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重难点10 基因工程中的3 个必考命题角度
目录
1.命题趋势：明考情知方向
2.重难诠释：知重难、掌技巧、攻薄弱
（1）酶切问题
（2）PCR 及引物的选择
（3）目的基因导入及表达的检测
3.创新情境练：知情境练突破
4.限时提升练：（30min）综合能力提升
考点
历年考情分析
2025 考向预测
酶切问题
2021 辽宁：探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫颈癌
细胞增殖的原因考察对限制酶的选择
①命题情境:以最新研究成果为载
体，综合考查基因工程的工具与
操作步骤等。
②命题形式:考查形式多样既有单
独考查，又有结合其他知识的综
合考查，如与遗传规律、微生物
的培养、细胞工程、胚胎工程等
联系起来，综合考查考生解决实
际问题的能力
PCR 及引物的选择
2022 辽宁：PCR 的过程
2024 黑吉辽：琼脂糖凝胶电泳和PCR
2023 辽宁：借助PCR 改造淀粉酶基因考察引物
的选择
2024 黑吉辽：将天然Ti 质粒改造，转入农杆
菌，提高转化效率考察引物的选择
目的基因导入及表
达的检测
2023 辽宁：计算导入目的基因的质粒长度确定
导入目的基因的大肠杆菌
2024 黑吉辽：选择标记基因初步筛选转化的棉
花愈伤组织。
1.图解限制酶的选择依据
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstI
1
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②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaI。
③为避免目的基因与质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因
和质粒，如图甲也可选择用PstI 和EcoRI 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位
点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶一般要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如
图乙中限制酶 SmaI 会破坏标记基因;如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢
失某些片段,若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进人受体细胞后不能自主复制。
2.PCR 中引物的设计要求
引物的作用
使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA 链，同时限定了制区
域
设计两种引物的原因
基因的两条链都作为模板,其碱基序列不同,且 DNA 聚合酶只能从
3'端延伸子链,用两种引物才能确保 DNA 的两条链同时被扩增
引物长度
用于PCR 的引物长度通常为20~30 个核苷酸。若引物过短,则引物与
模板链结合的特异性较差
其他要求
(1)每种引物内部不能发生过多的局部碱基互补配对,否则会导致自身
折叠;
(2)两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,否则会导致引物二聚
体产生
引物中设计限制酶的
酶切位点
为了便于扩增的DNA 片段与表达载体连接,可在引物的5'端加上限制
酶的酶切位点,且常在两种引物上设计不同的酶切位点,主要目的是保
证目的基因与载体的正向连接
3.目的基因导入及表达的检测
（1）目的基因导入不同受体细胞的方法
A.目的基因导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法
B.目的基因导入动物受精卵：显微注射法
C.目的基因导入大肠杆菌：Ca2+处理法
（2）图解法记忆目的基因的检测与鉴定
2
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（建议用时：15 分钟）
1．（酶切问题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN 基
因，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN 疫苗。根据所学知识回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如下图所示。其中GtP 为启动子，其作用是 。
若需实现r2HN 仅在水稻胚乳中表达，GtP 应为 的启动子。图中Nos 为终止子，已知r2HN 基因
内部不含载体的限制酶识别位点，可选择限制酶 对r2HN 基因与载体进行酶切，用于表达载
体的构建。
2．（PCR 及引物的选择）研究发现，若将第52 位的脯氨酸（密码子为 CCA）替换成苏氨酸（密码子为
ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1 所示，箭头下方
的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过
程如图2 所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2 所使用的引物组合
为（ ）
3
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A．引物1 和引物4
B．引物2 和引物6
C．引物2 和引物4
D．引物3 和引物5
3．（新趋势·遗传与基因工程融合命题）亚洲玉米螟、黏虫是造成我国玉米减产的主要害虫。我国科研
人员通过图示过程将Bt 基因（能够控制合成 Bt 毒蛋白）转入玉米细胞培育出了抗虫转基因玉米。回答下
列问题：
(1)利用基因工程培育作物新品种时，常采用Ti 质粒作为载体，主要优点在于 。
(2)据图分析，为确保目的基因能够与 Ti 质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti 质粒，科研人员应选
用限制酶 切割Ti 质粒和含 Bt 基因的 DNA 片段。在获得重组Ti 质粒后，可将其加入经
处理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 成为转基因玉米植株。
(3)为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员首先利用 法检测Bt 基因是否成功翻译；在进行个
体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，
多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3：1 和
15：1 两种情况。出现15：1 的原因是 。
