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第14 天 基因工程
知识点一 基因工程
1．基因工程的三种工具：限制性内切核酸酶(简称限制酶)、__DNA
连接酶
__、载体。但工具酶只有__限
制酶和
DNA
连接酶
__两种。
2．有关限制性内切核酸酶的四要点
(1)主要从__原核__生物中提取。
(2)具有__专一__性。
(3)使特定部位的两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__断裂。
(4)形成两种末端：__黏性末端__和平末端。
3．基因工程的“四部曲”
目的基因的筛选与获取(筛选合适的目的基因，利用PCR 获取和扩增目的基因)→__基因表达载体的构建
__(核心步骤)→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
4．基因表达载体的四个重要部件：__启动子__、目的基因、__终止子__和标记基因。
5．目的基因导入三类受体细胞
(1)导入植物细胞的两种方法：__农杆菌转化法__和花粉管通道法。
(2)导入动物细胞的方法：__显微注射法__。
(3)导入微生物细胞的方法：__感受态细胞__法(用Ca2+处理，使其成为感受态细胞)。
6．检测目的基因的两个水平
分子水平和个体水平，其中分子水平包括PCR 或核酸杂交技术(DNA 与DNA、DNA 与RNA)和__抗原—抗
体杂交__技术。
7．蛋白质工程的基本思路
预期的蛋白质功能→设计预期的__蛋白质结构__→推测应有的__氨基酸__序列→找到并改变相对应的脱氧
核苷酸序列(基因)或合成__新的基因__→获得所需要的蛋白质。
8．基因工程在三大领域的应用
(1)在农牧业方面：主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物。
(2)在医药卫生领域：如将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的__启动子__等调控元件重组，转入转基
因动物，获得乳腺生物反应器。再如培育出不会引起__免疫排斥__反应的转基因克隆猪器官。
(3)在食品工业方面：如通过基因工程的方法获得外源基因得到高效表达的基因工程菌。
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知识点二 DNA 的粗提取与鉴定、PCR 技术及电泳鉴定
1．纯化DNA 的两个原理
(1)DNA 在__不同浓度的
NaCl
__溶液中溶解度不同，较高浓度时可使DNA 溶解，在__0.14_mol·L
-1 __时溶
解度最小，可使DNA 析出，从而去除杂质。
(2)DNA 不溶于__酒精__，可用体积分数为95%的冷酒精将DNA 和蛋白质进一步分离。
2．DNA 的鉴定：在溶有DNA(丝状物)的氯化钠溶液中加入__二苯胺__试剂，混合均匀后将试管置于__沸
水__中加热5 min，溶液变成__蓝色__。需另设一个对照组。
3．PCR 技术的三个阶段
(1)变性：温度超过90 ℃时，双链DNA 解聚为单链。
(2)复性：温度下降到50 ℃左右时，__引物__与两条单链DNA 结合。
(3)延伸：温度上升到72 ℃左右，在__耐高温的
DNA
聚合
( 或
Taq
_DNA
聚合
) __
酶的作用下，将4 种脱氧核苷酸加到引物的__3′__端。
4．利用PCR 技术扩增DNA 片段的2 个原理、1 个仪器、7 个配方组分
(1)PCR 的原理：DNA 体外复制、__DNA
热变性
__。
(2)PCR 技术利用到了PCR 仪。
(3)PCR 反应体系配方的7 个组分：扩增缓冲液、4 种__脱氧核苷酸__等量混合液、引物Ⅰ、引物Ⅱ、无菌
水、Taq DNA 聚合酶、模板DNA。
5．PCR 产物鉴定的2 个原理、5 个步骤
(1)DNA 片段电泳鉴定的原理：①PCR 产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA 分子的__迁移速率__与
凝胶的浓度、DNA 分子大小和构象等有关；②凝胶中的DNA 通过染色后，可在300 nm 的紫外灯下被检测
出来。
(2)步骤：配制琼脂糖溶液→制备凝胶并加缓冲液→加样(留一个加样孔作对照)→电泳(指示剂前沿接近凝胶
边缘时停止)→紫外灯下观察并照相。
一、单选题
1．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有目的基
因的DNA 片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误
的是（ ）
2
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A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
2．（2023·辽宁·高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达和
转运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼
接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
3．（2023·湖南·高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1
蛋白通过调节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（
）
3
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A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
4．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建
的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组
质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
5．（2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠
Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得
Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于
PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
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下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
6．（2023·广东·高考真题）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列
叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
7．（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将目的
基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶
的切割位点如图所示。
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下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
二、非选择题
8．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果
酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对非
转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1
为本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检
测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较
在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中
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ME 含量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞内脂
质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
9．（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造β-淀
粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问
题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明
显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不同大
肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基
因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的模板。
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10．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，
如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的
不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
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D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
11．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，
为此设计表达载体，思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产
物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法
同源重组是碱基序列基本相同的DNA 区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源
重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB 短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB 之间，在设计表达载体时，可采
用PCR 技术在外源基因两端分别引入A 和B,获得乙图所示长片段。PCR 时应选用的一对引物为
