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6 基因工程类大题突破
1.(2023·湖南长沙模拟)为使甘蓝具有抗除草剂能力,科研人员将除草剂草甘膦抗性基因
转入甘蓝植株,获得抗草甘膦转基因甘蓝。
(1)草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下,采用PCR 技术获取和扩增草甘膦抗性基因,
应选用的引物组合为( )
A.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'
B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3'
C.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3'
D.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3'
(2)基因工程中最核心的步骤是 (填数字编号),其目的是
。
(3)步骤②用 处理农杆菌后获得感受态细胞,以便将重组质粒导入。步骤③
将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后,在步骤④的培养基中添加 以便筛选出
含目的基因的甘蓝植株。
(4)若目的基因用BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ剪切,质粒用BamH Ⅰ剪切,酶切后的目的基因存在正
向与反向两种连接方式,可用 酶对两种重组质粒进行剪切,通过凝胶电泳分
析产物大小进行区分,如下图所示,图中 (填“样品1”或“样品2”)为所需基
因表达载体。
限制酶
识别序列和切割位点
BamH Ⅰ
2
Bgl Ⅱ
EcoR Ⅰ
2.(2023·湖北模拟)玉米是我国乃至全球总产量最高的粮食作物,玉米植株一般为雌雄同
株异花,同时也存在只有雄花序的雄株和只有雌花序的雌株。玉米的性别由独立遗传的
两对等位基因(E/e 和T/t)控制;其中E 和T 同时存在时,表现为雌雄同株异花;仅有T 而没
有E 时,表现为雄株;t 隐性纯合时,表现为雌株。
(1)选取雌雄同株纯合子和雌株进行杂交,获得F1后自交得到F2。若F2中不出现雄株,则
亲本的基因型分别为 ;若F2中出现3/16 雄株,则亲本的基因型分别为
。
(2)若一雄株与一雌株杂交,子代中雌株占1/2,则亲本可能的基因型有
(写出两种基因型组合)。
(3)培育抗除草剂玉米可有效降低玉米种植中的劳动总量。草甘膦是目前世界上使用最
广泛的除草剂,EPSPS 基因是常用的抗草甘膦基因。
①EPSPS 基因某条链的末端序列如下图:
图1
采用PCR 技术获取和扩增EPSPS 基因时,所需要的两种引物序列分别为
(标出5'和3'端)。
②下表为相关限制酶及其识别序列,图2 为经切割得到的目的基因及末端(除黏性末端序
列外,其他碱基序列省略),图3 为所使用的质粒,其中Tetr、Ampr为标记基因。
限制酶
BamH Ⅰ
Bcl Ⅰ
Sma Ⅰ
Sau3A Ⅰ
识别位
点及切
割位点
图2
3
图3
据图3 可知,将EPSPS 基因导入玉米细胞的方法为 ;对质粒进行酶切应选
用的两种限制酶为 。
③用重组质粒转化玉米幼胚后,向培养基中加入草甘膦筛选出成功导入目的基因的幼胚。
提取培养后的植株DNA,进行目的基因的检测和鉴定,从玉米细胞提取DNA 过程中,加
入预冷的酒精的目的是 。
④下表为鉴定含EPSPS 基因植株的4 种方法。预测同一后代群体中,4 种方法检出的含
EPSPS 基因植株的比例从小到大依次是 。
方法
检测对象
检测目标
检出的含G 基
因植株的比例
PCR
扩增
基因组DNA
EPSPS 基因
X1
分子
杂交
总mRNA
EPSPS 基因转录产物
X2
抗原—
抗体杂交
总蛋白质
EPSPS 基因编码的蛋白质
X3
喷洒除
草剂
幼苗
抗草甘膦幼苗
X4
3.(2023·福建龙岩三模)重组PCR 技术是一项新的PCR 技术,通过重组PCR 技术能将两
个不同的DNA 连接成为一个新DNA 分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到
LTB 和ST1 两个基因片段,利用重组PCR 技术构建了LTB—ST1 融合基因,制备过程如图
1 所示。回答下列问题。
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图1
(1)利用PCR 技术扩增目的基因的过程中,向反应体系中加入的物质除了引物和模板链
外,还需要加入 。利用PCR 技术扩增目的
基因,依据的生物学原理是 。
(2)从P2、P3 两种引物的角度分析,LTB 和ST1 基因能够融合的关键是PCR1 和PCR2 不
能在同一个反应体系中进行,原因是
。
(3)②过程 (填“需要”或“不需要”)加入引物,原因是
。
(4)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因,将反应后体系中的各种DNA 分子进行
电泳,结果如图2 所示。则融合基因最可能是 。
图2
4.(2023·山东济南模拟)研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶(LA)的细菌,经诱变
后获得两突变体菌株。突变体1 菌株产生的酶LA1 可耐高温,突变体2 菌株产生的酶
LA2 具有高催化效率,且LA1 基因和LA2 基因具有93%的同源性。研究人员期望采用
PCR 技术通过基因重组的方法优化基因序列,获得更适于高效生产的酶。回答下列问题。
(1)采用PCR 技术扩增LA1 时,除模板、原料、酶、缓冲液等条件外,还需加入引物,引物
的作用是 。
