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第14 天 基因工程
知识点一 基因工程
1．基因工程的三种工具：限制性内切核酸酶(简称限制酶)、__DNA
连接酶
__、载体。但工具酶只有__限
制酶和
DNA
连接酶
__两种。
2．有关限制性内切核酸酶的四要点
(1)主要从__原核__生物中提取。
(2)具有__专一__性。
(3)使特定部位的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__断裂。
(4)形成两种末端：__黏性末端__和平末端。
3．基因工程的“四部曲”
目的基因的筛选与获取(筛选合适的目的基因，利用PCR 获取和扩增目的基因)→__基因表达载体的构建
__(核心步骤)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
4．基因表达载体的四个重要部件：__启动子__、目的基因、__终止子__和标记基因。
5．目的基因导入三类受体细胞
(1)导入植物细胞的两种方法：__农杆菌转化法__和花粉管通道法。
(2)导入动物细胞的方法：__显微注射法__。
(3)导入微生物细胞的方法：__感受态细胞__法(用Ca2+处理，使其成为感受态细胞)。
6．检测目的基因的两个水平
分子水平和个体水平，其中分子水平包括PCR 或核酸杂交技术(DNA 与DNA、DNA 与RNA)和__抗原—抗
体杂交__技术。
7．蛋白质工程的基本思路
预期的蛋白质功能→设计预期的__蛋白质结构__→推测应有的__氨基酸__序列→找到并改变相对应的脱氧
核苷酸序列(基因)或合成__新的基因__→获得所需要的蛋白质。
8．基因工程在三大领域的应用
(1)在农牧业方面：主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物。
(2)在医药卫生领域：如将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的__启动子__等调控元件重组，转入转基
因动物，获得乳腺生物反应器。再如培育出不会引起__免疫排斥__反应的转基因克隆猪器官。
(3)在食品工业方面：如通过基因工程的方法获得外源基因得到高效表达的基因工程菌。
知识点二 DNA 的粗提取与鉴定、PCR 技术及电泳鉴定
1．纯化DNA 的两个原理
(1)DNA 在__不同浓度的
NaCl
__溶液中溶解度不同，较高浓度时可使DNA 溶解，在__0.14_mol·L
-1 __时溶
1
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解度最小，可使DNA 析出，从而去除杂质。
(2)DNA 不溶于__酒精__，可用体积分数为95%的冷酒精将DNA 和蛋白质进一步分离。
2．DNA 的鉴定：在溶有DNA(丝状物)的氯化钠溶液中加入__二苯胺__试剂，混合均匀后将试管置于__沸
水__中加热5 min，溶液变成__蓝色__。需另设一个对照组。
3．PCR 技术的三个阶段
(1)变性：温度超过90 ℃时，双链DNA 解聚为单链。
(2)复性：温度下降到50 ℃左右时，__引物__与两条单链DNA 结合。
(3)延伸：温度上升到72 ℃左右，在__耐高温的
DNA
聚合
( 或
Taq
_DNA
聚合
) __
酶的作用下，将4 种脱氧核苷酸加到引物的__3′__端。
4．利用PCR 技术扩增DNA 片段的2 个原理、1 个仪器、7 个配方组分
(1)PCR 的原理：DNA 体外复制、__DNA
热变性
__。
(2)PCR 技术利用到了PCR 仪。
(3)PCR 反应体系配方的7 个组分：扩增缓冲液、4 种__脱氧核苷酸__等量混合液、引物Ⅰ、引物Ⅱ、无菌
水、Taq DNA 聚合酶、模板DNA。
5．PCR 产物鉴定的2 个原理、5 个步骤
(1)DNA 片段电泳鉴定的原理：①PCR 产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA 分子的__迁移速率__与
凝胶的浓度、DNA 分子大小和构象等有关；②凝胶中的DNA 通过染色后，可在300 nm 的紫外灯下被检测
出来。
(2)步骤：配制琼脂糖溶液→制备凝胶并加缓冲液→加样(留一个加样孔作对照)→电泳(指示剂前沿接近凝胶
边缘时停止)→紫外灯下观察并照相。
一、单选题
1．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有目的基
因的DNA 片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误
的是（ ）
2
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A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
【答案】B
【分析】E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。
【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇
TGCGCAGT-3＇，A 正确；
B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI 切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI 切割形成
的，B 错误；
C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI 和CfoI 进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA 的
序列，切割之后至少获得了2 个片段，C 正确；
D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又
可连接黏性末端，D 正确。
故选B。
2．（2023·辽宁·高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达和
转运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼
接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记
基因等。
【详解】为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基
因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163 基因转录形成的mRNA 中不能出现
终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP 基因转录形成的mRNA 不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因
此该拼接过程的关键步骤是除去CD163 基因中编码终止密码子的序列，B 符合题意，ACD 不符合题意。
故选B。
3．（2023·湖南·高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1
3
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蛋白通过调节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（
）
A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【分析】分析题图：AT1 蛋白通过抑制PIP2s 蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2 排到细胞外，从而导致
植物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1 蛋白缺陷，可以提高PIP2s 蛋白的磷酸化水平，促进
细胞内的H2O2 排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1 蛋白缺陷，可以促进PIP2s 蛋白的磷酸化，进而促进H2O2 排出
膜外，A 正确；
B、据题图左侧的信息可知，AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的磷酸化，减少了H2O2 从细胞内输出到细胞外
的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B 错误；
C、结合对A 选项的分析可推测，敲除AT1 基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，
进而提高其成活率，C 正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D 正确。
故选B。
4．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建
的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组
质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
4
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A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
【答案】D
【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI 和PvuI 的酶切位点，四环素抗性基因
（TetR）内含有HindIII、SphI 和SalI 的酶切位点。
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A 正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的
菌落，不一定含有目的基因，B 正确；
C、DNA 凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA 片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒
构建成功与否，C 正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因
（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet 的培
养基中不能形成菌落，D 错误。
故选D。
5．（2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠
Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得
Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于
PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
5
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A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【分析】PCR 技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA
复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转录后，可以
使GEP 基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA 从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译
时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
C、整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只有
小片段，是野生型，C 错误；
D、用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，无法区分杂合子和纯合子，因为二者扩增后只得到小片段，D 错误。
故选B。
6．（2023·广东·高考真题）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列
叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在0.14mol/L 的
氯化钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA 等物质，A 正确；
