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题型16 CRISPRCas9 基因组编辑技术
一、单选题
1．CRISPR/Cas9 系统是一种基因组编辑技术，Cas9 蛋白能与人工设计的sgRNA 形成复合
体（如图），利用该技术可以对DNA 进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是（
）
A．Cas9 蛋白能切割目的基因的磷酸二酯键，使DNA 双链断裂
B．对不同的目的基因进行编辑时可能使用相同的Cas9 蛋白和sgRNA
C．基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D．通过基因组编辑技术引起的变异属于基因重组
2．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引
导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
A．Cas9 蛋白相当于限制酶，切割特定基因位点的脱氧核糖和碱基之间的化学键
B．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
C．CRISPR/Cas9 基因编辑技术有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，一般
SgRNA 序列越长，脱靶率越低
D．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和相同的sgRNA 进行基因编辑
3．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引
导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
1
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A．Cas9 蛋白相当于限制酶，切割特定基因位点的脱氧核糖和碱基之间的化学键
B．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
C．CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，一般
SgRNA 序列越短，脱靶率越低
D．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和不同的sgRNA 进行基因编辑
4．CRISPR/Cas9 是一种生物学工具，能够通过“剪切和连接”脱氧核糖核酸（DNA）序
列的机制来编辑基因组。这套系统源自细菌的防御机制，是一种对任何生物基因组均有效
的基因编辑工具。CRISPR/Cas9 基因组编辑系统由向导RNA（也叫sgRNA）和Cas9 蛋白
组成，向导RNA 识别并结合靶基因DNA．Cas9 蛋白切断双链DNA 使其形成两个末端。
这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基
因敲除，如图所示。CRISPR/Cas9 基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶。下列叙
述正确的是（ ）
A．Cas9 蛋白能作用于脱氧核糖和碱基之间的化学键
B．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和相同的sgRNA 进行基因编辑
C．CRISPR/Cas9 基因组编辑系统使细菌获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力
D．其他DNA 序列含有与 sgRNA 互补配对的序列，会造成 sgRNA 错误结合而脱靶
5．CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一把“分子剪
刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基
因。CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示，下列分析正确的是（ ）
2
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A．构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要插入到质粒的启动子上游
B．SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后，其功能类似于DNA 聚合酶
C．根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标DNA 的定点切割
D．CRISPR/Cas9 识别目标DNA 序列主要与Cas9 蛋白的特异性相关
6．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引
导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
A．SgRNA 通过碱基互补配对原则识别目标DNA 分子，Cas9 蛋白的功能与DNA 连接
酶相似
B．若要利用CRISPR/Cas9 技术将一个基因从目标DNA 分子上去除，通常需设计两个
序列不同的SgRNA
