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题型16 CRISPRCas9 基因组编辑技术
一、单选题
1．CRISPR/Cas9 系统是一种基因组编辑技术，Cas9 蛋白能与人工设计的sgRNA 形成复合
体（如图），利用该技术可以对DNA 进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是（
）
A．Cas9 蛋白能切割目的基因的磷酸二酯键，使DNA 双链断裂
B．对不同的目的基因进行编辑时可能使用相同的Cas9 蛋白和sgRNA
C．基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D．通过基因组编辑技术引起的变异属于基因重组
【答案】D
【分析】CRISPR/Cas9 系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA 能识别并结
合特定的DNA 序列，从而引导Cas9 蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因
序列的编辑。
【详解】A、Cas9 蛋白能与人工设计的sgRNA 形成复合体，复合体中的sgRNA 与目的基
因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9 蛋白切割磷酸二酯键，使DNA 双链断裂，A
正确；
B、不同的目的基因中可能含有相同的碱基序列能被该复合物识别，故对不同的目的基因
进行编辑时可能使用相同的Cas9 蛋白和sgRNA，B 正确；
C、细胞在修复断裂的DNA 时会随机插入、删除或替换部分碱基对，C 正确；
D、通过基因组编辑技术引起的变异属于基因突变，D 错误。
故选D。
2．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引
导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
A．Cas9 蛋白相当于限制酶，切割特定基因位点的脱氧核糖和碱基之间的化学键
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B．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
C．CRISPR/Cas9 基因编辑技术有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，一般
SgRNA 序列越长，脱靶率越低
D．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和相同的sgRNA 进行基因编辑
【答案】C
【分析】限制酶能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特
定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
【详解】A、Cas9 蛋白切割特定基因位点，相当于限制酶，作用于脱氧核糖和磷酸之间的
磷酸二酯键，A 错误；
B、向导RNA 是以DNA 的一条链为模板通过转录形成的，可以在RNA 聚合酶的催化下合
成，合成的原料包括四种核糖核苷酸，B 错误；
C、CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA 的
序列越短，可识别的DNA 上的特定碱基序列越短，越容易发生脱靶现象，即脱靶率越高，
C 正确；
D、在对不同目标DNA 进行编辑时，应使用Cas9 蛋白和不同的sgRNA 结合进而实现对不
同基因的编辑，D 错误。
故选C。
3．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引
导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
A．Cas9 蛋白相当于限制酶，切割特定基因位点的脱氧核糖和碱基之间的化学键
B．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
C．CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，一般
SgRNA 序列越短，脱靶率越低
D．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和不同的sgRNA 进行基因编辑
【答案】D
【分析】限制酶能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特
定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
【详解】A、Cas9 蛋白切割特定基因位点，相当于限制酶，作用于脱氧核糖和磷酸之间的
磷酸二酯键，A 错误；
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B、向导RNA 是以DNA 的一条链为模板通过转录形成的，可以在RNA 聚合酶的催化下合
成，合成的原料包括四种核糖核苷酸，B 错误；
C、CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA 的
序列越短，可识别的DNA 上的特定碱基序列越短，越容易发生脱靶现象，即脱靶率越高，
C 错误；
D、在对不同目标DNA 进行编辑时，应使用Cas9 蛋白和“不同”的sgRNA 结合进而实现
对不同基因的编辑，D 正确。
故选D。
4．CRISPR/Cas9 是一种生物学工具，能够通过“剪切和连接”脱氧核糖核酸（DNA）序
列的机制来编辑基因组。这套系统源自细菌的防御机制，是一种对任何生物基因组均有效
的基因编辑工具。CRISPR/Cas9 基因组编辑系统由向导RNA（也叫sgRNA）和Cas9 蛋白
组成，向导RNA 识别并结合靶基因DNA．Cas9 蛋白切断双链DNA 使其形成两个末端。
这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基
因敲除，如图所示。CRISPR/Cas9 基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶。下列叙
述正确的是（ ）
A．Cas9 蛋白能作用于脱氧核糖和碱基之间的化学键
B．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和相同的sgRNA 进行基因编辑
C．CRISPR/Cas9 基因组编辑系统使细菌获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力
D．其他DNA 序列含有与 sgRNA 互补配对的序列，会造成 sgRNA 错误结合而脱靶
【答案】D
【分析】由题意可知，CRISPR-Cas9 体系是由靶基因的向导RNA 和Cas9 蛋白构成的复合
体。向导RNA 在基因组中负责寻找靶基因并与其结合；Cas9 蛋白在向导RNA 的引导下切
割靶基因，使DNA 双链断裂产生平末端。在随后DNA 自我修复的过程中，容易随机引起
一些碱基对的插入或缺失，导致基因功能改变。
【详解】A、Cas9 蛋白识别并切断双链DNA 形成两个末端，相当于限制酶，能作用于脱氧
核苷酸之间的磷酸二酯键即脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键，A 错误；
B、在对不同目标DNA 进行编辑时，应使用Cas9 蛋白和“不同”的sgRNA 结合进而实现
对不同基因的编辑，B 错误；
C、噬菌体是通过将自身的DNA 注入细菌内，利用细菌内的物质进行自我复制而完成侵染
的，而CRISPR−Cas9 系统可以定向切割外源DNA，故该系统使细菌获得抵抗噬菌体的能
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力，但不能获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力，C 错误；
D、CRISRP−Cas9 基因编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，其最可能的原因是其他
DNA 序列也含有与向导RNA（sgRNA）互补配对的序列，造成向导RNA（sgRNA）错误
结合而脱靶，D 正确。
故选D。
5．CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一把“分子剪
刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基
因。CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示，下列分析正确的是（ ）
A．构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要插入到质粒的启动子上游
B．SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后，其功能类似于DNA 聚合酶
C．根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标DNA 的定点切割
D．CRISPR/Cas9 识别目标DNA 序列主要与Cas9 蛋白的特异性相关
【答案】C
【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用
PCR 技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表
达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根
据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、
基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的
基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的
检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因-DNA 分子杂交技术②检测目的
基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体
杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、构建重组质粒时，SgRNA 编码序列需要插入到质粒的启动子下游，便于转录
产生SgRNA，A 错误。
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B、SgRNA 和Cas9 蛋白形成复合体后，可切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因，
其功能类似于限制酶，B 错误；
C、SgRNA 可以特异性切割DNA 位点，根据目标DNA 设计相应的SgRNA，可实现对目标
DNA 的定点切割，C 正确；
D、CRISPR/Cas9 识别目标DNA 序列主要与SgRNA 编码序列有关，D 错误；
故选C。
6．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引
导Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
A．SgRNA 通过碱基互补配对原则识别目标DNA 分子，Cas9 蛋白的功能与DNA 连接
酶相似
B．若要利用CRISPR/Cas9 技术将一个基因从目标DNA 分子上去除，通常需设计两个
序列不同的SgRNA
C．CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，一般
SgRNA 序列越短，脱靶率越低
D．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
【答案】B
【分析】由图示可知，SgRNA 可通过与特定基因位点的碱基互补配对，来引导Cas9 蛋白
到该位点进行切割，即SgRNA 是通过碱基互补配对原则来识别目标DNA 分子的。
【详解】A、由图可知，SgRNA 可通过与特定基因位点的碱基互补配对，来引导Cas9 蛋白
到该位点进行切割。即SgRNA 通过碱基互补配对原则识别目标DNA 分子，而Cas9 蛋白的
功能与限制酶相似，A 错误；
B、为了防止因目的基因两侧的“黏性末端”相同而导致的自身环化，若要利用CRISPR/
Cas9 技术将一个基因从目标DNA 分子上去除，通常需设计两个序列不同的SgRNA，B 正
确；
C、CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA 的
序列越短，可识别的DNA 上的特定碱基序列越短，越容易发生脱靶现象，即脱靶率越高，
C 错误；
D、向导RNA 是以DNA 的一条链为模板通过转录形成的，可以在RNA 聚合酶的催化下合
成，合成的原料包括四种核糖核苷酸，D 错误。
故选B。
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7．采用CRISPR／Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入受
精卵的Y 染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠体外受精后，
通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
A．该转基因小鼠的精子与野生型雌性小鼠的卵母细胞要分别进行成熟培养和获能处理
B．可观察到绿色荧光的胚胎应为雄性小鼠胚胎
C．早期胚胎通过胚胎分割这一无性繁殖技术可获得更多遗传性状相同的个体
D．分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
【答案】A
【分析】通过基因编辑技术将EGFP 基因定点插入到受精卵的Y 染色体上，使含有该Y 染
色体的小鼠能够发出绿色荧光，转基因鼠将Y 染色体传递给子代的雄性个体，通过观察荧
光可确定早期胚胎的性别。
【详解】 A、体外受精时对精子要进行获能的处理，卵母细胞也需要培养至减Ⅱ中期才能
进行受精作用，A 错误；
B、通过基因编辑技术将Y 染色体用绿色荧光蛋白基因标记，通过观察早期胚胎的荧光，
能表达EGFP 的个体含有Y 染色体，即为雄性小鼠胚胎，B 正确；
C、早期胚胎通过胚胎分割和胚胎移植，可获得更多遗传性状相同的个体，该过程属于无
性繁殖，C 正确；
D、分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植、早期胚胎培养、胚胎移植等技术，可
获得大量的转基因小鼠，D 正确。
故选A。
8．CRISPR／Cas13d 技术是一项新兴的RNA 编辑技术，该技术以一条单链向导RNA
（gRNA）引导Cas13d 蛋白在一个特定的基因位点对RNA 进行切割。研究人员设计出的若
干个gRNA 能分别定点切割新冠病毒RNA 基因组的不同基因（如图所示），但不影响人体
细胞的RNA。下列叙述正确的是（ ）
A．gRNA 分子中，相邻碱基之间有1 个核糖和1 个磷酸基团
B．gRNA 与病毒基因间的碱基配对方式有A—T、U—A、G—C 三种
C．CRISPR／Cas13d 可能借助gRNA 与Cas13d 的特异性实现对RNA 的定点切割
D．新冠病毒不同RNA 片段的差别在于脱氧核苷酸的数量和排列顺序
【答案】C
【分析】分析题文：基因编辑又称基因组编辑或基因组工程，是一种新兴的比较精确的能
对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程，通过向导RNA 中20
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个碱基的识别序列与剪切点附近序列互补配对，引导核酸内切酶Cas9 到一个特定的基因位
点进行切割。
【详解】A、gRNA 分子中，相邻碱基之间有2 个核糖和1 个磷酸基团，A 错误；
B、据题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，gRNA 与病毒基因（RNA）间的碱基配对
方式有A—U、G—C 两种，B 错误；
C、CRISPR／Cas13d 能对RNA 上的特定位点进行切割，与gRNA、Cas13d 的特异性都有
关，C 正确；
D、新冠病毒的基因组中不同基因的差别在于核糖核苷酸的数量和排列顺序，D 错误。
故选C。
9．在一项新的研究中，研究人员展示了他们如何通过使用CRISPR/dCas9 基因组编辑技术，
在体外培养的小鼠和人类细胞中，成功去除特定基因的DNA 甲基化，并分析了几个人类
和小鼠基因中不同区域去甲基化的转录后果，研究表明近端启动子上的DNA 去甲基化在
某些情况下会增加基因的表达。下列说法错误的是（ ）
A．CRISPR/dCas9 基因组编辑技术对基因进行碱基的敲除和加入会引起基因重组
B．CRISPR/dCas9 基因组编辑技术有助于研究基因缺失对细胞分化的影响
C．DNA 甲基化后可能干扰了RNA 聚合酶与启动子的识别和结合
D．被甲基化的DNA 片段中遗传信息未发生改变
【答案】A
【分析】甲基化，是指从活性甲基化合物上将甲基催化转移到其他化合物的过程，可形成
各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统
内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的
调节以及核糖核酸加工。
【详解】A、CRISPR/dCas9 基因组编辑技术对基因进行碱基的敲除和加入会引起基因结构
的改变，引起基因突变，A 错误；
B、细胞分化是基因的选择性表达的结果，CRISPR/dCas9 基因组编辑技术有助于研究基因
缺失对细胞分化的影响，B 正确；
C、近端启动子上的DNA 去甲基化在某些情况下会增加基因的表达，故DNA 甲基化后可
能干扰了RNA 聚合酶与启动子的识别和结合（基因表达中的转录过程），C 正确；
D、被甲基化的DNA 片段只是DNA 经过了修饰，其中遗传信息未发生改变，D 正确。
故选A。
10．美国纽约大学朗格尼健康中心日前实施了一台特殊的肾移植手术，医生成功将一头转
基因猪（通过基因编辑技术敲除α-Gal 基因）的肾脏移植到人体，且随后3 天里均未发生
排异现象，病人体内的一些指标也降至正常水平。CRISPR/Cas9 系统是目前最常用的一种
基因编辑工具，该系统由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白组成，由SgRNA 引导Cas9 蛋
白在特定的基因位点进行切割完成基因编辑过程，其原理如图所示。下列相关叙述中，错
误的是（ ）
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A．通常选择受精卵作为受体细胞，是因为受精卵体积大容易操作
B．将Cas9-SgRNA 复合体注入受体细胞的常用方法是显微注射法
C．推测Cas9 蛋白与限制性核酸内切酶具有相似的功能
D．转基因猪的培育过程还需要用到胚胎移植等现代生物技术
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：
是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导
入动物细胞最有效的方法是显微注射法（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、由于受精卵的全能性高，因此基因工程中常选用受精卵作为外源基因的受体
细胞，A 错误；
B、结合题意可知，本操作中的受体细胞为受精卵，将Cas9-SgRNA 复合体注入受精卵细
胞的常用方法是显微注射法，B 正确；
C、结合题意“由SgRNA 引导Cas9 蛋白在特定的基因位点进行切割来完成基因的编辑过
程”可知，该基因编辑工具中对基因进行剪切的是Cas9 蛋白，即Cas9 蛋白与限制性核酸
内切酶具有相似的功能，C 正确；
D、转基因猪的肾脏需要移植到人体中起作用，故在此之前还需要用到胚胎移植等现代生
物技术，D 正确。
故选A。
11．CRISPR/Cas9 基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑，其原理是由一条单链
向导RNA 引导Cas9 蛋白到一个特定的基因位点对特定的DNA 序列进行切割。通过设计向
导RNA 中20 个碱基的识别序列，Cas9 蛋白可人为选择DNA 上的目标位点进行切割。下
列相关叙述错误的是（ ）
A．Cas9 蛋白具有限制酶的特性
B．Cas9 蛋白借助向导RNA 对目标分子进行定位依赖于碱基互补配对
C．对不同目标基因进行编辑时可能使用相同的Cas9 蛋白和向导RNA
D．Cas9 蛋白切割的位点是氢键
【答案】D
【分析】结合题意可知：基因编辑又称基因组编辑或基因组工程，是一种新兴的比较精确
的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程，通过向导RNA 中
20 个碱基的识别序列与剪切点附近序列互补配对，引导核酸内切酶Cas9 到一个特定的基
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因位点进行切割。
【详解】A、结合题意可知，Cas9 蛋白可对特定的DNA 序列进行切割，具有核酸内切酶的
特性，A 正确；
B、向导RNA 对目标DNA 进行序列识别，从而实现Cas9 蛋白对DNA 分子的定位，这依
赖于碱基对间遵循碱基互补配对原则，B 正确；
C、RNA 引导Cas9 蛋白到一个特定的基因位点对特定的DNA 序列进行切割，不同的目的
基因中可能含有相同的碱基序列能被该复合物识别，故对不同目标基因进行编辑时可能使
用相同的Cas9 蛋白和向导RNA，C 正确；
D、Cas9 蛋白相当于限制酶，其切割的位点是磷酸二酯键，D 错误。
故选D。
12．2020 年的诺贝尔化学奖授予了两位在基因组编辑技术（如CRISPR/Cas）领域作出杰
出贡献的女科学家。这项技术的问世源自于人们在本世纪初对细菌抵御噬菌体的机理研究：
不少的细菌第一次被特定的噬菌体感染后，由细菌Cas2 基因表达的Cas2 核酸内切酶（蛋
白质）便会随机低效切断入侵的噬菌体DNA 双链，并将切下的DNA 片段插入CRISPR 位
点，形成“免疫记忆”。当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR 位点转录产生的
crRNA 便会将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA 处，并将之切断，即
“免疫杀灭”。过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．细菌体内发生图中的①过程，需要细菌提供场所、模板、原料、能量等