B、DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L 的NaCl 溶液， 将溶液过滤，即可将混合
物中的多糖、蛋白质等与DNA 分离，B 正确；
C、DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA 纯度，C 正
确；
D、将DNA 溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D 错误。
故选D。
7．（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将目的
6
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基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶
的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
【答案】C
【分析】DNA 连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA 连接酶、T4DNA 连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外
T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3 切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA 连接酶连接，A 错误；
B、质粒用酶3 切割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B 错误；
C、质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目的基因在
质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C 正确；
D、若用酶2 和酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺
少标记基因，无法进行后续的筛选，D 错误。
故选C。
二、非选择题
8．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果
酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
7
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(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对非
转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1
为本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检
测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较
在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中
ME 含量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞内脂
质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
【答案】(1)溶解度
(2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME 基
因”）
(3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME 基因序列整合
到硅藻细胞基因组中”）
(4) 增加 细胞数量
(5)有氧呼吸生成的ATP 增多
(6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生
产”）
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【分析】1、PCR 的含义：PCR 是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在生物
体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2、PCR 原理：DNA 半保留复制。
3、PCR 基本条件：DNA 模板、4 种脱氧核苷三磷酸、2 种引物、耐高温的DNA 聚合酶、缓冲液。
【详解】（1）DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA 和蛋白质。
因此，根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到
的粗提DNA 可以作为PCR 扩增目的基因的模板。
（2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有
特殊序列结构的DNA 片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果
酸酶（ME）基因。
（3）PCR 是一项根据DNA 半保留复制原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的
基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链
核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA 作为
PCR 模板，而在实验组中以转ME 基因的硅藻细胞基因组DNA 作为模板。如此比较两个实验扩增结果可
以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME 基因序列是否整合到硅藻细胞基
因组中。
（4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3 分析
可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B 的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定
硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A 与B 的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高
产生物柴油的优良硅藻细胞品系。
（5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B 线
粒体中ME 含量显著高于品系A。据此分析可知，ME 基因的超表达导致线粒体中的NADH 水平升高，
NADH 进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。
（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、
不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
9．（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀
粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问
题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
9
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(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
【答案】(1)蛋白质
(2)③
(3)②
(4)标记基因
(5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
(6)逆转录
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检
测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
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（2）PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片
段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶
切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA 为模板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
10．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，
如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的
不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
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D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度
(2)CD
(3)限制性内切核酸酶（限制酶）
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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【详解】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行
PCR 扩增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR
过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR 反应体系中，模
板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温
度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用
的Taq DNA 聚 133 合酶为例，催化DNA 延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片
段大小在 30s~2min 的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-GACGAG-3'能
与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中
的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，
由于PCR 产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核
酸酶（限制酶）和DNA 连接酶。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于
30，A 错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，
故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落
无需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
11．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，
为此设计表达载体，思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产
物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法
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同源重组是碱基序列基本相同的DNA 区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源
重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB 短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB 之间，在设计表达载体时，可采
