应用文档 | 荧光寿命流式细胞术:为单细胞分析引入时间维度

流式细胞术（Flow Cytometry）是生命科学研究中广泛使用的单细胞分析技术。借助鞘流系统，悬浮液中的细胞逐一通过激光检测区域，仪器采集散射光和荧光信号，对细胞的物理特征、分子表达及群体组成进行快速分析。现代流式细胞仪的分析速度可达每秒数万个细胞，广泛应用于免疫学、肿瘤学、细胞生物学及临床诊断等领域。

传统荧光流式细胞术主要依靠荧光强度和发射光谱区分不同的细胞群体。随着多色荧光检测技术的发展，研究人员能够同时获取越来越多的细胞表型信息，但不同荧光团之间的光谱重叠、信号强度差异以及背景自发荧光，仍然会影响部分测量的准确性。

除了荧光强度和光谱，荧光信号还包含另一个可供分析的参数：荧光寿命（Fluorescence Lifetime)。

荧光寿命流式细胞术（Fluorescence Lifetime Flow Cytometry，FLFC）正是利用这一时间维度，为单细胞分析提供额外的测量信息。

荧光分子吸收光子后进入激发态，随后通过辐射和非辐射跃迁返回较低能态。荧光寿命描述的是荧光分子处于激发态的平均时间，通常在纳秒量级。

与荧光强度不同，荧光寿命通常不直接依赖于激发光强度和荧光团浓度，而与分子的辐射及非辐射跃迁过程有关。因此，荧光寿命不仅能够作为区分荧光团的依据，还能够反映分子所处的微环境及其相互作用状态。

在流式细胞分析中，引入荧光寿命主要具有两方面的应用价值。

荧光寿命测量既可以采用频域方法，也可以采用时域方法。其中，时间相关单光子计数（Time-Correlated Single-Photon Counting，TCSPC）是实现高时间分辨率荧光寿命测量的重要技术。

在基于 TCSPC 的 FLFC 系统中，脉冲激光照射流经检测区域的细胞，激发产生的荧光经滤光片和光学系统收集后，由光电倍增管（PMT）或单光子雪崩二极管（SPAD）等探测器转换为电脉冲。

高精度时间电子学设备分别记录激光同步信号和荧光光子的到达时间。通过计算光子相对于激发脉冲的时间差，并对大量光子事件进行统计，即可构建荧光衰减直方图，进而提取荧光寿命信息。

对于流式细胞术，测量还需要确定哪些光子来自同一个细胞。研究人员可以结合散射光信号、荧光计数随时间的变化或其他细胞检测方法，将连续采集的光子事件归属于各个细胞。

由此，每个细胞不仅具有荧光强度等传统测量参数，还可以获得相应的荧光衰减特征。

寿命信息可通过指数衰减拟合或相量分析（Phasor Analysis）等方法提取。其中，相量分析将荧光衰减映射到二维相量空间，便于比较不同细胞群体的荧光寿命特征。

图1 基于 TCSPC 的 FLFC 系统示意图

与固定样品的荧光寿命测量不同，FLFC 必须在细胞快速通过激光检测区域的有限时间内完成光子采集。

这使测量面临两个相互关联的问题。

对于多激光、多探测器系统，还需要考虑不同通道之间的时间同步，以及多路光子数据的并行采集和分析。

SwabianInstruments - 施瓦本仪器® TimeTagger 采用时间标记架构，能够记录激光同步信号与单光子探测事件的时间信息，为基于 TCSPC 的 FLFC 系统提供时间测量和数据采集平台。

在实际应用中，TimeTagger 主要发挥以下作用：

虽然荧光寿命流式细胞术近年来得到越来越多科研人员的关注，但相较于成熟的强度和光谱流式细胞术，其应用仍处于持续发展阶段。

荧光寿命的引入，使研究人员能够在传统细胞表型分析之外，进一步利用荧光衰减动力学研究分子环境和细胞代谢状态。与此同时，高速流动条件下的有限光子统计量、细胞事件识别及实时数据处理，也对测量系统提出了新的要求。

对于基于 TCSPC 的研究方案，SwabianInstruments-施瓦本仪器®TimeTagger提供了高精度、多通道的时间标记能力，以及灵活的软件测量与数据处理接口，特别适合需要自主搭建和开发测量系统的科研团队。