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考点49 基因工程的工具及操作程序（精练）
1.
（2023•海口一模）限制酶、DNA 连接酶等的发现为DNA 分子的切割，连接及基因表达载体的构建创造了
条件。下列关于重组DNA 技术基本工具的叙述，正确的是（ ）
A．限制酶在原核细胞内的主要作用是切割修剪自身的DNA
B．噬菌体、动植物病毒均可作为载体将外源基因导入受体细胞
C．用作载体的质粒DNA 分子上可以不含有限制酶切割位点
D．DNA 连接酶可连接DNA 分子两条链中碱基对之间的氢键
【分析】1、基因工程又叫作重组DNA 技术，是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新
的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，具有特异性，即能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸
序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
【解答】解：A、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，其在原核细胞中的主要作用是切割外源DNA
使之失效，从而达到保护自身的目的，A 错误；
B、将外源基因导入受体细胞，常常需要将目的基因与运载体结合构建基因表达载体，常用的载体有质
粒、噬菌体和动植物病毒，B 正确；
C、作为载体的质粒上有限制酶的切割位点，这是质粒作为运载体的条件之一，C 错误；
D、DNA 连接酶是连接的磷酸二酯键，D 错误。
故选：B。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析
问题的能力。
2.
（2023•沈阳模拟）PCR 又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。下列有
关PCR 的叙述错误的是（ ）
A．以DNA 半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行
B．耐高温的DNA 聚合酶只能从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸
1
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C．反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步
D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物
【分析】PCR 是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C 左右）时引物与
单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度（72°C 左右），DNA 聚合酶
沿着磷酸到五碳糖（5'
3'
﹣）的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR 仪实际就是一个温控设备，能
在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【解答】解：A、PCR 是体外进行DNA 复制，以半保留复制为原理，为了维持反应的稳定，反应需要
在缓冲液中进行，A 正确；
B、耐高温的DNA 聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，B 错误；
C、反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，
C 正确；
D、常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物，按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，D 正
确。
故选：B。
【点评】本题考查PCR 技术的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分
析问题的能力。
3.
（2023•南平模拟）生物实验中经常需要使用各种试剂，下列教材实验中使用的试剂及其作用，错误的是（
）
选项
实验
试剂及其作用
A
淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用
碘液可鉴定淀粉和蔗糖是否被水解
B
观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂
醋酸洋红液可使染色体着色
C
模拟生物体维持pH 的稳定
HCl、NaOH 溶液可分别创设酸性和碱性环
境
D
DNA 的粗提取与鉴定
二苯胺试剂用于鉴定DNA
A．A
B．B
C．C
D．D
【分析】使用斐林试剂在水浴加热的条件下鉴定还原性糖，产生砖红色沉淀；醋酸洋红液、或甲紫等碱
性染料可将染色体染为深色；在DNA 的粗提取与鉴定实验中，可用二苯胺试剂用于鉴定DNA。
【解答】解：A、碘液可用于鉴定淀粉是否被水解，但不能鉴定蔗糖是否被水解，淀粉和蔗糖水解的产
物都是还原性糖，应使用斐林试剂进行鉴定，A 错误；
B、观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂的实验中，醋酸洋红液可将染色体染为深色，B 正确；
C、在模拟生物体维持pH 的稳定的实验中，可用HCl、NaOH 溶液分别创设酸性和碱性环境，C 正确；
2
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D、在DNA 的粗提取与鉴定实验中，可用二苯胺试剂鉴定DNA，D 正确。
故选：A。
【点评】本题考查生物学的相关实验，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验
选择的材料、实验采用的试剂及试剂的作用，实验现象等，需要考生在平时的学习生活中注意积累。
4.
（2023•沧州模拟）基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫
基因导入某植物，下列分析错误的是（ ）
A．应该将抗虫基因插入农杆菌Ti 质粒的T
DNA
﹣
片段内
B．可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物
C．目的基因与Ti 质粒的结合未涉及碱基互补配对原则
D．转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和
标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞
的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射
法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因
是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：A、农杆菌中的Ti 质粒上的T
DNA
﹣
可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的
DNA 上。因此应该将抗虫基因插入农杆菌Ti 质粒的T
DNA
﹣
片段内，A 正确；
B、若在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物，则可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物，B 正确；
C、目的基因的黏性末端与质粒的黏性末端依赖碱基互补配对原则连接在一起，C 错误；
D、转基因是否成功，最简便的方法是从个体水平上观察该植物有没有抗虫性状，D 正确。
故选：C。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作
步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
5.