用PCR 技术在外源基因两端分别引入A 和B,获得乙图所示长片段。PCR 时应选用的一对引物为
(从P1~P6 中选)。
(3)标记基因的选择 URA3 是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3 编码的蛋白可将外
源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶I 基因的菌株1，需将酶I 基因同URA3 一起插入URA3 缺陷型酿酒酵母基因组AB 之
间，并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3 作为筛选标记，需切除菌株1 的URA3。为此设计表达载体
时，还应向URA3 两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C 和C´,并以下图方式 排列才能通
过同源重组达到上述目的。
此后，需要将菌株1 在 的培养基上培养，存活菌株即为URA3 被成功切除的菌株1´。
(4)表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、
C´、URA3 和酶基因应采用下图 的排布方式。
【答案】(1)外
(2)P1 和P6
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(3) 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2 分）
(4)4
【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA 分子水平上进
行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
【详解】（1）由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所
在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，
将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1 和
P6 这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上
培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式一，C 和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，
切割后形成末端，便于连接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，
如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同 时满足两个条件：一是需要将UR43 标
记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵母基因组AB 之间，所以A、B 应置于标记基因与目的基因
最 外侧；二是需要利用C、C 片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C 应紧邻
URA3 两侧。同时满足上述条件 的只有图4。
12．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因的
（填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
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（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
【答案】(1) RNA 聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2 和R1 或F1 与R2
a 链
(3) J-V5 融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此
RNA 聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；
②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是
安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具
备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2 与R1 或F1 与R2 结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连
接到质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2 和R1 或F1 与
R2。b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应
该是3’-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方
向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是
3’-5'的b 链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是J-V5 融合蛋白。
抗J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的蛋白不是由重组质粒上
的融合的J 基因表达的。
13．（2023·广东·高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变
筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替换，
突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株
的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用DNA 连接酶将
两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个
位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目
的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
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①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养
基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的
T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切
酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带
涂黑 。
【答案】(1)野生型
(2) 载体（基因表达载体） 启动子和终止子
(3) DAI 基因和卡那霉素抗性基因 75
自交 100
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【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是
细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI 基因为显性基因，因此采用
农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大
小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR 技术扩增DAI 基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI 基因和运载体进行切割，再用
DNA 连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾
端，因此为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0 代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA 上含有DAI 基因和卡那霉素
抗性基因）液中转化，再将获得的T1 代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上
有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI 基因和卡那霉
素抗性基因。
②T1 代阳性植株都含有DAI 基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一
位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相
当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1 的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植
株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2 代阳性植株自交，再将得到的T3 代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养
基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目
标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X
的切割位点，而突变型的基因有限制酶X 的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有
150bp，突变型有50bp 和100bp，如图：
。
14．（2023·全国·高考真题）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因为材
料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP
基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
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(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表
达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作
用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧
光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变基因
进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光蛋白基
因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
【答案】(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有
这种生物的不同的基因
(2) 终止子 启动子 RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是
否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(3)密码子具有简并性
(4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP 基因）导入酵母菌中进行表达
【分析】有关密码子，考生可从以下几方面把握：
①概念：密码子是mRNA 上相邻的3 个碱基。
②种类：64 种，其中有3 种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用
性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。
【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含
有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的
