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考点49 基因工程的工具及操作程序
一、基因工程的基本工具
1. 限制性内切核酸酶（简称
）——分子手术刀
（1）存在：主要存在于
中。
（2）作用：识别
DNA 分子的特定
，并且使每一条链中特定部位的
断开。
（3）特点：具有
。
（4）结果：形成
或
。
原核生物容易受到自然界外源DNA 的入侵。限制酶作为一种防御工具，可切割外源DNA，使之失效，进行保证原核生物的
安全。
原核生物中不存在相应限制酶的识别序列或识别序列已被修饰，故限制酶不切割自身的DNA。
2. DNA 连接酶——分子缝合针
（1）作用：连接两个DNA 片段。
（2）主要种类：
①
：从大肠杆菌中分离得到，只能连接具有互补
的DNA 片段。
②
：从T4 噬菌体中分离出来，可以“缝合”双链DNA 片段互补的
和双链DNA 片段的
。
T4DNA 连接酶虽然两种末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。
（3）DNA 连接酶和限制酶的区别与联系
项目
类型
限制酶
DNA 连接酶
作用
使特定部位的磷酸二酯键
在DNA 片段之间重新
磷酸二酯键
应用
用于
目的基因和
载体
用于目的基因片段与载体的
1
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联系
3. 基因进入受体细胞的载体——分子运输车
（1）质粒：一种
、结构简单、独立于真核细胞
或原核细胞
之外，并
具有
能力的
双链DNA 分子。
（2）其他载体：
和
等。
（3）载体必需的条件（以质粒为例）
①有一个至多个
切割位点，供外源DNA 片段（基因）插入其中。
②能在受体细胞中进行
，或整合到
上，随受体DNA 同步复制。
③有特殊的
，便于重组DNA 分子的筛选。
易错提醒：
工具包括3 种：限制酶（限制性内切核酸酶）、DNA 连接酶、载体；工具酶包括2 种：限制酶（限制性内切核酸
酶）、DNA 连接酶。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
二、基因工程的基本操作程序
1. 目的基因的筛选与获取
（1）筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指
的基因，如Bt 抗虫蛋白基因。
②筛选方法：
a.从相关的已知
和
清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。如培育转基因抗虫棉中
用到的苏云金杆菌的Bt 抗虫蛋白基因。
b.通过构建基因文库来获取目的基因。
（2）利用PCR 获取和扩增目的基因
①PCR：即聚合酶链式反应，是一项根据
的原理，在体外提供参与DNA 复制的各种
组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
②条件
缓冲溶液
维持溶液的pH
DNA 母链
提供DNA 复制的模板
2 种引物
使DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
耐高温的DNA 聚合酶
催化合成DNA 子链
2
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4 种脱氧核苷酸
合成DNA 子链的原料
耐高温的DNA 聚合酶——Taq DNA 聚合酶。
③步骤
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链
复性
温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条
DNA 单链结合
延伸
72℃左右时，在耐高温的DNA 聚合酶的作用下，可使DNA
新链有5’端向3’端延伸
每次循环一般可以分为
三步。
目的基因的数量：目的基因的数量呈指数形式增长，扩增循环n 次，DNA 的数量约为2n。
仪器：PCR 扩增仪
PCR 产物鉴定：常用琼脂糖凝胶电泳。
2. 基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中
存在，并且
给下一代，同时使其能够
和
作用。
（2）基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子、复制原点以及标记基因等。
组成
功能
启动子
一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起
始位点，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出
mRNA。
终止子
一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的下游，使转录在所需
要的地方停下来。
标记基因
一般是抗生素抗性基因，还有发光基因、产生特定颜色的表达产物的
基因等，用来筛选、鉴别受体细胞是否含有目的基因。
（3）基因表达载体的构建模式图
3
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3. 将目的基因导入受体细胞
（1）导入植物细胞常用的方法
①
法
②
法
a.转化：
进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持
和
的过程。
b.农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的 （可转移
的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的
上。
c.原理：将目的基因插入
的
