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专题25 基因工程
1．（2023·天津·统考高考真题）根据下图，正确的是（ ）
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1 需要MII 期去核卵母细胞
C．过程2 可以大幅改良动物性状
D．过程2 为过程3 提供了量产方式，过程3 为过程1、2 提供了改良性状的方式
【答案】D
【详解】A、子代动物的遗传性状与供体基本一致，但与受体无关，A 错误；B、核移植过程中需要处于
MII 中期的去核卵母细胞，而过程1 是培育试管动物，需要培育到适宜时期（桑葚胚或囊胚等时期）进行
胚胎移植，B 错误；C、过程2 得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C 错误；
D、过程2 克隆技术可得到大量同种个体，为过程3 提供了量产方式；过程3 是转基因技术，转基因可导入
外源优良基因，为过程1、2 提供了改良性状的方式，D 正确。故选D。
2．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物
AT1 蛋白通过调节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1 蛋白缺陷，可以促进PIP2s 蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出
膜外，A 正确；B、据题图左侧的信息可知，AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞
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内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B 错误；C、结合对A 选项的
分析可推测，敲除AT1 基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，
C 正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D 正确。故选B。
3．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因
构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体
（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
【答案】D
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A 正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的
菌落，不一定含有目的基因，B 正确；C、DNA 凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA 片段，重组质粒
的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C 正确；D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因
中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp
（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet 的培养基中不能形成菌落，D 错误。故选D。
4．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型
小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期
获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用
于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
2
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【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转录后，可以
使GEP 基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；B、因启动子在左侧，转录的方
向向右，合成的mRNA 从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成
GFP 蛋白，B 正确；C、整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因
纯合子，4 号个体只有小片段，是野生型，C 错误；D、用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，扩增出的片段大
小差异较小，无法较好的区分片段，D 错误。故选B。
5．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将
目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限
制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
【答案】C
【详解】A、酶3 切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA 连接酶连接，A 错误；B、质粒用酶3 切割后得
到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B 错误；C、质粒和目的基因都用酶
1 和酶2 切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重
组表达载体的构建方案最合理且高效，C 正确；D、若用酶2 和酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的
抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D 错误。故选C。
6．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质
粒，如图1 所示。请回答下列问题：
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(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有
，扩增程序中最主要的不同是
。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用__________________。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有
。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_____________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有
。
4
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(6) 对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是
。
【答案】(1)模板（片段F1、片段F2）、引物 引物 (2)CD (3)限制性核酸内切酶（限制酶）
(4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检
测DNA 分子的碱基序列
【详解】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR
扩增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR 过程
需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR 反应成败的
最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，
引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此
引物F2-F 选用C。D 选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-
R 选用D。（3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相
同的黏性末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载
体混合后，在DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）。（4）
A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，
A 错误；B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，
故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用
稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D 正确。故选ABC。（5）EGFP 为
720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F 和F2-R 进行了PCR 扩增，其
大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于
分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列，因此对于PCR 产物电泳结果符合预
期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
7．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径
I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了
L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA 的EdU 和
BrdU 均能与
互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短时间内即被
降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一
组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU 标记细胞的百分
比（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从 点到 点。
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(3)为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，
即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基因：源自噬菌
体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；③Er 基因：编码的Er 蛋白位于
细胞质，与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细
胞核。请完善制备小鼠IK 的技术路线：
→连接
到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→
→获得小鼠IK。
(4) 各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的
三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，再过t2时间后检测B 细胞被标
记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
【答案】(1)A/腺嘌呤 (2)Q R (3)将Ce 酶基因和Er 基因连接 饲喂口服药T (4)大多
数B 细胞没有被BrdU 标记
【详解】（1）分析题意可知，EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，
掺入DNA 的EdU 和BrdU 均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。（2）DNA 分子复制时会发
生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，
各孔同时加入EdU，则EdU 会与A 结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入
BrdU，则BrdU 也会与A 结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，
图中反映DNA 复制所需时长的是从Q 点到R 点。（3）分析题意，要制备IK 小鼠，需要用诱导型基因敲
除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK 的技术
路线为：将Ce 酶基因和Er 基因连接（Ce 酶可作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失）→连接到表达载
体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er 蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。（4）据题可
知，变胖过程中增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途
径Ⅱ），由于但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU 饲喂小
鼠IK，各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU
标记，实验假设是变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的
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B 细胞直接分裂，不会再有DNA 复制过程，故t2时间后用BrdU 饲喂则不起作用，即大多数B 细胞没有被
BrdU 标记。
8．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新
型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1 与图2 分别是利用常规转化法和
CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
(1) 图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于
；从愈伤组织到幼苗的培养过程需
要的激素有生长素和
，该过程还需要光照，其作用是
。
(2)图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的
。图1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注
。
(3)图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是
。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体
（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得
转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是
，图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是
，依据是
。
(5)与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是
（答出2 点即可）。
【答案】(1)脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
(2)遗传特性 转基因标识 (3)Ti 质粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞
的染色体DNA 整合到一起 (4)荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白
化特征 PDS 缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除
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(5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【详解】（1）图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来
特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值
能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机
物，供试管苗生长发育。（2）图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保
持植株A 的遗传特性。图1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，
即进行转基因标识。（3）图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti 质粒的作用，Ti
质粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到一起。（4）已知
某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体（含有
绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植
株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2 中，鉴定导入幼苗
中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS 缺失会导致植株白
化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除。（5）与常规转化法相比，采用
CDB 法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周
期较短。
9．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多
种酶，推测这些酶生效的场所应该是
（填“细胞内”和“细胞
外”）。
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA 连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小
段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同
源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA 有许多A-B 序列位点可以
同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物
对目的基因进
行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳
清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在
的培养基上
筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA 基因，
再重新导入。研究人员在UGA 基因序列两端加上酵母菌DNA 中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA
基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA 片段在切割后是否可
以顺利重连，如图，则应选择方式
进行连接。
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（ii）切去UGA 基因的酵母菌应在
的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图
。
【答案】(1)细胞外 (2)P1和P6 (3)缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸 (4)图3
【详解】（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。（2）根据题
干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因
直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进
行PCR。（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的
培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C 和
C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末
端，便于连接。（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清
酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形
成菌落。（4）根据前面分析，C 和C'的中间插入UGA，A 和B 之间插入的目的基因，所以图3 正确。
10．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
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(1)与图甲中启动子结合的酶是
。除图甲中标出的结构外，作为载体，质
粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即
可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物
。已知J 基因转录的模板链位于b 链，
由此可知引物F1 与图甲中J 基因的 （填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了
，
条带2 所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
【答案】(1)RNA 聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2)F2和R1或F1与R2 a 链
(3)J-V5 融合蛋白 不是
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此
RNA 聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；
②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是
安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具
备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部
位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若
仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可
知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到
DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；
图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b 链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是J-V5 融合蛋白。
抗J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的蛋白不是由重组质粒上的J
基因表达的。
11．（2023·全国·统考高考真题）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因