转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，
位于基因的首端，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所
需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛
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选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
（3）正常情况下，GFP 突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度
分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP
基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP 基因能在真核细胞中表达，反之则不
能在真核细胞中表达。
一、单选题
1．（2024·山东济宁·二模）关于“DNA 粗提取和鉴定”以及“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列
说法错误的是（ ）
A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀
B．根据DNA 在不同浓度NaCl 溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质
C．DNA 分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷
D．PCR 实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压灭菌处理
【答案】C
【分析】电泳法：利用分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子
产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。原理：在一定的pH 下，多肽、核酸等生物大分
子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
【详解】A、将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀，A 正确；
B、根据DNA 在不同浓度NaCl 溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质，B 正确；
C、DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，
这些带点分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C 错误；
D、PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，D 正确。
故选C。
2．（2024·浙江·二模）菊花是两性花，LFY 基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY 导致
植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有拟南芥过量表达的LFY 基因的转基因菊花。重组
Ti 质粒的部分信息及实验流程如下图所示，其中启动子均为真核细胞启动子。下列叙述正确的是（ ）
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A．在含潮霉素的培养基上存活的农杆菌才可用于侵染菊花叶片
B．过程①②③所使用的培养基中植物激素的浓度和配比可以相同
C．I 是一团具有一定组织结构、松散的薄壁细胞团，具有较强的分裂和分化能力
D．诱导出芽和根的试管苗要先炼苗以适应外界的低湿强光环境才可进行移栽
【答案】D
【分析】1、基因工程的基本工具：分子手术刀”是指限制性核酸内切酶（限制酶）、“分子缝合针”是
指DNA 连接酶、“分子运输车”是指载体；
2、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受
体细胞，④目的基因的检测与鉴定；
3、标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
常用的标记基因是抗生素抗性基因；
4、目的基因的检测和表达：
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用DNA 分子杂交技术；
（2）其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA 杂交；
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-
抗体杂交；
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
【详解】A、重组质粒中含有潮霉素抗性基因，能表达出潮霉素抗性物质，在含潮霉素的培养基上存活的
农杆菌不一定是导入LFY 基因的农杆菌，还有可能是只导入质粒的农杆菌，因此只有在含潮霉素的培养基
上存活并导入LFY 基因的农杆菌才可用于侵染菊花叶片，A 错误；
B、植物组织培养的培养基中的生长素和细胞分裂素的含量和比例会影响愈伤组织的生长和分化，在脱分
化形成愈伤组织的过程中要求生长素和细胞分裂素的比例相当，而在再分化过程中生长素和细胞分裂素比
例高有利于根的分化，比例低有利于芽的分化，B 错误；
C、愈伤组织是一团排列疏松而无规则、高度液泡化的、呈无定形状态的、具有分生能力的薄壁细胞，不
具有特定的结构和功能，C 错误；
D、诱导出芽和根的试管苗要先炼苗有助于试管苗逐渐适应室外环境，并减少在移栽后因气候和土壤变化
而造成的伤害，适应外界的低湿强光环境才可进行移栽，D 正确。
故选D。
3．（2024·江苏·模拟预测）为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用
NaOH 裂解细胞并快速提取DNA 的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是（ ）
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A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末
B．利用NaOH 溶液提取DNA，可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤
C．NaOH 溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈震荡，以免造成DNA 损伤断裂
D．缓冲液除了中和碱性物质之外，还具有维持DNA 酶活性、促进微生物生长等功能
【答案】D
【分析】DNA 粗提取选材的标准：DNA 含量高，并且材料易得，由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞
核和细胞器，因此不采用哺乳动物的血液。DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在0.14mol/L 的
氯化钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；
2、DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同；
3、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末，有利于提取DNA，
A 正确；
B、NaOH 呈碱性，碱溶液可能可以破坏细胞膜和细胞壁进而可以快速提取DNA，可省去低温下冷藏静置
和用冷却酒精析出等步骤，B 正确；
C、NaOH 溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈震荡，否则会造成DNA 损伤断裂，C 正确；
D、缓冲液除了中和碱性物质之外，还可使DNA 酶失活、抑制微生物生长等功能，D 错误。
故选D。
4．（2024·江苏·模拟预测）真核细胞转座子有逆转录转座子和 DNA 转座子之分，可在染色体内部和染色
体间转移。该过程依托转座酶将转座子两端特定序列进行切割，再将其插入到DNA 分子的特定位点中，
具体机制如下图①和②所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．转座酶和限制性内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键
B．转座引起的变异类型有基因突变、基因重组和染色体变异
C．DNA 转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变
D．逆转录转座子通常存在于外显子等不易于转录的区域
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【答案】D
【分析】可遗传的变异有三种来源：基因突变、染色体变异和基因重组。（1）基因突变是基因结构的改
变，包括碱基对的增添、缺失或替换。（2）基因重组的方式有同源染色体上非姐妹单体之间的交叉互换
和非同源染色体上非等位基因之间的自由组合，另外，外源基因的导入也会引起基因重组。（3）染色体
变异是指染色体结构和数目的改变。
【详解】A、转座酶将转座子两端特定序列进行切割，破坏的是磷酸二酯键，限制性内切核酸酶能够识别
双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，因此转座酶和限制性
内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键，A 正确；
B、转座子在DNA 分子内部转移，可造成基因突变，在真核细胞染色体内部转移，可造成基因重组，在染
色体间转移造成染色体变异，B 正确；
C、由图可知，逆转录转座子不仅改变其在染色体上的位置，总数还会增多，DNA 转座子只改变其在染色
体上的位置，总数保持不变，C 正确；
D、编码区分为能编码蛋白质的外显子和不能编码蛋白质的内含子，逆转录转座子通常存在于外显子等易
于转录的区域，D 错误。
故选D。
5．（2024·湖南·二模）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，
但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳
酸的酵母工程菌株。下图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG 为原核生物偏好的起始密码子编码序列，
ATG 为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法正确的是（ ）
A．引物2 的3'端序列应包含XbaI 的识别序列
B．重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
C．PCR 反应时，缓冲液中一般要添加Ca2+来激活相关酶
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D．引物1 的5'端序列应考虑将GTG 改为ATG
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、根据题意可知，含GTG 的一端为LDH 基因的起始，为保证通过双酶切以正确方向插入质粒
设计引物1 的5'端序列需要包含BamHI 的识别序列，引物2 的5'端序列应包含XbaI 的识别序列，A 错误；
B、结合题意可知，质粒上有作为标记基因尿嘧啶合成酶基因，所以本过程中重组质粒以不能合成尿嘧啶
的酵母菌株为受体，然后在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入
重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用，B 错误；
C、真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg2+激活，因此，PCR 反应缓冲液中一般要添加Mg2+，C 错
误；
D、设计引物1 的5'端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG 转变为真核生物偏好
的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达，D 正确。
故选D。
6．（2024·山东日照·二模）反向PCR 是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下