中，通过
的转化作用，使目的基因进入细胞。
d.转化过程
（2）导入动物细胞的方法
①受体细胞：
②常用方法：
③程序
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成具有
新性状的动物
（3）导入原核细胞的方法
4
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①方法：
②程序
4. 目的基因的检测与鉴定
（1）分子水平的检测
①检测目的基因是否插入或是转录出mRNA：
等技术。
②检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质：提取受体中的蛋白质，用相应的抗体进行
。
（2）个体生物学水平的鉴定
对目标性状进行鉴定，如进行
。如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt 基因是否赋予
了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
三、DNA 的粗提取与鉴定
1. 实验原理
（1）DNA 不溶于
，但某些蛋白质溶于
，利用这一原理，可初步分离DNA 与蛋白质。
（2）DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中
不同，它能溶于
的NaCl 溶液。
（3）DNA+
蓝色。
2. 实验步骤
【微点拨】
Ca2+处理细胞，使细胞膜的通透性发生改变。
5
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3. 实验注意事项
（1）破碎细胞应彻底、充分。
（2）酒精必须经过充分
后才能使用。
（3）实验过程中，搅拌时玻璃棒
直插烧杯底部，并且搅拌要
，并沿
搅拌以便
获得较完整的DNA 分子。
（4）将丝状物溶于2mol/L 的NaCl 溶液中时，需要不断搅拌以增加溶解的DNA 的量。
（5）二苯胺试剂要
，否则会影响鉴定的效果。
考法1 基因工程及基本操作程序
1. 对基因工程概念的理解
基因工程的别名
重组DNA 技术
操作对象
基因
操作水平
分子水平
原理
基因重组
【微点拨】
研磨液中的部分成分及功能
1. SDS（十二烷基硫酸钠）：可使细胞核内的蛋白质变性与DNA 分离。
2. EDTA（乙二胺四乙酸）：一种DNA 酶抑制剂，防止细胞破碎后DNA 酶降解DNA。
3. Tris（三羟甲基氨基甲烷）：提供使DNA 呈稳定状态的缓冲体系。
提取DNA：玻璃棒上卷着的丝状物是用冷却的酒精析出的DNA。
6
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优点
能克服远缘杂交不亲和的障碍，能定向改造生物性状
2. 几组概念的辨析
（1）黏性末端和平末端
（2）限制酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶等相关酶的分析比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA 切开
DNA 连接酶
磷酸二酯键
DNA 片段
将两个DNA 片段连接为一个DNA 分子
DNA 聚合酶或耐高
温的DNA 聚合酶
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA 单链3’末端
DNA（水解）酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA 片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA 分子局部解旋为单链
RNA 聚合酶
磷酸二酯键和氢键
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到单链RNA3’端
3. 关于限制酶的分析
（1）切割目的基因和载体时用同种限制酶的原因：产生相同的黏性末端。也可用不同的限制酶切割，但
产生的黏性末端必须互补。
（2）作为载体必须具有多个限制酶切位点，而且每种酶的切点最好只有一个，原因是一种限制酶一般只
能识别单一酶切位点，若载体上有一个以上的同种酶切位点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的
片段含复制原点，则基因表达载体进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有限制酶的一个酶切位
点，则酶切后既能把环打开以接纳外源DNA 片段，又不会丢失自己的片段。
（3）要获取一个目的基因，需用限制酶剪切目的基因的两端，共产生4 个黏性末端或平末端。
（4）限制酶的选择依据
①根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
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a. 应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，可选择图中的Pst I。
b. 不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，故不能选择图中的Sma I。
c. 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因及质粒，如图中的
Pst I 和EcoR I。
②根据质粒的特点确定限制酶的种类
③根据Ti 质粒的T-DNA 片段确定限制酶的种类（设切割目的基因的限制酶为Xba I 和Sac I）
图中甲、乙、丁Ti 质粒均不宜选取，而丙Ti 质粒宜选取。