为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP
基因的突变基因文库。通常，基因文库是指
。
(2) 构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建
表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为
；②为
，其作用是
；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是
。
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(3) 目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色
荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
(4) 新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变基
因进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光蛋白基
因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是
。
【答案】(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有
这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性
(4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP 基因）导入酵母菌中进行表达
【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含
有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有
启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动
子，启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了
它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含
有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。（3）正常情况
下，GFP 突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密
码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。（4）基因工程研究中常用的真核表达系
统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP 基因能
否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP 基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵
母菌发出黄色荧光，说明YFP 基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
12．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙
肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因
工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是
。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表
达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是
。能识别载体
中的启动子并驱动目的基因转录的酶是
。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取
进行DNA 分子杂交，DNA 分子杂交时应使用的探针是
。
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(5) 若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
。
【答案】(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖 (2)筛选 RNA 聚合酶 (3)
核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA 片段 (4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技
术，检测mRNA 是否翻译形成蛋白质
【详解】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒
遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的
筛选。
RNA 聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵
母细胞染色体进行目的基因鉴定。基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸
序列。（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基
因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。
13．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。
某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体
融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备
的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼
苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为
和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处
理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的
失活。对处理后的原生质体在显微镜下用
计数，确定原生质体
密度。两种原生质体1∶1 混合后，通过添加适宜浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过量的培养基
进行稀释，稀释的目的是
。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，
并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于
。
下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出
，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR 技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA 序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA
序列b；M1、M2为序列a 的特异性引物，N1、N2为序列b 的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的
。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系，
为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序
列b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经
后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预
期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
【答案】(1)再生 叶 (2)纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG 浓度，使
其失去融合作用 (3)同一个杂种融合原生质体 ABD (4)再分化 根和芽 (5)模板
M1、M2 凝胶电泳 1
【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能
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力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的
根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原
生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高
产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核
失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞
计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1 混合后，通过添加适宜浓度的PEG 进行融合；一定
时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG 浓度,使其失去融合作用。（3）将融合原生
质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、
分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细
胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体
细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这
些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出
根和芽，直接发育形成再生植株。（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的模板。Ⅱ．将
DNA 提取物加入PCR 反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。Ⅲ．得
到的2 个PCR 扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预期的1 个条带，则可初步确
定再生植株来自于杂种细胞。
14．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行
诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替
换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株
的种子大小应与
植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和
进行切割，用
DNA 连接酶将两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备
。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个
位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目
的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了
。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养
基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株
（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得
的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因
植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核
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酸内切酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置
的条带涂黑。
【答案】(1)野生型 (2)载体（基因表达载体） 启动子和终止子 (3) DAI 基因和卡那霉
素抗性基因 75 自交 100
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI 基因为显性基因，因此采用
农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大
小应与野生型植株的种子大小相近。（2）利用PCR 技术扩增DAI 基因后，应该用同种限制性核酸内切酶
对DAI 基因和运载体进行切割，再用DNA 连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的
基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具
备启动子和终止子。（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA 上含有
DAI 基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，
若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入
DAI 基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI 基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂
时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位
点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1 的性状分离比，而
题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得
的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有
卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X 的切割位点，而
突变型的基因有限制酶X 的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有
50bp 和100bp，如图：
。
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1．（2022·辽宁·统考高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转
基因生物安全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（
）
A．预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
【答案】B
【详解】A、预变性是使模板DNA 充分变性，A 错误；B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让
单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B 正确；C、延伸过程需引物参与，C 错
误；
D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D 错误；故选
B。
2．（2022·河北·统考高考真题·多选）人染色体DNA 中存在串联重复序列，对这些序列进行体外扩增、电
泳分离后可得到个体的DNA 指纹图谱。该技术可用于亲子鉴定和法医学分析。下列叙述错误的是
（ ）
A．DNA 分子的多样性、特异性及稳定性是DNA 鉴定技术的基础
B．串联重复序列在父母与子女之间的遗传不遵循孟德尔遗传定律
C．指纹图谱显示的DNA 片段属于人体基础代谢功能蛋白的编码序列
D．串联重复序列突变可能会造成亲子鉴定结论出现错误
【答案】BC
【详解】A、DNA 分子的多样性、特异性及稳定性是DNA 鉴定技术的基础，A 正确；B、串联重复序列在
染色体上，属于核基因，在父母与子女之间的遗传遵循孟德尔遗传定律，B 错误；C、指纹图谱由串联重
复序列扩增获得，串联重复序列是广泛分布于真核生物核基因组中的简单重复非编码序列，C 错误；D、
串联重复序列突变后，分离得到的指纹图谱可能会发生改变，可能会造成亲子鉴定结论出现错误，D 正确。
故选BC。
3．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1 导入谷氨
酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
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(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1 中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB 两个标记基
因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端
引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR 扩增载体3 中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含
（EcoRⅠ∕HindⅢ∕XhoⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2 构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1 基因整合到载体4 构建载体5。将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉
素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA 片
段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
【答案】(1)1 4 5＇ (2)XhoⅠ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR
【详解】（1）据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR（卡那霉素抗性基因），需要引物1 和
4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1 和4。PCR 时，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物
3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此在引物的5'端引入XhoⅠ酶
识别序列。
（2）据图可知，载体4 中RpsL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhoⅠ酶识别序列，载体3 中不含XhoⅠ酶
识别序列，如果将载体2 和载体3 连接形成高效筛选载体4 时，需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。
（3）基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5 中含有RpsL（链霉
素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉
素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。（4）据题意
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可知，载体5 导入的时链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌中P1 基因脱
离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA 片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏
感、链霉素不敏感，B 正确，ACD 错误。故选B。（5）通过PCR 技术可以检测目的基因是否插入受体细
胞的染色体DNA 中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。
4．（2022·重庆·统考高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能
途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui 基因，并开展了相关探索。
步骤I：
步骤II：
(1) 花药培养能缩短育种年限，原因是
。在步骤I 的花药培养过
程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含
的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I
中能用于制造人工种子的材料是 。
(2) 步骤II 中，eui 基因克隆于cDNA 文库而不是基因组文库，原因是
；在构建重组Ti 质粒时使
用的工具酶有 。为筛选含重组Ti 质粒的菌株，需在
培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I 中的
，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui 基因的鉴定方法是 ，移栽后
若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
【答案】(1)单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状
体
(2)cDNA 文库是由编码蛋白质的mRNA 逆转录来的基因导入受体菌而形成的，基因工程中只需要转录出编
码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行 限制酶和 DNA 连接酶 抗生素 愈伤组织
DNA 分子杂交技术
【详解】（1）单倍体育种过程中，单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离，
所以可以明显缩短育种年限。将水稻花粉进行脱分化处理，可产生单倍体的愈伤组织，秋水仙素能抑制纺
锤体的形成，导致染色体不能移向细胞两极，从而引起细胞内染色体数目加倍，故将其培养于含秋水仙素
的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可用于制造人工种子。（2）cDNA 文库又叫部分基因文
库，是由编码蛋白质的mRNA 逆转录来的基因导入受体菌而形成的，而基因组文库包含了本物种全部基因，
基因工程中只需转录出编码蛋白质的基因部分就即可，故选cDNA 文库。在构建重组Ti 质粒时，必须使用
限制性核酸内切酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA 连接酶将目的基
因和质粒连接成重组质粒。该重组的Ti 质粒中含有抗生素抗性基因，故应在培养基中添加抗生素，以便对
重组质粒进行筛选和鉴定。将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，即用含eu 基因的农杆菌侵染愈
伤组织，以便将eui 基因导入愈伤组织，获得转基因再生植株。检测植株是否含有eui 基因，可采取DNA
分子杂交技术的方法。
5．（2022·江苏·统考高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究
纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1 所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能
是 。
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(3) 某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基因X 进行了PCR 扩