图。下列叙述错误的是（ ）
A．过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键
B．过程②需用DNA 连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增
C．过程③需添加方向相对的引物1 和3 以便DNA 聚合酶从其3′端延伸子链
D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合
【答案】D
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【分析】1、PCR 只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR 可扩增一段已知序列的两端未知序列。反
向PCR 的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引
物外侧合成DNA。2、如图所示，DNA 分子被限制酶切割，然后环化并加入已知序列合成的引物，再通过
PCR 扩增得到中间是未知序列两侧是已知序列的DNA 分子。
【详解】A、由图可知，过程①即酶切后，已知序列能环化，说明两端的黏性末端相同，故过程①是用同
一种限制酶对未知序列两端进行切割，A 正确；
B、过程②即环化，将DNA 片段连接起来，该过程中使用DNA 连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯
键，B 正确；
C、过程③为扩增，需添加方向相对的引物1 和3 以便DNA 聚合酶从其3′端延伸子链，C 正确；
D、过程③中将温度调至72℃的目的是耐高温的DNA 聚合酶，将四种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则
合成新的DNA 链，D 错误。
故选D。
7．（2024·山西·二模）制备重组蛋白疫苗时，通常先构建插入了某种病毒目的抗原基因的表达载体，然后
将已构建的表达载体转化到细菌、酵母菌、哺乳动物或昆虫细胞中，在一定诱导条件下，这些细胞可表达
出大量的抗原蛋白，再通过分离、纯化，即可制成重组蛋白疫苗。下列有关叙述错误的是（ ）
A．将目的抗原基因连接在表达载体上时需要使用限制酶和DNA 连接酶
B．利用哺乳动物生产抗原蛋白时，常以受精卵作为受体细胞
C．与灭活疫苗相比，上述重组蛋白疫苗对多种病原体发挥免疫预防作用
D．利用转基因技术生产疫苗的优势有安全性好、产量高、纯度高等
【答案】C
【分析】疫苗通常是用灭活的或减毒的病原体制成的生物制品。疫苗属于抗原，常见的疫苗有减毒活疫苗、
灭活病毒疫苗、重组蛋白疫苗、重组病毒载体疫苗、核酸疫苗等。
【详解】A、构建基因表达载体时，常需要使用限制酶和DNA 连接酶，即将目的抗原基因连接在表达载体
上时需要使用限制酶和DNA 连接酶，A 正确；
B、动物受精卵的全能性最高，可以发育成完整的动物个体，因此利用哺乳动物生产抗原蛋白时，常以受
精卵作为受体细胞，B 正确；
C、抗原抗体的结合具有特异性，重组蛋白疫苗对单一病原体发挥免疫预防作用，C 错误；
D、由题意“在一定诱导条件下，这些细胞可表达出大量的抗原蛋白，再通过分离、纯化，即可制成重组
蛋白疫苗”可知，利用转基因技术生产疫苗的优势有安全性好、产量高、纯度高等，D 正确。
故选C。
8．（2024·湖北十堰·二模）不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。
加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR 反应的最初的若
干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的
ssDNA。不对称PCR 的简单过程如图所示。假设模板DNA 分子初始数量为a 个，6 次循环后开始扩增产生
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ssDNA。下列叙述错误的是（ ）
A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计
B．据图可知，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同
C．该不对称PCR 过程中需要（26-1）a 个限制性引物
D．上述过程中子链分别沿限制性引物的5'端、非限制性引物的3'端延伸
【答案】D
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要
原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
【详解】A、PCR 扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物
均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计，A 正确；
B、非限制性引物是与乙链结合，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列一致，B 正确；
C、PCR 扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA 分子初始数量为a 个，6 次循环后产生26 个DNA
分子，因此该不对称PCR 过程中需要（26-1）a 个限制性引物，C 正确；
D、扩增时耐高温DNA 聚合酶将4 种脱氧核苷酸连接至引物的3'端，D 错误。
故选D。
9．（2024·江西·模拟预测）图1 表示DNA 的平面结构示意图，图2 表示某种限制酶的识别序列和作用位
点，下列相关说法正确的是（ ）
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A．图1 中a 所示部位即图2 中箭头所示部位
B．图2 所示的DNA 片段被限制酶切割后获得的末端形式与图1 末端相同
C．T4DNA 连接酶可以将两个图1 所示结构连接成为一个DNA 片段
D．基因工程的载体必须具有图2 所示的碱基序列
【答案】C
【分析】DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E·coliDNA 连接酶只能缝合黏性末端；T4-
DNA 连接酶对于黏性末端与平末端都可以缝合，但连接平末端时的效率比较低。图2 被限制酶切割后形成
的是黏性末端。
【详解】A、图1 中a 所示部位为一个脱氧核苷酸内部磷酸和脱氧核糖连接的化学键，图2 中箭头所示部位
为相邻的不同脱氧核苷酸之间连接的磷酸二酯键，二者不同，A 错误；
B、图2 所示的DNA 片段被限制酶切割后获得的末端为黏性末端，图1 为平末端，故图2 所示的DNA 片
段被限制酶切割后获得的末端形式与图1 末端不同，B 错误；
C、T4-DNA 连接酶可以连接平末端，因此T4-DNA 连接酶可以将两个图1 所示结构连接成为一个DNA 片
段，C 正确；
D、基因工程的载体一般具有多个限制酶识别序列，即不一定具有图2 所示的碱基序列，D 错误。
故选C。
10．（2024·湖南永州·三模）HA 蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋
白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA 蛋白
鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列叙述正确的是（ ）
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A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4 种游离的核糖核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入EcoRI 和HindⅢ的识别序
列，拼接前载体用MfeI 和HindⅢ切割
C．利用PCR 扩增目的基因时，反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是维持渗透压稳定
D．利用鸡输卵管生物反应器生产HA 蛋白可以大规模用于禽流感疫苗制备
【答案】D
【分析】基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等；启动子是一段有着特殊序列结构的
DNA 片段，位于目的基因的上游，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出
mRNA，最终表达出蛋白质；终止子位于目的基因的下游，作用是终止转录，也是一段有特殊序列结构的
DNA 片段。
【详解】A、图中①以禽流感病毒RNA 形成目的基因DNA 过程，为逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，
逆转录合成的是DNA，需要4 种脱氧核苷酸作为原料，A 错误；
B、要使目的基因能够与启动子结合，目的基因应连接在启动子下游，并借助启动子启动转录过程，按照
图中启动子上的箭头方向推测，目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子右侧拼接，拼接前应先在目的基因两端
分别引入BamHI 和HindⅢ的识别序列，拼接前载体用MfeI 和HindⅢ切割，B 错误；
C、利用PCR 扩增目的基因时，反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是激活耐高温的DNA 聚合酶，C
错误；
D、HA 蛋白是禽流感病毒的重要抗原，利用鸡输卵管生物反应器生产HA 蛋白可以大规模用于禽流感疫苗
制备，D 正确。
故选D。
11．（2024·河南三门峡·一模）多溴联苯醚（分子式C12H5Br4O，简称BDE-47）是一种电子垃圾分解后产
生的环境污染物，进入人体会对神经系统、生殖系统等产生毒害。为了提高好氧细菌的降解效率，将GB-2
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细菌内获取的BDE-47 降解基因导入WT-G 受体菌，构建成基因工程菌1、2、3，如图是对三种菌相关基因
的电泳结果。下列叙述错误的是（ ）
A．由图可知，工程菌2 为降解BDE-47 能力强的目的菌株
B．从GB-2 细菌内获取的BDE-47 降解基因可通过PCR 技术进行扩增
C．将含有BDE-47 降解基因的重组质粒导入WT-G 受体菌时，用Ca2+处理会增大导入率
D．若要增加筛选GB-2 细菌的可能性，应从多溴联苯醚污染区取样并进行菌体培养
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、由图可知，工程菌2 含有降解基因，若要鉴定工程菌2 的降解能力，需进行相关的降解能力
的实验，A 错误；
B、从GB-2 细菌内获取的BDE-47 降解基因可通过PCR 技术进行扩增，B 正确；
C、Ca2+处理会使受体菌处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，因此会增大导入率，C 正确；
D、污染区的土壤中降解BDE-47 的菌体数量相对较多，从污染区取样，再经过菌体培养增加目的菌的浓
度，利于筛选得到GB-2 细菌，D 正确。
故选A。
12．（2024·北京朝阳·一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表
达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。
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下列相关分析不正确的是（ ）
A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因
B．该方法需利用限制酶和DNA 连接酶实现目的基因与载体的连接
C．扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA 序列
D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果
【答案】B
【分析】基因工程中常用限制酶切割目的基因和质粒（载体），用DNA 连接酶连接目的基因和载体。
【详解】A、由题意可知，表达载体导入不能合成尿嘧啶的酵母菌，所以可将尿嘧啶合成基因作为表达载
体上的标记基因，若导入表达载体后酵母菌能产生尿嘧啶，说明导入成功，A 正确；
B、该方法需利用DNA 连接酶实现目的基因与载体的连接，不需要使用限制酶，B 错误；
C、扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA 序列，以便引物与目的基因配对，
C 正确；