B．图中②过程的机理类似于mRNA 与DNA 模板链的结合
C．核酸内切酶Cas2 通过识别特定序列的DNA，并在特定位点将DNA 切断
D．细菌利用CRISPR/Cas9 分子装置剿灭入侵噬菌体的过程相当于高等动物的特异性
免疫
【答案】C
【分析】分析图形：左图是初次免疫形成免疫记忆，右图为再次感染后的免疫杀灭。左图
中细菌当第一次被特定的噬菌体感染后，细菌cas2 基因表达的Cas2 核酸内切酶（蛋白
质）会随机低效切断入侵的噬菌体DNA 双链，并将切下的DNA 片段插入CRISPR 位点，
形成“免疫记忆”。右图中当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR 位点转录产生的
crRNA 便会将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA 处，并将之切断，形成
“免疫杀灭。
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【详解】A、细菌体内发生图中的①过程为基因的表达，包括转录和翻译过程，需要提供
核糖体（翻译场所）、细菌DNA（转录模板）、转移RNA（运输氨基酸）、核糖核苷酸
（转录原料）、氨基酸（翻译原料）、ATP（供能），A 正确；
B、由图可知：当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR 位点转录产生的crRNA 便会将
另一种核酸内切酶准确带到入侵者DNA 处，涉及RNA 与DNA 的结合，与mRNA 与DNA
模板链的结合的机理类似，利用的是碱基互补配对的原则，B 正确；
C、根据题干信息可知：Cas2 核酸内切酶能随机低效切断入侵的噬菌体DNA 双链，并没有
特异性的识别，C 错误；
D、细菌利用如图所示的CRISPR/Cas 分子装置剿灭入侵噬菌体的过程，是后天形成的，则
相当于高等动物的特异性免疫，D 正确。
故选C。
【点睛】
13．基因编辑是指将外源DNA 片段导入到染色体DNA 特定位点或删除基因内部片段，定
点改造基因，获得预期的生物体基因序列发生遗传性改变的技术。下图是对某生物的B 基
因进行基因编辑的过程，该过程中用sgRNA 指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的靶位点。
下列分析合理的是（ ）
A．sgRNA 的基本组成单位是脱氧核苷酸
B．Cas9 蛋白借助sgRNA 对目标DNA 分子进行定位，依赖于碱基互补配对
C．图中sgRNA1 的碱基序列和sgRNA2 碱基序列相同或互补
D．图中B 基因缺失一段核苷酸序列可能导致染色体结构变异
【答案】B
【分析】基因突变是指基因中碱基对的增添、缺失或替换，这会导致基因结构的改变，进
而产生新基因。
碱基互补配对原则是指互补的碱基之间形成氢键而配对，如A 和U 或T 之间；G 和C 之间
进行配对，通过碱基互补配对可实现DNA 单链之间、DNA 与RNA 链之间以及RNA 和
RNA 链之间的配对，从而实现基因的定位。
【详解】A、sgRNA 的基本组成单位是核糖核苷酸，A 错误；
B、sgRNA 对目标DNA 进行序列识别，从而实现Cas9 蛋白对DNA 分子的定位，这依赖于
碱基对间遵循碱基互补配对原则，B 正确；
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C、图中sgRNAl 的碱基序列和sgRNA2 的碱基序列，结合的是不同的DNA 区段，故一般
情况下二者既不相同，也不互补，C 错误；
D、图中B 基因缺失一段核苷酸序列，引起的是基因突变，D 错误。
故选B。
【点睛】
14．科学家以含有16 条染色体的酿酒酵母为原型，借助CRISPR-Cas9 工具精确敲除了15
个着丝粒和30 个端粒中的DNA，使染色体末端-末端相连，最终构建出只含有一条功能性
染色体的单染色体酵母菌株SY14。下列有关说法错误的是（ ）
A．单染色体酵母的染色体主要位于细胞核和细胞质中
B．CRISPR-Cas9 工具与限制性核酸内切酶的作用效果类似
C．单染色体酵母进行酒精发酵时产生二氧化碳的场所是细胞质基质
D．单染色体酵母在细胞分裂时着丝粒数目最多可达两个
【答案】A
【分析】在真核细胞中，DNA 主要分布在细胞核中，此外在线粒体和叶绿体中也有少量分
布。染色体的主要成分是蛋白质和DNA，其中蛋白质的基本组成单位是氨基酸，DNA 的
基本组成单位是脱氧核苷酸。
【详解】A、染色体位于真核细胞的细胞核中，细胞质中没有，A 错误；
B、 CRISPR-Cas9 的作用是切割DNA 与限制性核酸内切酶的作用效果类似，B 正确；
C、酒精发酵产生二氧化碳的场所是细胞质基质，C 正确；
D、单染色体酵母细胞分裂时只有一或两个着丝粒，所以最多为两个，D 正确。
故选A。
15．采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入到
受精卵的Y 染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过
观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B．基因编辑处理的受精卵经体外培养至2 细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，
才可获得表达 EGFP 的小鼠
C．分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达 EGFP 的即为雄性小鼠胚胎
【答案】B
【分析】分析题意可知，通过基因编辑技术将EGFP 基因定点插入到受精卵的Y 染色体上，
使含有该Y 染色体的小鼠能够发出绿色荧光，转基因鼠将Y 染色体传递给子代的雄性个体，
通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。
【详解】A、依据胚胎在不同发育阶段对培养条件的特定需要，受精卵在体外培养时，不
同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液，A 正确；
B、基因编辑处理的受精卵一般经体外培养至桑椹胚或囊胚阶段，进行胚胎移植，可获得
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表达EGFP 的小鼠，B 错误；
C、分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植、早期胚胎培养、胚胎移植等技术，可获
得大量的转基因小鼠，C 正确；
D、由分析可知，通过基因编辑技术将Y 染色体用绿色荧光蛋白基因标记，通过观察早期
胚胎的荧光，能表达EGFP 的个体含有Y 染色体，即为雄性小鼠胚胎，D 正确。
故选B。
16．细胞衰老和干细胞耗竭是机体衰老的重要标志，转录激活因子YAP 是发育和细胞命运
决定中发挥重要作用的蛋白质。研究人员利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术和定向分化技术
来产生YAP 特异性缺失的人胚胎干细胞，YAP 缺失的干细胞会表现出严重的加速衰老。下
列叙述错误的是（ ）
A．推测YAP 在维持人体干细胞年轻态中发挥着关键作用
B．转录激活因子YAP 的合成需要在核糖体上进行
C．YAP 缺失的干细胞的形态结构和功能会发生改变
D．CRISPR/Cas9 基因编辑过程中，基因中的高能磷酸键会断裂
【答案】D
【分析】基因编辑技术是一种精准改变目标DNA 序列的技术，其原理是使基因发生定向
突变。转录激活因子YAP 是发育和细胞命运决定中发挥重要作用的蛋白质，YAP 缺失的干
细胞会表现出严重的加速衰老。
【详解】A、根据“YAP 缺失的干细胞会表现出严重的加速衰老”，可推测YAP 在维持人
体干细胞年轻态中发挥着关键作用，A 正确；
B、转录激活因子YAP 是一种蛋白质，其合成场所是核糖体，B 正确；
C、 “YAP 缺失的干细胞会表现出严重的加速衰老”，而细胞衰老过程中形态结构和功能
会发生改变，所以YAP 缺失的干细胞的形态结构和功能会发生改变，C 正确；
D、CRISPR/Cas9 基因编辑过程中，基因中的磷酸二酯键会断裂，D 错误。
故选D。
17．下图是采用 CRISPR 技术对某生物基因进行编辑的过程，该过程中用 sgRNA 可指引
核酸内切酶 Cas9 结合到特定的位点进行切割，下列叙述正确的是（ ）
A．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的 sgRNA
B．图中 sgRNA1 的碱基序列和 sgRNA2 碱基序列相同或互补
C．根据破坏 B 基因后生物体的功能变化，可推测 B 基因的功能
D．被编辑后的 B 基因不能进行转录
【答案】C
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【分析】分析题图可知，sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定位点进行切割，使B
基因中的基因Ⅱ被切除，连接基因Ⅰ和基因Ⅲ，形成新的基因B。
【详解】A、sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定位点进行切割，因此基因定点编辑
前需要设计与被切割基因的两端碱基序列配对的sgRNA，A 错误；
B、图中 sgRNA1 的碱基序列和 sgRNA2 碱基序列分别与基因Ⅱ两端的碱基序列配对，B
错误；
C、根据破坏 B 基因后生物体的功能变化，可推测 B 基因的功能，C 正确；
D、被编辑后的 B 基因仍能进行转录，D 错误；
故选C。
18．基因编辑是对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。该技术的实
施离不开Cas9 的酶和向导RNA（gRNA），gRNA 能将Cas9 引导到特定的DNA 序列上进
行切割。下列有关叙述错误的是
A．Cas9 发挥切割作用要受温度、PH 的影响
B．Cas9 能切断磷酸和脱氧核糖之间的连接
C．编辑不同基因所选用的gRNA 碱基序列相同
D．gRNA 通过与DNA 进行碱基互补配对发挥作用
【答案】C
【分析】微生物中限制酶被提取出来之后，可以在细胞外起作用，进行DNA 的切割，例
如基因工程中的限制酶的应用就是在细胞外进行的。限制酶作用于两个核苷酸之间的磷酸
二酯键，每种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列。
【详解】A、酶的活性受温度、pH 的影响，所以Cas9 发挥切割作用要受温度、PH 的影响，
A 正确。
B、限制酶的作用部位是磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，Cas9 能切断磷酸和脱氧核糖
之间的连接，B 正确。
C、一般来说，在使用基因编辑工具对不同基因进行编辑时，应使用Cas9 和不同的向导
RNA 进行基因的相关编辑，C 错误。
D、向导RNA 中的识别序列可与目标DNA 单链特定区域进行碱基互补配对，D 正确。
【点睛】本题考查了限制酶的相关知识，意在考查学生的理解和应用所学知识的要点，把
握知识间的内在联系的能力。
19．对基因进行编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某生物B 基因进行定点编辑的过