增与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，溶
液中添加NaC1 至2．0mo1/L 的目的是 。PCR 扩增时，需在
催化下，在引物 端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测
序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，
可示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M 重组质粒（在
EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR 鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融
合片段M 中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR 目的产物约为 bp。
确保M 及连接处序列正确，Y-M 的连接
处上游含有Hind III+EcoR V 的识别序
列，下游含有EcoR V+BamH I 的识别序
列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细
胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在
纤毛基部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量
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相等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环
数）。从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
倍。
【答案】(1)与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心） (2)溶解DNA 耐高温
DNA 聚合酶（Taq 酶） 3' (3) a、b 1100 Q4 X 蛋白参与中心体的形成
(4) 逆转录 32
【详解】（1）中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。（2）从细胞样品中分离DNA 时，可通过
交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，DNA 在2．0mo1/L 的NaC1 溶液中的浓度最大，高于
或低于这一浓度，DNA 的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1 至2．0mo1/L 的目的是溶解
DNA。PCR 扩增时，需在耐高温的DNA 聚合酶（即Taq 聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA 链的
延伸，获得扩增产物用于测序。（3）PCR 扩增目的DNA 片段时，在引物的3’端进行DNA 链的延伸，据
图可知，应选择图II 中的引物a 和引物b，PCR 目的产物约为300+800=1100bp。确保M 及连接处序列正确，
Y-M 的连接处上游含有Hind III+EcoR V 的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I 的识别序列，根据题干信
息构建Y-M 重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段），Y-M 的连接处测序后部分序列应含有EcoR V+BamH I
的识别序列，根据EcoR V 识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分
别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X 参与中心
体的组成。（4）研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z
的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模
板量相等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR
循环数），说明病人基因Z 表达较弱，设健康人Z 基因的cDNA 数为x，病人Z 基因的cDNA 数为y，则
有x×215=y×220，从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
25=32 倍。
6．（2022·河北·统考高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶
抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答
下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的
上，此方法的不足之处是
。
(4) 为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有
（写出两点即可）。
(5) 确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的
以鉴定其抗性程度。下图为
三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析
（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是
。
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(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。
导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了
抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是
（写出两点即可）。
【答案】(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的 (2)#基因表达载体
的构建/表达载体的构建# (3)T-DNA 该方法不适用与单子叶植物 (4)基因--DNA 分子杂交技
术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术 (5) 效果 NaPI＋StPinlA 饲喂NaPI＋
StPinlA 转基因的虫体质量最小、棉铃数量最多 (6) 定向改变 由于害虫发生基因突变后，在
胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶
抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂
【详解】（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗
虫的目的。（2）基因工程的核心是基因表达载体的构建。（3）农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti 质粒
上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上。根据农杆菌的这一特点，如果将
目的基因插入到Ti 质粒的T-DNA 上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色
体的DNA 上。其不足之处是该方法不适用与单子叶植物。（4）目的基因是否整合的检测，在分子水平上
可通过检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因、是否能转录处目的基因对应的mRNA、是否能
合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗虫性、抗病性、活性等。即可利用基因--DNA
分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术等。（5）抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞
中稳定表达后，还需进一步做抗虫的效果以鉴定其抗性程度。由图可知，NaPI＋StPinlA 转基因棉花的抗虫
效果最佳，因为饲喂NaPI＋StPinlA 转基因的虫体质量最小、棉铃数量最多。（6）在自然选择的作用下，
种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶
抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基
因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂。
7．（2022·北京·统考高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E 物质）污染
会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖
细胞等存在E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经
济且快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是
。
(2)为监测E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE 和酵母来源的UAS 是
两种诱导型启动子，分别被E 物质-受体复合物和酵母来源的Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1 相比，方案2 的主要优势是
，因而被用于制备监测鱼（MO）。
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(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，
需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将
选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：
。
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P 生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P 肌）
Ⅱ.基因：
。
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
(4)SM 不育的原因是：成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后
造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM 不育的目的是
。
【答案】(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3)② D (4)激活ERE 诱导Gal4 表达，Gal4 结
合UAS 诱导dg 表达，生殖细胞凋亡 (5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵
的最佳方式是显微注射法。（2）由图可知，方案1E 物质-受体复合物激活ERE，使GFP 基因表达，方案2
E 物质-受体复合物先激活ERE 获得Gal4 蛋白，然后Gal4 蛋白激活UAS 启动子，使GFP 基因表达，方案
2GFP 蛋白表达量大，更灵敏。（3）MO 和另一亲本（X）杂交获得SM，MO 是方案2 获得，所以亲本X
启动子选择UAS。要获得SM 是不育个体，MO 是可育的所以X 必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因
（dg）。（4）成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE 诱导Gal4 表达，Gal4 与
UAS 启动子结合诱导dg 表达，使生殖细胞凋亡。（5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了
避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM 不育。
8．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶识别并降解，药
物A 可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融
合蛋白FLAG-P 和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG 是一种短肽，连接在P 或P△的氨基
端，使融合蛋白能与含有FLAG 抗体的介质结合，但不影响P 或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的引物需满足的条件是
、为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引
物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，
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其中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA 序列正
确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同。据图甲分析，
出现该问题的原因是
。修改扩增P 基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是
。
(3) 融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A 和UBC 按照图乙中的组合方式分成5 组。各组
样品混匀后分别流经含FLAG 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC 抗体检测，检测结果如图
丙所示。已知FLAG-P 和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A 的作用是
；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中
缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A 治疗该病的机理是 。
【答案】(1)能与P 基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2)P 基因编码链的第一
个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA 的密码子被错位读取。 在引
物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1 个碱基 (3)增强FLAG-P 与UBC 的结合 参与P 与UBC 的结合
(4)药物A 通过增强P 与UBC 结合促进P 降解。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P 基
因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA 聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加
到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。（2）融合基因转录出的
mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同，
说明P 基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA 中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P 基
因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别
序列3'端添加1 个碱基，使其碱基数目加上FLAG 的碱基数目为3 的倍数，这样能保证P 基因转录出的
mRNA 上的读码框不改变，能够正常翻译。（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC 抗体检测，不出现杂
交带；②组添加UBC 和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A 和FLAG-P，杂交带更加明显，说
明药物A 的作用是促进UBC 与FLAG-P 的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现
杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC 结合的关键序
列。（4）根据（3）的分析推测，药物A 促进UBC 与FLAG-P 的结合，从而促进蛋白P 被蛋白酶识别并降
解，达到治疗的目的。
9．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，
具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
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(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a 是 ，物质b 是 。
在生产过程中，物质b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是
。
(2) 蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有
、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基
本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所
示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的
（填“种类”或“含量”）有关，
导致其活性不同的原因是
。
(3) 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要
写出实验设计思路
。
【答案】(1)氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性 (2)从基因文库中获取目的基因
通过DNA 合成仪用化学方法直接人工合成 DNA 双链复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时
间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)取3 支试管，分别加入等量的蛋
白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物
（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3 号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝
固时间
【详解】（1）据分析可知，物质a 是氨基酸序列多肽链，物质b 是mRNA。在生产过程中，物质b 可能不
同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。（2）蛋
白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过
DNA 合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA 双链复
制。（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间
的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗
凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处
理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种
处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解
时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭
素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3 支试管，分别加入等
量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种
动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3 号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血
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液凝固时间。
10．（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于
某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）
为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR 技术，在优化反应
条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合
成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
，终止子的作用是
。
(4) 培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是
，此外丙酮的积累会伤
害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(5) 这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济
特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于
，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】(1)引物 (2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需
要的地方停下来 (3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长 (4) 废
物的资源化 不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
【详解】（1）利用PCR 技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，
引物与模板链结合后，Taq 酶才能从引物的3’端延伸子链。（2）基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标
记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。
（3）重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而
不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。（4）根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新
技术,以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。
从“碳中和”的角度看,该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化
碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
11．（2022·全国·统考高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作
用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA 病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR 法。这种方法的基本原
理是先以病毒RNA 为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR 技
术扩增相应的DNA 片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR 引物时必须依据新冠病毒RNA 中的
来进行。PCR 过程每次循环分为3 步，其中温度最低的一步是 。
