，将需要的目的基因扩
增出来，C 正确；
D、如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D
错误。
故选：D。
【点评】本题主要考查PCR 的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能
力，能够运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。
【变式3】（2023•大东区校级四模）单分子荧光测序技术原理如图所示。某种脱氧核糖核苷三磷酸
（dNTP）提供一个相应的脱氧核苷酸连接到DNA 子链上的同时，会产生一分子的焦磷酸（PPi），一分子
的PPi 可以通过一系列反应使荧光素发出一次荧光，通过检测荧光的有无可推测模板链上相应位点的碱基
种类。下列说法错误的是（ ）
27
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．测序过程中dNTP 可以为反应提供能量
B．单分子荧光测序需要在DNA 复制过程中进行
C．测序时需要在反应体系中同时加入4 种dNTP
D．利用该技术测序时可能会连续多次出现荧光现象
【分析】多聚酶链式反应扩增DNA 片段：
1、PCR 原理：在高温加热作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是
从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，
其主要原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
2、PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【解答】解：A、测序过程反应中的能量来自dNTP 水解放出的能量，A 正确；
B、分析题干信息及示意图，单分子荧光测序技术指的是某种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）提供一个相
应的脱氧核苷酸连接到DNA 子链上的同时，会产生一分子的焦磷酸（PPi），一分子的PPi 可以通过一
系列反应使荧光素发出一次荧光，通过检测荧光的有无可推测模板链上相应位点的碱基种类，需要在
DNA 复制过程中进行，B 正确；
C、每一轮测序中只加入1 种dNTP，C 错误；
D、在连续的位置可能出现相同碱基，则会连续多次出现荧光现象，D 正确。
故选：C。
【点评】本题主要考查的是DNA 片段的扩增与电泳鉴定的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解
掌握，难度适中。
【变式4】（2023•苏州三模）为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。
科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系，为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐盐
基因（RST1）编码链首端到末端（其中一条链）的序列为5'
ATCTACGCGCTCATCCG...
﹣
（省略3n 个核
苷酸序列）…CGCAGCAATGAGTAGCG
3'
﹣。如图1 为构建重组质粒的过程示意图，BamHⅠ、BclⅠ、
SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶（四种酶的识别序列详见表）。请回答下列问题：
28
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
SmaⅠ
Sau3AⅠ
识别序列及切割位点（5′→3′）
G↓GATCC
T↓GATCA
CCC↓GGG
↓GATC
（1）为获取更多RST1 基因，可通过PCR 扩增，在反应体系中加入引物的作用是
。某同学设计了如下六种PCR 引物，
其中可选用的引物是
（选填序号）。
①5'
GACTACTCGCGCATCTA
3'
﹣
﹣
②5'
ATCTACGCGCTCATCCG
3'
﹣
﹣
③5'
GCGATGAGTAACGACGC
3'
﹣
﹣
④5'
CGCTACTCATTGCTGCG
3'
﹣
﹣
⑤5'
TAGATGCGCGAGTAGGC
3'
﹣
﹣
⑥5'
CGCAGCAATGAGTAGCG
3'
﹣
﹣
（2）若PCR 反应未得到任何扩增产物，主要原因有
（选填序号）。
①退火温度过高 ②Taq 酶失活 ③设计的引物过短 ④变性温度过低 ⑤模板受到污染 ⑥Mg2+浓度
过低
（3）为将图中质粒A 和RST1 基因正确连接构建重组质粒B，设计RST1 基因的引物时，在两种引物的
5'端分别添加
酶的识别序列，选用
酶切割质粒A，酶切后的
载体和目的基因片段通过
酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体
细胞，应首先在筛选平板培养基添加
，再将平板上长出的菌落通过影印接种法（盖章）接种
到添加
的平板培养基上继续培养观察。
（4）从平板上长出的菌落若提取重组质粒B 利用Sau3AI 进行酶切，最多可以得到
种大小不同的
DNA 片段。
（5）图2 是对重组质粒测序的部分序列，若目的基因与质粒正确连接（启动子顺时针转录），则图中
连接处的序列正确的是
（填序列编号）。
【分析】题图分析：图示表示应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系的过程，其中①表示以
29
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
mRNA 为模板逆转录形成DNA；②表示采用PCR 技术扩增目的基因；④表示基因表达载体的构建过
程；⑤表示将目的基因导入大肠杆菌，使其大量繁殖；⑥⑦表示采用农杆菌转化法将目的基因导入受
体细胞。
【解答】解：（1）通过PCR 扩增可获取更多RST1 基因，在反应体系中加入引物的作用是与目的基因
的模板链配对，使Taq 酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，延伸子链。该耐盐基因（RST1）编码链首
端到末端（其中一条链）的序列为5'
ATCTACGCGCTCATCCG...