（2023•东阳市模拟）从目标生物中提取分离DNA，是进行基因工程操作的基础。某兴趣小组尝试从新鲜
香蕉果肉中进行DNA 的粗提取及分离，下列有关叙述错误的是（ ）
A．可用蛋白酶对滤液中的DNA 进行纯化
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B．酵母或菜花可以作为替代香蕉果肉的材料
C．加入冷酒精后快速研磨以析出絮状物
D．设置只加二苯胺试剂的空白对照组，目的是与实验组进行颜色对照
【分析】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适
当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原
理，可以初步分离DNA 与蛋白质。DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 的
NaCl 溶液。
【解答】解：A、蛋白酶可分解蛋白质，利用蛋白酶可对滤液中的DNA 进行纯化，A 正确；
B、酵母或菜花的细胞中都含有DNA，可以作为替代香蕉果肉的材料，B 正确；
C、DNA 不溶解于酒精，在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为 95%的酒精溶液，静置2〜3
min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA，不需要快速研磨，C 错误；
D、设置只加二苯胺试剂的空白对照组，目的是与实验组进行颜色对照，以鉴定提取出的物质是DNA，
D 正确。
故选：C。
【点评】本题主要考查DNA 的粗提取与鉴定，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和
所学知识进行分析应用。
6.
（2023•广东一模）下列有关“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA 的粗提取
B．DNA 不溶于体积分数为95%的冷酒精而溶于2mol/L 的NaCl 溶液
C．在研磨植物细胞时加入研磨液是为了溶解细胞壁
D．溶有DNA 的NaCl 溶液中加入二苯胺试剂后即呈蓝色
【分析】1、DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同
浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出，
从而达到分离的目的；①DNA 不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理
可以将蛋白质和DNA 进一步分离；③DNA 对于酶、高温和洗涤剂的耐受性，蛋白酶能水解蛋白质，
但是不能水解DNA，蛋白质不能耐受较高温度，DNA 能耐受较高温度洗涤剂能瓦解细胞膜，但是对
DNA 没有影响；④在沸水浴的条件下DNA 遇二苯胺会呈现蓝色。
2、DNA 粗提取与鉴定的实验中，不同操作步骤中加水的作用不同，破碎细胞获取含DNA 的滤液时加
蒸馏水的目的是使血细胞涨破；出去滤液中的杂质时，加蒸馏水的目的是降低NaCl 溶液浓度使DNA 析
出。
【解答】解：A、猪是哺乳动物，其红细胞没有细胞核，所以新鲜猪血不可用于DNA 的粗提取，A 错
4
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误；
B、DNA 不溶于体积分数为95%的冷酒精而溶于2mol/L 的NaCl 溶液，在0.14mol/L 的NaCl 溶液中溶解
度最小，B 正确；
C、在研磨植物细胞时加入洗涤剂而不是研磨液，C 错误；
D、溶有DNA 的NaCl 溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热，冷却后才呈蓝色，D 错误。
故选：B。
【点评】本题考查DNA 粗提取和鉴定实验，意在考查考生的识记能力和理解所学知识要点，把握知识
间内在联系，形成知识网络结构的能力；能运用所学知识和观点，对生物学问题作出准确判断的能力。
7.
（2023•新洲区校级模拟）如图为不同限制性核酸内切酶识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述错
误的是（ ）
A．图示4 种限制性核酸内切酶均不能够识别和切割RNA 分子内的核苷酸序列
B．若DNA 上的碱基随机排列，NotⅠ限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切
酶高
C．酶切时使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA 片段自身环化
D．用酶BglⅡ切出的目的基因与酶BamHⅠ切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开
【分析】限制性核酸内切酶是基因工程中切割DNA 分子的工具，能识别双链DNA 分子的特定序列，
并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
【解答】解：A、酶具有专一性，限制酶是专门切割DNA 序列中一定部位的酶，所以图示4 种限制性
核酸内切酶均不能够识别和切割RNA 分子内的核苷酸序列，A 正确；
B、由于Not I 限制性核酸内切酶识别的序列比其他三种酶的序列长，若DNA 上的碱基随机排列，Not I
限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶低，B 错误；
C、两种不同的限制酶可产生不同的黏性末端，所以使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的
基因的外源DNA 片段自身环化，C 正确；
D、用酶BglⅡ切出的目的基因与酶BamHⅠ切割的质粒重组后，重组DNA 分子序列为
，6
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个脱氧核苷酸对序列既不能被限制酶BglⅡ识别，也不能被BamHⅠ识别，所以不可能被这两种酶切开，
D 正确。
故选：B。
【点评】本题考查重组DNA 技术中的基本工具，要求学生熟记限制性核酸内切酶的作用本质、特点等，
从而完成答题。
8.