【典例1】（2023•云南二模）下列有关重组DNA 技术的基本工具的叙述，正确的是（ ）
A．限制酶能够识别RNA 分子的特定核苷酸序列
B．携带外源DNA 片段的质粒可在受体细胞中进行复制
C．DNA 连接酶不能连接双链DNA 片段的平末端
D．DNA 连接酶能连接DNA 分子双链碱基对之间的氢键
【典例2】（2023•古冶区校级一模）载体是基因工程中携带外源DNA 片段（目的基因）进入受体细胞的重
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要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。如图是利用细菌生产人胰岛素的基本
流程示意图，下列相关叙述正确的是（ ）
A．重组载体A、重组载体B 分别是基因表达载体和基因克隆载体
B．载体A 和载体B 都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间
D．培养细菌A 和细菌B 的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
【典例3】（2023•厦门模拟）如表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置（箭头所指），下
列叙述正确的是（ ）
限制酶种类
序列及切点
限制酶种类
序列及切点
①：EcoRⅠ
5′
G↓AATTC
3′
﹣
﹣
3′
CTTAA↑G
5′
﹣
﹣
③：BglⅡ
5′
A↓GATCT
3′
﹣
﹣
3′
TCTAG↑A
5′
﹣
﹣
②：BamHⅠ
5′
G↓GATCC
3′
﹣
﹣
3′
CCTAG↑G
5′
﹣
﹣
④：NotⅠ
5′
GC↓GGCCGC
3′
﹣
﹣
3′
CGCCGG↑CG
3′
﹣
﹣
A．①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端
B．①切出的DNA 片段，只有用E.coli 连接酶才能连接起来
C．②、③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割
D．构建基因表达载体时，用②、③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接
【典例4】（2023•杭州模拟）研究人员用EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ两种限制酶处理某DNA 分子，图1 为EcoR Ⅰ
切割该DNA 分子后的结果；图2 是酶切后的凝胶电泳图谱，其中1 号泳道是DNA Marker，2 号、3 号、4
号分别是EcoR Ⅰ单独处理、Sma Ⅰ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（
）
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A．据图1 可知EcoR Ⅰ的识别序列为﹣GAATTC﹣，切割位点在G 和A 之间
B．据图2 可知琼脂糖凝胶的加样孔在B 端，且连着电泳槽的负极
C．据图2 可知该DNA 分子最可能是含1000 个碱基对的环状DNA
D．据图2 可知该DNA 分子中两种限制酶的酶切位点各有一个
【典例5】（2023•福建模拟）2022 年1 月7 日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57 岁的心脏病患
者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2 个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低
免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9 技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9 系统主要由
向导RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，sgRNA 可引导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制
如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．若要对一个基因进行编辑，则通常至少需要设计两个序列不同的sgRNA
B．sgRNA 可以特异性识别目标DNA 分子，Cas9 蛋白作用于磷酸二酯键
C．有时sgRNA 会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA 序列越短，脱靶率越低
D．为降低免疫排斥反应，可通过CRISPR/Cas9 技术敲除相关抗原蛋白基因
【典例6】（2023•南充模拟）大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程、细胞工程等现代生物技术，培
育出了铁含量比普通水稻高60%的转基因水稻，改良了大米的营养品质。如图为培育转基因水稻过程示意
图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ，HindⅢ，BamHⅠ为限制酶。
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（1）完成图中①过程需选用
限制酶处理Ti 质粒和含目的基因的DNA。
（2）②过程中用
处理农杆菌，使其成为感受态细胞。农杆菌转化法的原理是：在农杆菌的
Ti 质粒上存在
片段，它具有可以整合到受体细胞
上的特点，使目的基因进入