C．CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，一般
SgRNA 序列越短，脱靶率越低
D．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
7．采用CRISPR／Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入受
精卵的Y 染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠体外受精后，
通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
A．该转基因小鼠的精子与野生型雌性小鼠的卵母细胞要分别进行成熟培养和获能处理
B．可观察到绿色荧光的胚胎应为雄性小鼠胚胎
3
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C．早期胚胎通过胚胎分割这一无性繁殖技术可获得更多遗传性状相同的个体
D．分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
8．CRISPR／Cas13d 技术是一项新兴的RNA 编辑技术，该技术以一条单链向导RNA
（gRNA）引导Cas13d 蛋白在一个特定的基因位点对RNA 进行切割。研究人员设计出的若
干个gRNA 能分别定点切割新冠病毒RNA 基因组的不同基因（如图所示），但不影响人体
细胞的RNA。下列叙述正确的是（ ）
A．gRNA 分子中，相邻碱基之间有1 个核糖和1 个磷酸基团
B．gRNA 与病毒基因间的碱基配对方式有A—T、U—A、G—C 三种
C．CRISPR／Cas13d 可能借助gRNA 与Cas13d 的特异性实现对RNA 的定点切割
D．新冠病毒不同RNA 片段的差别在于脱氧核苷酸的数量和排列顺序
9．在一项新的研究中，研究人员展示了他们如何通过使用CRISPR/dCas9 基因组编辑技术，
在体外培养的小鼠和人类细胞中，成功去除特定基因的DNA 甲基化，并分析了几个人类
和小鼠基因中不同区域去甲基化的转录后果，研究表明近端启动子上的DNA 去甲基化在
某些情况下会增加基因的表达。下列说法错误的是（ ）
A．CRISPR/dCas9 基因组编辑技术对基因进行碱基的敲除和加入会引起基因重组
B．CRISPR/dCas9 基因组编辑技术有助于研究基因缺失对细胞分化的影响
C．DNA 甲基化后可能干扰了RNA 聚合酶与启动子的识别和结合
D．被甲基化的DNA 片段中遗传信息未发生改变
10．美国纽约大学朗格尼健康中心日前实施了一台特殊的肾移植手术，医生成功将一头转
基因猪（通过基因编辑技术敲除α-Gal 基因）的肾脏移植到人体，且随后3 天里均未发生
排异现象，病人体内的一些指标也降至正常水平。CRISPR/Cas9 系统是目前最常用的一种
基因编辑工具，该系统由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白组成，由SgRNA 引导Cas9 蛋
白在特定的基因位点进行切割完成基因编辑过程，其原理如图所示。下列相关叙述中，错
误的是（ ）
A．通常选择受精卵作为受体细胞，是因为受精卵体积大容易操作
4
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B．将Cas9-SgRNA 复合体注入受体细胞的常用方法是显微注射法
C．推测Cas9 蛋白与限制性核酸内切酶具有相似的功能
D．转基因猪的培育过程还需要用到胚胎移植等现代生物技术
11．CRISPR/Cas9 基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑，其原理是由一条单链
向导RNA 引导Cas9 蛋白到一个特定的基因位点对特定的DNA 序列进行切割。通过设计向
导RNA 中20 个碱基的识别序列，Cas9 蛋白可人为选择DNA 上的目标位点进行切割。下
列相关叙述错误的是（ ）
A．Cas9 蛋白具有限制酶的特性
B．Cas9 蛋白借助向导RNA 对目标分子进行定位依赖于碱基互补配对
C．对不同目标基因进行编辑时可能使用相同的Cas9 蛋白和向导RNA
D．Cas9 蛋白切割的位点是氢键
12．2020 年的诺贝尔化学奖授予了两位在基因组编辑技术（如CRISPR/Cas）领域作出杰
出贡献的女科学家。这项技术的问世源自于人们在本世纪初对细菌抵御噬菌体的机理研究：
不少的细菌第一次被特定的噬菌体感染后，由细菌Cas2 基因表达的Cas2 核酸内切酶（蛋
白质）便会随机低效切断入侵的噬菌体DNA 双链，并将切下的DNA 片段插入CRISPR 位
点，形成“免疫记忆”。当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR 位点转录产生的
crRNA 便会将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA 处，并将之切断，即
“免疫杀灭”。过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．细菌体内发生图中的①过程，需要细菌提供场所、模板、原料、能量等
B．图中②过程的机理类似于mRNA 与DNA 模板链的结合
C．核酸内切酶Cas2 通过识别特定序列的DNA，并在特定位点将DNA 切断
D．细菌利用CRISPR/Cas9 分子装置剿灭入侵噬菌体的过程相当于高等动物的特异性
免疫
13．基因编辑是指将外源DNA 片段导入到染色体DNA 特定位点或删除基因内部片段，定