D、在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果，若能利用纤维素发酵，则
证明转基因成功，D 正确。
故选B。
13．（2024·广东韶关·二模）科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素（一种可用于预防和治疗血栓的蛋白
质）第47 位的天冬酰胺替换为赖氨酸，显著提高了它的抗凝血活性，流程图如下。已知天冬酰胺对应的密
码子为AAU、AAC，赖氨酸对应的密码子为AAA、GUA 等。下列叙述错误的是（ ）
A．上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的
B．在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因
C．上图中大分子物质a 和b 的单体序列均是唯一的
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D．用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质
【答案】C
【分析】蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合
成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
【详解】A、据图分析，通过分析预期的水蛭素功能推导出蛋白质的结构，进而明确氨基酸序列，最终确
定基因中碱基对的排列顺序，A 正确；
B、蛋白质的改造工程直接改变的是控制蛋白质合成所对应的基因，B 正确；
C、基因a 的基本单位是四种脱氧核苷酸，b 是mRNA 基本单位是四种核糖核苷酸，因此大分子物质a 和b
的单体序列均不是唯一的，C 错误；
D、基因工程是利用已有的基因生产蛋白质，而蛋白质工程师通过改造基因从而获得原本没有的蛋白质，
因此用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质，D 正确。
故选C。
14．（2024·重庆九龙坡·二模）中国科学家发展了一种可工作于活细胞环境的框架核酸状态智能机（如
图），可以在活细胞中实现人为添加的时序信号调控的CRISPR（基因编辑）系统的分级运输、基因组定
位与基因编辑功能。下列说法正确的是（ ）
A．核仁蛋白不能分布到细胞膜上，参与细胞的识别作用
B．有限状态机与向导RNA 结合后，进入细胞的过程不需要消耗能量
C．cas9（核酸编辑酶：一种蛋白质）/向导RNA 复合物能通过核孔进入细胞核
D．向导RNA 能够通过碱基互补配对定位到特定的基因位置并切断磷酸二酯键
【答案】C
【分析】细胞核的结构：（1）核膜：核膜是双层膜，外膜上附有许多核糖体，常与内质网相连；其上有
核孔，是核质之间频繁进行物质交换和信息交流的通道；（2）核仁：与某种RNA 的合成以及核糖体的形
成有关；（3）染色质：细胞核中能被碱性染料染成深色的物质，其主要成分是DNA 和蛋白质。
【详解】AB、据图可知，有限状态机与向导RNA 结合后，与分布在细胞膜上的核仁蛋白接触，进而进入
细胞内，进入细胞的过程是胞吞，胞吞需要消耗能量，AB 错误；
C、核孔是大分子物质进出细胞核的通道，cas9（核酸编辑酶：一种蛋白质）/向导RNA 复合物能通过核孔
进入细胞核，C 正确；
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D、向导RNA 能够通过碱基互补配对定位到特定的基因位置，但不能切割磷酸二酯键，D 错误。
故选C。
15．（2024·安徽安庆·模拟预测）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是（
）
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA 聚合酶参与
B．③导入④后，重组Ti 质粒整合到④的染色体DNA 上
C．②到③过程，需要钙离子处理，有助于促进重组Ti 质粒转化到农杆菌细胞中
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了不可遗传变异
【答案】C
【分析】基因工程的工具酶包括限制酶和DNA 连接酶。 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对
大部分单子叶植物没有感染力；Ti 质粒的T-DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。 目
的基因导入受体细胞后需要进行检测和鉴定，才能确定其是否导入或成功表达。
【详解】A、②重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA 连接酶参与，DNA 聚合酶一般用于DNA 复
制过程，A 错误；
B、③侵染④植物细胞后，重组Ti 质粒上的T-DNA 整合到植物细胞的染色体上，B 错误；
C、将重组质粒导入农杆菌，常用钙离子处理，使农杆菌处于感受态，易于吸收周围的DNA 分子，有助
于促进重组Ti 质粒转化到农杆菌细胞中，C 正确；
D、⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异，D 错误。
故选C。
二、多选题
16．（2024·黑龙江大庆·模拟预测）研究人员将PCR 扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方
向）插入图中载体P 区，构建表达载体，转入大肠杆菌，获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述不
正确的是（ ）
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A．PCR 扩增时，应在启动子两侧引入EcoRⅠ、BamHI 识别序列
B．用Mg2+处理大肠杆菌以便转入构建好的表达载体
C．在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株不一定为所需菌株
D．可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物
【答案】AB
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；
目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、据图可知，目的基因中存在SmaⅠ和EcoRⅠ两种酶的识别序列，若用这两种酶会破坏目的基因，
因此为防止目的基因和质粒自身环化和正确连接，因此质粒和目的基因应该用Xhol、BamHI 切割，因此
PCR 扩增启动子S 时，图中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入Xhol、BamHI 的识别序列，A 错误；
B、用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于易于吸收周围环境DNA 分子的状态，便于转入构建好的表达载体，B
错误；
C、氨苄青霉素抗性基因是标记基因，可使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入重组质粒的菌株，在添加
氨苄青霉素的培养基上存活的菌株不一定为所需菌株，也可能只是导入了质粒，C 正确；
D、绿色荧光蛋白也是标记基因，可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物，D 正确。
故选AB。
17．（2024·辽宁·三模）研究发现，若将第52 位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为
ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1 所示，箭头下方
的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程
如图2 所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“ ”代表突变位点。改造过程中PCR2 所使用的引物组合不
可能为（ ）
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A．引物1 和引物4
B．引物2 和引物6
C．引物2 和引物4
D．引物3 和引物5
【答案】ACD
【分析】1、PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核
苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是
从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其
主要原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
2、PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】据题图可知，利用重叠延伸PCR 技术对DNA 分子进行定点突变的过程中，通过PCR2 获得产物
CD 时所用的引物组合为引物c 、d 。引物d 与转录模板链的3' 端结合，因此引物d 的序列为
5'GTCACGTG，引物2 符合该序列。现要利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强
的抗菌肽，则需要将第52 位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将mRNA 上的
第154 号碱基由C 替换为A，则需要将DNA 非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为A。因此引物c 的
碱基序列为5'CCTGTTAT，引物6 符合该序列。综上所述，B 正确，ACD 错误。
故选ACD。
18．（2024·黑龙江大庆·模拟预测）通过PCR 的定点诱变技术获得的改良基因两侧的碱基序列和大肠杆菌
的质粒（有氨苄青霉素抗性基因、LacZ 基因及一些酶切位点）结构如下图所示，研究者欲将改良基因导入
大肠杆菌的质粒中保存。下列叙述错误的是（ ）
A．使用PCR 技术扩增时需要一种引物、四种脱氧核苷酸及Mg2+等
B．实现质粒和改良基因的高效连接应选用限制酶SmaI
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C．在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的培养基上，白色菌落的大肠杆菌含重组质粒
D．构建重组质粒需用到的酶有XmaI、NheI 和DNA 连接酶
【答案】ABD
【分析】PCR 技术的原理是模拟生物体内DNA 分子复制的过程，利用DNA 分子热变形原理，通过控制温
度控制控制DNA 分子的解聚和结合，DNA 分子体内复制过程DNA 的解旋是在解旋酶的作用下实现的；
过程：①高温变性：DNA 解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、使用PCR 技术扩增时需要一对引物，四种dNTP 及Mg2+等，A 错误；
B、选择SmaⅠ，获得的是平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接，B 错误；
C、LacZ 基因编码的酶能分解β—半乳糖苷，产生蓝色物质，菌落为蓝色，如果没有分解，则菌落为白色，
因此可以将菌液涂布在含氨苄青霉素和β—半乳糖苷的平板上，由于重组质粒的LacZ 基因在重组过程中被
切断，即构建改良基因质粒时破坏了LacZ 基因，不能编码相应的酶分解β—半乳糖苷，菌落呈现白色，所
以白色菌落含有重组质粒，C 正确；
D、从各种限制酶的酶切位点分析，除使用XmaI 外，还需使用BglⅡ切除相应黏性末端，产生GATC 的黏
性末端与改良基因CTAG 一侧进行连接，同时需要用DNA 连接酶构建基因表达载体，D 错误。
故选ABD。
19．（2024·江西景德镇·模拟预测）反向PCR 是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，
其过程如下图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．应选择引物1 和引物4 进行PCR 扩增
B．设计的引物中GC 碱基含量越高，复性的温度越高
C．PCR 产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA 分子
D．整个过程需用到限制酶、DNA 连接酶、耐高温DNA 聚合酶及逆转录酶
【答案】CD
【分析】1、PCR 只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR 可扩增一段已知序列的两端未知序列。反