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(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴
性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1 种情况即
可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明
。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的
编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操
作流程是
。
【答案】(1)逆转录酶/反转录酶 (2)特异性核苷酸序列 退火/复性 (3)曾感染新冠病毒，已康
复 已感染新冠病毒，是患者 (4)获取S 蛋白基因→构建S 蛋白基因与运载体的表达载体→导入受
体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S 蛋白）
【详解】（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR 法需要先得到cDNA，由RNA 到
DNA 的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。（2）PCR 过程需要加入引
物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，
在设计PCR 引物时必须依据新冠病毒RNA 中的特异性核苷酸序列来进行；PCR 过程每次循环分为3 步，
分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的一步是复性（或退火）。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说
明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，
但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均
为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经
感染新冠病毒，为患者。（4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因
工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得
大量的S 蛋白，故具体流程为：获取S 蛋白基因→构建S 蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→
目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S 蛋白）。
12．（2022·福建·统考高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生
的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14 的单克
隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
（一）基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14 基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR 扩增CD14 片段。已知DNA 聚合酶催化引
物的3’—OH 与加入的脱氧核苷酸的5’—P 形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是
（填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。
(2) 载体和CD14 片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1 所示。用Xho I 和Sal 1 分别酶切CD14
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和载体后连接，CD14 接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶
对CD14 的连接方向进行鉴定，理由是
。
培养能表达CD14 蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
（二）抗CD14 单克隆抗体的制备流程如图2 所示：
(3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)步骤②所用的SP2/0 细胞的生长特点是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入
进行专
一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14 抗体，原因是
。
(6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14 抗体，用于检测巨噬细胞。
【答案】(1)5'→3' (2)正向连接的重组DNA 有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的
重组DNA 会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列） (3)CD14 蛋
白/CD14 抗原 分泌抗CD14 抗体的杂交瘤细胞 (4)能在体外无限增殖 (5)CD14 蛋白 参
与形成杂交瘤细胞的B 淋巴细胞种类多，有的不能分泌抗CD14 抗体 (6)小鼠腹水
【详解】（1）PCR 扩增时，DNA 聚合酶催化引物的3'-OH 与加入的脱氧核苷酸的5'-P 形成磷酸二酯键，
因此新链合成的方向是从5'→3'。（2）可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14 的连接方向进行鉴定，是因
为正向连接的重组DNA 有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA 会形成新的序
列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）。（3）步骤①是注射特定抗原，针对本实验目
的可知，要获得抗CD14 单克隆抗体，故应该注射CD14 蛋白/CD14 抗原；步骤⑤是将分泌抗CD14 抗体的
杂交瘤细胞注入小鼠体内培养，以获得大量单克隆抗体。（4）步骤②所用的SP2/0 细胞是骨髓瘤细胞，特
点是能在体外无限增殖。（5）根据抗原—抗体杂交原理，应该用CD14 蛋白检测其中是否含抗CD14 蛋白
的抗体。因为形成杂交瘤细胞的B 淋巴细胞种类很多，因此有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14 抗体。（6）
从制备单克隆抗体的流程可知，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，最终要从小鼠的腹水中提取抗CD14 抗
体。
1．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（
）
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A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA 序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
【答案】D
【详解】A、农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上，
故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA 序列，进而成功整合到受体细胞染色体上，A
正确；B、该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体
上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B 正确；C、通过杂交分离结果可知，
经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了三种类型细胞，其中包括只含目的基因的，只含标记基因的和既含目
的基因又含标记基因的，C 正确；D、获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D 错误。故选D。
2．（2021·湖北·统考高考真题）某实验利用PCR 技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引
物与模板完全配对）外，还有2 条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产
生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA 的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
【答案】D
【详解】A、增加模板DNA 的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A 错误；BC、延长
热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反
应非特异性条带，BC 错误；D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位
点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D 正确。故选D。
3．（2021·湖北·统考高考真题）限制性内切酶EcoRI 识别并切割
双链DNA，用EcoRI
完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA 片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A．6
B．250
C．4000
D．24000
【答案】C
【详解】据图可知，EcoRI 的酶切位点有6 个碱基对，由于DNA 分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一
位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096≈4000 个碱基对可能出现一个限制酶
EcoRI 的酶切位点，故理论上得到DNA 片段的平均长度（碱基对）约为4000。C 符合题意。故选C。
4．（2021·山东·统考高考真题）我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引
子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用
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于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（ ）
A．“引子”的彻底水解产物有两种
B．设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA
C．设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列
D．土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别
【答案】C
【详解】A、根据分析“引子”是一段DNA 序列，彻底水解产物有磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基，共6
种产物，A 错误；B、由于线粒体中也含有DNA，因此设计“引子”的 DNA 序列信息还可以来自线粒体
DNA，B 错误；C、根据题干信息“利用现代人的 DNA 序列设计并合成了引子”，说明设计“引子”前
不需要知道古人类的 DNA 序列，C 正确；D、土壤沉积物中的古人类双链 DNA 需要经过提取，且在体
外经过加热解旋后，才能与“引子”结合，而不能直接与引子结合，D 错误。故选C。
5．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m 的功能，构建了融合表达蛋白M 和tag 标签的质粒，
请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m 片段。
②为了获得融合tag 标签的蛋白M，设计引物P2 时，不能包含基因m 终止密码子的编码序列，否则将导致
。
③热启动PCR 可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA 聚合酶（Taq 酶）以外的各成分混合后，加
热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR 扩增，下列叙述正确的有
A．Taq 酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR 相比，热启动PCR 可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR 产物DNA 碱基序列的特异性体现了Taq 酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I 切开的载体A 与添加同源序列的m 混合，用特定DNA 酶处理形成黏性末端，然后降温以促进
，形成A-m 结合体。将A-m 结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA 聚合酶及
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酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m 仍能被Sma I 切开，则Sma I 的酶切位点可能在
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3 基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿
嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是
。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag 标签，说明 ，
后续实验可借助tag 标签进行蛋白M 的分离纯化。
【答案】(1) mRNA 蛋白M 上不含tag 标签 BC (2) 黏性末端碱基配对 DNA
连接 基因m 的连接处或基因m 的内部 (3) 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重
组质粒的受体菌含有URA3 基因可以长成菌落 融合基因表达（或融合基因正确解码）
【详解】（1）①以逆转录获得cDNA 的方式，要先从真菌细胞中提取基因m 转录出来的mRNA。②从构
建好的重组质粒上看，tag 序列位于目的基因下游，若m 基因的转录产物mRNA 上有终止密码子，核糖体
移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag 序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M 上就不含tag 标签。
③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR 扩增”，故Taq 酶最适催化温度
范围为94℃左右，A 错误；B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下
引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配
形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，
B 正确；C、DNA 分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C 正确；D、Taq 酶没有特异性，与普通
的DNA 聚合酶相比，Taq 酶更耐高温，D 错误。故选BC。（2）①从图上看，载体A 只有一个Sma I 的酶
切位点，故被Sma I 切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma I 切开的载体A 与添加同源序列的m 混合，
用特定DNA 酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A 与添加同源序列的m 的黏性末端碱基互补配对。
将A-m 结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA 聚合酶及DNA 连接酶等，完成质粒的环化。②重组
质粒中，载体A 被Sma I 切开的位置已经与基因m 相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质
粒A—m 仍能被Sma I 切开，则Sma I 的酶切位点可能在基因m 的连接处或基因m 内部。（3）①筛选目的
菌株的机理是：导入了质粒A-m 的目的菌株由于含有URA3 基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而
URA3 基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag 标签，位于lag 标签上游的基因m 应该正常表达，说
明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
6．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一把
“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示。
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回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定sgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然后
将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
(3)过程③~⑤中，SgRNA 与Cas9 蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异
性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9 蛋白可切割
序列。
(3) 利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除一个长度为1200bp 的基因，在DNA 水平上判断基因敲除是否成
功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是
。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9 质粒中获得重组
质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA 中，构建得到能
大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因
组DNA 的编辑过程：
。
【答案】(1)DNA 连接酶 (2)感受态细胞法/Ca2+处理法 (3)碱基互补配对 目标（目的）DNA
（基因）
(4) DNA 分子杂交技术 经编辑过的DNA 片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对
应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功 (5)表达Cas9 蛋白和sgRNA，两者形成复合体；
sgRNA 识别并结合目标DNA 序列；引导Cas9 蛋白切割目标DNA 序列
【详解】（1）基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA 连接酶，限制酶负责切割，DNA 连接酶负责连接，
因此为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定sgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然后将其插入
到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA 连接酶。（2）大肠杆菌是原核生物，属于微生
物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（3）根据题图可知：在CRISPR/Cas9 基因编辑
技术中，SgRNA 是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9 切割与SgRNA 配对的靶基因DNA 序列。
Cas9 能借助SgRNA 分子与目标DNA 进行特异性结合的原因在于SgRNA 分子上的碱基序列与目标DNA
分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA 与目标DNA 特定序列的特定识别，进而定位；
由此可见，Cas9 在功能上属于限制酶，可切割目标DNA 特定的核苷酸序列。（4）可利用DNA 分子杂交
技术判断基因敲除是否成功，即利用经编辑过的DNA 片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的
目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功。（5）根据图示可知：CRISPR/Cas9 重组质粒
在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9 蛋白，二者形成复合体，该复
合体中的SgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异性结合，引导Cas9 蛋白切割目标DNA 序列。
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7．（2021·福建·统考高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广
泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT 基因导入大肠杆菌构
建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA 的核苷酸序列设计了相应的引物（图1 甲），通过PCR 扩增MT 基因。已知A 位
点和B 位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为
。
(2)本实验中，PCR 所用的DNA 聚合酶扩增出的MT 基因的末端为平末端。由于载体E 只有能产生黏性末
端的酶切位点，需借助中间载体P 将MT 基因接入载体E。载体P 和载体E 的酶切位点及相应的酶切序列
如图1 乙所示。
①选用 酶将载体P 切开，再用 （填“T4DNA 或“E·coli81DNA”）连接酶将MT 基
因与载体P 相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT 基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E 进
行酶切，将切下的MT 基因和载体E 用DA 连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处
理的大肠杆菌，筛出MT 工程菌。
(3)MT 基因在工程菌的表达量如图2 所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT
工程菌，理由是 。
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【答案】(1)引物1 和引物4 (2)EcoRV T4DNA 启动子 终止子 XhoI 和PstI 钙
(3)尚未在个体生物学水平上对MT 工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
【详解】（1）密码子位于mRNA 上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和
结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A 和位点B 的两侧，故选择引物1 和引物4。
（2）①MT 基因的末端为平末端，故需要用EcoR Ⅴ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′
和载体E 连接，故需将MT 基因插入Xho I 和Pst I 两个酶切位点之间，故选EcoR Ⅴ将载体P 切开；由于