点改造基因，获得预期的生物体基因序列发生遗传性改变的技术。下图是对某生物的B 基
因进行基因编辑的过程，该过程中用sgRNA 指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的靶位点。
下列分析合理的是（ ）
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A．sgRNA 的基本组成单位是脱氧核苷酸
B．Cas9 蛋白借助sgRNA 对目标DNA 分子进行定位，依赖于碱基互补配对
C．图中sgRNA1 的碱基序列和sgRNA2 碱基序列相同或互补
D．图中B 基因缺失一段核苷酸序列可能导致染色体结构变异
14．科学家以含有16 条染色体的酿酒酵母为原型，借助CRISPR-Cas9 工具精确敲除了15
个着丝粒和30 个端粒中的DNA，使染色体末端-末端相连，最终构建出只含有一条功能性
染色体的单染色体酵母菌株SY14。下列有关说法错误的是（ ）
A．单染色体酵母的染色体主要位于细胞核和细胞质中
B．CRISPR-Cas9 工具与限制性核酸内切酶的作用效果类似
C．单染色体酵母进行酒精发酵时产生二氧化碳的场所是细胞质基质
D．单染色体酵母在细胞分裂时着丝粒数目最多可达两个
15．采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入到
受精卵的Y 染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过
观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B．基因编辑处理的受精卵经体外培养至2 细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，
才可获得表达 EGFP 的小鼠
C．分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达 EGFP 的即为雄性小鼠胚胎
16．细胞衰老和干细胞耗竭是机体衰老的重要标志，转录激活因子YAP 是发育和细胞命运
决定中发挥重要作用的蛋白质。研究人员利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术和定向分化技术
来产生YAP 特异性缺失的人胚胎干细胞，YAP 缺失的干细胞会表现出严重的加速衰老。下
列叙述错误的是（ ）
A．推测YAP 在维持人体干细胞年轻态中发挥着关键作用
B．转录激活因子YAP 的合成需要在核糖体上进行
C．YAP 缺失的干细胞的形态结构和功能会发生改变
D．CRISPR/Cas9 基因编辑过程中，基因中的高能磷酸键会断裂
17．下图是采用 CRISPR 技术对某生物基因进行编辑的过程，该过程中用 sgRNA 可指引
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核酸内切酶 Cas9 结合到特定的位点进行切割，下列叙述正确的是（ ）
A．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的 sgRNA
B．图中 sgRNA1 的碱基序列和 sgRNA2 碱基序列相同或互补
C．根据破坏 B 基因后生物体的功能变化，可推测 B 基因的功能
D．被编辑后的 B 基因不能进行转录
18．基因编辑是对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。该技术的实
施离不开Cas9 的酶和向导RNA（gRNA），gRNA 能将Cas9 引导到特定的DNA 序列上进
行切割。下列有关叙述错误的是
A．Cas9 发挥切割作用要受温度、PH 的影响
B．Cas9 能切断磷酸和脱氧核糖之间的连接
C．编辑不同基因所选用的gRNA 碱基序列相同
D．gRNA 通过与DNA 进行碱基互补配对发挥作用
19．对基因进行编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某生物B 基因进行定点编辑的过
程，该过程中用 sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的切割位点，相关说法正确的
是（ ）
A．通过破坏B 基因后生物体的功能变化可推测B 基因的功能
B．基因定点编辑前需要设计与靶基因序列完全配对的sgRNA
C．核酸内切酶Cas9 可断裂核糖核苷酸之间的化学键
D．被编辑后的B 基因因不能转录而无法表达相关蛋白质
20．核基因CCR5 控制的CCR5 蛋白质是HIV 入侵人体细胞的主要受体之一。研究人员对
受精卵进行基因编辑，将CCR5 基因中的32 个碱基去除，使之无法在细胞表面表达正常受
体，以期人类先天免疫艾滋病。下列相关分析错误的是（ ）
A．该变异类型属于染色体结构的缺失
B．编辑后的基因与原基因互为等位基因
C．编辑后的基因中(A+G) / (C+T)不会改变
D．基因编辑能改变人类基因库，要严防滥用
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二、多选题
21．2022 年1 月7 日，马兰里大学的医学中心成功将猪心脏移植到一名57 岁的心脏病患者
身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2 个月时间，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观