植物细胞并稳定存在和表达。为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1 号培养基需要加入
。
（3）图中
过程，属于植物组织培养技术，该技术依据的基本原理（理论基础）是
。
【变式1】（2023•平度市模拟）北极比目鱼体内有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11 个氨基酸的重复序
列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图。下列有关叙述
错误的是（ ）
A．过程①获取的目的基因含有启动子和终止子
B．过程②涉及磷酸二酯键的断裂与形成
C．农杆菌Ti 质粒中T
DNA
﹣
可将抗冻基因导入番茄细胞
D．抗冻番茄植株中抗冻基因与比目鱼体内抗冻基因碱基序列可能不同
【变式2】（2023•辽宁二模）为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因
数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小为0.9kb（1kb＝1000 碱基对），利用大
肠杆菌表达该蛋白。图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点如表，phb2 基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物
经电泳分离，结果如图2。下列叙述错误的是（ ）
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相关限制酶的识别序列及切割位点（注：箭头表示切割位点）
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTTTTCGA↑A
EcoRⅠ
G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTGGTC↑GAC
PstⅠ
GA↑CGTCGA↑CGTC
KpnⅠ
G↓GATCCCCATG↑G
BamHⅠ
G↓GATCCCCTAG↑G
A．需设计特异性的引物通过PCR 技术扩增phb2 基因
B．为使phb2 基因与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的
识别序列
C．经过两种限制酶酶切的phb2 基因与载体进行连接时，可选用T4DNA 连接酶
D．图2 中3 号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒
31．（2023•广东二模）二倍体马铃薯受核糖核酸酶基因（S
RNase
﹣
）影响，普遍存在自交不亲和的现象
一一自交不产生种子，我国科研人员通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除了马铃薯的S
RNase
﹣
基因，
获得自交亲和的二倍体马铃薯如图示该技术的原理：由一条单链向导RNA 引导内切核酸酶Cas9 蛋白到
一个特定的基因位点进行切割。下列叙述错误的是（ ）
A．向导RNA 和S
RNase
﹣
基因识别结合的碱基互补配对方式与目标DNA 双链中的碱基互补配对方式
相同
B．Cas9 蛋白可催化磷酸二酯键水解，剪切特定DNA 片段
C．可让马铃薯自交看能否产生种子，从个体水平上检测该基因编辑技术是否成功
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D．向导RNA 的序列越短，该基因编辑技术在编辑对象时出错的概率就越高
33．（2023•通许县三模）研究表明，服用α﹣干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。
人参是一种名贵药材，具有较好的滋补作用。限制酶的发现为DNA 的切割和功能基因的获得创造了条
件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。
含干扰素基因的DNA 片段如图1 所示，图2 为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程
图，①～④表示相关的操作。请回答下列问题：
（1）结合上图，在构建基因表达载体时，为克服目的基因和农杆菌Ti 质粒的自身环化以及目的基因与
质粒的任意连接等，应选择用限制酶
处理含某目的基因的DNA 和质粒。
（2）DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是
。
（3）图2 操作①常利用PCR 技术获取和扩增干扰素基因，除含有干扰素基因的DNA 片段之外，该过
程需要提供
以及与干扰素基因两端两条模板链结合的两种
引物。设计引物时，为了保证目的基因与质粒顺利连接，防止出现自身环化连接，需要在两种引物的一
端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列
。
（4）图2 步骤②除EcoRⅠ、BamHⅠ两种酶外，还需要用
酶。构建的基因表达载体除含
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有目的基因片段以外，还必须有
，以保证干扰素基因能在人参愈伤组织细胞中稳定
存在和表达。同时，还应含有标记基因以便于
。
（5）图2 操作④常用
技术检测干扰素基因是否成功表达出干扰素。
考法2 （实验）DNA 的粗提取与鉴定
【典例1】（2023•上虞区模拟）关于“DNA 的粗提取和鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．研磨时倒入的研磨液，是为了破坏细胞壁
