bioRxiv老文献 | 利用碱基编辑器介导外显子包含,实现永久性纠正家族性自主神经功能障碍

家族性自主神经功能障碍(FD)是一种致命的常染色体隐性感觉和自主神经病，由ELP1基因内含子20中T→C点突变(c.2204+6T>C)引起，导致第20号外显子组织特异性跳跃和ELP1蛋白水平降低，目前尚无FDA批准的疾病修饰疗法。近期，麻省总医院/哈佛医学院在bioRxiv更新了2024年发表的预印本“Development of a cytosine base editor for the treatment of familial dysautonomia”。该研究通过系统性筛选碱基编辑器和引导RNA，鉴定出TadCBEd-SpG/gRNA-C6为最优配置，在人细胞中实现高达70%的靶向纠正并恢复ELP1第20号外显子inclusion。通过双AAV内含肽分裂碱基编辑器静脉递送至人源化FD小鼠模型后，在肝、脑和心脏组织中实现遗传纠正并显著增加ELP1外显子20 inclusion。在FD患者来源iPSC分化交感神经元中，约10%的纠正效率即足以挽救疾病相关的神经元过度活跃表型，证明部分纠正即可恢复功能表型。

主要研究结果

1，通过系统筛选CBE编辑器与gRNA组合，鉴定TadCBEd-SpG/gRNA-C6实现最高约50%纠正效率，而TadCBEd-SpRY/gRNA-C11实现无旁观者编辑的精准纠正。

利用ABE在HEK293T细胞中构建纯合ELP1 T6C突变细胞系(图S1)，随后系统评估CBE编辑器(图1B-C)。TadCBEd脱氨酶与SpRY或SpG配对后，在多个gRNA中实现高效C-to-T编辑(图1D-E)，其中TadCBEd-SpG/gRNA-C6(NGC PAM)达最高约50%纠正效率(图1E)，TadCBEd-SpRY/gRNA-C11(NTG PAM)实现精准纠正且无旁观者编辑(图1D)。TadCBEd活性显著优于CBE6a和CBE6b(图1F-G)。综合筛选确认这两个配置为优先候选。

图1 工程化胞嘧啶碱基编辑器纠正ELP1 T6C突变

2，AAV兼容的内含肽分裂CBE系统实现ELP1剪接恢复，旁观者编辑可能协同增强外显子 inclusion。

为便于体内递送，构建AAV兼容的内含肽分裂CBE系统(图2A)。TadCBEd-SpG/gRNA-C6经分裂系统递送后显著增加ELP1外显子20 inclusion，而TadCBEd-SpRY/gRNA-C11尽管检测到编辑但未恢复剪接(图2D-F)，提示最大化编辑效率比最小化旁观者编辑对功能剪接纠正更重要，且旁观者编辑可能通过调节局部剪接调控元件进一步增强外显子 inclusion。质粒滴定实验模拟低表达水平下TadCBEd-SpG/gRNA-C6仍保持最高纠正效率(图2G)。gRNA正向排列(tandem-facing)较反向排列(opposite-facing)适度提升编辑效率(图2I-K)。

图2 AAV兼容内含肽分裂碱基编辑器系统的工程与优化

3，全基因组脱靶分析显示TadCBEd-SpG/gRNA-C6在三种人细胞类型中均具高特异性，所有验证脱靶事件低于0.2%。

GUIDE-seq2鉴定SpG/gRNA-C6五个候选脱靶位点，SpRY/gRNA-C11六个候选脱靶位点(图3C)，SpG/gRNA-C6约70%读段映射至预期ELP1靶位点(图3D)。Cas-OFFinder预测SpG/gRNA-C6有17个候选位点，SpRY/gRNA-C11有84个(图3E)。靶向深度测序验证20个候选位点后，在HEK293T-ELP1-TC6细胞中检测到9个位点有低频编辑，FD-iPSC交感神经元中8个，FD患者成纤维细胞中仅1个(图3G)，所有验证脱靶事件均低于0.2%(图3H)。PAM选择性LWRYEK变体在部分脱靶位点降低编辑但增加旁观者编辑(图3I)。

图3 ELP1碱基编辑的特异性评估

4，AAV介导的碱基编辑器在FD人源化小鼠模型中恢复ELP1剪接，在FD患者神经元中约10%编辑效率即挽救神经元过度活跃表型。

在TgFD9小鼠(含人ELP1 T6C转基因)中，AAV2玻璃体内注射后视网膜细胞达约8%纠正(图4A-B)；AAV9新生鼠静脉注射后肝约30%、心约10%、脑约5%纠正(图4C-D)。处理后肝、脑和心脏中ELP1外显子20 inclusion显著增加，脑中外显子inclusion增加约50%(图4E-H)。在FD-iPSC分化交感神经元中，AAV2转导后外显子inclusion增加(图4I-J)，多电极阵列记录显示未治疗FD神经元呈显著自发放电过度活跃，而AAV2-BE治疗组放电频率大幅降低，接近健康对照水平(图4K)，证明约10%的DNA纠正效率即可挽救疾病相关功能表型。

图4 AAV递送碱基编辑器在体内恢复ELP1剪接并在FD模型中挽救神经元表型

综上所述，本研究通过系统性比较碱基编辑器和引导RNA，并通过双AAV内含肽分裂系统递送后在人源化FD小鼠模型中实现多组织ELP1剪接恢复。然而，AAV介导的体内递送效率在脑组织中仍较低(约5%)，需进一步优化；长期编辑稳定性和潜在免疫原性尚待评估；PAM选择性LWRYEK变体在降低部分脱靶位点编辑的同时增加了旁观者编辑，需进一步权衡优化。

参考来源：

Yun, S., Cifuentes, A., Kleinstiver, B.P., Slaugenhaupt, S.A., Morini, E. & Alves, C.R.R. Development of a cytosine base editor for the treatment of familial dysautonomia. bioRxiv (2026). DOI:2024.11.27.625322

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