(2)LA1 基因的序列如图1 所示,若只使用1 种引物,其他条件无误,PCR 后只合成出了与
模板b 链相同的单链。该实验使用的引物序列5'- -3'(写
5
出引物对应的15 个碱基),若扩增图中序列时引物选择正确,PCR 操作过程没有问题,但对
产物进行电泳时,发现除了目标序列外还有很多非特异性条带,请分析出现此情况的原因。
(2 点即可)。
图1 LA1 基因
(3)传统的基因重组可采用限制酶切再用DNA 连接酶连接的方式获得重组的基因,但存
在工作量大、效率低等缺点,交错延伸PCR 技术可以解决以上问题。此技术采用LA1、
LA2 均作模板,具体流程如图2(仅显示其中一条链延伸情况)。经过过程①80 轮交错循
环后,可获得PCR 混合产物,请比较PCR 过程中的第三个步骤中,交错延伸PCR 与普通
PCR 技术的区别是 。最终获
得的混合PCR 产物中,DNA 分子的种类数为 (填字母)。
a.4 种 b.16 种
c.64 种
d.无法计算
获得的重组LA 基因中,同时具有LA1 和LA2 基因序列的原因是
。
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图2
(4)将所获得的PCR 混合产物插入PM 质粒,图中A 为启动子、B 为氯霉素抗性基因
cat,C 为终止子,D 为asd-突变基因[asd 基因是编码细菌二氨基庚二酸(DAP)合成途径的
关键酶,DAP 是细菌细胞壁的主要成分,asd 基因缺失时,将导致菌株生长对DAP 依赖],E
为复制原点,箭头处指不同限制酶的识别位点。为使目的基因定向插入PM 质粒,交错延
伸的PCR 过程引物的5'端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和
鉴定,作为受体菌应采用asd 基因 的受体菌,能从含有PM 质粒、重组PM
质粒的受体菌中将含有重组PM 质粒的受体菌筛选的选择思路为
。
答案：
1.答案 (1)A
(2)① 使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可以遗传给下一代,同时使目的基因能够
表达和发挥作用
(3)Ca2+ 潮霉素
(4)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ 样品2
解析 (1)图1 所示碱基序列磷酸端为5'端,羟基端为3'端,在进行PCR 操作时,引物应分别
与基因两条链的3'端根据碱基互补配对原则结合,根据图中两端序列,通常选择5'-
CTTGGATGAT-3'(上面链的引物)和5'-TCTGTTGAAT-3'(下面链的引物)作为引物对。
(2)步骤①为基因表达载体的构建,是基因工程中最核心的步骤;目的是使目的基因在受
体细胞中稳定存在,并可遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。(3)步骤
②用Ca2+处理农杆菌获得感受态细胞;T-DNA 也称为转移DNA,是Ti 质粒上的一段
DNA,可整合到受体细胞的染色体DNA 上,潮霉素抗性基因在T-DNA 片段中。在步骤
④的培养基中可添加潮霉素以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。(4)据图表可知,
BamH Ⅰ切割得到的黏性末端为5'-GATC,Bgl Ⅱ切割得到的黏性末端也为5'-GATC,其
黏性末端相同,故剪切后的目的基因能与质粒连接在一起;重组质粒形成后,在重组质粒
上不再有Bgl Ⅱ的识别位点,质粒上有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别位点,目的基因的编码
顺序是从BamH Ⅰ到Bgl Ⅱ,用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ会将正向连接的目的基因片段剪切去
除;正向连接的重组质粒会被切去20+25=45(kb)长度的片段,反向连接的重组质粒会被切
去20 kb 长度的片段,电泳凝胶中,DNA 相对分子质量越大,在凝胶中受到的阻力越大,迁
移距离越短,正向连接的重组质粒被切割后两个片段的大小介于反向连接的重组质粒被
切割后两个片段的大小之间,说明样品2 是所需的基因表达载体。
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2.答案 (1)EETT、EEtt EETT、eett
(2)eeTt×Eett 或eeTt×eett 或eeTt×EEtt(写出两种即可)
(3)①5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3' ②农杆菌转化法 Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ
③析出DNA(使DNA 形成沉淀) ④X4、X3、X2、X1
解析 (1)根据题目信息,纯合的雌雄同株基因型是EETT,纯合雌株基因型是EEtt 或eett,
若F2中没有雄株的出现,说明F2中不会出现eeT_,那么亲本中不会有e 基因,所以亲本的
基因型为EETT 和EEtt,F1基因型为EETt。仅有T 而没有E 时,表现为雄株,若F2中出现
3/16 雄株,即F2中eeT_占3/16,可以推F1为EeTt,则亲本的基因型分别为EETT×eett。(2)
若一株雄株(eeT_)与一株雌株(E_tt 或eett)杂交,后代雌株(E_tt 或eett)占1/2,则亲本雄株
基因型一定为eeTt,故亲本的基因型组合为eeTt×Eett 或eeTt×eett 或eeTt×EEtt。(3)①利
用PCR 扩增目的基因时,需要与模板的3'端(—OH 端)结合,并遵循碱基互补配对原则,据
图可知,采用PCR 技术获取和扩增EPSPS 基因,需要使用的引物序列为5'-
CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3';②由图3 可知,重组质粒中含有T-DNA,据此可
知将EPSPS 基因导入植物细胞的方法为农杆菌转化法;基因表达载体构建时,需要将目
的基因和载体切割出相同的末端,图示BamH Ⅰ会破坏目的基因,故若对质粒进行切割时,
选用的两种酶为Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ;③DNA 不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质则
溶于酒精,向滤液中加入冷却的体积分数为95%的酒精,静置2~3 min,溶液中会出现白色
丝状物,就是粗提取的DNA,加入预冷的酒精的目的是析出DNA(使DNA 形成沉淀);
④G 基因导入受体细胞后(利用PCR 扩增技术检测G 基因),不一定转录形成mRNA(利
用分子杂交技术检测G 基因转录产物),转录形成的mRNA 不一定翻译形成相应的蛋白
质(用抗原—抗体杂交技术检测G 基因编码的蛋白质),翻译形成相应的蛋白质不一定表
现出抗除草剂性状(通过喷洒除草剂鉴别抗除草剂的幼苗),所以4 种方法检出的含G 基
因植株的比例,从小到大依次是X4、X3、X2、X1。
3.答案 (1)耐高温的DNA 聚合酶和四种脱氧核苷酸(或Taq 酶和dNTP) DNA 双链复制
(2)引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合,从而影响PCR 过程
(3)不需要 两条母链的起始段位置的碱基序列即为引物,可以作为子链合成的引物,为
DNA 聚合酶提供3'端
(4)3 号DNA 分子
解析 (1)PCR 体系中需要加入的物质有引物、模板链、耐高温的DNA 聚合酶(Taq 酶)
和dNTP 等。PCR 是一项体外扩增DNA 的技术,利用PCR 技术扩增目的基因,依据的生
物学原理是DNA 双链复制。(2)由于P2 和P3 两种引物存在互补配对序列,因此PCR1
和PCR2 不能在同一个体系中进行,理由是引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合,
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从而影响PCR 过程。(3)②过程不需要加入引物,两条母链的起始段位置的碱基序列即
为引物,可以作为子链合成的引物,为DNA 聚合酶提供3'端。(4)PCR 体系中存在融合和
未融合的DNA 分子,融合的DNA 包括了2 个DNA 分子片段,其相对分子质量较大。根
据电泳图可知,3 号DNA 分子的相对分子质量最大,因此3 号DNA 分子最可能是融合基
因。
4.答案 (1)使DNA 聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(2)CTCCGATGGCGCATG 复性温度过低、引物特异性不高
(3)每轮扩增仅延伸一小段,经过多轮“产物—模板”交替结合、延伸,最终扩增出交错
重组基因片段混合产物 d 第一轮以LA1(LA2)为模板合成的子链片段在第二轮复制
时作为引物结合到LA2(LA1)的模板上继续合成子链,经多轮交错循环扩增,可以使产物
同时含有两种基因的序列
(4)Xho Ⅰ 正常表达 将正常培养基上分离出的受体菌单菌落,平移印制到含氯霉素的
培养基上,在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM 质粒
的受体菌
解析 (1)引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的
作用使DNA 聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。(2)PCR 后只合成出了与模板b
链相同的单链,则引物的序列与a 链3'端互补,即5'-CTCCGATGGCGCATG-3'。扩增时
复性温度过低,可能会导致引物与非互补配对的序列发生部分结合,会产生不同长度的
DNA 分子从而出现多条条带,即出现非特异性扩增条带;引物特异性不高,也会导致与非
互补配对的序列发生部分结合,出现非特异性扩增条带。(3)交错延伸PCR 与普通PCR
技术的区别是每轮扩增仅延伸一小段,经过多轮“产物—模板”交替结合、延伸,最终扩
增出交错重组基因片段混合产物。分析题图可知,由于采用交错延伸PCR 的方法重组
LA 序列,故最终获得的混合PCR 产物中,LA 基因片段的位置不确定,即DNA 分子的种类
数无法计算。通过交错延伸PCR 过程中,第一轮以LA1(LA2)为模板合成的子链片段在
第二轮复制时作为引物结合到LA2(LA1)的模板上继续合成子链,经过多轮交错循环扩增,
可以使产物同时含有两种基因的序列。(4)由于Sal Ⅰ和Pvit2 有两个识别位点,若选用则
会破坏标记基因或复制原点,因此要选用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ进行切割,为使目的基因定向
插入PM 质粒,交错延伸的PCR 过程引物的5'端需引入Xho Ⅰ的识别序列。PM 质粒中
带有asd-突变基因,为了筛选含有PM 质粒或重组PM 质粒的受体菌,需要选用asd 基因
正常表达的受体菌。PM 质粒有完整的氯霉素抗性基因cat,重组PM 质粒没有完整的氯
霉素抗性基因cat,可以将正常培养基上分离出的受体菌单菌落平移印制到含氯霉素的
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培养基上,在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM 质粒
的受体菌。