B．离心研磨液是为了加速DNA 的沉淀
C．在DNA 提取物中加入二苯胺，迅速呈现蓝色
D．提取DNA 时要用玻璃棒沿一个方向缓缓搅动
【变式1】（2023•山东模拟）下列与DNA 粗提取和鉴定有关的叙述，错误的是（ ）
A．预冷的酒精容易使DNA 析出
B．DNA 能溶于2mol/L 的NaCl 溶液中
C．若提取出白色丝状物，说明DNA 中杂质少
D．可用碱性染料甲紫鉴定提取出来的DNA
考法3 PCR 的基本操作和应用
1. 物质条件
（1）引物：PCR 所用的引物是一小段单链RNA 或单链DNA，它能与DNA 母链的一段碱基序列互补配
对。DNA 复制之所以需要引物，是因为DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3’端延伸
DNA 链。PCR 的引物通常由20~30 个核苷酸聚合而成，引物的量需保证满足几十次循环反应的需要。
（2）DNA 聚合酶：PCR 中所用的酶是一种从嗜热菌中分离得到的耐高温的DNA 聚合酶，高温条件下不
会失活。反应体系中加入Mg2+，可以使酶催化的活化能更加降低，使得反应能够进行得更加容易。
2. PCR 扩增与DNA 复制的比较
PCR 扩增
DNA 复制
不
同
点
场所
在体外的反应缓冲液中进行
在体内的活细胞内进行
解旋方式
高温变性解聚
解旋酶解旋
扩增过程
完全解聚再复制，分为变性、复性（或退火）
和延伸三个步骤
边解旋边复制
引物
DNA 或RNA
RNA
结果
短时间内形成大量的DNA 片段
形成的是整个DNA 分子
相同点
①都需要DNA 模板、DNA 聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸等成分；
②都遵循碱基互补配对原则，有解聚和延伸过程，子链延伸的方向都是从5’端到3’端；
③都属于半保留复制；
④结果都使DNA 数量呈2n的指数式扩增
3. PCR 的应用
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（1）分析人的血液，对细菌、病毒感染情况进行早期诊断。
（2）用于遗传病的基因诊断与基因治疗。
（3）用于鉴别犯罪嫌疑人、亲子鉴定。
（4）分析生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。
（5）检测目的基因是否已经插入目标生物染色体DNA 和目的基因是否转录出mRNA。
（6）PCR 产物的电泳鉴定：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
①电泳概念：DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场
作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
②电泳原理：在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。
【典例1】（2023•沧县校级模拟）基于聚合酶制造的PCR 仪实际上是一个温控设备，能在变性温度、复性
温度、延伸温度之间很好地进行切换，主要过程如图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A．实施上述过程的前提是已知目的基因的一段核苷酸序列
B．图中a、b、c 过程控制的温度由高到低依次是过程a、c、b
C．耐高温的DNA 聚合酶沿着5'→3'的方向合成互补子链
D．c 延伸过程中需要缓冲溶液、ATP 和四种核糖核苷酸
【典例2】（2023•肥城市模拟）通过设计引物，运用PCR 技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因
工程中获取突变基因的过程，其中引物1 序列中含有一个碱基T 不能与目的基因片段配对，但不影响引物
与模板链的整体配对，反应体系中引物1 和引物2 的5′端分别设计增加限制酶a 和限制酶b 的识别位点。
有关叙述正确的是（ ）
A．在PCR 反应体系中还需要加入4 种游离核苷酸、解旋酶、Taq 酶等
B．第2 轮PCR，引物1 能与图中②结合并且形成两条链等长的突变
基因
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入运载体
D．第3 轮PCR 结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA 占
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【典例3】（2023•湖北模拟）乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质
和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因
（L
PG
﹣
），可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如图所示。下列说法不正确的是（ ）
A．可借助序列数据库（GenBank）等查询L
PG
﹣
基因的序列和功能
B．可以利用PCR 技术筛选导入了L
PG
﹣
基因的受体细胞
C．酵母菌PD 基因被替换为L
PG
﹣
基因的过程中发生了基因重组
D．电泳鉴定L
PG
﹣
基因时，当观察到核酸染料迁移至凝胶边缘时，停止电泳
【典例4】（2023•博白县模拟）细菌病的防治一直是困扰人类的难题之一，特别是长期使用抗生素，许多
细菌产生了明显的耐药性。通过基因工程和胚胎工程生产抗菌肽，是研制新型抗菌药物的有效途径。回答
下列问题：
（1）生产抗菌肽所需的抗菌肽基因，可用
技术大量扩增。扩增过程中需要将温度冷却至55～
60℃，这步叫复性，目的是