程，该过程中用 sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的切割位点，相关说法正确的
是（ ）
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A．通过破坏B 基因后生物体的功能变化可推测B 基因的功能
B．基因定点编辑前需要设计与靶基因序列完全配对的sgRNA
C．核酸内切酶Cas9 可断裂核糖核苷酸之间的化学键
D．被编辑后的B 基因因不能转录而无法表达相关蛋白质
【答案】A
【分析】分析题图：用sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的切割位点并进行切割，
进而将基因Ⅱ切除，连接基因Ⅰ和Ⅲ，形成新的B 基因。
【详解】A、通过破坏B 基因后生物体的功能变化可推测B 基因的功能，A 正确；
B、sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的切割位点，因此基因定点编辑前需要设计
与被切割基因两端碱基序列配对的sgRNA，B 错误；
C、核酸内切酶Cas9 可断裂脱氧核糖核苷酸之间的化学键--磷酸二酯键，C 错误；
D、被编辑后的B 基因仍能进行转录，D 错误。
故选A。
20．核基因CCR5 控制的CCR5 蛋白质是HIV 入侵人体细胞的主要受体之一。研究人员对
受精卵进行基因编辑，将CCR5 基因中的32 个碱基去除，使之无法在细胞表面表达正常受
体，以期人类先天免疫艾滋病。下列相关分析错误的是（ ）
A．该变异类型属于染色体结构的缺失
B．编辑后的基因与原基因互为等位基因
C．编辑后的基因中(A+G) / (C+T)不会改变
D．基因编辑能改变人类基因库，要严防滥用
【答案】A
【分析】根据题干信息“将核基因CCR5 中的32 个碱基去除，使之无法在细胞表面表达正
常受体”，说明受精卵细胞内基因数量并没有增减，只是基因种类改变，这种变异属于基
因突变。
【详解】从题干信息可知,发生了碱基对的缺失,属于基因突变，A 错误；基因突变发生了基
因结构的改变,而该基因为核基因,突变后的基因与原基因互为等位基因，B 正确；编辑后的
基因仍是双链DNA,由于碱基互补配对,A 的含量等于T 的含量,G 的含量等于C 的含量,
(A+G)/(C+T)=1,不会改变，C 正确；针对人类生殖细胞及受精卵的基因编辑超出现有伦理
框架,技术可控性低,群体危害性高,不可随意而为,要严防滥用，D 正确。
【点睛】注意：染色体结构变异中片段的缺失与基因突变中碱基对的缺失是有区别的，前
者的缺失会导致染色体上基因数量减少，而后者的缺失不会导致原染色体DNA 中基因数
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量减少。
二、多选题
21．2022 年1 月7 日，马兰里大学的医学中心成功将猪心脏移植到一名57 岁的心脏病患者
身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2 个月时间，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观
的数据。为了减低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9 技术获得经过基因编辑的猪心
脏。CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA 和Cas9 蛋白两部分组成，向导RNA 可引导Cas9
蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法错误的是（ ）
A．题述基因编辑的对象是猪的心肌细胞
B．CRISPR/Cas9 进行基因编辑时，有氢键的断裂但无氢键的形成
C．CRISPR/Cas9 系统具有限制酶的功能
D．接受器官移植的受体往往需服用免疫增强剂来减轻免疫排斥
【答案】ABD
【分析】分析图形：CRISPR/Cas9 基因编辑系统主要包含向导 RNA 和Cas9 蛋白两部分，
向导RNA 能特异性识别特定的DNA 序列，依据的原理是向导RNA 与目标DNA 的一条链
发生碱基互补配对，从而引导Cas9 蛋白催化特定部位磷酸二酯键水解，完成对特定DNA
片段的剪切，最终实现对靶基因序列定点编辑。移植的器官会被人的免疫系统视作抗原加
以攻击，使用免疫抑制剂可以减轻免疫排斥反应。
【详解】A、要获得基因编辑的猪的心脏，需要对猪的受精卵或干细胞进行基因编辑，再
经胚胎移植或诱导，获得基因编辑过的猪心脏，通常不直接对猪的心肌细胞进行操作，A
错误；
B、由题图可知，CRISPR/Cas9 在基因编辑时，向导RNA 需要与DNA 碱基互补配对，识
别DNA 序列，存在DNA 双链解旋，有氢键断裂，而向导RNA 与DNA 结合，有氢键形成，
B 错误；
C、CRISPR/Cas9 系统能识别并剪切DNA 的特定位点，与限制酶在功能上相似，C 正确；
D、免疫抑制剂是降低免疫功能，减轻免疫排斥，故接受器官移植的受体往往需要服用免
疫抑制剂，以减轻免疫排斥反应，D 错误。
故选ABD。
22．2020 年诺贝尔化学奖授予新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9 的开发者。基因组编辑
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CRISPR/Cas9 系统由Cas9 蛋白和人工设计的向导RNA 构成，在向导RNA 引导下，Cas9 蛋
白与靶序列结合并将DNA 双链切断，从而完成对目的基因的编辑。下列相关叙述正确的
是（ ）
A．Cas9 蛋白的功能是准确识别DNA 特定序列并进行切割
B．可设计向导RNA 与靶基因的启动子区域互补，从而促进靶基因转录
C．向导RNA 的序列越短，越容易导致编辑对象出错而造成“脱靶”
D．将CRISPR/Cas9 技术用于治疗人类疾病时，需注意安全性及伦理问题
【答案】CD
【分析】由题意可知，向导RNA 是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA 的特
定位点，从而引导Cas9 蛋白到达准确位置进行DNA 的切割。
【详解】A、Cas9 蛋白不具有识别功能 ，A 错误；
B、可设计向导RNA 与靶基因的启动子区域互补，导致RNA 聚合酶不能和启动子结合，
从而抑制靶基因的转录过程，B 错误；
C、由于非基因编辑对象也可能含有与向导RNA 配对的碱基序列，故向导RNA 的序列越
短，越容易导致编辑对象出错而造成“脱靶”，C 正确；
D、根据题意分析可知，CRISPR/Cas9 系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导
RNA 能识别并结合特定的DNA 序列，从而引导Cas9 蛋白结合到相应位置并剪切DNA，
最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA 序列也含有与引导RNA 互补配对的序列，
造成引导RNA 错误结合而出现脱靶现象。因此将CRISPR/Cas9 技术应用人类疾病治疗时，
特别要注意安全性和伦理方面的问题，D 正确。
故选CD。
23．基因组编辑技术是研究基因生物功能的重要手段，下图是对某生物B 基因进行定点编
辑的过程，该过程中用sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的切割位点，相关说法
正确的是（ ）
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A．靶基因部分序列与sgRNA 通过碱基互补配对原则进行配对
B．核酸内切酶Cas9 可断裂脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键
C．被编辑后的B 基因与编辑前的B 基因互称为非等位基因
D．通过破坏B 基因后生物体的功能变化可推测B 基因的功能
【答案】ABD
【分析】等位基因是指位于同源染色体相同位置，控制相对性状的一对基因。
分析题图：用sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的切割位点并进行切割，进而将
基因Ⅱ切除，连接基因Ⅰ和Ⅲ，形成新的B 基因。
【详解】A、sgRNA 可指引核酸内切酶Cas9 结合到特定的切割位点，因此基因定点编辑前
需要设计与被切割基因两端碱基序列配对的sgRNA，A 正确；
B、核酸内切酶Cas9 可断裂脱氧核糖核苷酸之间的化学键，即磷酸二酯键，B 正确；
C、被编辑后的B 基因与编辑前的B 基因由于位于同源染色体的相同位置，所以它们互称
为等位基因，C 错误；
D、通过破坏B 基因后生物体的功能变化可推测B 基因原有的功能，D 正确。
故选ABD。
24．CRISPR/Cas9 基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑，其原理是由一条单链
向导RNA 引导Cas9 蛋白到一个特定的基因位点对特定的DNA 序列进行切割。通过设计向
导RNA 中20 个碱基的识别序列，可人为选择DNA 上的目标位点进行切割。下列相关叙述
正确的是（ ）
A．Cas9 蛋白由相应基因指导在核糖体中合成，它具有核酸内切酶的特性
B．Cas9 蛋白借助向导RNA 对目标DNA 分子进行定位依赖于碱基互补配对
C．对不同目标基因进行编辑时，可能使用相同的Cas9 蛋白和不同的向导RNA
D．因向导RNA 碱基序列的特异性，Cas9 只能对人为选定的目标位点进行切割
【答案】ABC
【解析】基因编辑又称基因组编辑或基因组工程，是一种新兴的比较精确的能对生物体基
因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程；早期的基因工程技术只能将外源
或内源遗传物质随机插入宿主基因组，基因编辑则能定点编辑想要编辑的基因；基因编辑
依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特
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异性双链断裂（DSB），诱导生物体通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来
修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变，这种靶向突变就是基因编辑；
基因编辑以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方
面展示出了巨大的潜力。
【详解】A、核糖体是蛋白质的合成场所，故Cas9 蛋白质由相应基因指导在核糖体中合成，
Cas9 蛋白可对特定的DNA 序列进行切割，具有核酸内切酶的特性，A 正确；
B、向导RNA 对目标DNA 进行序列识别，从而实现Cas9 蛋白对DNA 分子的定位，这依
赖于碱基对间遵循碱基互补配对原则，B 正确；
C、在使用Cas9 蛋白对不同目标DNA 进行编辑时，由于向导RNA 能识别并结合特定的
DNA 序列，所以应使用Cas9 蛋白和不同向导RNA 进行基因编辑，C 正确；
D、因为该蛋白质类似于限制酶，而限制酶的特点是识别特定序列，并在特定位点进行切
割所以Cas9 蛋白借助单链向导RNA 引导不一定只对人为选定的目标位点进行切割，D 错
误。
故选ABC。
25．2018 年3 月，我国科学家宣布首次利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，精准地将人亨廷