E·coli81DNA 连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA 连接酶可以连接平末端，而MT 基因的末端为平末端，
故需要用T4DNA 连接酶将MT 基因与载体P 相连，构成重组载体P′。②载体P′是重组质粒，故不含有有表
达MT 基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载
体P′和载体E 均含有XhoI 和PstI 酶，故可选用XhoI 和PstI 酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法
是钙离子处理法。（3）由于尚未在个体生物学水平上对MT 工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使
MT 工程菌的MT 蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT 工程菌。
8．（2021·辽宁·统考高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制
人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小
为0．9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经
过程得到cDNA，将其作为
PCR 反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入 和
两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，可选用 （填
“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
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名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞周期
（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是
将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【答案】(1)逆转录 (2)EcoRI PvitⅡ T4DNA 连接酶 (3)感受态 (4)3 (5)G2/M
【详解】（1）利用RNA 获得cDNA 的过程称为逆转录。（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目
的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI 在质粒
上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI 和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，
切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA 连接酶连接质粒和目的基因。（3）转化时用
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CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。（4）由于这些菌落都可以生长
在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRI 和PvitⅡ
两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2 基因大小为0．9kb，所以对
应电泳图是菌落3。（5）比较图4 中G1期和S 期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S
期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2 蛋白应该作用于G2/M 期。
9．（2021·天津·统考高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸
能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的
工程菌株。下图1 为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2 为构建表达载体时所需的关键条件。
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG 转变为真核生物偏好的ATG，且能通
过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1 和2。其中引物1 的5′端序列应考虑
和 。
②将上述PCR 产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有
，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录
系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效
表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体
培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提
高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件
B．使用乳酸菌LDH 基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
【答案】(1)细胞质基质 (2)包含BamHI 的识别序列 将GTG 改为ATG 原核生物复制原点
不能 缺失尿嘧啶 (3)B
【详解】（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。（2）①设计引物1 的5′端序列，应考
虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG 转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细
胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI 的识别序列。②将重组质粒导
入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，
重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效
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表达。
③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌
株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。（3）A、进一步优化发酵条件，使
其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A 正确；B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌
LDH 基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B 错误；C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母
菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C 正确；D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高
产菌株，D 正确。故选B。
10．（2021·北京·统考高考真题）新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫
苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠
病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S 基因连接到位于载体上
的腺病毒基因组DNA 中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
(1)新冠病毒是RNA 病毒，一般先通过 得到cDNA，经 获取S 基因，
酶切后再连接到载体。
(2)重组疫苗中的S 基因应编码________。
A．病毒与细胞识别的蛋白
B．与病毒核酸结合的蛋白
C．催化病毒核酸复制的酶
D．帮助病毒组装的蛋白
(3)为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可
以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→
→ →诱发特异性免疫反应。
(4)重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA
不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因
。
【答案】(1)逆转录/反转录 PCR 扩增 (2)A (3) （重组腺病毒）进入细胞 表达抗原
(4)重组腺病毒DNA 在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统。
【详解】（1）新冠病毒是RNA 病毒，其遗传物质是RNA，若要得到与其对应的cDNA，则要进行逆转录。
用cDNA 扩增出目的基因——S 基因，需要利用PCR 扩增技术。（2）重组疫苗作为抗原需要被人体免疫
系统识别，而重组疫苗中的S 基因是从新冠病毒中提取的，所以重组疫苗中的S 基因应编码病毒与细胞都
能识别的蛋白，A 正确，BCD 错误。故选A。（3）重组疫苗对人体来说属于外来异物，即抗原，故人体
接种疫苗后，重组腺病毒进入人体细胞，其在人体细胞内表达出抗原，引发机体产生特异性免疫——细胞
免疫和体液免疫，因此该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→（重组腺病毒）进入细胞→表达抗原→诱发
特异性免疫反应。（4）接种疫苗后，由于长时间内接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA，而DNA 会不
断表达出S 蛋白，S 蛋白作为抗原刺激机体，故机体会反复针对抗原产生特异性免疫应答。
11．（2021·山东·统考高考真题）人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位
点结合 BCL11A 蛋白后，γ 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ 基因表达的抑制，
可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入
表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
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（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图
可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是
，在 R 末端添加的序列所对
应的限制酶是
。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要
种
酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表
达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细
胞无荧光的原因是
。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R
扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的
结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于
，理由是
。
【答案】 SalI EcoRI 6 F7 与R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增
产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上
均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与
F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的
扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R 端与荧光蛋白基因中限制
酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，
需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增
后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶
Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注
释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R
末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光
蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载
体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在
DNA 连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq 酶催化，合成更多的产物，故从
产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6 种酶，分别是Taq 酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制
酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA 连接酶；（2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的
BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA 聚合酶与启动子结合，才
能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含
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F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7 与R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表
达；（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A 基因表达，产生 BCL11A 蛋白，
BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的
受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4 与引物R 之间的序列上；含 F5～F6
与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5 的上游序列，故据此
结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
12．（2021·浙江·统考高考真题·节选）回答下列（一）小题：
（一）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以
及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体
，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼
每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载
体形成
，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、
并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有
（答出2 点即可）。提取质粒后，采用
法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并
观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用
分散斑马鱼囊胚的内细胞
团，取分散细胞作为初始材料进行
培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为
，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
【答案】冷却 玻璃刮刀 较大透明圈 斜面 乙醇 耐酒精度高、耐酸高 灭菌
吸附法 富营养化 重组DNA 分子 限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因 显
微注射 胰蛋白酶 原代 饲养层细胞
【详解】（一）（1）生活污水富含N、P，未经处理就大量排放，会导致水体富营养化，导致藻类大量繁
殖形成水华或赤潮。（2）具有相同黏性末端的目的基因和载体DNA（如质粒），经DNA 连接酶处理后，
会形成重组DNA 分子。与目的基因相同的限制性核酸内切酶识别序列，可以确保限制性内切酶处理后与
目的基因形成相同的黏性末端，以便于和目的基因的连接。标记基因（抗生素抗性基因）的存在，便于筛
选含有目的基因的受体细胞。动物基因工程，通常采用显微注射法将重组DNA 分子导入动物受精卵中。
（3）使用胰蛋白酶处理囊胚的内细胞团，借助酶的专一性，可分解细胞间质的蛋白质，让细胞分散，便
于培养。将分散的细胞初次在卡氏瓶中培养，称之为原代培养。提高细胞克隆形成率的措施有：选择适宜
的培养基、添加血清（胎牛血清最好）、饲养层细胞（滋养细胞如经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤
维细胞）支持生长、激素（胰岛素等）刺激、使用CO2培养箱、调节pH 等。
13．（2021·河北·统考高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用
植物修复技术将土壤中的Cd 富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），
可降低土壤中Cd 的含量。为提高植物对Cd 污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd 转运蛋白
（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1 基因，将酵母细胞的全部DNA 提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，
这个群体称为
。
（2）将DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是
。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是
。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1 基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是
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。研究者进一步获得了转YCF1 基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材
料的目的是
。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd 污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同
器官中Cd 含量（图2）。据图1 可知，与野生型比，转基因植株对Cd 具有更强的
（填“耐性”或“富集能力”）；据图2 可知，对转基因植株的
进行后续处理对于缓解土壤
Cd 污染最为方便有效。
（5）已知YCF1 特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高
Cd 环境的原因是
。
相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd 污染土壤修复植物的优势在于
（写出两点即可）。
【答案】基因组文库 限制酶和DNA 连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化法
避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1 可通过主动运输将Cd 离子运到液泡中，
提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良
环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【详解】（1）为获取YCF1 基因，将酵母细胞的全部DNA 提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体
中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。（2）将DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体
时，需要用限制酶切割供体DNA 和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA 连接酶进行连接。基因表
达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-
DNA 可转移并插入到受体细胞DNA 中，将含有YCF1 基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采
用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因
在自然界中的扩散。（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增
加，说明转基因植株在Cd 污染的土壤中生长较好，即对Cd 具有更强的耐性；据图2 分析，转基因植株的
茎、叶中Cd 含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集
Cd 的作用，对于缓解土壤Cd 污染最为方便有效。（5）YCF1 特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可
通过主动运输将Cd 离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型
能更好地适应高Cd 环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良
环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd 污染土壤修复植物更具有优势。
14．（2021·全国·统考高考真题）PCR 技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，
医生进行了相关操作：①分析PCR 扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR 扩增DNA 片
段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是
（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是
。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、
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三步，其中复性的结果是
。
（3）为了做出正确的诊断，PCR 反应所用的引物应该能与
特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指
。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】④②③① Taq 酶（热稳定DNA 聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链