（2023•武汉模拟）由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E 只有产生黏性末端的酶切位点，需借助
中间载体P 将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A．通过PCR 扩增获取目的基因是基因工程的核心工作
B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P
C．载体P 只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和
标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞
的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的
基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原﹣抗体杂交技术。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：A、基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，不是通过PCR 扩增获取目的基因，A 错误；
B、由于载体E 只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P 接入载体E，同时防止载体E 自身环化，
需要用两种限制酶分别切割载体E 和中间载体P，据图可知，中间载体P 和载体E 均含有XhoI 和PstI
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酶识别序列，故可选用XhoI 和PstI 酶进行酶切，载体P 的这两种酶识别序列中含有EcoRV 识别位点，
并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI 酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点
没有位于XhoI 和PstI 酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P 进行切割，B 错误；
C、载体P 是中间质粒，不含有表达MT 基因的启动子和终止子，C 正确；
D、受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒，D 错误。
故选：C。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，解答本题的关键是分析题图，明确基因工程的工具，并根据限
制酶的切割位点判断引物应该设计的碱基序列，结合题意明确检测基因表达载体的方法。
9.
（2023•濠江区校级三模）如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的
是（ ）
A．分子运输车——载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等
B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA 连接酶从引物a 和引物b 起始延伸互补链
C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞
D．含目的基因的植物受体细胞可能无需培养成完整植株
【分析】基因工程技术的基本步骤是：
1、目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因——DNA 分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原﹣抗体杂交技术。
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（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：A、基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，载体不包括目的基因，
A 错误；
B、若利用PCR 技术扩增目的基因时，利用耐高温的DNA 聚合酶延伸子链，B 错误；
C、接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是受精卵，因为受精卵的全能性最高，C 错误；
D、为了大量生产人血清白蛋白，可从愈伤组织获得，无需培养为完整植株，D 正确。
故选：D。
【点评】本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，
掌握各操作步骤中需要注意的细节，再结合所学的知识准确答题。
10. （2023•东宝区校级模拟）利用PCR 既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR 的
叙述，错误的是（ ）
A．PCR 用的DNA 聚合酶是一种耐高温酶
B．变性过程中，双链DNA 的解开不需要解旋酶
C．复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D．延伸过程中，需要DNA 聚合酶、ATP 和4 种核糖核苷酸
【分析】PCR 技术：
1、概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。
2、原理：DNA 复制。
3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。
4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）
5、过程：①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可
自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【解答】解：A、PCR 用的DNA 聚合酶是一种耐高温酶，A 正确；
B、变性过程中，双链DNA 的解开不需要解旋酶，该过程通过高温使DNA 双链间的氢键断裂，B 正确；
C、复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则，C 正确；
D、延伸过程中，需要DNA 聚合酶、ATP 和4 种脱氧核糖核苷酸，D 错误。
故选：D。
【点评】本题考查PCR 技术的相关知识，要求考生识记PCR 技术的概念、原理、条件及过程，能结合
所学的知识准确判断各选项。
11.
（2023•五华区校级模拟）下列关于DNA 的粗提取和PCR 的叙述，错误的是（ ）
A．鱼的精巢中DNA 含量较高，可作为DNA 粗提取的实验材料
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B．DNA 粗提取实验的研磨液中含有抑制DNA 酶的物质
C．可用二苯胺鉴定PCR 获得的具有特定序列的DNA 分子
D．PCR 反应缓冲液中一般要添加Mg2+
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精溶
液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
2、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【解答】解：A、DNA 粗提取实验需选择DNA 含量较高的生物材料，鱼的精巢中DNA 含量较高，可