顿舞蹈症基因插入猪成纤维细胞中，成功培育出亨廷顿舞蹈症的模型猪，为治疗人类神经
细胞功能退行性疾病提供了理想的动物模型。有关叙述错误的是（ ）
A．外源基因插入猪成纤维细胞中，其变异类型属于染色体变异
B．以猪成纤维细胞作为受体细胞的主要原因是它具有全能性
C．模型猪的培育涉及体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
D．模型猪为老年痴呆等疾病的病理研究、药物研发提供试验材料
【答案】ABC
【分析】由题文和选项的描述可知：本题考查学生对基因工程、胚胎干细胞及其应用等相
关知识的识记和理解能力，以及获取信息、分析问题的能力。
【详解】外源基因插入猪成纤维细胞中，其变异类型属于基因重组，A 错误；以猪成纤维
细胞作为受体细胞的主要原因是它功能活动旺盛，具明显的蛋白质合成和分泌活动，对不
同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用，B 错误；模
型猪的培育没有涉及体外受精，C 错误；由题意“为治疗人类神经细胞功能退行性疾病提
供了理想的动物模型”可知：模型猪能为老年痴呆等疾病的病理研究、药物研发提供试验
材料，D 正确。
三、非选择题
26．为研究组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）基因的生物学功能，研究者以斑马鱼为研究对
象，通过CRISPR/Cas9 技术构建HDAC8 基因缺失的突变模型（如图1 所示）。
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回答下列问题：
(1)据图1 分析可知：CRISPR/Cas9 基因编辑技术可实现靶向切除HDAC8 基因的原理是
Cas9 蛋白—sgRNA 复合体中sgRNA 识别并与目标DNA 中的靶点序列结合，其中sgRNA
与靶点序列结合的碱基序列为 ；Cas9 蛋白作用于目标DNA 的 （填化学键）使双
链断裂，实现对HDAC8 基因敲除。
(2)sgRNA 是由体外转录形成的，其基因的上游具有 ，该结构的作用是 。
(3)通过对野生型斑马鱼和实施HDAC8 基因敲除的斑马鱼HDAC8 进行检测，结果如图2 所
示（数字表示HDAC8 氨基酸的数量）。研究人员认为HDAC8 基因敲除成功，理由是 ，
功能丧失。出现图2 结果的原因可能是HDAC8 基因转录的mRNA 中 提前出现。
(4)将敲除成功的纯合斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，F1自由交配得F2。将F2不同类型的斑马
鱼标记后放归到有捕食性天敌的野外水域中，一段时间后发现突变纯合子数量明显减少，
而其他类型的数量几乎没变。请结合图3 解释突变纯合子数量变化的原因 。
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【答案】(1) 5'-CAAUG-3' 磷酸二酯键
(2) 启动子 RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
(3) 基因敲除斑马鱼HDAC8 蛋白长度变短 终止密码子
(4)（HDAC8 基因被敲除后使）突变纯合子的运动能力（游动速度、活动性、运动距离
均）下降，更容易被天敌捕捉
【分析】图为CRISPER/Cas9 基因编辑的工作原理，CRISPER/Cas9 基因编辑系统中sgRNA
的碱基序列可以人为任意设计，当其与靶DNA 上某序列发生局部互补结合时，Cas9 蛋白
就可以像“剪刀”一样切断此处的DNA 序列。
【详解】（1）CRISPR/Cas9 基因编辑技术的原理是Cas9 蛋白—sgRNA 复合体中sgRNA 识
别并与目标DNA 中的靶点序列结合，图中靶点序列为3'-GTTAC-5'，根据碱基互补配对原
则，故sgRNA 与靶点序列结合的碱基序列为5'-CAAUG-3'；Cas9 使目标DNA 断裂，故作
用的化学键为磷酸二酯键。
（2）sgRNA 是由体外转录形成的，其基因的上游具有启动子，启动子的功能是RNA 聚合
酶识别和结合的部位，驱动基因转录。
（3）分析图2，基因敲除斑马鱼HDAC8 蛋白长度变短，故推测基因敲除成功。HDAC8 蛋
白长度变短的原因可能是HDAC8 基因转录的mRNA 中终止密码子提前出现。
（4）将敲除成功的纯合斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，F1 自由交配得F2。将F2 不同类型的
斑马鱼标记后放归到有捕食性天敌的野外水域中，一段时间后发现突变纯合子数量明显减
少，而其他类型的数量几乎没变。请结合图3 解释突变纯合子数量变化的原因（HDAC8 基
因被敲除后使）突变纯合子的运动能力（游动速度、活动性、运动距离均）下降，更容易
被天敌捕捉。
27．CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信
息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，sgRNA 是根据靶
基因设计的引导RNA，准确引导Cas9 切割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列。请回答下
列问题：
(1)Cas9 可准确切割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列，由此可见，Cas9 在功能上属于
酶，该过程体现了酶具有 性；此外，Cas9 可准确切割靶基因DNA 序列还依赖于
sgRNA 与靶基因DNA 序列之间的 。
(2)sgRNA 是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23 个连续的碱基组成。
研究发现，sgRNA 有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是 ；解决措施是
。
(3)为了实现某基因的特异性敲除，如图1 所示，科学家将含有3 个不同的但靶向相同基因
的sgRNA 编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。
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注：eflap 是能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP 是增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI 是
归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中。
理论上，一个sgRNA 便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1 所示重组质粒的优势：
(答出两点)。
(4)为筛选特定D 基因“敲除”的果蝇，在D 基因的DNA 断裂位点插入绿色荧光蛋白基因
(EGFP)需构建携带有绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP 基因和His 标签基因(His 标
签由6 个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2 为载体、EGFP 基因的
结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)
编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。
①写出His 基因模板链的碱基序列：5'- -3'。
②为构建融合基因并将其插入载体科研人员设计了一对与EGFP 基因编码区两端序列互补
配对的引物，设计时需在引物 (填“A”或“B”)的5'端增加相应的限制酶识别序列和
His 基因的编码序列，请写出该引物开头的12 个碱基序列：5'- -3'。
【答案】(1) 限制 专一 碱基互补配对
(2) sgRNA 序列过短，易与靶基因以外的DNA 序列互补配对而脱靶 适当增加
sgRNA 的长度，提高其与靶基因识别的特异性
(3)只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选
(4) ATGATGATGATGATGATGCAT A CAATTGATGCAT
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：利用PCR 技术扩增和化学合成法等。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入
植物细胞的方法常用农杆菌转化法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态法。
4、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）Cas9 可准确切割与sgRNA 配对的靶基因DNA 序列，Cas9 在功能上属于限
制酶，该过程体现了酶具有专一性；此外，Cas9 可准确切割靶基因DNA 序列还依赖于
sgRNA 与靶基因DNA 序列之间的碱基互补配对。
（2）sgRNA 是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23 个连续的碱基组成。
由于sgRNA 序列过短，易与靶基因以外的DNA 序列互补配对而脱靶，可以通过适当增加
sgRNA 的长度，提高其与靶基因识别的特异性来解决这个问题。
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（3）由图1 可知，EGFP 是增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI 是归位内切酶，可将质粒随
机插入目标生物的基因组中，理论上，一个sgRNA 便能实现靶基因的敲除，构建图1 所示
重组质粒的优势有：只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿
色荧光进行筛选等。
（4）已知His 标签由6 个组氨酸组成，组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，所
以His 基因模板链的碱基序列为：5'-ATGATGATGATGATGATGCAT-3'；设计与EGFP 基因
编码区两端序列互补配对的引物时要保证限制酶切割位点不能破坏EGFP 基因且标签基因
连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，故需在引物A 的5'端增加相应的限制酶识
别序列和His 基因的编码序列，由图2 分析可知，选择MunI 限制酶，结合组氨酸的密码子
为CAU，起始密码子为AUG，引物序列为：5'-CAATTGATGCAT-3'。
28．研究人员利用最新基因编辑工具CRISPR/Cas9，成功敲除了比格犬的载脂蛋白E
（APOE）基因，培育出动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”。利用“苹果”腹部皮肤体细
胞作为样本，建立细胞系，取其细胞核注入比格犬去核卵母细胞中，形成早期胚胎后进行
胚胎移植，得到了我国首只克隆犬“龙龙”。如图为克隆犬“龙龙”诞生的流程图，回答
下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 系统是由Cas9 蛋白和sgRNA 构成的RNA-蛋白复合体，其中的