。获得大量抗菌肽基因后，为了使其和
质粒能正确地成功拼接，一般操作方法是用
切割含抗菌肽基因的DNA
片段和质粒。
（2）抗菌肽基因导入受体细胞后，可利用放射性同位素标记的目的基因的DNA 片段作为
，
目的是检测
。
（3）一般科学家将抗菌肽基因导入受精卵，以培育出能产生抗菌肽的转基因动物，请分析选择受精卵
作为受体细胞的原因是
。
（4）受精卵在体外培养到早期胚胎过程中，需用
培养液培养。早期胚胎发育到适宜的时期再
将胚胎移植到代孕母体的子宫里，用这种方法得到的动物称为
（填“克隆动物”或
“试管动物”）。
【变式1】（2023•厦门模拟）如图表示PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，
L、R 表示方向。下列叙述正确的是（ ）
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A．②链从L 到R 的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B．PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C．以1 个DNA 为模板经 3 次循环需消耗8 个引物③
D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经2 次循环才可获得该序列的双链产物
【变式2】（2023•滨州二模）巢式PCR 是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目
的基因大的DNA 片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩
增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．PCR 反应缓冲液中Mg2+的作用是激活DNA 聚合酶
B．与传统PCR 相比，巢式PCR 能有效提高产物中目的基因的比例
C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
【变式3】（2023•大东区校级四模）单分子荧光测序技术原理如图所示。某种脱氧核糖核苷三磷酸
（dNTP）提供一个相应的脱氧核苷酸连接到DNA 子链上的同时，会产生一分子的焦磷酸（PPi），一分子
的PPi 可以通过一系列反应使荧光素发出一次荧光，通过检测荧光的有无可推测模板链上相应位点的碱基
种类。下列说法错误的是（ ）
A．测序过程中dNTP 可以为反应提供能量
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B．单分子荧光测序需要在DNA 复制过程中进行
C．测序时需要在反应体系中同时加入4 种dNTP
D．利用该技术测序时可能会连续多次出现荧光现象
【变式4】（2023•苏州三模）为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。
科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系，为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐盐
基因（RST1）编码链首端到末端（其中一条链）的序列为5'
ATCTACGCGCTCATCCG...
﹣
（省略3n 个核
苷酸序列）…CGCAGCAATGAGTAGCG
3'
﹣。如图1 为构建重组质粒的过程示意图，BamHⅠ、BclⅠ、
SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶（四种酶的识别序列详见表）。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
SmaⅠ
Sau3AⅠ
识别序列及切割位点（5′→3′）
G↓GATCC
T↓GATCA
CCC↓GGG
↓GATC
（1）为获取更多RST1 基因，可通过PCR 扩增，在反应体系中加入引物的作用是
。某同学设计了如下六种PCR 引物，
其中可选用的引物是
（选填序号）。
①5'
GACTACTCGCGCATCTA
3'
﹣
﹣
②5'
ATCTACGCGCTCATCCG
3'
﹣
﹣
③5'
GCGATGAGTAACGACGC
3'
﹣
﹣
④5'
CGCTACTCATTGCTGCG
3'
﹣
﹣
⑤5'
TAGATGCGCGAGTAGGC
3'
﹣
﹣
⑥5'
CGCAGCAATGAGTAGCG
3'
﹣
﹣
（2）若PCR 反应未得到任何扩增产物，主要原因有
（选填序号）。
①退火温度过高 ②Taq 酶失活 ③设计的引物过短 ④变性温度过低 ⑤模板受到污染 ⑥Mg2+浓度
过低
（3）为将图中质粒A 和RST1 基因正确连接构建重组质粒B，设计RST1 基因的引物时，在两种引物的
5'端分别添加
酶的识别序列，选用
酶切割质粒A，酶切后的
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载体和目的基因片段通过
酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体
细胞，应首先在筛选平板培养基添加
，再将平板上长出的菌落通过影印接种法（盖章）接种
到添加
的平板培养基上继续培养观察。
（4）从平板上长出的菌落若提取重组质粒B 利用Sau3AI 进行酶切，最多可以得到
种大小不同的
DNA 片段。
（5）图2 是对重组质粒测序的部分序列，若目的基因与质粒正确连接（启动子顺时针转录），则图中
连接处的序列正确的是
（填序列编号）。
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