以用于该实验，A 正确；
B、研磨液中应加入DNA 酶的抑制剂，以防细胞破碎后DNA 酶降解DNA，减少DNA 的提取量，B 正
确；
C、二苯胺只能鉴定DNA 有无，不能用来鉴定DNA 的碱基序列，因此不能用于鉴定PCR 获得的具有特
定序列的DNA 分子，C 错误；
D、真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR 反应缓冲液中一般要添加 Mg2+，D 正
确。
故选：C。
【点评】本题主要考查DNA 的粗提取和PCR 的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合
题干信息和所学知识进行分析应用。
12. （2023•江汉区校级模拟）经科学工作者研究，发现了数种快速检验新冠肺炎病原体的方法。下列与新型冠
状病毒的研究、诊断有关的说法中错误的是（ ）
A．镜检法：在光学显微镜下直接观察病人的痰液或血液，可发现病原体
B．PCR 技术：体外基因复制技术，可在几十分钟内把病原体的基因扩增到数百万倍
C．抗原—抗体法：用病原体蛋白质与病人血清中相应抗体特异性结合，可确认是否感染过
D．DNA 探针技术：用放射性同位素、荧光因子等标记的 DNA 分子做探针可检测病原体
【分析】核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。基因诊断技术它的基本原理是：互补的DNA
单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交．这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则
进行，它不仅能在DNA 和DNA 之间进行，也能在DNA 和RNA 之间进行。
【解答】解：A、光学显微镜下观察不到病毒，不能检测病原体的种类，A 错误；
B、PCR 是利用DNA 分子复制的原理在体外扩增目的基因的技术，利用PCR 技术可在几十分钟内把病
原体的基因扩展到数百万倍，B 正确；
C、病原体进入人体后会刺激机体产生特异性免疫反应，产生相应抗体，由于抗体与抗原结合具有特异
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性，因此通过用特殊制备的病原体蛋白质与病人血清中的相关抗体特异性结合，通过酶联反应，可以发
现病原体，C 正确；
D、可以DNA 分子为探针，利用DNA 分子杂交技术检测病原体，若出现杂交带，则证明有病原体存在，
D 正确。
故选：A。
【点评】本题主要考查的是DNA 片段的扩增以及电泳鉴定的相关知识，意在考查学生对基础知识的理
解掌握，难度适中。
13. （2023•祁东县校级模拟）为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含
子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K 呈现蓝色。转化过程中愈伤
组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（
）
A．T
DNA
﹣
可将基因G 转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA 上
B．利用物质K 和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C．利用物质K 和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D．愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素
【分析】1、农杆菌转化法的具体过程：
（1）利用土壤的Ti 质粒构建基因表达载体，即将目的基因整合到土壤农杆菌的Ti 质粒上。
（2）将整合了目的基因的Ti 质粒导入土壤农杆菌细胞内。
（3）利用土壤农杆菌感染植物细胞，该过程实际上是将含有目的基因的土壤农杆菌Ti 质粒导入植物细
胞内。
（4）含有目的基因的土壤农杆菌Ti 质粒进入植物细胞后，可以把自己的一段基因整合到细胞核中的染
色体上，这段基因中包含了目的基因。
2、原理：农杆菌中的Ti 质粒上的T
DNA
﹣
可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上。
根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti 质粒的T
DNA
﹣
上，通过农杆菌的转化作用，就可
以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA 上。
3、农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力；Ti 质粒的T
DNA
﹣
可转移
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至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。
4、转化：目的基因插入Ti 质粒的T
DNA
﹣
上 农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色
体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
【解答】解：A、农杆菌中的Ti 质粒上的T
DNA
﹣
可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的
DNA 上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因（基因G）插入到Ti 质粒的T
DNA
﹣
上，通过农杆菌的
转化作用，就可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA 上，A 正确；
B、农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现农杆菌的蓝
色菌落，B 错误；
C、根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K 呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致
未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K 和除草剂进行筛选2，更易于获得抗
除草剂的转基因植株，C 正确；
D、愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素，如生长素和细胞分裂素，D 正确。
故选：B。
【点评】本题主要考查基因工程的操作过程，意在考查考生的识图能力和理解所学知识要点，把握知识
间内在联系的能力，能够运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。
14. （2023•唐山一模）某一质粒载体如图甲所示，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tett表示四环素抗性基因。
有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA 连接酶进行连接反
应，用得到的混合物直接转化后得到多种大肠杆菌，并利用培养基乙和丙筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。