负责识别并结合特定DNA 序列，引导Cas9 蛋白对目的基因进行编辑，在实践中发现该系
统有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”的现象，实验发现sgRNA 的序列长短影响成功率，
sgRNA 序列越长脱靶率越 （填“高”或“低”）。
(2)取“苹果”的皮肤细胞，并进行体细胞建系。皮肤细胞在培养过程中，首先应保证其处
于 的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要一定的气体环境
是 。
(3)为了获得较多的卵母细胞，需要对供体实验比格犬注射 ，获得的卵母
细胞应在体外培养到 期。在对卵母细胞去核时，可采用的方法有
________________________（至少答出两种）。
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(4)克隆本质上是一种无性繁殖，该过程的最后一道工序是胚胎移植，其实质是
。胚胎移植前，需对供、受体犬进行 处理，为供体胚胎移入受体提供相同的
生理环境。重构胚通常需要发育到 阶段才能进行胚胎移植。
【答案】(1) sgRNA 低
(2) 无菌、无毒 95%空气加5%CO2 的混合气体
(3) 促性腺激素 MII 中 显微操作法、梯度离心、紫外线短时间照射和化学物
质处理等
(4) 无性繁殖 同期发情 桑葚胚或囊胚
【分析】使用CRISPR/Cas9 技术，需要向要进行编辑的细胞中加入以下组分：人工合成的
短链RNA 和一种来自细菌的核酸酶Cas9。短链RNA 作为“向导”，它的部分序列通过碱
基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑的DNA 序列相结合；核酸酶Cas9 也与短链
RNA 结合，然后切割与“向导”RNA 结合的DNA，使DNA 双链断裂；这种情况下，细胞
内原有的负责修复DNA 切口的酶将“行动”起来，修复断裂的DNA。
【详解】（1）CRISPR/Cas9 系统是由Cas9 蛋白和sgRNA 构成的RNA-蛋白复合体。其中
的sgRNA 负责识别并结合特定DNA 序列，引导蛋白对目的基因进行编辑。sgRNA 的序列
长短影响成功率，sgRNA 序列越长脱靶率越低，因为其通过碱基互补配对与待编辑序列结
合。
（2）细胞在培养过程中，首先应保证其处于无菌、无毒的环境，除了适宜的营养物质、温
度等条件外，还需要一定的气体环境是95%空气加5%CO2 的混合气体。
（3）为了获得较多的卵母细胞，需要对供体实验比格犬注射促性腺激素，其可促进卵巢产
生更多的卵母细胞，获得的卵母细胞应在体外培养到MII 中期。在对卵母细胞去核时，可
采用的方法有显微操作法、梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等。
（4）克隆本质上是一种无性繁殖，该过程最后一道工序是胚胎移植，其实质是早期胚胎在
相同生理环境条件下空间位置的转移。为实现这一工序，需用相应激素对受体母犬进行同
期发情处理，使供体和受体的生理状态相同。重构胚通常需要发育到桑葚胚或囊胚阶段才
能进行胚胎移植。
29．CRISPR-Cas 系统包含CRISPR 基因和Cas 基因（CRISPR 关联基因）两部分，其中
CRISPR 是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病
毒基因的一小段存储到 CRISPR，Cas 基因则位于CRISPR 基因附近或分散于基因组其他地
方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR 序列区域共同发生作用，CRISPR-Cas 系统的组成如
下图所示，现在CRISPR-Cas9（由一条单链向导RNA 和内切核酸酶Cas9 组成）已发展成
为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。回答下列有关问题：
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(1)CRISPR-Cas 系统的形成是细菌与病毒 的结果，在CRISPR-Cas 系统中，
前导区作为启动子，是 识别和结合的部位，能驱动 基
因的表达过程。
(2)CRISPR—Cas 系统中，间隔区应是 ，该系统在细菌中的作用是 。
(3)CRISPR—Cas9 基因编辑技术取代早期基因工程的原因是 ，根据
其组成成分推测其工作的原理并简要叙述 。
【答案】(1) 协同进化 RNA 聚合酶 间隔区
(2) 某些病毒的基因序列/外源DNA 序列 原核生物的一种天然免疫系统
(3) CRISPR—Cas9 基因编辑技术可以对特定位点进行编辑 Cas 蛋白切割外来
DNA 片段，然后将其整合到CRISPR 序列上，CRISPR 序列经过转录、切割成为成熟的
RNA；成熟的crRNA 招募Cas 蛋白复合物特异性切割病毒同源性DNA，起到了免疫作用
【分析】切割DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核
生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条
链中特定部位的磷酸二酯键断开。
【详解】（1）CRISPR-Cas 系统中的CRISPR 是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，
当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到 CRISPR，当病毒再次入侵细胞
的时候起到免疫作用，这是细菌与病毒协同进化的结果。启动子是RNA 聚合酶识别的位点，
其作用的RNA 聚合酶启动（间隔区）基因的转录。
（2）当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到 CRISPR，所以CRISPR—
Cas 系统中，间隔区应是某些病毒的基因序列（外源DNA 序列），CRISPR—Cas 系统原核
生物的一种天然免疫系统，能够阻止病毒的增殖。
（3）由于CRISPR—Cas9 基因编辑技术可以对特定位点进行编辑，所以CRISPR—Cas9 基
因编辑技术能取代早期基因工程。据图可知，CRISPR—Cas9 的组成成分为，CAS 基因序
列、前导区和CRISPR 序列，Cas9（由一条单链向导RNA 和内切核酸酶Cas9 组成）。间
隔区是病毒的基因序列，前导区能启动间隔区基因的表达，所以CRISPR—Cas9 的工作原
理是Cas 蛋白切割外来DNA 片段，然后将其整合到CRISPR 序列上，CRISPR 序列经过转
录、切割成为成熟的RNA；成熟的RNA 招募Cas 蛋白复合物特异性切割病毒同源性
DNA，阻止病毒的增殖，起到了免疫作用。
30．PCR 可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或偏差等问题，而新研发的基于
CRISPR/Cas12a 系统的检测方法，可在低浓度样本中更灵敏，快速识别靶标DNA。该系统
利用gRNA 介导Cas12a 蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通
过检测荧光强度确定靶标DNA 含量，利用Cas12a 检测靶标DNA 的过程如下图所示。回答：
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(1)根据图中信息可推测Cas12a 作用于靶标DNA 时，具有类似 酶和
酶的功能；gRNA 识别靶标DNA，遵循的是 原则。
(2)在构建表达Cas12a 蛋白的载体时，通常是将Cas12a 基因插入到lacZ 基因内，使lacZ 基
因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含
氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到含有Cas12a 基因表达载体的工
程菌，判断的依据是 。
(3)荧光检测时，60 分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是 。
(4)实验研究时，增加NTC 组作对照的作用是 ；g-3+g-7 组可更快检测出靶标
DNA，原因是 。
【答案】(1) 限制 解旋 碱基互补配对
(2)使用的培养基中不含无色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养
上长出的菌落，无论Cas12a 基因是否成功导入都不会出现显色反应
(3)Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同
(4) 排除其他物质介导Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光 g-3+g-7 组在介导
Cas12a 蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用
【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，
③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定；
2、基因工程的三种工具：限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA 连接酶、运载体；
3、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞
筛选出来。
【详解】（1）根据图中信息可推测Cas12a 作用于靶标DNA 时，可以切割靶标DNA，并
能解开靶标DNA，使其与g-3 和g-7 结合，所以Cas12a 具有类似限制酶和解旋酶的功能；
gRNA 识别靶标DNA，遵循的是碱基互补配对原则。
（2）在构建表达Cas12a 蛋白的载体时，通常是将Cas12a 基因插入到lacZ 基因内，使lacZ
基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，而使用的培养基中不含无色底物，所以在
含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养上长出的菌落，无论Cas12a 基因是否成功
导入都不会出现显色反应。
（3）荧光检测时，60 分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是Cas12a 蛋白切割荧光底
物使其发出荧光的物质含量相同。
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（4）实验研究时，增加NTC 组作对照的作用是排除其他物质介导Cas12a 蛋白切割荧光底
物使其发出荧光；g-3+g-7 组可更快检测出靶标DNA，原因是g-3+g-7 组在介导Cas12a 蛋
白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用。
31．党的二十大对保障粮食安全提出了更高要求，马铃薯块基富含淀粉，而且其中的维生
素是所有粮食中最全的，因此我国科学家对马铃薯这种重要粮食作物开展了大量研究。
(1)马铃薯因为自交不亲和，所以只能进行无性繁殖，我国科学家用基因编辑技术定点敲除
二倍体马铃薯的自交不亲和基因获得了二倍体自交系的马铃薯。
①普通（非转基因）马铃薯不能自交的根本原因是 。