的数据。为了减低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9 技术获得经过基因编辑的猪心
脏。CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA 和Cas9 蛋白两部分组成，向导RNA 可引导Cas9
蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．题述基因编辑的对象是猪的心肌细胞
B．CRISPR/Cas9 进行基因编辑时，有氢键的断裂但无氢键的形成
C．CRISPR/Cas9 系统具有限制酶的功能
D．接受器官移植的受体往往需服用免疫增强剂来减轻免疫排斥
22．2020 年诺贝尔化学奖授予新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9 的开发者。基因组编辑
CRISPR/Cas9 系统由Cas9 蛋白和人工设计的向导RNA 构成，在向导RNA 引导下，Cas9 蛋
白与靶序列结合并将DNA 双链切断，从而完成对目的基因的编辑。下列相关叙述正确的
是（ ）
A．Cas9 蛋白的功能是准确识别DNA 特定序列并进行切割
B．可设计向导RNA 与靶基因的启动子区域互补，从而促进靶基因转录
C．向导RNA 的序列越短，越容易导致编辑对象出错而造成“脱靶”
D．将CRISPR/Cas9 技术用于治疗人类疾病时，需注意安全性及伦理问题
23．基因组编辑技术是研究基因生物功能的重要手段，下图是对某生物B 基因进行定点编
辑的过程，该过程中用sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的切割位点，相关说法
正确的是（ ）
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A．靶基因部分序列与sgRNA 通过碱基互补配对原则进行配对
B．核酸内切酶Cas9 可断裂脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键
C．被编辑后的B 基因与编辑前的B 基因互称为非等位基因
D．通过破坏B 基因后生物体的功能变化可推测B 基因的功能
24．CRISPR/Cas9 基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑，其原理是由一条单链
向导RNA 引导Cas9 蛋白到一个特定的基因位点对特定的DNA 序列进行切割。通过设计向
导RNA 中20 个碱基的识别序列，可人为选择DNA 上的目标位点进行切割。下列相关叙述
正确的是（ ）
A．Cas9 蛋白由相应基因指导在核糖体中合成，它具有核酸内切酶的特性
B．Cas9 蛋白借助向导RNA 对目标DNA 分子进行定位依赖于碱基互补配对
C．对不同目标基因进行编辑时，可能使用相同的Cas9 蛋白和不同的向导RNA
D．因向导RNA 碱基序列的特异性，Cas9 只能对人为选定的目标位点进行切割
25．2018 年3 月，我国科学家宣布首次利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，精准地将人亨廷
顿舞蹈症基因插入猪成纤维细胞中，成功培育出亨廷顿舞蹈症的模型猪，为治疗人类神经
细胞功能退行性疾病提供了理想的动物模型。有关叙述错误的是（ ）
A．外源基因插入猪成纤维细胞中，其变异类型属于染色体变异
B．以猪成纤维细胞作为受体细胞的主要原因是它具有全能性
C．模型猪的培育涉及体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
D．模型猪为老年痴呆等疾病的病理研究、药物研发提供试验材料
三、非选择题
26．为研究组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）基因的生物学功能，研究者以斑马鱼为研究对
象，通过CRISPR/Cas9 技术构建HDAC8 基因缺失的突变模型（如图1 所示）。
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回答下列问题：
(1)据图1 分析可知：CRISPR/Cas9 基因编辑技术可实现靶向切除HDAC8 基因的原理是
Cas9 蛋白—sgRNA 复合体中sgRNA 识别并与目标DNA 中的靶点序列结合，其中sgRNA
与靶点序列结合的碱基序列为 ；Cas9 蛋白作用于目标DNA 的 （填化学键）使双
链断裂，实现对HDAC8 基因敲除。
(2)sgRNA 是由体外转录形成的，其基因的上游具有 ，该结构的作用是 。
(3)通过对野生型斑马鱼和实施HDAC8 基因敲除的斑马鱼HDAC8 进行检测，结果如图2 所
示（数字表示HDAC8 氨基酸的数量）。研究人员认为HDAC8 基因敲除成功，理由是 ，
功能丧失。出现图2 结果的原因可能是HDAC8 基因转录的mRNA 中 提前出现。
(4)将敲除成功的纯合斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，F1自由交配得F2。将F2不同类型的斑马
鱼标记后放归到有捕食性天敌的野外水域中，一段时间后发现突变纯合子数量明显减少，
而其他类型的数量几乎没变。请结合图3 解释突变纯合子数量变化的原因 。
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27．CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信