下列叙述错误的是（ ）
A．图甲所示的质粒中还应含有复制原点和终止子等结构
B．将经转化处理后的大肠杆菌菌液接种至培养基乙使用的是稀释涂布平板法
C．配制培养基乙时应加入青霉素
D．培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌
【分析】1、根据题意四环素抗性基因中有BamHI 酶切位点，将此质粒载体用BamHI 酶切后，四环素
抗性基因被破坏。
2、用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌
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有三种，分别是：含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。大
肠杆菌中含有质粒载体的，有两种抗性；含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌，有氨苄青霉素抗
性，但没有四环素抗性；含有环状目的基因的大肠杆菌，没有抗性。
【解答】解：A、质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有具有标记基因、具有一个或多个
限制酶切点、能在受体细胞中复制（复制原点），若是同时作为表达载体，还需要具有启动子和终止子
等结构，A 正确；
B、稀释涂布平板法可以用于微生物的分离计数，题中培养基乙后需要影印接种，可以使用稀释涂布平
板法接种转化处理后的大肠杆菌的菌液，B 正确；
C、配制培养基乙时应加入青霉素，使转化环状目的基因的大肠杆菌筛选掉，C 正确；
D、培养基乙中生长的菌落为转化质粒载体或者含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌；培养基丙
中生长的菌落为导入质粒载体的大肠杆菌，故不能在培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆
菌，D 错误。
故选：D。
【点评】本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作工具及操作步骤，掌
握各操作工具的作用及各操作步骤中需要注意的细节，能正确分析题图，再结合所学的知识准确答题。
15. （2023•桃城区校级三模）基因工程中需使用特定的限制酶切割基因载体，以便其与目的基因连接形成基因
表达载体。研究人员将相同的基因载体分组并进行相应酶切处理（如表所示），其中限制酶H1 和H2 识别
序列不同。各组基因载体经酶切处理后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图所示。下列说法错误的
是（ ）
分组
相应酶切处理
甲
限制酶H1
乙
限制酶H2
丙
限制酶H1+H2
A．该基因载体最有可能为环状DNA 分子
B．限制酶H1 与H2 在该载体上都有识别和切割位点
C．限制酶H1 与H2 在该载体上的酶切位点最短相距0.2kb
D．限制酶作用于该载体时会直接导致氢键和磷酸二酯键的断裂
【分析】基因工程中，在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同
末端以便使用DNA 连接酶进行连接。可通过标记基因的作用来检测受体细胞是否含有目的基因。
【解答】解：A、由图可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA 片段，因此该载
体最有可能为环状DNA 分子，A 正确；
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B、当用一种限制酶切割载体时，产生的DNA 片段等长，而用两种限制酶同时切割时，产生两种长度
的DNA 片段，所以两种限制酶在该载体上都有酶切位点，B 正确；
C、用两种限制酶同时切割载体时，产生0.6kb 和0.2kb 两种长度的DNA 片段，所以两种限制酶的酶切
位点最短相距0.2kb，C 正确；
D、限制酶切割载体时直接破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D 错误。
故选：D。
【点评】本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具等基础知
识，能正确分析题图，根据两种限制酶的识别序列及切割位点做出准确的选择，再结合所学的知识准确
答题。
16. （2023•思明区校级模拟）研究人员将编码甜菜红素合成酶的四个基因BvCYP，BvDOD、cDOPA 和ADH
与绿色荧光蛋白基因eGFP 连接，搭载到农杆菌Ti 质粒的T
DNA
﹣
片段上构建多基因表达载体，利用农杆
菌转化法使其在烟草细胞中表达，并能观察到甜菜红素的合成与绿色荧光。下列说法错误的是（ ）
A．构建多基因表达载体时需用到限制酶和DNA 连接酶
B．可用PCR 技术检测五个基因是否成功导入烟草细胞
C．图中五个基因转录时均以DNA 的同一条单链为模板
D．应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的烟草细胞
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和
标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞
的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射
法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因
是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：A、构建多基因表达载体时需先用限制酶切割外源DNA 和载体，其次用DNA 连接酶将多
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个基因与载体结合，A 正确；
B、检测目的基因是否成功导入受体细胞可采用DNA 分子杂交技术，也可采用PCR 技术，B 正确；
C、BvCYP 启动子启动转录的方向与其他的不同，所以五个基因转录时的模板不是同一条DNA 单链，
C 错误；
D、卡那霉素抗性基因不位于T
DNA
﹣
中，不能表达，而潮霉素抗性基因位于T
DNA
﹣
中，能表达，应
选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，D 正确。
故选：C。
【点评】本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作步骤，掌握各操作步
骤中需要注意的细节，能结合图中信息准确判断各选项。
17. （2023•历城区校级模拟）第一代基因测序技术又叫双脱氧链终止法，它以DNA 合成反应为基础，反应体
系中需加入ddNTP（有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP4 种）。如图是该技术的测序原理和某待测DNA
序列的电泳图谱。下列说法错误的是（ ）
A．反应体系中加入ddNTP 的作用是使DNA 复制停止
B．待分离DNA 片段有可解离的基团，在电场中会带上正电荷或负电荷
C．需根据待分离DNA 片段的大小用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液浓度
D．待测DNA 的碱基序列是3'
GACTGCCA
5'
﹣
﹣
【分析】基因检测是指通过检测生物体中的DNA 序列，以了解生物体基因状况的技术手段。Sanger 双