②为敲除自交不亲和基因，研究者采用了CRISPR/Cas9 基因编辑技术，如图所示：
该技术利用一段与靶序列互补的向导RNA 引导Cas9 蛋白对特异靶向DNA 进行识别和定点
敲除自交不亲和基因，其中的Cas9 蛋白相当于 酶，若要将自交不亲和基因从目标
DNA 上切除下来，需要设计 种不同的向导RNA。若靶序列为5'-AGCAT……
GTACCT-3'，则设计的向导RNA 中相应的序列应为 。
(2)MAP30 蛋白是一种能使Ⅰ型核酸核糖体失活的蛋白质，实验表明MAP30 蛋白具有抗
pvx 病毒功能，为培育高效表达该基因的马铃薯新品种，科研团队利用农杆菌转化法将
MAP30 基因导入马铃薯细胞内，如图所示：
①选择Ti 质粒做载体的原因是 ，构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择
识别切割质粒，再用 连接。
②个体水平上，可通过 的方法检测转基因马铃薯是否具有抗病毒的特性，具体
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做法是 。
【答案】(1) 存在自交不亲和基因 限制/限制性内切核酸 2 3'-
UCGUA……CAUGGA-5'
(2) Ti 质粒上的T-DNA 可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上
Xbal 和Hindlll DNA 连接酶 接种感染 向转基因马铃薯植株和非转基因马铃
薯植株接种pvx 病毒，观察并对比它们的感染情况
【分析】1、由图可知，CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以定点敲除目标基因。向导RNA 是
一条单链RNA，能够引导Cas9 蛋白到一个特定的基因位点进行切割。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：构建基因文库获取目的基因、利用PCR 技术扩增和人工合成法。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导
入植物细胞的方法有农杆菌转化法、和花粉管通道法。农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵
染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将
其整合到该细胞的染色体DNA 上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti 质粒
的T-DNA 中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。将目的基因导入
动物细胞最有效的方法是显微注射法，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】（1）①普通（非转基因）马铃薯不能自交，科学家通过CRISPR/Cas9 基因编辑
技术定点敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因后可解决自交不亲和现象，说明其不能自交
的根本原因是存在自交不亲和基因。
②识图分析可知，向导RNA 引导Cas9 蛋白对特异靶向DNA 进行识别和定点敲除自交不亲
和基因，Cas9 蛋白能够切割DNA，断裂的是磷酸二酯键，因而Cas9 蛋白具有类似限制酶
的作用。根据题图及题干信息，向导RNA 的识别序列是单链RNA 序列，能够利用碱基互
补配对原则，进行特异性识别目标DNA 的作用，因而必须根据靶（目标）基因的序列
（自交不亲和基因序列）来设计2 种不同的向导RNA。若靶序列为5'-AGCAT……
GTACCT-3'，则根据碱基互补配对原则，设计的向导RNA 中相应的序列应为3'-
UCGUA……CAUGGA-5'。
（2）①利用农杆菌转化法可以将目的基因导入马铃薯细胞内，农杆菌中含有Ti 质粒，在
Ti 质粒中含有T-DNA，即可转移的DNA，选择Ti 质粒做载体可以将目的基因插入到T-
DNA 中，Ti 质粒上的T-DNA 可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上。
构建基因表达载体时需要将目的基因插入到Ti 质粒的T-DNA 中，为避免目的基因与质粒
的反向拼接，同时为了避免破坏目的基因并将其插入启动子和终止子之间，应选择XbaI 和
HindIII 两种限制酶，再用DNA 连接酶连接。
②检测转基因马铃薯是否具有抗病毒的特性，在个体水平上可以用接种感染法。向转基因
马铃薯植株和非转基因马铃薯植株接种pvx 病毒，观察并对比它们的感染情况，如果转基
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因表达成功，那么病毒对转基因马铃薯几乎没有影响。
32．我国科学家利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术成功敲除B 猴成纤维细胞中的生物节律核
心基因BMAL1，并将其与去核的卵母细胞融合，发育形成的早期胚胎植入代孕雌猴，共
获得5 只生物节律紊乱的克隆猴，过程如下图所示。回答下列问题：
(1)需将A 猴卵母细胞体外培养至 期，并通过 进行去核处理，去核的目的是 。这
些克隆猴的遗传物质不与B 猴的100%相同的原因是 。
(2)CRISPR/Cas9 基因编辑系统由单链向导RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白组成，其中sgRNA
与靶DNA 上某序列发生局部互补结合时，Cas9 蛋白就可以像“剪刀”一样切断此处的
DNA 序列。CRISPR/Cas9 基因编辑系统在功能上与 酶相似，其与作用的位点之间的结
合具有 性。
(3)胚胎移植前，应进行同期发情处理，使供、受体生殖器官的生理变化保持 。胚胎移
植的实质是 。
【答案】(1) MⅡ 显微操作 使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自（有
研究价值的）供体细胞 克隆猴的部分遗传物质（如线粒体 DNA）来自受体卵母细胞
(2) 限制性核酸内切 特异＃＃专一
(3) 相同＃＃一致 早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移
【分析】图示过程为体细胞克隆过程，取胚胎成纤维细胞的细胞核，对处于减数第二次分
裂中期的卵母细胞去核，然后进行细胞核移植；融合后的细胞激活后培养到早期胚胎，再
进行胚胎移植，最终得到克隆猴。
【详解】（1）克隆猴是科学家利用核移植技术获得的，核移植前需将A 猴卵母细胞培养
至减数第二次分裂中期（MⅡ），因卵母细胞培养到减数第二次分裂中期才成熟；并通过显
微操作法进行去核操作，这样做的目的是保证克隆猴的遗传物质主要来自B 猴（有研究价
值的）供体细胞，然后将B 猴体细胞注入去核A 猴卵母细胞形成重组细胞。克隆猴的遗传
物质来自于B 猴成纤维细胞的细胞核和A 猴卵母细胞的细胞质，克隆猴的部分遗传物质
（如线粒体 DNA）来自受体卵母细胞，故克隆猴的遗传物质不与B 猴的100%相同。
（2）利用CRISPR/Cas9 技术进行基因编辑，需构建含sgRNA 基因和Cas9 基因的重组
DNA 分子（重组质粒，基因表达载体），并导入受体细胞。sgRNA 依据碱基互补配对原
则与靶序列特异性结合，引导Cas9 蛋白进行切割，Cas9 蛋白与限制（性核酸内切）酶的
功能相似。
（3）在胚胎移植的过程中，供体和受体动物选择好后，一般进行同期发情处理，主要目的
是供、受体的生理状态相同，以保证移植的胚胎能够继续正常发育。胚胎移植的实质是早
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期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
33．番茄是两性植物，既可自花受粉也可异花受粉，具有明显的杂种优势。雄性不育是实
现杂种优势利用的重要途径。
(1)目前番茄雄性不育ms 系的应用最为广泛，ms 基因是野生型植株2 号染色体上MS 基因
（可育基因）中插入一段DNA 序列形成的，由此可见该种雄性不育株的变异类型是 。
(2)番茄幼苗茎秆有两种性状，紫茎（A）对绿茎（a）为显性，研究者将苗期紫茎雄性可育
和苗期绿茎雄性不育两种纯合品系杂交，F1自交，并对F2在苗期和结果期进行调查，结果
如表所示：
F2
检测单株数
可育
株
不育株
苗期紫茎单
株
各取90 株
89 株
1 株
苗期绿茎单
株
1 株
89 株
上述结果说明亲代个体中ms 基因与 （填“A 基因”或“a 基因”）位于同一条染色体
上，依据上述发现，育种工作者选择 番茄幼苗即可获得雄性不育株。
(3)目前雄性不育株多以自然变异为主，可供研究或应用的数量有限。某科研团队利用
CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除雄蕊特异基因SISTR1 成功获得了雄性不育番茄。
CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，sgRNA 可引导
Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。
①CRISPR/Cas9 系统的表达涉及过程I 和II，其中II 过程表示 。
②sgRNA 可引导识别目标DNA 序列的原理是 ，Cas9 蛋白可催化 键断裂，剪切特
定DNA 片段。
③基因编辑是否成功可以通过提取相关基因进行PCR 扩增后经 鉴定。
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【答案】(1)基因突变
(2) a 基因 绿茎
(3) 转录 sgRNA 与目标DNA 可发生碱基互补配对 磷酸二酯键 琼脂糖
凝胶电泳（电泳）
【分析】基因突变：DNA 分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的
改变。
CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，sgRNA 可引导
Cas9 蛋白到特定基因位点进行切割，Cas9 蛋白可以催化磷酸二酯键的断裂。
【详解】（1）ms 基因是野生型植株2 号染色体上MS 基因（可育基因）中插入一段DNA
序列形成的，属于碱基对的增添，是基因突变
（2）据题意，苗期紫茎雄性可育和苗期绿茎雄性不育两种纯合品系杂交，所以亲本的紫茎
雄性的基因型是AAMSMS， 绿茎雄性不育的基因型是aamsms，杂交产生的子一代是
AaMSms，子一代自交后的比例不符合自由组合定律，而是发生了连锁，绿茎雄性不育的
基因型是aamsms，所以ms 基因与a 基因位于同一条染色体上。选择绿茎的番茄幼苗即可
获得雄性不育株。
（3）①II 过程的产物是sgRNA，说明此过程代表的是转录。
②sgRNA 可引导识别目标DNA 序列的原理是碱基互补配对，sgRNA 可引导Cas9 蛋白到
特定基因位点进行切割，所以Cas9 蛋白的作用是使磷酸二酯键断裂。
③基因编辑是否成功可以通过提取相关基因进行PCR 扩增后经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
34．为研究果蝇K 基因的功能，科研人员运用CRISPR 基因编辑技术“敲除”了K 基因。
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(1)CRISPR 系统由向导RNA 和Cas9 核酸酶组成，向导RNA 可与DNA 的一条链通过