向PCR 的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引
物外侧合成DNA。
2、如图所示，DNA 分子被限制酶切割，然后环化并加入已知序列合成的引物，再通过PCR 扩增得到中间
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是未知序列两侧是已知序列的DNA 分子。
【详解】A、DNA 子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选
择引物1 和引物4 进行PCR 扩增，A 正确；
B、G-C 碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，复性时的温度越高，B 正确；
C、PCR 产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA 分子，扩增产物还需要经过限制酶切割后再用
DNA 连接酶连接才能形成环状，C 错误；
D、整个过程需用到限制酶、DNA 连接酶和耐高温DNA 聚合酶，不需要逆转录酶，D 错误。
故选CD。
20．（2024·河北·模拟预测）某大肠杆菌的质粒上含有AmpR基因（氨苄青霉素抗性基因）和LacZ 基因
（编码的酶能使含X-gal 的平板上的菌落变蓝），科研人员欲利用该质粒构建L-天冬酰胺酶高表达载体，
并利用含氨苄青霉素和X-gal 的平板对受体菌进行筛选，该受体菌在普通平板上形成的菌落为白色，目的
基因结构和质粒结构如图，图中的多种限制酶识别序列各不相同。选用的限制酶和菌落应为（ ）
A．EcoRⅠ和BamHⅠ
B．EcoRⅠ和KpnⅠ
C．白色菌落
D．蓝色菌落
【答案】BC
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选与获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工
程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体
细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】目的基因中具有PstⅠ和BglⅡ的切割位点，应从BamHⅠ、EcoRⅠ和KpnⅠ中进行选择，只选用
EcoRⅠ容易导致错误连接，BamHI 会破坏氨苄青霉素抗性基因，结合L-天冬酰胺酶基因的转录方向、质粒
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上高效启动子启动的转录方向和终止子的位置可知，可选择EcoRⅠ和KpnⅠ对目的基因和质粒进行切割。由
于重组质粒中LacZ 基因被破坏，无法合成相应的酶使含X-gal 的平板上的菌落变蓝，故长出的菌落应为白
色，BC 正确，AD 错误。
故选BC。
三、非选择题
21．（2024·陕西榆林·模拟预测）细胞中NF-kB 蛋白的活性水平与肿瘤的发生发展密切相关。为了高效地
筛选出以NF-kB 为靶点的抗肿瘤药物，利用基因工程构建NF-kB 的报告基因载体。具体原理为把已确定的
NF-kB 基因的调控序列（响应元件）正确地剪切到报告基因GFP（其表达产物荧光蛋白可被实时检测）上，
使报告基因能与NF-kB 基因同步表达，其工作模式见下图。构建载体过程中，报告基因GFP 由pcDNA3．
1-Flag-GFP 质粒提供，NF-kB 基因由pGL6-NF-kB-Luc 质粒提供。请回答下列问题：
(1)构建pGL6-NF-kB-CFP 报告基因质粒时，首先以pcDNA3．1-Flag-GFP 质粒为模板，利用PCR 技术扩增
GFP 基因，PCR 扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、 （至少答两点）等。在PCR 循环的3
个步骤中，温度设置最高的是 。
(2)用BamHI 和HindⅢ限制性核酸内切酶（二者切割后的黏性末端不同）对上述PCR 产物及pGL6-NF-kB-
Luc 质粒进行双酶切，该方法的优点是 ，然后还需要使用 酶，才能得到
pGL6-NF-kB-GFP 报告基因质粒。
(3)将pGL6-NF-kB-CFP 报告基因质粒导入肿瘤细胞常用的方法是 ；体外培养肿瘤细胞除了
需要使用合成培养基外，还需要加入 等一些天然成分；再放入气体组成成分为
的培养箱中进行培养。
(4)将转染成功的肿瘤细胞置于含待检测抗肿瘤药物的培养基中培养一段时间，并通过特定方法检测细胞中
GFP 蛋白表达量的变化，以显示NF-kB 的活性水平。若药物抗肿瘤效果显著，可观测到的现象为
。
【答案】(1) 引物、热稳定性的DNA 聚合酶（或Taq 酶）、4 种脱氧核苷酸（原料） 变性
(2) 避免质粒和GFP 基因自身环化，避免GFP 基因反向连接（或确保目的基因和质粒正确连接）
DNA 连接
(3) 显微注射法 血清、血浆 95%空气和5%CO2
(4)添加该药物的培养基中，肿瘤细胞GFP 蛋白表达量显著下降
【分析】1、PCR 技术过程包括：变性，当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链；复性，当温度
下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合；延伸，当温度上升到72℃左右时，
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溶液中的4 种脱氧核苷酸在耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
2、一般来说，动物细胞培养需要满足以下条件：
（1）营养：细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。将细胞所需的营养物质按
种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清
楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。培养动物细胞一般使用液体培养基，
也称为培养液。
（2）无菌、无毒的环境：在体外培养细胞时，必须保证环境是无菌、无毒的，即需要对培养液和所有培
养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代
谢物积累对细胞自身造成危害。
（3）温度、pH 和渗透压：维持细胞生存必须有适宜的温度。哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5 °C 为
宜。多数动物细胞生存的适宜pH 为7.2~ 7.4。此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要
环境参数。
（4）气体环境：动物细胞培养所需气体主要有O2 和CO2。O2 是细胞代谢所必需的，CO2 的主要作用是
维持培养液的pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和
5%CO2 的混合气体的CO2 培养箱中进行培养。
【详解】（1）利用PCR 技术扩增GFP 基因，PCR 扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、引物、热稳定性的
DNA 聚合酶（或Taq 酶）、4 种脱氧核苷酸（原料）等。在PCR 循环的3 个步骤中，变性温度在90℃以上，
复性温度50 ℃左右，延伸温度72℃左右，所以温度设置最高的是变性。
（2）由题意可知，用两种切割后形成不同黏性末端的限制酶切割质粒和GFP 基因，可以避免质粒和GFP
基因自身环化，也可以避免GFP 基因反向连接。该反应系中还需要加入DNA 连接酶才能将切割完的
pGL6-NF-kB-Luc 质粒与GFP 基因连接成pGL6-NF-kB-GFP 报告基因质粒。
（3）将外源基因导入动物细胞常用显微注射法。体外培养肿瘤细胞除了需要使用合成培养基外，由于人
们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此通常需要加入血清等一些天然成分。培养箱中的气体具
体组成成分为95%空气+5%CO2，其中O2 是细胞代谢所必需的，CO2 的主要作用是维持培养液的pH。
（4）本研究的目的是高效地筛选出以NF-kB 为靶点的抗肿瘤药物，由于GFP 基因是NF-kB 基因的报告基
因，因此抗肿瘤效果显著的药物使用后会使NF-kB 表达量显著下降，与NF-kB 基因具有相同响应元件的
GFP 基因表达量也显著下降，因此会观测到肿瘤细胞GFP 蛋白表达量显著下降的现象。
22．（2024·新疆·二模）动物细胞生物反应器旨在复现动物体内的生理条件，以便在实验室环境中进行有
效的细胞培养。该系统特别适用于生产特定蛋白质，例如人乳铁蛋白。实验人员构建了人乳铁蛋白基因表
达载体，然后将该重组载体导入奶牛体内以生产人乳铁蛋白相关过程如图所示。回答下列问题：
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(1)获取人乳铁蛋白基因是实施人乳铁蛋白动物细胞生物反应器工程的第一步。实验人员利用PCK 技术材
增人乳铁蛋白基因过程中，需要使用TaqDNA 聚合酶，而不能使用普通的DNA 聚合酶，其原因是
。
(2)图中标注了三种限制酶BamHI、HindⅢ、SmaI 及其酶切位点，TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨
苄青霉素抗性基因。据图分析，构建人乳铁蛋白基因表达载体时，应选择的两种限制酶是 ，同
时，要将人乳铁蛋白基因导入启动子和 之间。
(3)将人乳铁蛋白基因表达载体导入供体牛受精卵后培养至早期胚胎，然后将早期胚胎移植到代孕牛体内。
此过程中，一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂，这是因为 。
(4)为检测人乳铁蛋白基因是否在雌性转基因牛中表达，研究人员提取了A、B、C 三头转基因牛的乳汁，
从中提取了蛋白质，结果发现A、C 两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B 转基因牛提取
的乳汁中检测到了人乳铁蛋白。进一步提取A、C 两头转基因牛的基因组DNA 和mRNA 进行检测，A 转
基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但不能检测到相关mRNA，C 转基因牛则都不能检测到。以上两次检测
结果说明了 。
【答案】(1)PCR 技术扩增人乳铁蛋白基因时，需要加热至72℃左右合成DNA 子链，在该温度下，
TaqDNA 聚合酶能够耐高温并发挥作用，普通的DNA 聚合酶因不耐高温而失活
(2) BamHI、HindⅢ 终止子
(3)受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应
(4)A 转基因牛成功导入了人乳铁蛋白基因，但未能表达，C 转基因牛未导入人乳铁蛋白基因，B 转基因牛
成功导入了人乳铁蛋白基因，且能表达
【分析】根据题意和图示分析可知：图中质粒包括四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、启动子、复制
原点，以及两个限制酶切点，并且两个限制酶切点的位置均在四环素抗性基因上；目的基因上有三个限制
酶切点，与质粒对照，共有的是BamHⅠ、HindⅢ。图中①表示目的基因导入受体细胞，②表示通过胚胎移
植的方式将早期胚胎移植到代孕母牛体内。
【详解】（1）TaqDNA 聚合酶，与普通的DNA 聚合酶相比较，耐高温，PCR 技术需要经过变性
（90℃）、复性（50℃）和延伸（70℃）三个过程，所需要的温度条件均高于普通的DNA 聚合酶的耐受
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温度，TaqDNA 聚合酶能够耐高温并发挥作用，普通的DNA 聚合酶因不耐高温而失活，所以使用TaqDNA
聚合酶。
（2）从图中可知，SmaI 会破坏人乳铁蛋白基因，所以应使用BamHI、HindⅢ两种限制酶，构建基因表达
载体，同时将人乳铁蛋白基因导入启动子和终止子之间。
（3）在胚胎移植过程中，供体牛的早期胚胎被植入代孕牛体内，代孕牛通常不会对移植的胚胎产生免疫
排斥反应，因此一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂。
（4）A、C 两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B 转基因牛提取的乳汁中检测到了人乳铁
蛋白，说明B 转基因牛成功导入了人乳铁蛋白基因，且能表达；A 转基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但
不能检测到相关mRNA，C 转基因牛则都不能检测到，说明A 转基因牛成功导入了人乳铁蛋白基因，但未
能表达，C 转基因牛未导入人乳铁蛋白基因。