脱氧链终止法是DNA 测序的基本方法，其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、带有3′
OH
﹣
末端的单链
核苷酸引物、四种dNTP 存在的条件下复制或转录时，如果在反应系统中分别引入单一种类的ddNTP
（即2、3 双脱氧核苷三磷酸，在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯
键），只要ddNTP 掺入链端，该链就停止延长，末端掺入dNTP 的片段可继续延长。
【解答】解：A、由于ddNTP 没有3′
OH
﹣
末端，则反应体系中加入ddNTP，作用是使DNA 复制停止，
A 正确；
B、DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用
下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳，B 错误；
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C、DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关，所以需根据待分离DNA 片段
的大小用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液浓度，C 正确；
D、根据电泳图谱，由左到右读出待测DNA 的碱基序列是3'
GACTGCCA
5'
﹣
﹣，D 正确。
故选：B。
【点评】本题考查PCR 技术的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分
析问题的能力。
18. （2023•莆田模拟）CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一把“分子剪
刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/
Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示，下列分析正确的是（ ）
A．构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要插入到质粒的启动子上游
B．SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后，其功能类似于DNA 聚合酶
C．根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标DNA 的定点切割
D．CRISPR/Cas9 识别目标DNA 序列主要与Cas9 蛋白的特异性相关
【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞
最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检
测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因﹣DNA 分子杂交
技术②检测目的基因是否转录出了mRNA﹣分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原
﹣抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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【解答】解：A、启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合
的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质，构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要
插入到质粒的启动子下游，便于转录产生SgRNA，A 错误。
B、SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后，可切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因，其功能类似
于限制酶，B 错误；
C、SgRNA 可以特异性切割DNA 位点，根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标DNA 的定点
切割，C 正确；
D、CRISPR/Cas9 识别目标DNA 序列主要与SgRNA 编码序列有关，D 错误；
故选：C。
【点评】本题主要考查基因工程的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所
学知识进行分析应用。
19. （2023•襄城区校级模拟）重叠延伸PCR 技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模
板，通过多次PCR 扩增，从而获得目的基因的方法。某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中
的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47 位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子
为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图所示。下列说法错误的是（ ）
注：引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
A．过程①需要模板、含Mg2+的缓冲液、引物、4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA 聚合酶等
B．若引物2 的突变位点设计为A，则引物3 的突变位点应设计为G
C．经过过程④获得的杂交DNA 有2 种，只有其中一种可以经过过程⑤获得目的基因
D．以过程⑤获得的目的基因为模板，可以使用引物1 和引物4 进行PCR
【分析】1、PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧
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核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成
方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要
引物，其主要原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
2、PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【解答】解：A、过程①为PCR 反应，需要在一定的添加Mg2+的缓冲液中才能进行，需提供模板
DNA、分别与两条模板链结合的引物、4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA 聚合酶等，A 正确；
B、结合图1，若引物2 的突变位点设计为A，则目的是让基因中的碱基对A
T
﹣
突变为T
A
﹣，由图2
可看出，步骤④获得的杂交DNA，一条链与引物2 互补，另一条链与引物3 互补，所以引物2 和引物3
的序列互补，引物3 的突变位点应设计为T，B 错误；