息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，sgRNA 是根据靶
基因设计的引导RNA，准确引导Cas9 切割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列。请回答下
列问题：
(1)Cas9 可准确切割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列，由此可见，Cas9 在功能上属于
酶，该过程体现了酶具有 性；此外，Cas9 可准确切割靶基因DNA 序列还依赖于
sgRNA 与靶基因DNA 序列之间的 。
(2)sgRNA 是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23 个连续的碱基组成。
研究发现，sgRNA 有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是 ；解决措施是
。
(3)为了实现某基因的特异性敲除，如图1 所示，科学家将含有3 个不同的但靶向相同基因
的sgRNA 编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。
注：eflap 是能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP 是增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI 是
归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中。
理论上，一个sgRNA 便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1 所示重组质粒的优势：
(答出两点)。
(4)为筛选特定D 基因“敲除”的果蝇，在D 基因的DNA 断裂位点插入绿色荧光蛋白基因
(EGFP)需构建携带有绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP 基因和His 标签基因(His 标
签由6 个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2 为载体、EGFP 基因的
结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)
编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。
①写出His 基因模板链的碱基序列：5'- -3'。
②为构建融合基因并将其插入载体科研人员设计了一对与EGFP 基因编码区两端序列互补
配对的引物，设计时需在引物 (填“A”或“B”)的5'端增加相应的限制酶识别序列和
His 基因的编码序列，请写出该引物开头的12 个碱基序列：5'- -3'。
28．研究人员利用最新基因编辑工具CRISPR/Cas9，成功敲除了比格犬的载脂蛋白E
（APOE）基因，培育出动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”。利用“苹果”腹部皮肤体细
胞作为样本，建立细胞系，取其细胞核注入比格犬去核卵母细胞中，形成早期胚胎后进行
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胚胎移植，得到了我国首只克隆犬“龙龙”。如图为克隆犬“龙龙”诞生的流程图，回答
下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 系统是由Cas9 蛋白和sgRNA 构成的RNA-蛋白复合体，其中的
负责识别并结合特定DNA 序列，引导Cas9 蛋白对目的基因进行编辑，在实践中发现该系
统有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”的现象，实验发现sgRNA 的序列长短影响成功率，
sgRNA 序列越长脱靶率越 （填“高”或“低”）。
(2)取“苹果”的皮肤细胞，并进行体细胞建系。皮肤细胞在培养过程中，首先应保证其处
于 的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要一定的气体环境
是 。
(3)为了获得较多的卵母细胞，需要对供体实验比格犬注射 ，获得的卵母
细胞应在体外培养到 期。在对卵母细胞去核时，可采用的方法有
________________________（至少答出两种）。
(4)克隆本质上是一种无性繁殖，该过程的最后一道工序是胚胎移植，其实质是
。胚胎移植前，需对供、受体犬进行 处理，为供体胚胎移入受体提供相同的
生理环境。重构胚通常需要发育到 阶段才能进行胚胎移植。
29．CRISPR-Cas 系统包含CRISPR 基因和Cas 基因（CRISPR 关联基因）两部分，其中
CRISPR 是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病
毒基因的一小段存储到 CRISPR，Cas 基因则位于CRISPR 基因附近或分散于基因组其他地
方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR 序列区域共同发生作用，CRISPR-Cas 系统的组成如
下图所示，现在CRISPR-Cas9（由一条单链向导RNA 和内切核酸酶Cas9 组成）已发展成
为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。回答下列有关问题：