原则结合，Cas9 酶能将与之结合的双链DNA 切割，如图1 所示。Cas9 酶与基因工程使用
的限制酶作用的差异是 。
(2)为后续筛选K 基因“敲除”的果蝇，在K 基因DNA 断裂位点插入红色荧光蛋白基因
（RFP）需提供携带有红色荧光蛋白基因的供体质粒。
①应选用 处理图2 所示的质粒和红色荧光蛋白基因，以构建供体质粒，同时避免质粒
自连。
②将Cas9 酶基因、向导RNA 基因和供体质RFP 基因粒导入果蝇的 中，若检测到红
色荧光，则表明K 基因可能被成功“敲除”，该受精卵发育成的果蝇即为F₀ 代果蝇。
(3)为确认K 基因是否被成功“敲除”，科研人员进行了如下实验：
①科研人员用图3 中的引物I、II、III 对F₀ 代果蝇DNA 进行PCR 并电泳检测（大于10kb
片段单次PCR 无法完成扩增）。若敲除成功，则观察到的不同个体电泳条带可能有两种情
况： 或 （长度单位：kb），出现这两种情况的原因是 。
②近年来，科研人员又发现了一种检测基因的方法——Cas12a 酶法。该酶类似Cas9 能够在
向导RNA 的作用下，在特定位点剪切目标DNA 之后，还发挥非定向切割单链DNA 的功
能（如图）。用该方法检测敲除是否成功并排除“脱靶”的方法是：利用 序列设计向
导RNA，取待检测细胞克隆导入 和报告分子，观测指标是 。
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(4)为进一步研究K 基因功能，科研人员做了如下表的实验，由此推测K 基因的功能是
。
子代果蝇个数（只）
野生型♂×野生型♀
103
野生型♂×K 基因“敲除”果
蝇♀
109
K 基因“敲除”果蝇♂×野生
型♀
0
【答案】(1) 碱基互补配对 Cas9 核酸酶不具有识别DNA 分子中特定核苷酸序列
的作用，切割的是与向导RNA 结合的DNA 中的磷酸二酯键，使DNA 双链断裂；限制酶
能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，切割的是DNA 每一条链中特定部位的磷酸二
酯键，使DNA 双链断裂
(2) BamHI、NotI 受精卵
(3) 4kb（或3.5kb） 4kb 和5.5kb（或3.5kb 和5.5kb） RFP 序列按图中方向
正向插入断裂区域，敲除成功的F0 代果蝇可能是敲除杂合体或纯合体、或敲除成功的F0
代果蝇插入了一个或两个RFP 基因（或者RFP 序列按图中方向反向插入断裂区域，敲除成
功的F0 代果蝇可能是敲除杂合体或纯合体、或敲除成功的F0 代果蝇插入了一个或两个
RFP 基因） 目标DNA 向导RNA 基因和Cas12a 酶基因 是否产生绿色荧光
(4)维持雄性果蝇的正常育性
【分析】基因工程的三个工具：限制性内切核酸酶，DNA 连接酶，基因进入受体细胞的载
体。基因工程的四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导
入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
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【详解】（1）CRISPR 系统由向导RNA 和Cas9 核酸酶组成，向导RNA 可与DNA 的一条
链通过碱基互补配对原则结合，Cas9 酶能将与之结合的双链DNA 切割。基因工程使用的
限制酶能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二
酯键断开。Cas9 核酸酶不具有识别DNA 分子中特定核苷酸序列的作用，需要向导RNA 进
行定位后，切割与之结合的双链DNA 中的磷酸二酯键，使DNA 双链断裂。
（2）①为了构建供体质粒，同时避免质粒自连，应选用两种不同的限制酶切割红色荧光蛋
白基因和质粒。分析图2 可知：KpnI 会切开卡那霉素抗性基因，不利于后续筛选；DraIII
会切开复制原点，影响质粒的复制；使用HindIII 与其他酶一起切割质粒时会使质粒上的启
动子缺失，影响基因的表达，所以选用BamHI 和NotI。
②将构建好的表达载体导入果蝇细胞中时，应选用受精卵作为受体细胞，因为动物的受精
卵具有全能性，能发育成完整个体。
（3）①若K 基因敲除成功并导入RFP 基因，F₀ 代果蝇能发出红的荧光，由于K 基因在果
蝇内成对存在，K 基因可能敲除了一个（K 基因敲除杂合子）或两个（K 基因敲除纯合
子），断裂位点也不一定都能插入RFP，且插入的RFP 方向不确定，所以要分情况分析。
情况一：按照图中的方向将RFP 基因序列正向插入断裂位置，若果蝇为K 基因敲除纯合子
且在K 基因DNA 断裂位点都插入了RFP，由于大于10kb 片段单次PCR 无法完成扩增，
PCR 只能获得引物I 和引物III 之间4kb 的片段；若果蝇为K 基因敲除纯合子但只有一条染
色体上的K 基因断裂位点插入RFP，或者果蝇为K 基因敲除杂合子，则除了获得引物I 和
引物III 之间4kb 的片段，还可以获得未插RFP 基因时或未被敲除的K 基因上引物I 与引物
II 之间5.5kb 的片段。
情况二：将图中RFP 基因序列反向插入断裂位置，若果蝇为K 基因敲除纯合子且在K 基因
DNA 断裂位点都插入了RFP，由于大于10kb 片段单次PCR 无法完成扩增，PCR 只能获得
引物II 和引物III 之间3.5kb 的片段；若果蝇为K 基因敲除纯合子但只有一条染色体上的K
基因断裂位点插入RFP，或者果蝇为K 基因敲除杂合子，则除了获得引物II 和引物III 之间
3.5kb 的片段，还可以获得未插RFP 基因时或未被敲除K 基因时引物I 与引物II 之间5.5kb
的片段。
②Cas12a 酶法类似Cas9 能够在向导RNA 的作用下，在特定位点剪切目标DNA 之后，还
发挥非定向切割单链DNA 的功能。所以应利用特定位点剪切的目标DNA 序列，根据碱基
互补配对的原则，设计向导RNA，取待检测细胞克隆导入向导RNA 基因、Cas12a 酶基因
和报告分子。在细胞体内，向导RNA 与目标DNA 结合，然后Cas12a 酶在向导RNA 结合
位点剪切目标DNA，然后Cas12a 酶发挥非定向切割单链DNA 的功能，剪切报告分子，报
告分子中的淬灭基团和绿色荧光基团分离，绿色荧光基团发出绿色荧光，所以可以通过观
察是否产生绿色荧光判断敲除是否成功并排除“脱靶”。
（4）野生型♂×野生型♀、野生型♂×K 基因“敲除”果蝇♀两组相比，子代个体数相近，
说明K 基因“敲除”不影响雌性个体的育性；而K 基因“敲除”果蝇♂×野生型♀杂交没
有子代，说明K 基因“敲除”影响雄性个体的育性，即K 基因的作用是维持雄性果蝇的正
常育性。
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35．基因驱动是指特定基因有偏向性地遗传给下一代的自然现象。CRISPR/Cas9 基因编辑
系统包含Cas9 基因和sgRNA 编码序列（gRNAs），科学家借助该系统研发出人工基因驱
动系统，并在拟南芥和蚊子等生物中实现了外部引入的基因多代遗传。在作物快速育种、
根除疟疾等方面具有广阔的前景。请回答下列问题：
(1)为研发拟南芥蓝光受体CRY1 基因驱动系统，科学家首先构建了基因驱动元件，将基因
驱动元件精确插入到一条染色体上的CRY1 基因中，过程如图1 所示。
①将基因驱动元件导入拟南芥细胞，在细胞中表达Cas9/sgRNA 复合物，该复合物通过
识别和结合DNA 特定序列，并引导Cas9 酶切断DNA 双链的 ，从而将基因驱动
元件插入到CRY1 基因中，该过程属于定点 （基因突变/染色体变异）。
②为确定基因驱动元件是否插入CRY1 基因，选择引物 进行PCR-电泳，结果如图
2。条带1 的大小约为7800bp，条带2 的大小约为3200bp。基因驱动元件成功插入的是条
带 ，基因驱动元件的大小约为 左右。
(2)当携带基因驱动元件的动物与野生型动物交配时，它们的后代从父母中各获得一份DNA
副本：自然版本和基因驱动版本。受精后，来自不同亲本的染色体排列在一起时，基因驱
动DNA 中的CRISPR 被激活。它能识别对侧染色体上自然基因的拷贝，并在胚胎发育开始
前引导Cas9 酶切除自然拷贝。一旦自然基因受损，细胞的特殊修复机制就会启动，修复丢
失的DNA，但它使用未断裂的染色体（携带基因驱动的染色体）作为模板。所以当修复完
成后，两条染色体都携带一份基因驱动的拷贝。此过程被称为同源定向修复。
①用CRY1 基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，F1中有多达8％的植株为纯合突变
体。纯合突变体产生的原因是F1中来自母本的基因驱动序列通过同源定向修复，使来自父
本的 （部位）上也插入CRY1 基因驱动元件。
②用基因驱动技术改造传播疟疾的按蚊X 染色体上的A 基因获得a 基因，已知含a 基因的
精子不能成活。用改造后的纯合雌蚊突变体与野生型雄蚊交配获得子一代，子一代相互交
配，子二代中的性别组成为 ，且子二代中含有a 基因的比例 （填“大于”
“等于”或“小于”）1/2。若将基因驱动雌蚊释放到疟疾疫区，可通过 降
低按蚊的种群密度。
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【答案】(1) sgRNA 磷酸二酯键 基因突变 P1 和P4 1 4600bp
(2) 同源染色体上 (全)雄 大于 破坏按蚊种群的性别比例，降低出生率
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的
构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。基因工程的三种工具：限
制性核酸内切酶（限制酶）、DNA 连接酶、运载体。
【详解】（1）①CRISPR/Cas9 基因编辑过程中，将基因驱动元件导入拟南芥细胞，在细
胞中表达Cas9/sgRNA 复合物，该复合物通过sgRNA 按照碱基互补配对原则来识别和结合
DNA 特定序列，并引导Cas9 蛋白酶切断DNA 双链中的磷酸二酯键，从而将基因驱动元件
插入到CRY1 基因中，该过程属于定点基因突变。
②子链从引物的3’进行延伸，为确定基因驱动元件是否插入CRY1 基因，选择引物P1 和
P4 进行PCR-电泳，其中M 加样孔加入的是已知大小的不同长度的DNA 混合物，即标准样
液。基因驱动元件成功插入CRY1 基因，使得PCR 扩增出的条带变长，碱基对数量增多，
对应条带1，则条带2 是未插入基因驱动元件的CRY1 基因，所以基因驱动元件的大小约为
7800bp-3200bp=4600bp。
（2）①由于F1 中来自母本的基因驱动序列通过同源定向修复，使来自父本的同源染色体
上也插入CRYI 基因驱动元件，所以用CRYI 基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，
F1 中有多达8%的植株为纯合突变体。
②雌蚊突变体基因型为XaXa，野生型雄蚊基因型为XAY，杂交后代雌性基因型为
XAXa，雄性基因型为XaY。子一代相互交配，由于含a 基因的精子不能成活，只产生Y
一种精子，因此子二代的性别是全雄，由于F1 中有多达8%的植株为纯合突变体，即F1 中
有8%的XAXa 变成了XaXa，因此，子二代中含有a 基因的比例大于1/2。若将基因驱动雌
蚊释放到疟疾疫区，因为破坏了按蚊种群的性别比例，导致出生率下降，种群密度下降，
所以疟疾发病率将会下降。
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