DNA 结合 病原菌的两条单链DNA 一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术
【详解】（1）PCR 技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④
采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR 扩增DNA 片段→①分析PCR 扩增结果。
（2）在用PCR 技术扩增DNA 时，DNA 的复制过程与细胞内DNA 的复制类似，操作③中使用的酶是Taq
酶（热稳定DNA 聚合酶），PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是引
物通过碱基互补配对与单链DNA 结合。（3）DNA 复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR 反应所用
的引物应该能与病原菌的两条单链DNA 特异性结合。（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是
指一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
15．（2021·广东·统考高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体
系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4 步酶促反应的非
细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造
成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有
。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋
白，方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4 种酶的表达。表达载体
转化大肠杆菌时，首先应制备
细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用
的方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是
。在分子水平上，可以通过改变
，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】基因文库中获取、人工合成法 盐析法、酶解法或高温变性 感受态 抗原-抗体杂交技
术 有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【详解】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR 技术，此外获
得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。（2）高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的
前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋白，可根据DNA 和蛋白质的溶解性、对酶、高温和
洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。（3）研究人员使用大肠杆菌BL21 作
为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细
胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA 分子。基因工程中，
酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
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（4）依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水
平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
16．（2021·全国·高考真题）用DNA 重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生
物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4 种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA 连接酶有E. coli DNA 连接酶和T4DNA 连接酶。上图中
酶
切割后的DNA 片段可以用E. coli DNA 连接酶连接。上图中
酶切割
后的DNA 片段可以用T4DNA 连接酶连接。
（2）DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是
。
（3）DNA 重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA 分子上有复制原点，可以保证质粒在受
体细胞中能
；质粒DNA 分子上有
，便于外源
DNA 插入；质粒DNA 分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的
宿主细胞，方法是
。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指
。
【答案】 EcoRI、PstI EcoRI、PstI、 SmaI 和EcoRV 磷酸二酯键 自我复制 一至
多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细
胞 位于基因首端的一段特殊DNA 序列，是RNA 聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【详解】（1）限制酶EcoRI 和PstI 切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI 和EcoRV 切割形成的是平末端，
E. coli DNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，
而T4DNA 连接酶来源于T4 噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI 和
PstI 切割后的DNA 片段（黏性末端）可以用E. coli DNA 连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA 片段，
限制酶SmaI 和EcoRV 切割后的DNA 片段（平末端）也可以用T4DNA 连接酶连接。（2）DNA 连接酶将
两个DNA 片段连接形成磷酸二酯键。（3）质粒是小型环状的DNA 分子，常作为基因表达的载体，首先
质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA 分子上有一个至多个限制性核酸内
切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具
体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。（4）启动
子是一段特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动
基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
一、单选题
1．回文序列是一段特定的核苷酸片段，其特点是一条核苷酸链与其互补链从5'端到3'端的碱基序列相同。
短回文序列往往是限制酶的识别位点，下列叙述正确的是（ ）
A．回文序列中（A+T）的数目与（C+G）的数目相等
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B．回文序列可能会存在于质粒中
C．限制酶作用于回文序列的氢键
D．短回文序列均由6 个核苷酸组成
【答案】B
【分析】限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，
并且使每一条链中的特定部位的磷酸二酯键断开。
【详解】A、回文序列是一段特定的核苷酸片段（两条链碱基互补），回文序列中(A+C)的数目与(T+G)的
数目相等，A 错误；
B、短回文序列往往是限制酶的识别位点，质粒是一段环状的DNA 分子，存在限制酶的识别位点，故回文
序列可能会存在于质粒中，B 正确；
C、限制酶作用于回文序列的磷酸二酯键，C 错误。
D、短回文序列往往是限制酶的识别位点，故短回文序列可能由4、6、8 个或其他数量的核苷酸组成，D
错误。
故选B。
2．为研究拟南芥植株E 基因的功能，科研人员将T-DNA 插入到E 基因中，导致其发生突变，突变后的基
因记为e。为验证某拟南芥植株的基因型，科研人员根据基因E 和T-DNA 的序列，设计了三种引物，引物
的结合位置如图所示。已知完整的E 基因和T-DNA 整合后，因片段长度过大，不能完成整个融合基因的
PCR 扩增。科研人员提取该植株的总DNA，分别用引物“I+III”组合及“II+III”组合进行PCR，两种引物
组合均能完成扩增。拟南芥植株的基因型为（ ）
A．Ee
B．EE
C．ee
D．EE 或Ee
【答案】A
【分析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA 片段的核酸合成技术，利用的
原理是DNA 复制。
【详解】根据题干“已知完整的基因E 和T-DNA 整合后，因片段长度过大，不能完成整个融合基因的
PCR 扩增”，且e 的产生是T-DNA 插入到基因E 中，因此当拟南芥的基因型为EE 时，用引物“Ⅱ+Ⅲ”组
合，可以获得PCR 产物，但用引物“I+Ⅲ”组合时，不能获得PCR 产物；当拟南芥的基因型为Ee 时，用引
物“Ⅱ+Ⅲ”组合和引物“I+Ⅲ”组合时，都能获得PCR 产物；当拟南芥的基因型为ee 时，用引物“Ⅱ+Ⅲ”
组合，不能获得PCR 产物，但用引物“I+Ⅲ”组合时，能获得PCR 产物；即该拟南芥植株的基因型为Ee，
BCD 错误，A 正确。
故选A。
3．科研人员为研究昆虫中的热激蛋白基因（GdHsp60） 的功能，利用显微注射技术将绿色荧光蛋白基因
对应的双链 RNA 片段（dsGFP） 和热激蛋白基因对应的双链RNA 片段（dsGdHsp60）分别导入昆虫幼
虫，一段时间后检测热激蛋白的表达量以及昆虫幼虫的结冰点，结果如图。下列叙述错误的是（ ）
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A．dsGFP 对热激蛋白的表达没有显著影响
B．dsGdHsp60 抑制了热激蛋白基因的转录或翻译
C．对照组和 dsGdHsp60 组利用“减法原理”控制自变量
D．推测当机体受到冷胁迫时，GdHsp60 基因大量表达
【答案】C
【分析】1、转录是指主要在细胞核中利用DNA 的一条链合成mRNA 的过程，催化转录过程主要的酶是
RNA 聚合酶；翻译是指在细胞质的核糖体上利用mRNA 作为翻译的模板，氨基酸作为原料合成肽链的过
程，翻译过程中，需要三种RNA 的参与，其中mRNA 作为翻译的模板，rRNA 是组成核糖体的成分之一，
tRNA 作为运输工具（转运氨基酸）。
2、分析题图：左图表示绿色荧光蛋白基因对应的双链 RNA 片段（dsGFP） 和热激蛋白基因对应的双链
RNA 片段（dsGdHsp60）分别导入昆虫幼虫后热激蛋白的表达量变化情况，由题图可知，随着处理时间的
延长，导入双链RNA 片段（dsGdHsp60）热激蛋白的表达量呈下降趋势，而导入双链 RNA 片段
（dsGFP）的热激蛋白变化不明显；右图表示绿色荧光蛋白基因对应的双链 RNA 片段（dsGFP） 和热激
蛋白基因对应的双链RNA 片段（dsGdHsp60）分别导入昆虫幼虫后昆虫幼虫的结冰点，题图可知，导入
双链 RNA 片段（dsGFP）的昆虫幼虫结冰点与对照一致，导入双链RNA 片段（dsGdHsp60）的昆虫幼虫
结冰点上升。
【详解】A、分析左图可知，导入dsGFP 组与对照组相比，表达量没有显著变化，说明导入dsGFP 对热激
蛋白的表达没有显著影响，A 正确；
B、分析左图可知，dsGdHsp60 组与对照组相比，表达量显著下降，则dsGdHsp60 可能抑制了热激蛋白基
因的转录或翻译，B 正确；
C、dsGFP 组和dsGdHsp60 组都对实验材料加入了相关的影响因素，则利用“加法原理”控制自变量，C
错误；
D、dsGdHsp60 组热激蛋白表达量降低，昆虫幼虫的结冰点升高，则dsGdHsp60 可能有利于抵抗低温，则
当机体受到冷胁迫时，GdHsp60 基因可大量表达，D 正确。
故选C。
4．下列有关PCR 的叙述，错误的是（ ）
A．退火温度和延伸时间均与引物有关
B．常用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物
C．PCR 时需加入DNA 聚合酶和解旋酶
D．可用细胞的基因组DNA 作为模板
【答案】C
【分析】利用PCR 可以在体外进行DNA 片段的扩增。PCR 利用了DNA 的热变性原理，通过调节温度来
控制DNA 双链的解聚与结合。PCR 仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR 一般要经历30
次循环。
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【详解】A、PCR 的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，退火温度（使引物结合到互补链DNA 上）
和延伸时间（从引物3'的合成子链）均与引物有关，A 正确；
B、PCR 的产物常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的
大小和构象有关，B 正确；
C、PCR 技术中，DNA 解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C 错误；
D、PCR 是一项体外扩增DNA 的技术，可用细胞的基因组DNA 作为模板，实现目的基因的快速扩增，D
正确。
故选C。
5．下列关于DNA 重组技术基本工具的说法，正确的是（ ）
A．DNA 连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
B．限制酶切割DNA 后一定能产生黏性末端
C．质粒是基因工程中唯一的载体
D．微生物中的限制性核酸内切酶对自身DNA 无损害作用
【答案】D
【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条
链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。（2）DNA 连接酶：据
酶的来源不同分为两类：E．coliDNA 连接酶、T4DNA 连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA
连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。（3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体
的衍生物、动植物病毒等。
【详解】A、DNA 连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成磷酸二酯键，A 错误；
B、限制酶切割DNA 后能产生黏性末端或平末端，B 错误；
C、质粒是基因工程中常用的载体，噬菌体的衍生物、动植物病毒也可以作为基因工程的运载体，C 错误；
D、微生物中的限制酶对自身DNA 无损害作用，主要用于切割外源DNA，D 正确。
故选D。
6．某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA 片段，并用限
制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
【答案】B
【分析】E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。
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【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇
TGCGCAGT-3＇，A 正确；
B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI 切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI 切割形成
的，B 错误；
C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI 和CfoI 进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA 的
序列，切割之后至少获得了2 个片段，C 正确；
D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又
可连接黏性末端，D 正确。
故选B。
7．CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋
白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去
（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记
基因等。
【详解】为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基
因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163 基因转录形成的mRNA 中不能出现
终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP 基因转录形成的mRNA 不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因
此该拼接过程的关键步骤是除去CD163 基因中编码终止密码子的序列，B 符合题意，ACD 不符合题意。
故选B。
8．常见的启动子可分为三类：组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；组成型启动子，
驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因
的转录水平有所提高。下列叙述正确的是（ ）
A．启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，是DNA 聚合酶识别和结合的部位
B．细胞分化与组织特异型启动子的调控有关，与组成型启动子无关
C．乳腺生物反应器的构建需要将组成型启动子与目的基因连接
D．植物在长日照下开花，与诱导型启动子被激活有关
【答案】D
【分析】动物基因工程的应用：培育快速生长的转基因动物，如转基因绵羊、转基因鲤鱼；改善畜产品品
质的转基因动物，如乳汁中含乳糖较少的转基因牛；生产药物的转基因动物，如利用乳腺生物反应器生产
药物；作器官移植供体的转基因动物，如无免疫排斥的转基因猪。
【详解】A、启动子是RNA 聚合酶识别和结合的位点，A 错误；
B、根据题干信息“组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达”，所以在细胞分化过
程中，与组成型启动子有关，B 错误；
C、组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，而乳腺生物反应器需要将组织特异性启动
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子与目的基因连接，导入细胞中，保证基因在乳腺细胞中表达，C 错误；
D、长日照下植物开花，跟特定基因的表达有关，需要相应的诱导型启动子被激活，D 正确。
故选D。
9．一种天然蛋白t-PA 能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗
患者注射大剂量的t-PA 会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA 第84 位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低
其诱发出血的副作用。据此，先对天然t-PA 基因的碱基序列进行改造，然后再采取传统的基因工程方法表
达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA 蛋白。（注：下图表示相关的目的基因、载体及限制酶。
pCLY11 为质粒）下列不正确的是（ ）
A．改造后的t-PA 基因的黏性末端如上图所示，则需要选用限制酶XmaⅠ和NheⅠ切割质粒pCLY11
B．成功转入重组质粒的受体细胞在培养基上会出现白色菌落
C．以上技术制造出性能优异的改良t-PA 过程被称为蛋白质工程
D．改良t-PA 基因的表达可在一定程度上降低发颅内出血的概率
【答案】A
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因——DNA 分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗
体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋
白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现。通过蛋白质工程生产出来的蛋白质更加符合人类生产和生
活的需要。
【详解】A、t-PA 改良基因的黏性末端如图所示，那么需选用限制酶XmaI 和 BglⅡ切开质粒pCLY11，才
能与tPA 改良基因高效连接，A 错误；
B、t-PA 能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，成功转入重组质粒的受体细胞在培养基上会出现具
有抗性的白色菌落，B 正确；
C、该技术通过改造基因，从而产生出优异的改良t-PA 蛋白，因此该技术蛋白质工程，C 正确；
D、改良t-PA 基因的表达的产物良t-PA 蛋白能显著降低其诱发出血的副作用，可在一定程度上降低发颅内
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出血的概率，D 正确。
故选A。
10．载体是基因工程中携带外源DNA 片段（目的基因）进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型
主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正
确的是（ ）
A．重组载体A、重组载体B 分别是基因表达载体和基因克隆载体
B．载体A 和载体B 都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间
D．培养细菌A 和细菌B 的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
【答案】B
【分析】分析题图：图中重组载体A 导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重
组载体B 导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体。
【详解】A、重组载体A 导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B 导
入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A 错误；
B、作为运载体必须要具备的条件：含有限制酶的切割位点（便于目的基因的插入）、复制原点（便于目
的基因的扩增）及标记基因（便于筛选含有目的基因的受体细胞）等，因此载体A 和载体B 都必须含有限
制酶切割位点、复制原点和标记基因，B 正确；
C、培养细菌A 的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A 的
启动子和终止子之间，C 错误；
D、培养细菌A 的目的是扩增目的基因，培养细菌B 的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养
成分和功能上有明显差异，D 错误。
故选B。
11．亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状。研究人员发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8
号染色体的880kb 至903kb 区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行
PCR，经过琼脂糖凝胶电泳后结果如图所示。下列选项错误的是（ ）
A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的8 号染色体上的DNA 进行PCR 扩增
B．该突变体出现的根本原因是引物6 对应的区间发生了碱基对的替换
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C．凝胶中的DNA 分子经染色后可以在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来
D．该突变体的出现改变了该种群的基因频率，为生物进化提供了原材料
