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第61 课时 基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求
1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发
展起来的。2.阐明重组DNA 技术的三种基本工具。3.阐明基因工程的基
本操作程序。
考情分析
1.基因工程的基本工具
2023·新课标·T6 2021·全国乙·T38 2021·湖
北·T7
2.基因工程的基本操作
程序
2023·全国乙·T38 2023·全国甲·T38 2023·湖
北·T4 2023·广东·T20
2021·广东·T22
考点一 基因工程的基本工具
1．基因工程的概念
2．基因工程的诞生和发展
(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA 是遗传物质，还证明了DNA 可在同种生物不同个
体之间________。
(2)DNA 双螺旋结构的提出和______________的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)______________的破译。
(5)基因转移载体的发现。______________________________的发现为DNA 的切割、连接以
及功能基因的获得创造了条件。
(6)________体外重组的实现。
(7)重组DNA 表达实验的成功。
(8)DNA 测序和合成技术的发明。
1
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(9)________技术的发明。
(10)________________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3．重组DNA 技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
提醒 ①限制酶的识别序列一般由6 个核苷酸组成，少数由4 个、8 个或其他数量的核苷酸
组成。
②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
③在切割含目的基因的DNA 分子时，需用限制酶切割两次此DNA 分子，产生4 个末端。
只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶
(3)载体
2
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(1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的( )
(2)DNA 连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA( )
(3)限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( )
(4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因( )
将从苏云金杆菌中获取的Bt 基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种
分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示
常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)请用图示法写出限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割后形成黏性末端的过程。
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
归纳总结 限制酶的选择
3
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(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所
选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标
记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选
成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正
常表达标记基因，造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般
需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所
在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免
目的基因与载体反向连接，即用DNA 连接酶连接后形成的重组DNA 分子上，目的基因和
载体启动子的方向(或描述为“RNA 聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入
后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择
某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
考向一 辨析基因工程的基本工具
1．(2021·湖北，7)限制性内切核酸酶EcoR Ⅰ识别并切割
双链DNA，用
EcoR Ⅰ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA 片段的平均长度(碱基对)约为( )
A．6 B．250 C．4 000 D．24 000
2．(2024·连云港高三调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，
通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶
切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入
(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是( )
项目
细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况
细菌在含四环素的培养基上生长情况
①
能生长
不能生长
②
能生长
能生长
4
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③
不能生长
能生长
A.质粒的复制原点上有RNA 聚合酶的结合位点
B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2 个
D．将外源基因与质粒连接时需用DNA 聚合酶
归纳提升 与DNA 有关的几种酶的比较
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞________或获得预期
______________等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知__________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用________________和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR__________和扩增目的基因
a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据________________________的原理，在体外提供参与
DNA 复制的各种__________与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行__________的技术。
b ．PCR 反应的条件：一定的______________ 、DNA 模板、2 种________ 、4 种
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__________________、____________DNA 聚合酶，以及能自动调控________的仪器。
c．PCR 扩增的过程
d．PCR 产物的鉴定：常采用____________________来鉴定。
归纳提升 PCR 技术和DNA 复制的比较
③通过构建______________来获取目的基因。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因______________________________________，同时，使目的基因能够
表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
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提醒 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
本质
DNA
DNA
mRNA
mRNA
位置
目的基因上游
目的基因下游
mRNA 首端
mRNA 尾端
功能
RNA 聚合酶识别
和结合的部位，驱
动基因转录出
mRNA
使转录在所需要的
地方停下来
翻译的起始信号
(编码氨基酸)
翻译的结束信号
(正常情况下，不
编码氨基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法、
________________________
________________________
________________________
显微注射法
__________处理法
受体细胞
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti 质粒的T
－DNA 中→农杆菌→导入
植物细胞→整合到受体细胞
的染色体DNA 上→表达
将含有目的基因的表
达载体提纯→取卵
(受精卵)→显微注射
→受精卵发育→获得
具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→细胞
处于一种能吸收周围
环境中DNA 分子的
生理状态→基因表达
载体导入
辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此
处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti 质粒的T－DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入
