一、感受态细胞的概念

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

所谓的感受态细胞，即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。通俗的讲，就是受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl2，RuCl3等化学试剂法)处理后，细胞膜的通透性变大，能够容许外源DNA分子通过，这时的细胞就称为感受态细胞。

一般来说，感受态细胞的最基本要求是：

1. 没有质粒(也可以有与待转质粒复制子兼容的质粒)

2. 容易被转进去(一般是G-细菌，细胞壁薄)

3. 营养条件一般，非苛养菌

二、原理

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法(如：电击法，CaCl2等化学试剂法)处理后使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

化学制备法

大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法)，该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×10⁶~2×10⁷转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子(如Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。

化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

物理制备法

电转法(除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到10¹⁰转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。)

三、感受态制备与转化具体步骤

化学方法制备感受态(以大肠杆菌感受态小量快速制备为例)

1. 菌液分装入EP管中(1.5ml)6000rpm，离心5min，沉淀菌体，弃上清液；

2. 加800ul预冷的CaCl2(0.1mol/l)重新悬浮沉淀，6000rpm，离心5min,，弃上清液；

3. 每管中加100ulCaCl2(0.1mol/l含10%-20%甘油)重新悬浮，即为感受态细胞。

这种小量快速制备感受态方法简便、快速，但是转化效率不高，可以用于一般的质粒转化。

转化

1. 取质粒1-5ul加入制备好的感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30-45min；

2. 42℃热激90s，迅速转至冰中3-5min；

3. 加800ul LB培养液，37℃，150rpm，摇床复苏1h；

4. 6000rpm，离心5min，保留沉淀及200ul LB培养液，轻轻混匀后，涂布在平板上。

5. 平板37℃正置半小时后，倒置培养。

四、感受态细胞制备及转化中的影响因素

1. 细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×10⁷个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株OD600为0.5时细胞密度在5×10⁷个/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。

此外受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积10%-15%的无菌甘油或-70℃保存(有效期6个月)。

2. 质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

3. 试剂的质量

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

5. 整个操作均需在冰上进行

整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

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