【答案】B
【分析】分析题图可知，分子量较大的扩增产物迁移速率慢，与点样处的距离较小，分子量较小的扩增产
物迁移速率快，与点样处的距离较大。
【详解】A、由于8 号染色体的880 kb 至903 kb 区间与突变体的光籽表型相关，故提取突变体和野生型的
8 号染色体上的DNA 进行PCR 扩增，A 正确；
B、根据题图分析，野生型和突变体经引物6 扩增的产物不同，其中突变体的相应扩增产物较大，故可推
知8 号染色体上的引物6 对应的区间发生碱基对的增添是该突变体光籽性状出现的根本原因，B 错误；
C、凝胶中的DNA 分子经染色后，对波长为300nm 的紫外光吸收性强，可在波长为300nm 的紫外灯下被
检测出来，C 正确；
D、可遗传变异为生物进化提供原材料，该突变体的出现改变了该种群的基因频率，为生物进化提供了原
材料，D 正确。
故选B。
12．新冠病毒、甲流病毒等微生物都会导致高烧等症状，靠临床表现难以进行区分和鉴定，多重 PCR—电
泳技术，可对多种病原体同时进行鉴别检测。多重 PCR—电泳技术指在同一个 PCR 反应体系中加入多对
引物，扩增相应的目的基因，产生不同长度的片段﹐再通过电泳进行分离和识别。下列相关叙述错误的是
（ ）
A．多重 PCR 过程中，不同引物的碱基排列顺序不能互补
B．PCR 过程复性阶段的温度过低，会导致非特异性条带增加
C．在电场作用下，带电分子一般向着与它所带电荷相同的电极移动
D．不同大小和构象的 DNA 分子在电泳时，迁移的速率不同
【答案】C
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要
原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
【详解】A、对于同一DNA 片段的不同区段进行扩增时，不同引物的碱基排列顺序不能互补，如果互补，
就会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率，A 正确；
B、复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，非特异性产物增加，B 正确；
C、带电DNA 分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相反的电极移动，C 错误；
D、电泳时不同大小的DNA 片段移动速率不同，分子量小的DNA 迁移速度大，D 正确。
故选C。
13．研究人员通过PCR 扩增质粒pDNR-LIB 中的sacB 基因，该基因的产物对蔗糖敏感，是一种常见的反
选择标记基因。tetA 是四环素抗性基因，利用基因工程将sacB 基因插入到质粒pAH162 上，构建含有tetA-
sacB 双重选择系统的重组质粒，即pAH162-sacB,具体过程如图所示。将pAH162-sacB 导入大肠杆菌验证其
双重选择作用。下列分析错误的是（ ）
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A．将sacB 基因插入到pAH162 上需要的限制酶是BamHI、EcoRI
B．需用Ca2+处理大肠杆菌细胞使其能主动吸收周围环境中的DNA 分子
C．为保证正向连接，PCR 时应在sacB 基因上游引物的5'端添加BamHI 识别序列
D．大肠杆菌能在含四环素的培养基中生长说明双重选择系统的重组质粒构建成功
【答案】D
【分析】PCR 扩增目的基因需要用耐高温的DNA 聚合酶，根据图示信息，还应该利用PCR 技术在目的基
因的两侧加入BamHI、EcoRI 酶的切割位点。
【详解】A、由图pAH162-sacB 可知，将sacB 基因插入到pAH162 上需要的限制酶是BamH I、EcoRI，A
正确；
B、导入重组质粒前，需用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状
态，B 正确；
C、为保证正向连接，PCR 时应在sacB 基因上游引物的5'端添加BamHI 识别序列，在sacB 基因下游引物
的5'端添加EcoRI 识别序列，C 正确；
D、具有双重选择系统的大肠杆菌在含四环素的培养基中生长，在含蔗糖的培养基中不生长，D 错误。
故选D。
14．RDX 是一种弹药使用后残留的危险污染物。研究人员将两个源于细菌的RDX 降解酶基因 XplA 和
XplB 插入柳枝稷草染色体中，如图所示，使柳枝稷草获得降解实弹射击场土壤中RDX 的能力。若要通过
PCR 检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA 和 XplB 基因，应选择的引物组合是（ ）
A．引物 1+引物3
B．引物 1+引物4
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C．引物2 +引物3
D．引物2+引物4
【答案】A
【分析】引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR 的引物长度通常
为20~30 个核苷酸，检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA 和 XplB 基因，应该是扩增包
括XplA 和 XplB 基因和两侧T-DNA 基因片段。
【详解】A、若正确插入，引物1 以XplB 的模板链为模板可以扩增出XplB 基因加部分左侧T-DNA 基因
片段，引物3 可以扩增出XplA 基因和XplB 基因片段，可以正确判断XplA 和 XplB 基因插入顺序，A 正
确；
B、引物1 可以扩增出XplB 基因加部分左侧T-DNA 基因片段，引物4 可以扩增出XplA 基因加部分右侧
T-DNA 基因片段，但是无法确定XplA 和 XplB 基因插入位置是否正确，B 错误；
C、引物2 和引物3 可以扩增出XplA 、XplB 基因，证明两者同时存在，无法确定其是否插入到T-DNA
上，C 错误；
D、引物2 可以扩增出XplB 基因加部分XplA 基因片段，引物4 可以扩增出XplA 基因加部分右侧T-DNA
基因片段，但是无法确定XplA 和 XplB 的正确插入顺序，D 错误；
故选A。
15．某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图
甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-GFP 基因纯合子
小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩增，PCR 产物电泳
结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子可以控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．4 号条带的小鼠是野生型，2 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】D
【分析】PCR 技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA
复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在编码区的左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转录
后，可以在Gata3 基因转录后，使GFP 基因转录，Gata3 基因的启动子也能控制GFP 基因的表达，A 正确；
B、据图可知，因启动子在左侧，转录从左向右，而翻译方向从mRNA 的5'-3'，Gata3 蛋白在GFP 蛋白的
左侧，所以翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
C、整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只有
小片段，是野生型，C 正确；
D、若用引物1 和引物3 进行PCR，杂合子和Gata3-GFP 基因纯合子都能扩增出相应的片段则不能区分杂
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合子和纯合子，D 错误。
故选D。
16．科研人员将目的基因J 与质粒构建重组表达载体，该质粒的部分结构如图所示，下列叙述错误的是（
）
A．除图中标出的结构外，质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶切位点等
B．与图中启动子结合的酶是RNA 聚合酶
C．用PCR 检测J 基因连接到质粒中且方向正确可选用的一对引物是F1和R2
D．若J 基因转录的链位于b 链，可知引物F1与基因J 的b 链相应部分序列相同
【答案】D
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】A、图中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制
原点等，A 正确；
B、启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，B 正确；
C、引物F2 与R1 或F1 与R2 结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连接到质粒中且插
入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2 和R1 或F1 与R2，C 正确；
D、b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该
是3’-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向
肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的
b 链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同，D 错误。
故选D。
17．表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA 上最常
见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达和STC2（癌症相关基
因）mRNA 的m6A 修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现ALKBH5 基因沉默和STC2
基因的过表达，以研究ALKBH5 介导的m6A 甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响（其中STC2 基因的α 链为
转录的模板链）。研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞迁移标志蛋白含量如图3 所示。
下列说法正确的是（ ）
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注：A、B、C、D 为四种引物序列；BamHⅠ、HindⅢ、SacⅠ为限制酶
A．PCR 反应体系需要加入耐高温的DNA 聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
B．利用PCR 扩增目的基因时，需要在引物B 的5＇端添加BamHⅠ识别序列和强启动子序列
C．为确保目的基因正确插入质粒，需要选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒
D．据图3 可知，ALKBH5 基因过表达导致STC2 基因表达的mRNA 去甲基化
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交
技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、PCR 反应体系中需加入耐高温的DNA 聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，复性过程不需要
酶，A 错误；
B、利用PCR 扩增目的基因STC2 时，引物使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，且
STC2 基因的a 链为转录的模板链，需要在引物C 的5'端添加BamH Ⅰ识别序列和强启动子序列，在引物B
的5'端添加Sac Ⅰ识别序列，B 错误；
C、目的基因STC 的两侧有BamH I、Sac Ⅰ的识别位点，二者不会把强启动子切割掉，因此为确保目的基
因正确插入质粒，需要选择BamH I、Sac Ⅰ限制酶切割质粒，C 错误；
D、根据题意“胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达和STC2（癌症相关基因）mRNA 的
m6A 修饰水平降低的异常现象”，并结合图示可知ALKBH5 基因过表达导致STC2 基因表达的mRNA 去
甲基化，进而导致STC2 基因过表达而引起癌细胞迁移，D 正确。
故选D。
18．科研人员利用PCR 技术扩增X 基因片段，需加入两种引物，引物结合位置如图甲所示。PCR 循环后
产生五种DNA 分子，如图乙所示。下列叙述正确的是（ ）
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A．利用DNA 聚合酶和DNA 连接酶才能完成PCR 扩增过程
B．如果加入大量引物1 和引物2，会干扰正常的PCR 扩增过程
C．在第四轮复制后，会出现8 个片段
D．经过第二轮PCR 后会出现①②③④五种DNA 分子
【答案】C
【分析】由图分析可知：X 基因第一次复制得到2 个两种DNA 分子：①和②；X 基因第二次复制得到4 个
四种DNA 分子：①复制得①和③，②复制得②和④；X 基因第三次复制得到8 个五种DNA 分子：①复制
得①和③，③复制得③和⑤，②复制得②和④，④复制得④和⑤；X 基因第四次复制得到16 个五种DNA
分子：①复制得①和③，②复制得②和④，2 个③复制得2 个③和2 个⑤，2 个④复制得2 个④和2 个⑤，
2 个⑤复制得4 个⑤。
【详解】A、利用PCR 技术扩增X 基因片段，利用DNA 聚合酶就能完成PCR 扩增过程，A 错误；
B、由图甲可知，利用PCR 技术扩增X 基因片段需要引物1 和2，如果加入大量引物1 和引物2，不会干扰
正常的PCR 扩增过程，B 错误；
C、第四次复制得到16 个DNA 分子：①复制得①和③，②复制得②和④，2 个③复制得2 个③和2 个⑤，
2 个④复制得2 个④和2 个⑤，2 个⑤复制得4 个⑤，C 正确；
D、X 基因第一次复制得到2 个两种DNA 分子：①和②；X 基因第二次复制得到4 个四种DNA 分子：①
复制得①和③，②复制得②和④。可见，经过第二轮PCR 后会出现①②③④四种DNA 分子，D 错误。
故选C。
19．用限制酶BamHⅠ、HindⅢ单独或联合切割某DNA 分子（长度为14 kb），在完全酶切（每个切点都被
切断）时得到的DNA 片段长度如图所示（1 kb 即1000 个碱基对）。下列说法错误的是（ ）
A．该DNA 分子上没有BamHⅠ的酶切位点
B．该DNA 分子上有2 个HindⅢ的酶切位点
C．该DNA 分子为环状DNA 分子
D．用BamHⅠ和HindⅢ联合切割该DNA 分子，最多可能得到7 种不同长度的线性片段
【答案】A
【分析】一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子。
【详解】ABC、甲DNA 分子中，BamHI 单独使用时DNA 片段，DNA 长度不变；HindⅢ单独使用时切割
为两个片段，说明该酶在甲DNA 分子上至少有一个酶切位点；BamHI 和HindⅢ联合切割甲DNA 分子时，
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被切割形成3 个片段，说明甲DNA 分子为环状DNA 分子，并且其上含有一个BamHI 的酶切位点，有两个
HindⅢ的酶切位点，A 错误，BC 正确；
D、用BamHI 和HindⅢ联合切割DNA 分子（所有切点都被切断），DNA 分子产生3 种不同长度的片段，
即3kb、5kb、6kb，也可能只被HindⅢ切割形成3kb、11kb 的片段，也可能只被BamHI 切成14kb 的片段，
或者BamHI 和HindⅢ不完全酶切得到8kb 和6kb 的片段，或5kb 和9kb 的片段，最多可能得到7 种不同长
度的线性片段，D 正确。
故选A。
20．Cre-loxP 系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre 酶能识别并切割的序列
(loxP1 和loxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre 酶随机“剪掉”,且两个
loxP1 之间或两个loxP2 之间的基因，最多会被Cre 酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜
色。下列说法错误的是（ ）
A．构建表达载体T 时用到的工具包括限制酶、DNA 连接酶
B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre 酶),其肌肉组织细胞呈无色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre 酶),其脑组织细胞只能呈红色或黄色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre 酶),其脑组织细胞可能出现两种颜色
【答案】C
【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶(限制酶)、 DNA 连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因
导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】A、基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA 连接酶两种工具酶处理，A 正确；
B、据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不
会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre 酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B 正确；
C、1oxP1、1oxP2 位置如图2 黑白三角符号所示，两个loxP1 和两个loxP2 之 间的基因最多会被Cre 酶敲
除一次，将含Cre 酶的病毒注入小鼠体内，Cre 酶表达情况不同，识别的loxP 不同，则有可能未敲除荧光
蛋白基因，此时为红色(同不含Cre 酶时)，也有可能敲除两个loxP1 之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色，
也有可能敲除两个1oxP2 之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色，因而不同脑细胞会差异表达红色、
黄色或蓝色荧光蛋白基因，C 错误；
D、小鼠脑组织细胞内有2 个相同表达载体T(含Cre 酶)，Cre 酶对每个DNA 片段随机剪切，因而细胞的颜
色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能出现两种颜色，D 正确。
故选C。
二、多选题
21．雌蚊会叮咬人类，可传播多种传染病。研究者利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统（可以实现对双链
DNA 的精确切割）和同源重组修复技术修改了蚊虫受精卵的某个基因，使拥有该基因的受精卵发育成雄蚊，
且该基因可遗传给子代，使群体中雄蚊比例升高。下列有关说法正确的是（ ）
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A．CRISPR/Cas9 基因编辑系统作用于DNA 的磷酸二酯键
B．转基因灭蚊技术通过提高蚊虫的死亡率来达到灭蚊的目的
C．转基因灭蚊技术具有效果显著、可持续等特点
D．该技术有可能造成目的基因扩散，导致基因污染
【答案】ACD
【分析】由题意可知，CRISPR/Cas9 基因编辑系统（可以实现对双链DNA 的精确切割），其与限制性内
切核酸酶功能相似。
【详解】A、CRISPR/Cas9 基因编辑系统与限制性内切核酸酶的功能相似，都可对DNA 进行切割，作用于
DNA 的磷酸二酯键，A 正确；
B、转基因灭蚊技术通过提高蚊虫群体中雄蚊比例，从而降低蚊虫群体出生率，B 错误；
C、由题意可知，转基因蚊的基因可遗传给子代，使群体中雄蚊比例升高，具有效果显著、可持续等特点，
C 正确；
D、转基因雄蚊可能会和近源物种杂交，导致目的基因扩散到自然界其他生物中，导致基因污染，D 正确。
故选ACD。
22．如图是将人的生长激素基因导入细菌B 细胞内制造“工程菌”的示意图．已知细菌B 细胞内不含质粒
A，也不含质粒A 上的基因．判断下列说法正确的是（ ）
A．将重组质粒导入细菌B 常用的方法是Ca2+处理法
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细
菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长
【答案】AC
【分析】根据题图分析：图示表示将人的生长激素基因导入细菌B 细胞内制造“工程菌”的过程。质粒A
上含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，构建基因表达载体后，破坏了质粒A 的四环素抗性基因，
但氨苄青霉素抗性基因正常，所以导入重组质粒或普通质粒的细菌都能抗氨苄青霉素，但导入重组质粒的
细菌不能抗四环素。
【详解】A 、将重组质粒导入细菌 B 之前，一般要先用Ca2＋处理细菌，使之处于感受态，从而能够吸
收重组质粒， A 正确；
B、质粒 A 中含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，而重组质粒中抗四环素基因被破坏，只含抗氨苄青
霉素基因，则在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入质粒 A 或重组质粒的细菌，B 错误；
C 、根据B 选项分析可知，能在含有四环素的培养基上生长的是导入了质粒 A 的细菌，C 正确；
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D 、根据题干信息分析，目的基因（人的生长激素基因）成功表达的标志是受体细胞能产生人的生长激
素， D 错误。
故选 AC 。
23．图1 为某种质粒简图，图2 表示某外源DNA 上的目的基因，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶
EcoRI、BamHI、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述正确的是（ ）
A．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA 的切割，则可选EcoRI
B．如果将一个外源DNA 分子和一个质粒分别用EcoRI 酶切后，再用DNA 连接酶连接，形成一个含
有目的基因的重组DNA，此重组DNA 中EcoRI 酶切点有1 个
C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA 片段自身环化，酶切时可使用BamHI 和HindⅢ两种限制
酶同时处理
D．一个图1 所示的质粒分子经EcoRI 切割后，含有2 个游离的磷酸基团
【答案】ACD
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
(1)分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测
目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
(2)个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、目的基因两侧都有，且质粒也有的限制酶是EcoRI，所以在基因工程中若只用一种限制酶完
成对质粒和外源DNA 的切割，可选EcoRI，A 正确；
B、如果将一个外源DNA 分子和一个质粒分别用EcoRI 酶切后，再用DNA 连接酶连接，形成一个含有目
的基因的重组DNA，此重组DNA 中EcoRI 酶切点有2 个，B 错误；
C、为了防止质粒和含目的基因的外源DNA 片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同
时处理，C 正确；
D、一个图l 所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，产生两个黏性末端，含有2 个游离的磷酸基团，D 正确。
故选ACD。
24．交错PCR 能实现同源基因的重组（如图，仅示单链）。第一轮延伸15s，获得短产物①②。在第二轮
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开始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸15s，合成交
错产物③④。每一轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物-模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基