目的基因的T－DNA 拼接到受体细胞的染色体DNA 上；第一次导入是将含目的基因的Ti 质
粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA 导入受体细胞。
4．目的基因的检测与鉴定
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(1)目的基因一定是编码蛋白质的基因( )
(2)真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR 反应缓冲溶液中一般要添
加Mg2＋( )
(3)基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束( )
(4)Ti 质粒上的T－DNA 可与植物受体细胞的染色体DNA 整合在一起( )
(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体( )
(6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术( )
1．Bt 抗虫蛋白基因(简称Bt 基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt 基因后
可以利用PCR 技术对其进行大量扩增。回答下列问题：
(1)什么是引物？DNA 复制时为什么需要引物？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(2)PCR 扩增Bt 基因需要知道Bt 基因的全部核苷酸序列吗？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(3)为检测Bt 基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经
逆转录过程获得总cDNA，通过PCR 技术可在总cDNA 中专一性地扩增出Bt 基因的
cDNA，原因是什么？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(4)PCR 扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt 毒蛋白基因在PCR 中经过n 轮循
环，理论上得到多少个DNA 分子？含引物的DNA 分子多少个？含其中一种引物的DNA 分
子多少个？同时含两种引物的DNA 分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核
苷酸链的DNA 分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA 分子多少个？
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________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(5)PCR 扩增Bt 基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA 聚合酶应具有什
么特点？
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________________________________________________________________________________
2．据图分析抗虫棉的培育过程。
(1)该过程中的目的基因是________________，载体是__________。
(2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割目的基因，这样做的原因是什么？
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________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要
求？
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________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
(4)该实例中，导入目的基因的方法是______________。为什么目的基因可以整合到染色体
的DNA 上？
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(5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA 或叶绿体DNA 上？
为什么？
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(6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
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考向二 辨析基因工程的基本操作程序
3．(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建
的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表
达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet 的培养基中能形
成菌落
4．(2024·江苏扬州中学高三模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti 质粒上的T－DNA 片段转
入植物的基因组。利用农杆菌以Ti 质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是( )
A．目的基因应插入T－DNA 片段外，以防止破坏T－DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti 质粒是一种环状DNA 分子，没有双螺旋结构
D．可以用PCR 技术检测外源DNA 是否整合到植物的染色体DNA 上
1. (选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过______________等技术，赋予生物新
的______________，创造出更符合人们需要的新的______________________。
2．(选择性必修3 P71)限制酶能够识别________________________________，并且使每一条
链中特定部位的磷酸二酯键断开。
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3．(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于________________________。
4 ．( 选择性必修3 P77)PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供
________________ 、________________ 、4
种________________ 和耐高温的
________________。
5．(选择性必修3 P77)真核细胞和细菌的____________________都需要Mg2＋激活。因此，
PCR
反
应
缓
冲
液
中
一
般
要
添
加
Mg2
＋
。
引
物
是
一
小
段
______________________________________
，
引
物
的
作
用
是
__________________________________________。
6．(选择性必修3 P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因_________________________，
同时，使目的基因能够________________________。基因表达载体是载体的一种，除目的基
因、________________外，还必须含有启动子、终止子等。启动子是__________________识
别和结合的部位，有了它才能驱动基因____________________，最终表达出人类需要的
____________。
7．(选择性必修3 P81)转化：____________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
8．(选择性必修3 P81 ～82)将目的基因导入植物细胞的方法是____________________、
______________；
导入动物细胞的方法是________________；导入微生物细胞的方法是____________________
处理法。
9．(选择性必修3 P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过________
等技术检测棉花的染色体DNA 上是否插入了Bt 基因或检测Bt 基因是否转录出了mRNA；
从转基因棉花中提取____________，用相应的________进行____________________，检测
Bt 基因是否翻译成Bt 抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过
________________________________________来确定Bt 基因是否赋予了棉花抗虫特性以及
抗性的程度。
10 ．如图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点为：Hind
Ⅲ(A↓AGCTT) 、Pvit Ⅱ(CAG↓CTG) 、Kpn Ⅰ(G↓GTACC) 、EcoR Ⅰ(G↓AATTC) 、
Pst Ⅰ(CTGCA↓G)、BamH Ⅰ(G↓GATCC)。为使phb2 基因(该基因序列不含图中限制酶的识
别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入____________________和
__________________两种不同限制酶的识别序列。将经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体
进行连接时，可选用____________________(填“E.coli DNA 连接酶”或“T4 DNA 连接
酶”)。
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