从GEO下载转录组数据:差异基因、火山图、热图、GO/KEGG功能富集分析方法

如何成为专业的生信人，那就是搞到质量高得数据。在数据库中，上传者往往不会将自己整理好的数据直接上传，而是放一个测序的原始数据，那我们下载下来是无法直接使用的，需要进行专业处理后得到基因表达矩阵。今天分享一个GEO数据库上载录的于2022年发表的人的RNA-seq测序数据，并教大家如何下载和预处理（将原格式转换为基因表达矩阵）

演示数据获取网址如下：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE216281

（1）可以发现作者这里仅提供了一个文件，是txt文件，算是比较友好的。点击http下载。

小贴士：在GEO 数据库的下载栏中，FTP 和HTTP 是两种用于下载数据的协议。

1. FTP（File Transfer Protocol）：通过FTP 下载数据时，会提供一个 FTP 地址，用户可以通过工具连接到 GEO 的服务器并下载文件。适合大文件或批量下载。需要使用支持 FTP 的客户端（如 FileZilla）或命令行工具（如 wget）进行下载。

2. HTTP（Hypertext Transfer Protocol）：点击链接即可在浏览器中直接下载文件。

（2）解压缩下载的文件

（3）用excel打开txt文件

（4）观察这个文件，A1单元格为所有样本名称

（5）A2单元格开始为基因探针和每个样本的该基因FPKM值

（6）我们需要做的就是，将A1中每个样本独立占据单元格，依次按B1、C1等分开；A2仅为基因探针，基因表达值依次占据B2、C2等单元格。如图所示，并且下面将演示如何操作。

（7）首先将文件另存为csv文件。

（8）用R语言处理该csv文件，运行代码即可。注意R操作路径为该文件所在位置（代码为药理实验屋团队编写，点赞 + 爱心，评论区留言即可领取）。

（9）打开代码运行后保存的文件，可以看到样本名称已经分开，并依次填充到后面单元格，与基因表达值一一对应；基因探针为第一列。现在只需要手动删除第一行，并将A2单元格NA改成Gene Symbol。

（10）现在使用R将基因探针对应成基因名称（代码为药理实验屋团队编写，点赞 + 爱心，评论区留言即可领取）。

（11）打开保存的文件，可以发现基因名称与探针一一对应。

（12）下面将上面三栏内容复制并插入表达矩阵中，并用函数索引进行基因的填充替换。黄色为原基因探针，橙色为复制内容，GENE栏为将要填充的基因探针对应的基因。

（13）使用VLOOKUP函数，公式：=VLOOKUP(@A:A,B:D,2,FALSE)。

（14）选中单元格，CTRL+D进行填充，补全全部基因。

（15）将GENE这一栏复制为仅数值插入右侧。

（16）删除前5列即可得到完整的基因表达矩阵。

（17）将GENE按升序排列。

（18）下拉到基因名为N/A的地方并删除。出现基因为N/A的原因是由于基因探针与GENE名称的对应关系在不断变化，或者每个测序公司有非公用探针。这种时候只能忽略这些值，或者更新自己的R包，或者联系文章作者。

（19）最后，将样本名更改成正常和疾病。回到GEO数据库中查看每个样本代表的是正常还是疾病。可以发现Braak_Group_0是正常，其余均代表发病，只是病情阶段不同。

（20）在基因表达矩阵中更改样本信息。

（21）新建一个CSV文件，将样本信息归组，用于后续差异基因分析用。

（22）读取基因表达矩阵，合并相同基因行，重新保存文件。因为一个基因会对应多个探针，所以转换ID会产生相同的基因，这时需要进行合并。

（23）重新读取基因表达矩阵，处理数据，包括取对数、均一化、去除低表达等。

（24）均一化展示图。

（25）读入样本分组信息，以logFC 为 1、 P.Value 为 0.05 为筛选目标进行差异基因分析。

（26）保存后的差异基因中注明了每个基因是上调还是下调。

（27）利用差异基因绘制火山图。

（28）火山图展示图。

（29）添加基因。

（30）读入基因表达矩阵，绘制热图。

（31）热图展示图。

（32）换个聚类算法。

（33）换个颜色。

（34）利用差异基因进行富集分析。可以使用上调、下调、上调+下调或自定义基因进行分析。将需要分析的基因保存为CSV文件。

（35）GO/KEGG功能富集分析展示图。

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