(4)某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，
棉铃虫并没有被杀死，这说明 。为此，科学家对棉花植株中的Bt 毒蛋白基因进行了修饰，结果
食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt 毒蛋白基因的修饰属于 。
4
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（建议用时：30 分钟）
一、单选题
1．（2024 年新课标高考生物真题辽宁卷）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确
的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
2．（2022 年新教材辽宁生物高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为
给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的
是（ ）
A．预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
3．（2025 届黑龙江省大庆市高三第一次教质量检测（一模））双脱氧末端终止测序法（Sanger 法）是第
一代DNA 测序方法。在4 支试管中分别加入4 种dNTP 和1 种ddNTP 进行PCR，PCR 产物变性后利用电
泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA 模板链
的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
5
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注：双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP 四种；脱氧核苷三磷酸（dNTP，
PCR 的原料）有dATP、dGTP、dTTP、dCTP 四种。在DNA 聚合酶作用下，ddNTP 与dNTP 竞争核苷酸链
延长位点，若连接上的是ddNTP，子链延伸终止；若连接上的是dNTP，子链延伸继续。
A．PCR 过程中遵循碱基互补配对原则
B．沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小
C．对照个体DNA 模板链序列为5′-CTACCCGTGAT-3′
D．患者该段序列中某位点的碱基G 突变为A
4．（2024 届辽宁省沈阳市第二中学高三下学期第四次模拟考试）S 基因与作物甜度相关，可用于培育转S
基因作物新品系。已知S 基因转录的模板链位于b 链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5’→3’。如下图，
为使S 基因按正确方向与质粒连接，酶切目的基因时选用的限制酶组合是（ ）
A．BamHⅠ和HindⅢ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．MunI 和BamHⅠ
D．EcoRⅠ和HindⅢ
二、多选题
5．（辽宁省本溪满族自治县高级中学2023-2024 学年高三2 月月考）基因工程在社会生产、生活及科研等
方面有着广泛的应用。运用基因工程技术可培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，培养出具
有特殊用途的动、植物，还可应用于生产药物和器官等。如图所示为利用基因工程培育出转基因鱼、转基
因牛、抗虫棉等的过程。下列相关叙述正确的是（ ）
6
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A．应用①中，药用蛋白基因需与乳腺蛋白基因的启动子共同构建表达载体
B．应用②中，可通过PCR 技术检测棉花的染色体DNA 上是否插入抗虫基因
C．应用③中，将生长激素基因导入鲤鱼受精卵最常用的方法是农杆菌转化法
D．应用④中，调节因子的作用可能是调控猪的某些器官组织细胞的抗原不表达
6．（2024 届辽宁省沈阳市第二中学高三下学期第五次模拟考试）下图为基因工程部分操作步骤，质粒的
外侧链为a 链，内侧链为b 链。基因Ampr转录的模板链属于a 链的片段。ALDH2 基因编码区首端到末端
（其中一条链）的序列为5′-ATCCATGCGCTC…（中间核苷酸序列）…CAGTGAGTAGCG-3′。四种限制酶
的识别序列及切割位点见下表。以下说法正确的是（ ）
注：Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因
限制酶
BamHI
PstI
XhoI
XbaI
识别序列和切割位点（5′→3′）
G↓GATCC
C↓TGCAG
C↓TCGAG
T↓CTAGA
A．质粒复制的模板链是“a 和b”，基因Tetr转录的模板链是b 链的片段
B．过程③需是基因工程的核心步骤，过程④的培养基具有选择性
C．为扩增目的基因，需选择的引物对为：5′-TCTAGACGCTACTCACTG-3′和5′-
GGATCCATCCATGCGCTC-3′
D．根据选定的引物，经过5 次循环，即可获得32 个符合要求的目的基因
7．（2024 届辽宁省鞍山市第一中学高三下学期八模）将编码四种不同酶的基因OsGLO1、EcCAT、
EcGCL 和TSR 与叶绿体转运肽基因连接，搭载到农杆菌Ti 质粒的T-DNA 片段构建多基因表达载体，最终
在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法错误的是（ ）
7
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A．图中表达载体中的T-DNA 插入外源基因后将失去侵染能力
B．四种基因最终都在水稻叶绿体内进行转录、翻译
C．应选用含潮霉素和卡那霉素的培养基共同筛选转化成功的水稻细胞
D．可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量
8．（2024 届吉林省长春市东北师范大学附属中学高三下学期第六次模拟考试）“DNA 粗提取与鉴定”的
操作步骤为研磨→去杂→析出→鉴定。某研究组欲探究不同去杂方法对实验结果的影响（如下表）。下列
叙述正确的是（ ）
去杂质方式
沉淀质量（g）
DNA 浓度（ng·μL-1）
OD260/OD280
二苯胺鉴定
离心
0.0680
81.50
1.53
蓝色
4℃冰箱静置
0.1028
336.4
1.41
蓝色
注：OD260与OD280的比值可检查DNA 纯度；纯DNA 的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比
值会明显降低。
A．猪肝、菜花、草莓均可作为提取DNA 的材料
B．对研磨液进行离心的目的是加速DNA 的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．析出时的离心转速明显高于去杂质时