因产物。相关叙述正确的是（ ）
A．交错PCR 原理是DNA 半保留复制
B．交错PCR 延伸温度设定为55℃可增加交错次数
C．上一轮交错产物需与模板链严格配对才能继续下一轮扩增
D．若交错循环20 轮，一共产生220 个DNA 分子
【答案】AB
【分析】PCR 技术的原理是模拟生物体内DNA 分子复制的过程，利用DNA 分子热变性原理，通过控制温
度控制控制DNA 分子的解聚和结合。
【详解】A、交错PCR 是PCR 技术的延伸，利用了DNA 半保留复制，A 正确；
B、在第二轮开始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸
15s，合成交错产物③④，故延伸温度设定为55℃可增加交错次数，B 正确；
CD、交错延伸PCR 与普通PCR 技术的区别是每轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物一模板”交替结合、
延伸，最终扩增出交错重组基因片段混合产物。故上一轮交错产物不需与模板链完全配对即可继续下一轮
扩增，交错循环20 轮，也只产生1 个DNA 分子，CD 错误。
故选AB。
25．为增加油菜种子含油量，科研人员尝试将酶D 基因（图甲左）与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进
入叶绿体）基因（图甲右）连接，构建融合基因后导入Ti 质粒（图乙），最终获得转基因油菜品种，以下
叙述正确的是（ ）
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A．用ClaⅠ切割酶D 基因和转运肽基因所在片段，再利用DNA 连接酶连接获得融合基因
B．用XbaI 和SacI 同时切割融合基因所在片段和载体片段，连接后获得重组Ti 质粒
C．将油菜细胞接种在含卡那霉素的固体培养基上筛选成功导入融合基因的细胞
D．转基因油菜的酶D 基因只表达于含叶绿体的细胞，并在叶绿体内转录、翻译
【答案】AB
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从利用PCR 技术扩增和人工合成。(2)基
因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法
有农杆菌转化法、花粉管通道法，将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入
微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染
色体的DNA 是否插入目的基因和检测目的基因是否转录出了mRNA--PCR 技术；③检测目的基因是否翻译
成蛋白质-抗原抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、据图甲可知，酶D 基因和转运肽基因上都有限制酶Cla Ⅰ切割位点，会产生相同的末端，再利
用DNA 连接酶连接获得融合的基因，A 正确；
B、根据A 项的结果获得重组的目的基因上，含有Xba I 和Sac I 两种限制酶的切割位点，结合图乙，目的
基因必修插在启动子和终止子之间，用Xba I 和Sac I 同时切割目的基因和载体片段，连接后获得重组Ti 质
粒，B 正确；
C、根据图乙可知，T-DNA 不含卡那霉素抗性基因，可将油菜细胞接种在含潮霉素的固体培养基上筛选成
功导入融合基因的细胞，C 正确；
D、由题意可知，叶绿体转运肽是引导合成的蛋白质进入叶绿体，由于酶D 基因与叶绿体转运肽基因重组
形成新的目的基因，转基因油菜的酶D 基因可以在其他细胞中表达，叶绿体转运肽会引导合成的蛋白质进
入叶绿体，D 错误。
故选AB。
三、综合题
26．金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基
因结构如图1 所示，其中B 链为转录的模板链。科研人员利用图2 所示质粒构建枣树的MT 基因重组DNA
分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT 工程菌。回答下列问题：
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（注：XhoI、KpnI、PstI 为不同限制酶的识别位点：LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质
X-gal 产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色：amp 基因为氨苄青霉素抗性基因。）
(1)为了使PCR 扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT 基因时应选择的引物组合是
，并在其5′末端分别添加限制酶 的识别序列。
(2)构建重组DNA 分子启动子是 识别并结合的部位。
(3)导入、筛选和鉴定MT 工程菌。
①将得到的混合物导入到用 处理的大肠杆菌完成转化实验
②将菌液稀释并涂布在含X-gal 和氨苄青霉素的培养基上进行培养后，随机挑取 的单菌落可获得MT
工程菌。
③欲进一步对MT 工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT 工程菌与普通大肠杆菌分别接种至含 的LB
液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。
【答案】(1) 引物Ⅱ和引物Ⅲ Kpn I 和Xho I
(2)RNA 聚合酶
(3) Ca2+ 白色 （一定浓度的重金属）镉
【分析】1、引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA 聚合酶
能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR 的引物长度通常为20 一30 个核苷酸。
2、启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合
酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）PCR 过程中，引物与模板链的3'端结合，因此应当选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，这样才能使DNA
聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。由题干可知，B 链为模板链，转录的方向是沿着模板链的
3'→5'，应将MT 基因的左端与启动子一侧连接，由于目的基因中含有Pst Ⅰ的识别序列，若在基因两侧添
加Pst Ⅰ识别序列，将来对MT 基因进行切割时会破坏目的基因，同时为了保证MT 基因正向连接到质粒上，
应当在MT 基因两侧连上连不同的限制酶识别序列，故添加的限制酶序列分别是Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ限制酶序列，
并且应添加在基因的外侧，才能不影响基因的序列，故添加在引物的5'端。
（2）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要
的蛋白质。
（3）①大肠杆菌是原核生物，需要Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，完
成将基因表达载体导入受体细胞并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，即转化过程。②在含有氨苄青霉
素的培养基上，导入了空白质粒和重组质粒的大肠杆菌都可以形成菌落，但导入重组质粒的大肠杆菌LacZ
基因被破坏，不能催化无色物质X-gal 产生蓝色物质，是白色菌落，故应挑取白色单菌落进行培养。③操
作获得的是对重金属镉（Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT 工程菌，因此欲进一步对MT 工程菌进行鉴定，
可将挑取出的MT 工程菌与普通大肠杆菌分别接种到含有(一定浓度的重金属)镉的LB 液体培养基中。
27．猪源大肠杆菌会引起仔猪发生肠炎、肠毒血症等疾病。LTB 和ST1 是猪源大肠杆菌肠毒素基因，融合
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基因LTB—ST1 的表达产物LTB—ST1 融合蛋白可有效预防仔猪黄痢。构建融合基因的方法如下图1 所示。
请回答：
(1)猪源大肠杆菌与猪细胞在结构上最主要的区别是 ，猪源大肠杆菌与猪的种间关系为
。
(2)在对LTB 基因与ST1 基因进行PCR 过程中，DNA 解旋的方法是 ，若引物中C 或G 的碱基
数量越高，则复性的温度会 （选填“升高”、“降低”或“不变”）。
(3)图1 中限制酶1 使得LTB 基因中的 键断裂。为保证经酶处理后的LTB 基因与ST1 基因能够
正常连接，限制酶1 与限制酶2 在选取时需满足 的特点，可见这种融合基因的方法具有局限性。
(4)为突破限制酶选取的局限性，研究人员通过重组PCR 技术构建了LTB—ST1 融合基因，如图2 所示，请
回答：
①重组PCR 技术依据的生物学原理是 。PCR1 和PCR2 需要在两个不同反应体系中进行的原因
是 ，两个反应体系中加入的物质中不同的是 。下列序列中符合引物P2 与引物P3
的5’末端碱基序列要求的是：
A．5’ATCGGACTTG···3’ B．5’ATCGGAGAAC···3’
C．5’TAGCCTGAAC···3’ D．5’CAAGTCCGAT···3’
②重组PCR 技术不仅可用于构建融合基因，还可用于研究基因定点突变。若要在两个基因连接处实现基因
定点突变，可对 进行设计，后通过重组PCR，使新合成的DNA 中含有突变位点，从而实现基
因的定点突变。
【答案】(1) 无以核膜为界限的细胞核 寄生
(2) 高温 升高
(3) 磷酸二酯键 可以形成相同的黏性末端
(4) DNA（半保留）复制 引物P2 与P3 可发生部分碱基互补配对，在同一个体系中无法正常完成
复性过程 引物、模板 AD 引物P2 和P3
【分析】1、PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与
DNA 复制的各种组分与反应条件，对日的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2、题图所示重组PCR 技术，是通过对引物的“接头”设计，将两个基因连接到一起，其本质上仍然是
PCR 技术。
【详解】（1）猪源大肠杆菌是原核生物，猪细胞为真核细胞，它们主要区别是猪源大肠杆菌无以核膜为
界限的细胞核；猪源大肠杆菌必须寄宿在猪的肠道生存，所以种间关系为寄生。
（2）PCR 过程中，DNA 解旋的方法是高温使双链打开；在一定范围内，反应体系中引物的G、C 碱基含
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量越高，其结合的特异性越强，复性的温度越高，
（3）限制酶切断的是DNA 的磷酸二酯键；为保证经酶处理后的LTB 基因与ST1 基因能够正常连接，限制
酶1 与限制酶2 在选取时需满足，酶切后的黏性末端是相同的，才可以通过碱基互补配对连接到一起。
（4）①重组PCR 技术依据的是DNA 的半保留复制的生物学原理。引物P2 与P3 是互补的，会发生部分碱
基互补配对，在同一个体系中无法正常完成复性过程。CR1 和PCR2 是在两个不同反应体系中进行，扩增
的是两个不同的基因，所以加入的模板不同，引物也不同。引物P2 与引物P3 是互补的，故选AD。
②利用重组PCR 技术进行基因定点突变，可以把突变位点设计在引物上，从而加到新合成的DNA 上。所
以可以根据突变位点的碱基序列设计引物P2 和P3，进行重组PCR。
28．结合所学知识及下列资料，完成相关设计。
资料一：人原癌基因 erbB2 编码的p185 蛋白可存在于肿瘤细胞膜上，erbB2 的过量表达与肿瘤细胞侵袭、
转移密切相关，人体自身免疫系统通常不会产生相应抗体。
注：Pl 为山羊乳腺特异性表达启动子，P2 为四环素诱导启动子(必须在四环素存在时才能起作用)；限制酶
Mbo I、XbaI 与 ScaI 的识别序列均不相同。
(1)鼠源单克隆抗体的获取
抗体由 细胞分泌，可将 注入小鼠体内，经杂交瘤技术获得相应的鼠源单克隆抗体， 以期治疗
肿瘤。
资料二：鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，研制、接种人-鼠嵌合抗体(简称M 抗体)可
降低免疫排斥， 用于肿瘤治疗。鼠源、人源抗体结构如图甲所示。
(2)M 抗体的设计
可将图示中的 与 组合，设计出M 抗体。
资料三：获得相关基因后，利用PCR 技术进行融合得到目的基因，可选择与乳腺细胞表达载体pBC1 构建
重组DNA 分子。 目的基因、表达载体pBCl 如图乙所示。
(3)重组DNA 分子的构建
①PCR 扩增图示目的基因时需加入 种引物和 酶。
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②本实验应选择限制酶 切割目的基因与pBCl 载体，将酶切产物正确连接后形成重组 DNA 分子， 以
便后续通过荧光检测筛选。
资料四：培育转基因小鼠，让目的基因在小鼠乳腺中表达。经检测，M 抗体的相关基因都能表达，也能组
装并分泌M 抗体。
(4)转基因小鼠的培育
①通常将重组DNA 分子导入小鼠的 (填细胞名称)，在培养液中加入 后，发出 荧光的即为
目标细胞，再经过 等胚胎工程技术获得转基因小鼠。
②通过 技术检测小鼠乳汁中的M 抗体水平，发现其含量较低，原因可能有 、M 抗体的组装及
分泌过程受阻等。
【答案】(1) 浆 p185 蛋白
(2) 鼠源抗体的可变区 人源抗体的恒定区
(3) 2 耐高温的DNA 聚合/Taq/Taq DNA 聚合 Sca Ⅰ和Xba Ⅰ
(4) 受精卵 四环素 红色 胚胎移植 抗原-抗体杂交 M 抗体的表达量低、山羊
乳腺特异性表达启动子在小鼠中作用效果不理想
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有利用PCR 技术扩增和人工合成等。2、基
因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定： （1） 分子水平上的检测：①检测
转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因—DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA
—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。（2） 个体水平上的鉴定：抗
虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）体液免疫中抗体由浆细胞分泌，根据题目，人原癌基因 erbB2 编码的p185 蛋白可存在于肿
瘤细胞膜上，且erbB2 的过量表达与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关，所以可将p185 蛋白注入小鼠体内，经
杂交瘤技术获得相应的鼠源单克隆抗体， 以期治疗肿瘤。
（2）根据资料二、与抗原结合的位点位于抗体可变区，研制人-鼠嵌合抗体（简称M 抗体）可将图示中的
鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区组合。
（3）PCR 反应的物质主要有五种即：引物、耐高温DNA 聚合酶、dNTP、模板和缓冲液；目的基因两条
链的碱基排列顺序不同，所以PCR 扩增图示目的基因时需加入2 种引物和耐高温DNA 聚合酶酶；目的基
因和运载体必须用同种限制酶进行切割，且目的基因只能用限制酶Sca Ⅰ和Xba Ⅰ进行切割（若用限制酶
Mbo Ⅰ切割，目的基因两端形成相同的末端，会导致目的基因出现自身相连的现象），所以应选择限制酶
Sca Ⅰ和Xba Ⅰ切割目的基因与pBCl 载体。
（4）动物细胞中受精卵的分化程度最低，全能性最高，所以通常将重组DNA 分子导入小鼠的受精卵，在
体外进行早期胚胎培养；根据题意，P2 为四环素诱导启动子且必须在四环素存在时才能起作用，所以需
在培养液中加入四环素；重组DNA 分子导入成功的细胞中含有红色荧光蛋白基因，表达后细胞会发出红
色荧光，所以发出红色荧光的即为目标细胞，最后再经过胚胎培养等胚胎工程技术获得转基因小鼠；检测
目的基因是否翻译成蛋白质的方法为抗原-抗体杂交技术，若发现转基因小鼠中M 抗体含量较低，原因可
能有M 抗体的表达量低、山羊乳腺特异性表达启动子在小鼠中作用效果不理想、M 抗体的组装及分泌过
程受阻等。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问
题的能力是解答本题的关键。
29．水蛭素是一种小分子蛋白质，对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现的最强凝血酶天然特异
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抑制剂，在心脑血栓疾病治疗中均有显著作用。天然水蛭素主要从医用水蛭的唾液腺中分离出来，产量有
限，因此利用基因工程制备重组水蛭素成为抗血栓治疗的研究热点之一。通过基因工程生产水蛭素的方法
如下图所示。EcoRI 和BamHI 为两种限制性内切核酸酶
回答下列问题：
(1)获取目的基因：从 中获取mRNA。在设计用于cDNA 扩增的特异性引物时，为方便扩增
产物与载体的连接，应在引物中加上
(2)构建重组质粒：按图所示，选用的限制性内切核酸酶为 ，原因是 。目的基
因和质粒可以“拼接”成功的原因是 。
(3)导入大肠杆菌；为提高大肠杆菌的转化效率，可将大肠杆菌放于低温、 （“高”或
“低”）浓度的CaCl2 溶液中，可使细胞膨胀通透性增加，制备成 ，促进重组质粒的转入。
(4)筛选与检测：将大肠杆菌培养在添加 的LB 固体培养基上，可筛选得到转入重组质粒的大
肠杆菌。还可以用 技术更加精准地鉴定大肠杆菌细胞中是否转入了水蛭素基因。
(5)生产：在规模化的发酵生产中，需监控发酵过程的营养供给、 等变化。采用低温（4℃）
离心、萃取方法分离和提纯水蛭素，低温处理的目的是 ，其理由是
(6)通过上述方法生产的水蛭素的抗凝血活性低于天然野生型水蛭素，可通过设计和改造 获
得抗凝血活性高的水蛭素。
【答案】(1) 水蛭唾液腺细胞 合适的（BamHI）限制酶识别序列
(2) BamHI 只有插入在启动子与终止子之间的目的基因才能正常表达 两者都是双螺旋结构
的DNA 分子，经酶切后有互补的黏性末端
(3) 低 感受态细胞
(4) 卡那霉素 PCR（或核酸分子检测）
(5) 溶解氧、温度和pH 保护水蛭素的活性 可防止发酵过程产生的蛋白酶的作用
(6)水蛭素基因
【分析】 1、基因工程四个步骤：目的基因的获取 、基因表达载体的构建 、将目的基因导入受体细胞 、
目的基因的检测与鉴定。目的基因获取途径：从基因文库中获取、PCR 扩增、化学合成；构建基因表达载
体时，需要用相同的限制酶将载体和目的基因切开，再用DNA 连接酶将目的基因和载体连接起来，构建
基因表达载体，常见的载体有质粒；将目的基因导入受体细胞时，如果受体细胞是植物细胞，可以用花粉
管通道法或农杆菌转化法；受体细胞是动物细胞时，用显微注射法；受体细胞是微生物细胞时，可以用
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Ca+处理法。目的基因导入受体细胞后，在细胞水平要鉴定是否导入，选择核酸分子杂交技术；鉴定是否
转录，选择核酸分子杂交技术，是否翻译，可用抗原-抗体杂交法；在个体水平上还可以进行抗性实验。
2、从图中分析可知，从水蛭唾液腺细胞中获得水蛭素nRNA 后，通过①逆转录形成cDNA，利用②PCR
或人工合成等方法增加目的基因的数量，再用相同达到限制酶处理目的基因和质粒，利用DNA 连接酶将
质粒与目的基因连接起来，③构建基因表达载体，利用④Ca+处理大肠杆菌体内，并⑤筛选出转化的大肠
杆菌，经过⑥扩大繁殖后得到大量的工程菌，从这些工程菌的培养液中分离纯化出水蛭素。
【详解】（1）从图中可知，获取目的基因先从水蛭唾液腺细胞中获取mRNA，再通过逆转录得到cDNA。
在设计用于cDNA 扩增的特异性引物时，为方便扩增产物与载体的连接，应在引物中加上合适的
（BamHI）限制酶识别序列，使扩增处来的目的基因中有（BamHI）限制酶识别序列。
（2）建重组质粒时，按图所示，选用的限制性内切核酸酶为BamHI，原因是只有插入在启动子与终止子
之间的目的基因才能正常表达，如果选择PvuⅠ限制酶，目的基因插在启动子上游，导致目的基因无法表达，
同样，XbaⅠ限制酶和SalⅠ限制酶会分别破坏启动子、终止子，导致目的基因无法表达；而AscⅠ限制酶在
扩增的目的基因中缺乏相应识别序列，所以选用的限制性内切核酸酶为BamHI。目的基因和质粒可以“拼
接”成功的原因是两者都是双螺旋结构的DNA 分子，经酶切后有互补的黏性末端，能够发生碱基互补配
对，使DNA 连接酶发挥作用。
（3）导入大肠杆菌时，为提高大肠杆菌的转化效率，可将大肠杆菌放于低温、低浓度的CaCl2 溶液中，
可使细胞吸水膨胀通透性增加，制备成感受态细胞，更容易吸收培养液中的基因表达载体，促进重组质粒
的转入。
（4）筛选与检测时，将大肠杆菌培养在添加卡那霉素的LB 固体培养基上，因为基因表达载体上具有卡那
霉素抗性基因，在这样的培养基中可筛选得到转入重组质粒的大肠杆菌。还可以用PCR（或核酸分子检
测）技术更加精准地鉴定大肠杆菌细胞中是否转入了水蛭素基因，在个体水平上也可以进行抗性检测。
（5）在规模化的发酵生产中，需监控发酵过程的营养供给、溶解氧、温度和pH 等变化，防止菌种繁殖受
到抑制。采用低温（4℃）离心、萃取方法分离和提纯水蛭素，水蛭素是一种小分子蛋白质，低温处理的
目的是保护水蛭素的活性，在低温下酶的活性低，可防止发酵过程产生的蛋白酶的作用。
（6）通过上述方法生产的水蛭素的抗凝血活性低于天然野生型水蛭素，天然水蛭素形成过程中有内质网、
高尔基体的加工，而上述方法产生的水蛭素是由大肠杆菌产生，大肠杆菌没有内质网和高尔基体的加工过
程，所以可通过设计和改造水蛭素基因获得抗凝血活性高的水蛭素。
30．表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA 上最常
见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达和STC2（癌症相关基
因）mRNA 的m6A 修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现ALKBH5 基因沉默和STC2
基因的过表达，以研究ALKBH5 介导的m6A 甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响。
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(1)已知STC2 基因的α 链为转录的模板链，据图1 分析，利用PCR 扩增目的基因时，需要在引物
的5′端添加BamHⅠ识别序列和强启动子序列，在引物 的5′端添加SacⅠ识别序列。目的基因两端
用不同限制酶切割的原因是 。
(2)为确保目的基因正确插入质粒，需要选择 限制酶切割质粒。将重组质粒导入大肠杆菌时，可
利用潮霉素和卡那霉素筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，试简要表述筛选思路： 。
(3)研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞迁移标志蛋白含量如下：
根据结果推测ALKBH5 基因影响胃癌迁移的机理是 。
【答案】(1) C B 可以减少目的基因及质粒的自身环化、使目的基因定向连接到质粒上，以
增大目的基因正向（正确）连接的概率
(2) BamHⅠ、SacⅠ 依次使用含卡那霉素的培养基和含潮霉素的培养基筛选，能够在含卡那霉素培
养基中生长，而不能在含潮霉素培养基中生长的大肠杆菌即为导入重组质粒的大肠杆菌
(3)ALKBH5 基因过表达导致STC2 基因表达的mRNA 去甲基化，进而导致STC2 基因过表达而引起癌细胞
迁移
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受
体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）据图1 分析，利用PCR 扩增目的基因STC2 时，在DNA 复制过程中，子链的延伸方向是从
5′端到3′端，且STC2 基因的α 链为转录的模板链，需要在引物C 的5′端添加BamHI 识别序列和强启动子
序列，在引物B 的5′端添加SacI 识别序列。目的基因两端用不同限制酶切割的原因是：可以减少目的基因
及质粒的自身环化、使目的基因定向连接到质粒上，以增大目的基因正向（正确）连接的概率。
（2）图1 显示，目的基因STC2 的两侧有BamHⅠ、SacⅠ的识别位点，二者且不会把强启动子切割掉，因此
为确保目的基因正确插入质粒，需要选择BamHⅠ、SacⅠ限制酶切割质粒。将重组质粒导入大肠杆菌时，可
利用潮霉素和卡那霉素筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。由于限制酶BamHⅠ和SacⅠ破坏了潮霉素抗性基
因，故可依次使用含卡那霉素的培养基和含潮霉素的培养基筛选，能够在含卡那霉素培养基中生长，而不
能在含潮霉素培养基中生长的大肠杆菌即为导入重组质粒的大肠杆菌。
（3）根据结果可知，ALKBH5 基因沉默会减少癌细胞迁移量，STC2 基因过表达会恢复癌细胞迁移量。因
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此推测ALKBH5 基因过表达导致STC2 基因表达的mRNA 去甲基化，进而导致STC2 基因过表达而引起癌
细胞迁移。
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