C、过程④获得的杂交DNA 有2 种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单链的杂交DNA 为所
需DNA，C 正确；
D、过程⑤获得的目的基因一条链一端能与引物1 互补，另一条链一端能与引物4 互补，因此可以使用
引物1 和引物4 进行PCR，D 正确。
故选：B。
【点评】本题结合图解，考查PCR 技术的相关知识，要求考生识记PCR 技术的原理、条件、过程等基
础知识，能结合题中信息和所学的知识准确答题。
20. （2023•临沂一模）新冠疫情的快速控制，离不开我国政府的科学决策和对新冠病毒（一种RNA 病毒）的
快速检测能力。荧光定量PCR 可定量检测样本中DNA 含量，其原理是在PCR 反应体系中加入引物的同时，
加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA 聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧
光分子，即DNA 每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图），荧光监测系统随时接收荧光信号变化。
每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次数称为循环阈值（Ct值）。下列说法正确的是（
）
A．细胞内DNA 复制的引物种类与PCR 所用引物种类相同
B．一个初始DNA 分子经过4 次循环后，得到6 个等长的DNA 分子
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C．Ct值越大，被检测样本中病毒数目越多，对被检测者的危害性越大
D．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA 的含量呈正相关
【分析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。荧光定量
PCR 技术可定量检测样本中某种DNA 含量的原理是在PCR 体系中每加入一对引物的同时加入一个与某
条模板链互补的荧光探针，当Taq 酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光
信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物的形成完全同步。
【解答】解：A、细胞内DNA 的复制时，引物是通过RNA 聚合酶合成的RNA 链，而PCR 反应中所需
的引物是人工合成的DNA 或RNA 链，A 错误；
B、一个初始DNA 分子经过4 次循环后，得到8 个等长的DNA 分子，B 错误；
C、Ct 值越小，说明所需循环的次数越少，可以理解为样本中的病毒含量相对较高，越容易被检测到。
而Ct 值越高，说明所需循环的次数越多，检测到时需要更多的时间与循环，提示样本中病毒的含量相
对较少。即新冠病毒含量越少，Ct 值越高，新冠病毒含量越多，Ct 值越低，C 错误；
D、题干中提出“加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，就有一个荧光分子生
成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA 含量呈正相关，D 正确。
故选：D。
【点评】本题考查PCR 技术的相关知识，意在考查学生的识图能力和判断能力，难度适中。
21. （2023•河南模拟）如图为转基因抗病毒香蕉的培育过程，含目的基因的外源DNA 和质粒上的箭头表示相
关限制酶的酶切位点。回答下列问题：
（1）质粒具有
的特点，
因此可作为基因工程的运载体。
（2）研究人员在构建重组质粒时，选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ对目的基因和质粒进行切割，不选择
EcoRⅠ酶和SmaⅠ酶切割目的基因和质粒的原因分别是
。
限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒时破坏的磷酸二酯键的数目为
。
（3）重组质粒导入农杆菌之前需要用
处理农杆菌，使其处于
的
感受态。获得转基因香蕉植株后，还需要进行
，以检验转基因抗病香蕉是否培育成功。
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【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和
标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞
的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射
法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因
是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：（1）质粒作为载体，具有多个酶切位点，以便插入目的基因；有标记基因，以便于含有
目的基因的受体细胞的筛选；质粒是一环状DNA，能在宿主细胞内复制并稳定保存。
（2）用EcoRⅠ酶切割目的基因和质粒可能造成二者反向连接和自身环化，用SmaⅠ酶切割目的基因和质
粒会破坏目的基因及质粒上的标记基因，所以选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ对目的基因和质粒进行切割，
不选择EcoRⅠ酶和SmaⅠ酶切割目的基因和质粒。每一种限制酶将DNA 双链中的磷酸二酯键都切开，即
酶切一个位置破坏两个磷酸二酯键，则限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒时破坏的磷酸二酯键的数目为
4。
（3）将目的基因导入微生物常用钙离子转化法，即用Ca2+（或CaCl2）处理农杆菌，使其处于能吸收外
界环境中DNA 分子的感受态。从个体水平上检验转基因抗病毒植株的方法是进行病毒接种试验。
故答案为：
（1）含有多个酶切位点、有标记基因、能在宿主细胞内复制并稳定保存
（2）用EcoRⅠ酶切割目的基因和质粒可能造成二者反向连接和自身环化，用SmaⅠ酶切割目的基因和质
粒会破坏目的基因及质粒上的标记基因 4
（3）Ca2+（CaCl2） 能吸收外界环境中DNA 分子 病毒接种试验
【点评】本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作步骤，掌握各操作步
骤中注意的细节，能正确分析题图，再结合所学的知识准确答题。
22. （2023•抚顺二模）盐胁迫会影响植物的生长，可用转基因技术提高植物的耐盐能力。mybx 是响应盐胁迫
的关键转录因子，其功能缺失突变体对150mmol•L
1
﹣的NaCl 高度敏感。HKT1 基因表达的Na+转运蛋白介
导Na+从木质部导管到木质部薄壁细胞的运输，减少木质部的Na+含量，从而提高植物的耐盐能力。科研
人员构建HKT1 基因的表达载体获得HKT1 基因表达菌体，构建过程如图所示。四种限制酶的识别序列及
切割位点如表所示。回答下列问题：
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限制酶
HindⅢ
BamHⅠ
XhoⅠ
BglⅡ
识别序列及切割位点
A↓AGCTT
G↓GATCC
C↓TCGAG
A↓GATCT
（1）将拟南芥细胞破碎提取RNA 时，需要在溶液中加入
，以防止RNA 降解。过程
③要选择合适的限制酶切割含HKT1 基因的DNA 片段，应选用的表中的限制酶是