23．（2024·湖南·二模）肌肉生长抑制素MSTN 是骨骼肌生长发育负调控因子，MSTN 在肌肉组织中特异
性表达，其活性的丧失或降低会引起动物肌肉的过度发育，表现为肌纤维直径变大或肌纤维数增加，口感
良好。因此，通过基因敲除获得具有育种能力的MSTN 基因突变牛十分必要。
限
制
酶
KpnI
MfeI
HindIII
EcoRI
BamHI
识
别
序
列
及
切
割
位
点
图2
(1)科研人员利用打靶载体敲除牛MSTN 基因（以下简称M 基因），载体构建及M 基因敲除过程如图1 所
示。为构建能够敲除M 基因的打靶载体，需先设计引物，通过PCR 技术扩增M 基因。在引物上添加PstI
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限制酶识别序列，限制酶识别序列添加至引物的 （填“5'端”或“3'端”），据图1 应选择的引物是
（从a、b、c、d 中选择），将得到的PCR 产物酶切后连入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。
(2)为将抗生素抗性基因neo（抵抗抗生素新霉素）从原载体中切下，随后插入M 基因中。据上图1 及表中
限制酶信息，应选择限制酶 分别对M 基因和neo 基因进行酶切，并用 连接，完成打靶载体构建。
(3)将构建好的打靶载体通过 法导入牛受体细胞中。据图1，受体细胞基因组中的M 基因通过交换被替
换为打靶载体上插入neo 基因的M 基因片段。交换后的打靶载体以及未成功交换的打靶载体（线形DNA
片段）很不稳定，在相关酶的作用下随即降解。
(4)载体可整合到受体细胞基因组DNA 的其他部位，引发K 基因表达，使细胞在加入物质Q 的培养基上无
法存活。在选择培养基中除有细胞培养的必需成分外，还需要加入物质Q 和 ，可筛选出成功敲除M 基
因的受体细胞，其原因是 。
【答案】(1) 5'端 a 和d
(2) EcoRI 和MfeI DNA 连接酶
(3)显微注射
(4) 新霉素 成功敲除M 基因的受体细胞基因组DNA 含有neo 基因，无K 基因表达，使其具有新
霉素抗性，且可在含物质Q 的培养基上存活
【分析】1、引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，其作用是使DNA 聚合酶能够从引物的
3'端开始连接脱氧核苷酸。
2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：
①不能破坏目的基因
②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）
③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自
身环化和质粒的自身环化。
3、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因；
②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平
上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）利用PCR 技术扩增DNA 分子时，子链的延伸方向是从引物的5'端到3'端，因此在引物上添
加PstI 限制酶识别序列，限制酶识别序列应添加至引物的5'端，否则引物失效。就图中给定的a、b、c、d
四种引物而言，想要将基因M 完整的扩增出来，应当选用引物a 和d。
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（2）由图可知，M 基因内部有HindⅢ、EcoRI 和BamHI 的识别位点，因此切割M 基因必须在这三种限制
酶之间选择；neo 基因两侧具有MfeI 和KpnI 的识别序列，切割neo 基因只能在这两种限制酶之间选择，根
据表中各种限制酶识别序列可知，只有MfeI 与EcoRI 切割得到的黏性末端相同，都为AATT—3'，因此可
用EcoRI 切割M 基因，用MfeI 切割neo 基因，得到相同黏性末端之后再用DNA 连接酶将其连接，即可将
neo 基因插入M 基因中，完成打靶载体构建。
（3）将目的基因导入受体细胞时，若受体细胞是动物细胞，常采用显微注射法。
（4）打靶载体也可能整合到受体细胞基因组DNA 的其他部位，引发K 基因表达，使细胞在加入物质Q 的
培养基上无法存活。在选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分外，还需加入新霉素和物质Q，可筛选
出成功敲除M 基因的受体细胞，其原因是敲除M 基因的受体细胞基因组DNA 含有neo 基因，无K 基因表
达，使其具有新霉素抗性，且可在含物质Q 的培养基上可存活。
24．（2024·福建三明·一模）表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷（m6A）是
真核生物mRNA 上最常见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达
和STC2（癌症相关基因）mRNA 的m6A 修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现
ALKBH5 基因沉默和STC2 基因的过表达，以研究ALKBH5 介导的m6A 甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影
响（其中STC2 基因的α 链为转录的模板链）。研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞
迁移标志蛋白含量如图3 所示。
STC2 基因：
注：A、B、C、D 为四种引物序列；BamHI、HindⅢ、SacI 为限制酶
(1)图1PCR 反应体系中需加入4 种dNTP、耐高温的DNA 聚合酶、模板和 ，还需加入引物
（选“A、B、C、D”）等。
(2)为达到图1 目的需要对上述引物进行设计，你的设计思路是 。
(3)为确保扩增的准确性，设计的引物不能太短，太短会导致 。
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(4)据图2 可知，应在培养基中添加 来初步筛选含重组DNA 分子的癌细胞。
(5)据图3 可知，ALKBH5 基因过表达导致 。
【答案】(1) 扩增缓冲液（或含Mg2+缓冲液） B、C
(2)需要在引物C 的5'端添加BamH Ⅰ识别序列和强启动子序列，在引物B 的5'端添加Sac Ⅰ识别序列
(3)导致非特异性扩增
(4)卡那霉素
(5)STC2 基因表达（转录）的mRNA 去甲基化
【分析】PCR 技术就是体外大量扩增DNA 的技术，即以少量DNA 制备大量DNA 的技术，原理是DNA 复
制，所以所需原料是脱氧核苷酸，并以指数方式扩增。
【详解】（1）图1PCR 反应体系中需加入4 种dNTP 作为原料、还需要加入耐高温的DNA 聚合酶
（TaqDNA 聚合酶）、模板和扩增缓冲液（或含Mg2+缓冲液），由于子链延伸时是从引物的3’端开始连
接脱氧核苷酸，因此引物需要连接在模板链的3’端，这样才能保证扩增的片段含有目的基因，据图1 可知，
还需加入引物B 和C。
（2）利用PCR 扩增目的基因STC2 时，引物使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，且
STC2 基因的α 链为转录的模板链，由于形成的mRNA 与模板链互补，且方向相反，并且形成mRNA 时
mRNA 链的延伸是从5'端→3'端，即图1 中基因转录时是由右向左进行，因此启动子应在引物C 的5'端，
即需要在引物C 的5'端添加BamH Ⅰ识别序列和强启动子序列，在引物B 的5'端添加Sac Ⅰ识别序列。保证
扩增的DNA 片段用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ切割后形成的目的基因含有强启动子。
（3）为确保扩增的准确性，设计的引物不能太短，因为太短会与多个位点结合，会导致非特异性扩增。
（4）由图可知，由于潮霉素抗性基因被破坏，因此重组质粒的抗性基因是卡那霉素抗性基因，应在培养
基中添加卡那霉素来初步筛选含重组DNA 分子的癌细胞。
（5）根据题意“胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达和STC2（癌症相关基因）mRNA
的m6A 修饰水平降低的异常现象”，并结合图示可知ALKBH5 基因过表达导致STC2 基因表达的mRNA
去甲基化，进而导致STC2 基因过表达而引起癌细胞迁移。
25．（2024·黑龙江大庆·模拟预测）草甘膦是一种非选择性除草剂，杀死杂草的同时也杀死农作物。它与
植物体内的PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）结构相似，可与PEP 竞争结合EPSP 合酶，阻止PEP 转化，影响植
物细胞正常代谢。我国科学家从草甘膦施用土壤中的微生物体内获取草甘膦抗性基因GR29，并将其导入
大豆体细胞中获得抗草甘膦的转基因大豆。
(1)结合上述信息推测GR29 发挥抗草甘膦作用的途径可能是GR29 表达的产物 （答出1
点即可）。
(2)将GR29 导入大豆细胞前，需将其与酶切后的质粒P 连接获得 。因GR29 基因序列两端无所需的
限制酶切位点，图1 与引物1 互补的为基因的非模板链，据图推测扩增该基因时需向引物1 和引物2 的5′
端分别加上 限制酶的识别序列。
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(3)荧光定量PCR 技术可实现对转基因大豆中目的基因的定量检测。在PCR 反应体系中，加入的荧光探针
与模板DNA（目的基因）的某条链互补结合，当合成的子链延伸至探针处，探针被酶切降解，此时荧光监
测系统就会接收到荧光信号，具体原理如图2 所示。
①若样品中不含模板DNA，则实验现象是 。荧光达到某一特定强度所需的循环次数越 ，模
板DNA 含量越高。
②通过上述技术定量检测目的基因，需从设计的多对引物和多种探针中选择特异性最好的组合，为此需进
行多组实验，每个实验组需向反应体系中加入转基因大豆的DNA 模板外，还需加入 。（填字母）
a、足量的待测引物
b、定量的待测引物
c、定量的待测荧光探针
d、耐高温的DNA 聚合酶
e、解旋酶
h、足量的脱氧核苷酸（dNTP）
③预期随时间变化，荧光强度达到一定值后将不再增加，这是由于 （答出2 点即可）。
【答案】(1)阻止草甘膦与PEP 竞争结合EPSP 合酶
(2) 重组质粒（或基因表达载体） XhoI 、PstI
(3) 几乎无法检测到荧光 少 b、c、d、h Taq 酶的扩增效率已经饱和，引物等反应物耗
尽
【分析】分析题意可知，草甘膦是一种非选择性除草剂，杀死杂草的同时也杀死农作物。它与植物体内的
PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）结构相似，可与PEP 竞争结合EPSP 合酶，阻止PEP 转化，影响植物细胞正常
代谢。所以若想阻止草甘膦杀死农作物，可以培养抗草甘膦的农作物，草甘膦抗性基因GR29 编码抗草甘
膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，通过该酶的作用，可以阻断草甘膦对生物合成途径的干扰，从
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而使菌种或植物不被草甘膦杀灭，因此，农作物中转入该基因，可使施用于农田的草甘膦只作用于杂草，
而不影响作物的正常生长。
【详解】（1）根据题意可知，草甘膦与植物体内的PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）结构相似，可与PEP 竞争
结合EPSP 合酶，阻止PEP 转化，影响植物细胞正常代谢。推测草甘膦抗性基因GR29 表达的产物应能阻
止草甘膦结合EPSP 合酶，从而抑制其对PEP 生物合成途径的干扰；
（2）GR29 为目的基因，将GR29 导入大豆细胞前，需将其与酶切后的质粒P 连接获得重组质粒。根据质
粒P 上的酶切位点可知，目的基因需要插入PstI 和XhoI 之间，以保证目的基因能正常复制和转录，同时又
可以防止目的基因自连，因此需要在两个引物的5'端分别加上PstI 和XhoI 限制酶的识别序列；
（3）①若样品中不含模板DNA，缺乏模板，则实验现象是几乎无法检测到荧光；荧光达到某一特定强度
所需的循环次数越少，模板DNA 含量越高；
②通过上述技术定量检测转基因大豆中目的基因，则模板应为转基因大豆的DNA，另外每个实验组还需向
反应体系中加入定量的待测引物、定量的待测荧光探针、耐高温的DNA 聚合酶、足量的脱氧核苷酸
（dNTP），PCR 技术中不需要添加解旋酶，故答案为b、c、d、h；
③由于Taq 酶的扩增效率已经饱和，或引物等反应物消耗尽，所以随着实验的变化，荧光强度达到一定值
后将不再增加。
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