﹣
（省略3n 个核苷酸序列）…
CGCAGCAATGAGTAGCG
3'
﹣。涉及的引物需要和模板链发生碱基互补配对，根据碱基互补配对原则
可知，六种PCR 引物，其中可选用的引物是②④。
（2）若PCR 反应未得到任何扩增产物，则可能得原因是①退火温度过高（使引物无法和模板链结合）、
②Taq 酶失活（无法催化子链延伸）、④变性温度过低（模板链无法解开）、⑥Mg2+浓度过低（导
致Taq 酶无法被激活）。
（3）为将图中质粒A 和RST1 基因正确连接构建重组质粒B，设计RST1 基因的引物时，由于目的基因
中间有BclⅠ的识别序列，因此不能在引物中设计该序列，而只能选择与该引物能产生相同黏性末端的
引物BamHⅠ，即需要在两种引物的5'端分别添加BamHⅠ、SmaⅠ酶的识别序列，同时需要选用BclⅠ、
SmaⅠ酶切割质粒A（质粒的切割不能用BamHⅠ），这样设计酶切后的载体和目的基因片段会出现相同
的黏性末端，通过DNA 连接酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞，由于重
组质粒中含有抗四环素的标记基因，而普通质粒中含有两种抗性基因，因此，为了筛选出成功导入目的
基因的受体细胞，应首先在筛选平板培养基添加四环素，再将平板上长出的菌落通过影印接种法（盖
章）接种到添加氨苄青霉素的平板培养基上继续培养观察，则在氨苄青霉素的培养基上无法生长的即为
目的菌。
（4）从平板上长出的菌落若提取重组质粒B 利用Sau3AI 进行酶切，由于重组质粒中有BamHⅠ、BclⅠ、
SmaⅠ和重组的接口处相应的序列5'TGATCC3'各一个，且Sau3AI 对其中的三种序列均可切割，只是不
能对SmaⅠ的序列进行切割，Sau3AI 酶切时4 个位置都被切割，则会出现4 种大小不同的DNA 片段
（假设4 段DNA 片段分别为①、②、③、④）；若Sau3AI 酶切时只切割1 个位置，则会有
①+②+③+④这个长度的DNA 片段；若Sau3AI 酶切时只切割2 个位置，可以有①、②+③+④，②、
①+③+④，③、①+②+④，④、①+②+③，①+②、③+④，②+③、④+①；若Sau3AI 酶切时只切
割3 个位置，可以有④+①、②、③，①+②、③、④，②+③、①、④，④+④、①、②；综合
上述情况，去除重复的DNA 片段，最终可得到12 种大小不同的DNA 片段，因此最多可以得到7 种大
小不同的DNA 片段。
（5）图2 是对重组质粒测序的部分序列，若目的基因与质粒正确连接（启动子顺时针转录），则图中
30
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
连接处的序列为5'TGATCC3'，因此对应的是图中的Q3。
故答案为：
（1）与目的基因的模板链配对（结合），使Taq 酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，延伸子链
②④
（2）①②④⑥
（3）BamHⅠ、SmaⅠBclⅠ、SmaⅠT4 DNA 连接 四环素 氨苄青霉素
（4）7
（5）Q3
【点评】本题主要考查的是基因工程的操作的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适
中。
31
