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高中生物·基因工程(必会知识点)
高中生物·基因工程(必会知识点)又叫 DNA 重组技术，是按照人们的意愿，把一种生物的某个基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向改造生物的遗传性状。 ✅ 区分：DNA 连接酶（连片段）；DNA 聚合酶（只能从引物后添加单个脱氧核苷酸，不能连接两个独立 DNA 片段） 常用：质粒（最常用）、λ噬菌体衍生物、动植物病毒 目的基因：编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子 获取方法： - 扩增规律：循环 n 次，DNA 总数 = 2^n 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 表达载体组成（按顺序理解）： 启动子 + 目的基因 + 终止子 + 标记基因 + 复制原点 植物细胞：导入方法为农杆菌转化法（最常用）；要点：Ti 质粒上 T-DNA 可转移至受体细胞，整合到受体细胞染色体 DNA 上，另外还有基因枪法、花粉管通道法。 动物细胞：导入方法为显微注射法；要点：受体一般是受精卵（动物体细胞全能性受限）。 微生物（大肠杆菌）：导入方法为 Ca²⁺ 处理法；要点：Ca²⁺ 处理，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态 → 感受态细胞。 分 分子水平检测 + 个体生物学水平鉴定 探针：放射性同位素（或荧光）标记的含目的基因的单链 DNA - 注意：不能修复原有缺陷基因，只是补充正常基因 预期蛋白质功能 → 设计预期蛋白质结构 → 推测应有的氨基酸序列 → 找到对应的脱氧核苷酸序列（基因） - 本质：改造基因（直接改造蛋白质不行，蛋白质不能遗传；改造基因可以遗传）
一、基因工程概念
原理：基因重组 操作水平：DNA 分子水平 优点：定向改造性状；克服远缘杂交不亲和障碍
二、三大工具
1. 限制性核酸内切酶（限制酶）
来源：主要来自原核生物 作用：识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 特点：专一性（识别特定序列，在特定位点切割） 切割结果： 黏性末端：错开切，留下突出单链 平末端：在识别序列中轴线处同时切开 例：EcoR I、Sma I
2. DNA 连接酶
作用：恢复两个 DNA 片段之间的磷酸二酯键 分类： E·coli DNA 连接酶：只能连接黏性末端 T4 DNA 连接酶：既可连黏性末端，也可连平末端（平末端效率低）
3. 载体（运载体）
质粒：裸露、结构简单、独立于拟核 DNA 之外、能自我复制的小型环状双链 DNA 分子 载体必备 4 个条件：
能在受体细胞中自我复制，或整合到染色体 DNA 上随染色体 DNA 同步复制 有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 插入 有标记基因（如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因），便于筛选含有目的基因的受体细胞 对受体细胞无害
三、基因工程四步核心操作（重中之重）
步骤 1：目的基因的获取
1. 从基因文库中获取
基因组文库：包含某种生物全部基因 cDNA 文库：由 mRNA 反转录得到，无启动子、终止子、内含子
2. PCR 技术扩增（高频考点）
全称：多聚酶链式反应 原理：DNA 的半保留复制 条件：模板 DNA、引物、dNTP（原料）、热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶） 过程（三步循环）：
变性：90～95℃，DNA 双链解旋 复性（退火）：55～60℃，引物结合到互补 DNA 链 延伸：70～75℃，Taq 酶从引物起始合成互补链
3. 人工合成：基因比较小、核苷酸序列已知，直接化学合成
步骤 2：基因表达载体的构建（核心步骤）
启动子：RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出 mRNA（在基因上游，DNA 片段，不是起始密码子） 终止子：位于基因下游，终止转录（不是终止密码子） 起始密码、终止密码：在 mRNA 上，控制翻译的开始和停止
步骤 3：将目的基因导入受体细胞
步骤 4：目的基因的检测与鉴定
检测是否插入目的基因：DNA 分子杂交技术（探针 + 基因组 DNA） 检测是否转录出 mRNA：分子杂交技术（探针 + mRNA） 检测是否翻译出蛋白质：抗原—抗体杂交 个体水平鉴定：直接看生物性状（如抗虫棉做抗虫接种实验）
四、基因工程的应用
植物：抗虫（Bt 毒蛋白基因）、抗病、抗逆、改良品质 动物：提高生长速度；乳腺生物反应器（目的基因与乳腺蛋白基因的启动子重组，从乳汁获取产物）；器官移植（降低免疫排斥） 医药：工程菌生产药物（胰岛素、干扰素、乙肝疫苗等） 基因治疗：把正常外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥功能，治疗遗传病；分为体外基因治疗、体内基因治疗
五、蛋白质工程（对比基因工程，极易考辨析）
基因工程：生产自然界已存在的蛋白质，流程：基因 → 表达 → 蛋白质 蛋白质工程：生产自然界不存在的蛋白质，属于第二代基因工程 蛋白质工程流程：
六、易混易错汇总（必背）
限制酶切割位点在磷酸二酯键；解旋酶断开氢键 启动子、终止子在 DNA；起始密码、终止密码在 mRNA cDNA 无启动子、终止子、内含子；基因组文库的基因有 PCR 不需要解旋酶，靠高温变性解旋；体内 DNA 复制需要解旋酶 农杆菌转化法：T-DNA 整合到植物细胞染色体 DNA 标记基因作用：筛选受体细胞；不能鉴定目的基因是否表达 基因工程变异类型：基因重组；不是基因突变 乳腺生物反应器：启动子必须是乳腺蛋白基因启动子，才能让基因只在乳腺细胞表达
七、公式/表达式
PCR：子代 DNA = 2^n 碱基、化学键：磷酸二酯键、氢键 杂交技术：DNA 分子杂交、分子杂交、抗原—抗体杂交