9．（2024 年辽宁高考生物学冲刺押题卷（四））反转录PCR 又称逆转录PCR（RT－PCR），是以mRNA
为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述正确的是（ ）
A．过程①除图示条件外还需反转录酶和扩增缓冲液等
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B．过程②形成的双链cDNA 中含外显子和内含子等片段
C．过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸
D．RT－PCR 技术可应用于是否被RNA 病毒感染的检测
三、非选择题
10．（2024 年新课标高考生物真题辽宁卷）将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒（辅助T-DNA
转移）和不含有Vir 基因、含有T-DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密
码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3 表示引物；T-DNA-LB 表示左边界；T-DNA-RB 表示右边界；Ori 表示复制原点；KanR
表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷
酒精，其目的是 。
(2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。
(3)穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其目的可能
是 。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛选转化
的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
和 。
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(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C．将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
11．（2023 年新高考辽宁卷高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助
PCR 改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。
回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
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(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
12．（2021 年新高考辽宁生物高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2
蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基
因），大小为0．9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR 反
应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入 和
两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，可选用 （填
“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
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注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞周期
（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是
将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
13．（辽宁省朝阳市建平县高级中学2024-2025 学年高三上学期月考）双乙酰是一种啤酒发酵过程中的产
物，它的浓度过高会影响啤酒的风味和口感。研究发现给啤酒酵母导入Y 基因后会减少啤酒酵母双乙酰的
生成，进而缩短啤酒的发酵周期，改善啤酒的风味和口感。图1 表示Y 基因所在的DNA 上的限制酶识别
位点，箭头表示Y 基因的转录方向。图2 表示构建表达载体时所用到的质粒。请回答下列问题：
(1)PCR 技术中引物的作用是 ，分析图1 要扩增Y 基因应选择的引物组合是 。
(2)结合图1 和图2，构建表达载体时应选择的限制酶组合是 ，不选择EcoRI 酶的原因是
。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，所以质粒上的尿嘧啶合成基因常作 ，用于重组质粒的筛选。
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在缺乏尿嘧啶的培养基上生长的酵母菌一定是含有Y 基因的酵母菌吗？ ，原因是：
。
(4)转基因成功后的酵母菌还需要借助发酵工程来生产啤酒，发酵工程的中心环节是 ，需要严
格控制 等发酵条件。
(5)啤酒发酵过程分为 和后发酵两个阶段，前者发酵过程中要适时往外排气，原因是
。
14．（黑龙江省大庆市石油高级中学2024-2025 高三上学期期中考试）RDX 是某种军用弹药使用后残留的
危险污染物。研究人员将源于细菌的RDX 降解酶基因XplA 和XplB 插入柳枝稷草染色体中，让转基因植
物修复军用弹药RDX 污染的土壤。基因XplA 和XplB 与引物结合位点及模板链分布情况如图1 所示。图2
为筛选含融合基因表达载体的农杆菌的示意图。回答下列问题：
(1)对细菌DNA 进行PCR 扩增时，需要先设计引物且引物的 （填“5'”或“3”）端要有限制酶的识
别序列。在PCR 的反应体系中，引物的作用是 。
(2)据图分析，将基因XplA 和XplB 拼接成融合基因时，基因XplA 的a 链的3′端与基因XplB 的
（填“a 链”或“b 链”）的5'端相连，理由是 。
(3)将融合基因与农杆菌Ti 质粒的T-DNA 重组，构建基因表达载体。用Ca2+处理农杆菌后使其处于
的状态，将其与基因表达载体混合一段时间，再接种到添加潮霉素的培养基中进行培养，培养基中添加潮
霉素的作用是 。
(4)用上述农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解
RDX 物质，原因是 。
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