。
（2）过程⑤将重组质粒导入大肠杆菌。在筛选含有HKT1 基因的大肠杆菌时，除必要的营养物质，还
需要在培养基中添加
。提取重组质粒A 将其导入农杆菌，用农杆菌侵染拟南芥mybz 突变
体
花
序
，
农
杆
菌
的
作
用
是
。
（3）检测转HKT1 基因拟南芥mybr 突变株是否表达出Na+转运蛋白时，可用
技术
进行检测。若Na+转运蛋白高度表达，还需要进一步鉴定其抗性程度，实验的思路是
。
【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞
最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检
测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因﹣PCR 等技术②
检测目的基因是否转录出了mRNA
PCR
﹣
等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原﹣抗体杂
交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：（1 将拟南芥细胞破碎提取RNA 时，为防止RNA 被RNA 酶催化水解，需要加入RNA 酶
抑制剂；根据图中的HKT1 基因两端的黏性末端序列，可知分别使用限制酶HindⅢ、XhoI，可获得与
HKT1 基因两端的黏性末端相同的序列，有相同的黏性末端在进行基因表达载体的构建时能够进行碱基
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互补配对。
（2）在构建重组质粒时，氨苄青霉素抗性基因被限制酶XhoⅠ切割而失去功能，卡那霉素抗性基因正常，
因此培养基中需要加入卡那霉素，以筛选含目的基因的受体细胞；利用农杆菌侵染将重组质粒导入受体
细胞，农杆菌能够携带HKT1 基因进入拟南芥细胞，并使HKT1 基因在细胞内维持稳定和表达。
（3）检测转HKT1 基因拟南芥mybr 突变株是否表达出Na+转运蛋白，检测目的基因是否翻译成蛋白质
采用抗原—抗体杂交技术；进一步鉴定其抗性程度是否与原本的高敏感不同，将转基因突变株种植在施
加了浓度为150mmol•L
1
﹣的NaCl 溶液的土壤中，检测木质部薄壁细胞的含盐量和植株的生长状况，可
进一步鉴定其抗性程度。
故答案为：
（1）RNA 酶抑制剂 HindⅢ、XhoI
（2）卡那霉素 携带HKT1 基因进入拟南芥细胞，并使HKT1 基因在细胞内维持稳定和表达
（3）抗原―抗体杂交 将转基因突变株种植在施加了浓度为150mmol•L
1
﹣的NaCl 溶液的土壤中，
检测木质部薄壁细胞的含盐量和植株的生长状况
【点评】本题主要考查基因工程的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所
学知识进行分析应用。
23. （2023•福州模拟）为探究Bcl
2
﹣相关抗凋亡蛋白3（BAG3）在细胞自噬中的作用，科研人员计划从质粒
A 中获取BAG3 基因，将其接入质粒pGEX
4T1
﹣
，然后在宿主细胞内表达目标蛋白，用于后续研究。请回
答下列问题：
（1）BAG3 的基因序列如图2 所示。由于BAC3 基因两侧没有合适的酶切位点，并确定内部不含有
EcoRI、XhoI 限制酶的识别序列。在设计引物时，需将引物与限制酶的识别序列相连，以便将目的基因
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与载体相连。设计出的引物是
。
A．引物5'
TTGAATTCATGAGCGCCGCCACCCACTC
3'
﹣
﹣
B．引物5'
TTGAATTCTACTCGCGGCGGTGGGTGAG
3'
﹣
﹣
C．引物5'
TAGAGCTCCGGTGCTGCTGGGTTACCAC
3'
﹣
﹣
D．引物5'
TACTCGAGCGGTGCTGCTGGGTTACCAG
3'
﹣
﹣
（2）合成引物后，以
为模板进行PCR，为了确认是否扩增出了目的基因，可对扩增
产物进行
，取出凝胶置于紫外灯下观察照相，与DNAmarker（标准参照物）进行对比，切下
含目的基因片段的琼脂糖凝胶，通过试剂盒回收目的基因。
（3）用双酶切法分别处理回收的目的基因和pCEX
4TI
﹣
质粒，为了提高目的基因与表达质粒的连接效
率，需要排除
的干扰。
（4）用
处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能
的生理状态，
将构建好的重组质粒导入其中。为了筛选出工程菌，以便后期提取质粒，检测是否含有目的基因片段，
请写出工程菌的纯培养过程。
。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和
标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞
的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射
法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因
是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：（1）目的基因BAC3基因两侧没有合适的酶切位点，并确定内部不含有EcoRI、XhoI 限
制酶的识别序列，为防止目的基因被限制酶切开，故在设计引物时，应选择EcoRI、XhoI 限制酶与引物
的5'段进行连接。PCR 过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。A
选项中，GAATTC 为EcoRⅠ限制酶的识别位点，5'
ATGAGCGCCGCCACCCACTC
3'
﹣
﹣是以目的基因
BAC3 的互补链为模板合成的，A 符合题意；D 选项中，CTCGAG 为XhoⅠ限制酶的识别位点，5'﹣
CGGTGCTGCTGGGTTACCAG
3'
﹣是以目的基因BAC3 为模板合成的，D 符合题意。
故选：AD。
22
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（2）由题干“科研人员计划从质粒A 中获取BAG3 基因”可知，在合成引物后，以质粒A（含目的基
因的片段）为模板进行PCR，PCR 产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
（3）用双酶切法分别处理回收的目的基因和pCEX
4T1
﹣
质粒，由于酶切后的非目标片段也含有相同的
粘性末端，因此需要排除酶切后的非目标片段的干扰。
（4）将重组质粒导入受体细胞，一般需要用Ca2+处理大肠杆菌，形成感受态，使其处于一种能吸收周
围环境中DNA 分子的生理状态。pGEX
4T1
﹣
质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，为了检测重组质粒中是
否含有目的基因片段，可以将其在含有氨苄青霉素的固体培养基上培养，挑取单菌落接种到液体培养基
中扩增培养。
故答案为：
（1）AD
（2）质粒A 电泳
（3）酶切后的非目标片段
（4）Ca2+ 吸收周围环境中DNA 分子 在含有氨苄青霉素的固体培养基上培养，挑取单
菌落接种到液体培养基中扩增培养
【点评】本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作工具、操作步骤，掌
握各步骤中需要注意的细节问题，能结合所学的知识准确答题．
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