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(1)CRISPR-Cas 系统的形成是细菌与病毒 的结果，在CRISPR-Cas 系统中，
前导区作为启动子，是 识别和结合的部位，能驱动 基
因的表达过程。
(2)CRISPR—Cas 系统中，间隔区应是 ，该系统在细菌中的作用是 。
(3)CRISPR—Cas9 基因编辑技术取代早期基因工程的原因是 ，根据
其组成成分推测其工作的原理并简要叙述 。
30．PCR 可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或偏差等问题，而新研发的基于
CRISPR/Cas12a 系统的检测方法，可在低浓度样本中更灵敏，快速识别靶标DNA。该系统
利用gRNA 介导Cas12a 蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通
过检测荧光强度确定靶标DNA 含量，利用Cas12a 检测靶标DNA 的过程如下图所示。回答：
(1)根据图中信息可推测Cas12a 作用于靶标DNA 时，具有类似 酶和
酶的功能；gRNA 识别靶标DNA，遵循的是 原则。
(2)在构建表达Cas12a 蛋白的载体时，通常是将Cas12a 基因插入到lacZ 基因内，使lacZ 基
因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含
氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到含有Cas12a 基因表达载体的工
程菌，判断的依据是 。
(3)荧光检测时，60 分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是 。
(4)实验研究时，增加NTC 组作对照的作用是 ；g-3+g-7 组可更快检测出靶标
DNA，原因是 。
31．党的二十大对保障粮食安全提出了更高要求，马铃薯块基富含淀粉，而且其中的维生
素是所有粮食中最全的，因此我国科学家对马铃薯这种重要粮食作物开展了大量研究。
(1)马铃薯因为自交不亲和，所以只能进行无性繁殖，我国科学家用基因编辑技术定点敲除
二倍体马铃薯的自交不亲和基因获得了二倍体自交系的马铃薯。
①普通（非转基因）马铃薯不能自交的根本原因是 。
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②为敲除自交不亲和基因，研究者采用了CRISPR/Cas9 基因编辑技术，如图所示：
该技术利用一段与靶序列互补的向导RNA 引导Cas9 蛋白对特异靶向DNA 进行识别和定点
敲除自交不亲和基因，其中的Cas9 蛋白相当于 酶，若要将自交不亲和基因从目标
DNA 上切除下来，需要设计 种不同的向导RNA。若靶序列为5'-AGCAT……
GTACCT-3'，则设计的向导RNA 中相应的序列应为 。
(2)MAP30 蛋白是一种能使Ⅰ型核酸核糖体失活的蛋白质，实验表明MAP30 蛋白具有抗
pvx 病毒功能，为培育高效表达该基因的马铃薯新品种，科研团队利用农杆菌转化法将
MAP30 基因导入马铃薯细胞内，如图所示：
①选择Ti 质粒做载体的原因是 ，构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择
识别切割质粒，再用 连接。
②个体水平上，可通过 的方法检测转基因马铃薯是否具有抗病毒的特性，具体
做法是 。
32．我国科学家利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术成功敲除B 猴成纤维细胞中的生物节律核
心基因BMAL1，并将其与去核的卵母细胞融合，发育形成的早期胚胎植入代孕雌猴，共
获得5 只生物节律紊乱的克隆猴，过程如下图所示。回答下列问题：
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(1)需将A 猴卵母细胞体外培养至 期，并通过 进行去核处理，去核的目的是 。这
些克隆猴的遗传物质不与B 猴的100%相同的原因是 。
(2)CRISPR/Cas9 基因编辑系统由单链向导RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白组成，其中sgRNA
与靶DNA 上某序列发生局部互补结合时，Cas9 蛋白就可以像“剪刀”一样切断此处的
DNA 序列。CRISPR/Cas9 基因编辑系统在功能上与 酶相似，其与作用的位点之间的结
合具有 性。
(3)胚胎移植前，应进行同期发情处理，使供、受体生殖器官的生理变化保持 。胚胎移
植的实质是 。
33．番茄是两性植物，既可自花受粉也可异花受粉，具有明显的杂种优势。雄性不育是实
现杂种优势利用的重要途径。
(1)目前番茄雄性不育ms 系的应用最为广泛，ms 基因是野生型植株2 号染色体上MS 基因
（可育基因）中插入一段DNA 序列形成的，由此可见该种雄性不育株的变异类型是 。
(2)番茄幼苗茎秆有两种性状，紫茎（A）对绿茎（a）为显性，研究者将苗期紫茎雄性可育
和苗期绿茎雄性不育两种纯合品系杂交，F1自交，并对F2在苗期和结果期进行调查，结果
如表所示：
F2
检测单株数
可育
株
不育株
苗期紫茎单
株
各取90 株
89 株
1 株
苗期绿茎单
株
1 株
89 株
上述结果说明亲代个体中ms 基因与 （填“A 基因”或“a 基因”）位于同一条染色体
上，依据上述发现，育种工作者选择 番茄幼苗即可获得雄性不育株。
(3)目前雄性不育株多以自然变异为主，可供研究或应用的数量有限。某科研团队利用
CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除雄蕊特异基因SISTR1 成功获得了雄性不育番茄。
CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，sgRNA 可引导
Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。
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①CRISPR/Cas9 系统的表达涉及过程I 和II，其中II 过程表示 。
②sgRNA 可引导识别目标DNA 序列的原理是 ，Cas9 蛋白可催化 键断裂，剪切特
定DNA 片段。
③基因编辑是否成功可以通过提取相关基因进行PCR 扩增后经 鉴定。
34．为研究果蝇K 基因的功能，科研人员运用CRISPR 基因编辑技术“敲除”了K 基因。
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(1)CRISPR 系统由向导RNA 和Cas9 核酸酶组成，向导RNA 可与DNA 的一条链通过
原则结合，Cas9 酶能将与之结合的双链DNA 切割，如图1 所示。Cas9 酶与基因工程使用
的限制酶作用的差异是 。
(2)为后续筛选K 基因“敲除”的果蝇，在K 基因DNA 断裂位点插入红色荧光蛋白基因
（RFP）需提供携带有红色荧光蛋白基因的供体质粒。
①应选用 处理图2 所示的质粒和红色荧光蛋白基因，以构建供体质粒，同时避免质粒
自连。
②将Cas9 酶基因、向导RNA 基因和供体质RFP 基因粒导入果蝇的 中，若检测到红
色荧光，则表明K 基因可能被成功“敲除”，该受精卵发育成的果蝇即为F₀ 代果蝇。
(3)为确认K 基因是否被成功“敲除”，科研人员进行了如下实验：
①科研人员用图3 中的引物I、II、III 对F₀ 代果蝇DNA 进行PCR 并电泳检测（大于10kb
片段单次PCR 无法完成扩增）。若敲除成功，则观察到的不同个体电泳条带可能有两种情
况： 或 （长度单位：kb），出现这两种情况的原因是 。
②近年来，科研人员又发现了一种检测基因的方法——Cas12a 酶法。该酶类似Cas9 能够在
向导RNA 的作用下，在特定位点剪切目标DNA 之后，还发挥非定向切割单链DNA 的功
能（如图）。用该方法检测敲除是否成功并排除“脱靶”的方法是：利用 序列设计向
导RNA，取待检测细胞克隆导入 和报告分子，观测指标是 。
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(4)为进一步研究K 基因功能，科研人员做了如下表的实验，由此推测K 基因的功能是
。
子代果蝇个数（只）
野生型♂×野生型♀
103
野生型♂×K 基因“敲除”果
蝇♀
109
K 基因“敲除”果蝇♂×野生
型♀
0
35．基因驱动是指特定基因有偏向性地遗传给下一代的自然现象。CRISPR/Cas9 基因编辑
系统包含Cas9 基因和sgRNA 编码序列（gRNAs），科学家借助该系统研发出人工基因驱
动系统，并在拟南芥和蚊子等生物中实现了外部引入的基因多代遗传。在作物快速育种、
根除疟疾等方面具有广阔的前景。请回答下列问题：
(1)为研发拟南芥蓝光受体CRY1 基因驱动系统，科学家首先构建了基因驱动元件，将基因
驱动元件精确插入到一条染色体上的CRY1 基因中，过程如图1 所示。
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①将基因驱动元件导入拟南芥细胞，在细胞中表达Cas9/sgRNA 复合物，该复合物通过
识别和结合DNA 特定序列，并引导Cas9 酶切断DNA 双链的 ，从而将基因驱动
元件插入到CRY1 基因中，该过程属于定点 （基因突变/染色体变异）。
②为确定基因驱动元件是否插入CRY1 基因，选择引物 进行PCR-电泳，结果如图
2。条带1 的大小约为7800bp，条带2 的大小约为3200bp。基因驱动元件成功插入的是条
带 ，基因驱动元件的大小约为 左右。
(2)当携带基因驱动元件的动物与野生型动物交配时，它们的后代从父母中各获得一份DNA
副本：自然版本和基因驱动版本。受精后，来自不同亲本的染色体排列在一起时，基因驱
动DNA 中的CRISPR 被激活。它能识别对侧染色体上自然基因的拷贝，并在胚胎发育开始
前引导Cas9 酶切除自然拷贝。一旦自然基因受损，细胞的特殊修复机制就会启动，修复丢
失的DNA，但它使用未断裂的染色体（携带基因驱动的染色体）作为模板。所以当修复完
成后，两条染色体都携带一份基因驱动的拷贝。此过程被称为同源定向修复。
①用CRY1 基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，F1中有多达8％的植株为纯合突变
体。纯合突变体产生的原因是F1中来自母本的基因驱动序列通过同源定向修复，使来自父
本的 （部位）上也插入CRY1 基因驱动元件。
②用基因驱动技术改造传播疟疾的按蚊X 染色体上的A 基因获得a 基因，已知含a 基因的
精子不能成活。用改造后的纯合雌蚊突变体与野生型雄蚊交配获得子一代，子一代相互交
配，子二代中的性别组成为 ，且子二代中含有a 基因的比例 （填“大于”
“等于”或“小于”）1/2。若将基因驱动雌蚊释放到疟疾疫区，可通过 降
低按蚊的种群密度。
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