(从P1~P6 中选)。
(3)标记基因的选择 URA3 是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3 编码的蛋白可将外
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源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶I 基因的菌株1，需将酶I 基因同URA3 一起插入URA3 缺陷型酿酒酵母基因组AB 之
间，并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3 作为筛选标记，需切除菌株1 的URA3。为此设计表达载体
时，还应向URA3 两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C 和C´,并以下图方式 排列才能通
过同源重组达到上述目的。
此后，需要将菌株1 在 的培养基上培养，存活菌株即为URA3 被成功切除的菌株1´。
(4)表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、
C´、URA3 和酶基因应采用下图 的排布方式。
12．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
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应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因的
（填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
13．（2023·广东·高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变
筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替换，
突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株
的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用DNA 连接酶将
两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个
位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目
的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养
基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的
T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切
酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带
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涂黑 。
14．（2023·全国·高考真题）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因为材
料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP
基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表
达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作
用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧
光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变基因
进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光蛋白基
因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
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一、单选题
1．（2024·山东济宁·二模）关于“DNA 粗提取和鉴定”以及“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列
说法错误的是（ ）
A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀
B．根据DNA 在不同浓度NaCl 溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质
C．DNA 分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷
D．PCR 实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压灭菌处理
2．（2024·浙江·二模）菊花是两性花，LFY 基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY 导致
植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有拟南芥过量表达的LFY 基因的转基因菊花。重组
Ti 质粒的部分信息及实验流程如下图所示，其中启动子均为真核细胞启动子。下列叙述正确的是（ ）
A．在含潮霉素的培养基上存活的农杆菌才可用于侵染菊花叶片
B．过程①②③所使用的培养基中植物激素的浓度和配比可以相同
C．I 是一团具有一定组织结构、松散的薄壁细胞团，具有较强的分裂和分化能力
D．诱导出芽和根的试管苗要先炼苗以适应外界的低湿强光环境才可进行移栽
3．（2024·江苏·模拟预测）为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用
NaOH 裂解细胞并快速提取DNA 的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是（ ）
A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末
B．利用NaOH 溶液提取DNA，可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤
C．NaOH 溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈震荡，以免造成DNA 损伤断裂
D．缓冲液除了中和碱性物质之外，还具有维持DNA 酶活性、促进微生物生长等功能
4．（2024·江苏·模拟预测）真核细胞转座子有逆转录转座子和 DNA 转座子之分，可在染色体内部和染色
体间转移。该过程依托转座酶将转座子两端特定序列进行切割，再将其插入到DNA 分子的特定位点中，
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具体机制如下图①和②所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．转座酶和限制性内切核酸酶均可破坏磷酸二酯键
B．转座引起的变异类型有基因突变、基因重组和染色体变异
C．DNA 转座子只改变其在染色体上的位置，总数保持不变
D．逆转录转座子通常存在于外显子等不易于转录的区域
5．（2024·湖南·二模）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，
但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳
酸的酵母工程菌株。下图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG 为原核生物偏好的起始密码子编码序列，
ATG 为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法正确的是（ ）
A．引物2 的3'端序列应包含XbaI 的识别序列
B．重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
C．PCR 反应时，缓冲液中一般要添加Ca2+来激活相关酶
D．引物1 的5'端序列应考虑将GTG 改为ATG
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6．（2024·山东日照·二模）反向PCR 是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下
图。下列叙述错误的是（ ）
A．过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键
B．过程②需用DNA 连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增
C．过程③需添加方向相对的引物1 和3 以便DNA 聚合酶从其3′端延伸子链
D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合
7．（2024·山西·二模）制备重组蛋白疫苗时，通常先构建插入了某种病毒目的抗原基因的表达载体，然后
将已构建的表达载体转化到细菌、酵母菌、哺乳动物或昆虫细胞中，在一定诱导条件下，这些细胞可表达
出大量的抗原蛋白，再通过分离、纯化，即可制成重组蛋白疫苗。下列有关叙述错误的是（ ）
A．将目的抗原基因连接在表达载体上时需要使用限制酶和DNA 连接酶
B．利用哺乳动物生产抗原蛋白时，常以受精卵作为受体细胞
C．与灭活疫苗相比，上述重组蛋白疫苗对多种病原体发挥免疫预防作用
D．利用转基因技术生产疫苗的优势有安全性好、产量高、纯度高等
8．（2024·湖北十堰·二模）不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。
加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR 反应的最初的若
干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的
ssDNA。不对称PCR 的简单过程如图所示。假设模板DNA 分子初始数量为a 个，6 次循环后开始扩增产生
ssDNA。下列叙述错误的是（ ）
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A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计
B．据图可知，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同
C．该不对称PCR 过程中需要（26-1）a 个限制性引物
D．上述过程中子链分别沿限制性引物的5'端、非限制性引物的3'端延伸
9．（2024·江西·模拟预测）图1 表示DNA 的平面结构示意图，图2 表示某种限制酶的识别序列和作用位
点，下列相关说法正确的是（ ）
A．图1 中a 所示部位即图2 中箭头所示部位
B．图2 所示的DNA 片段被限制酶切割后获得的末端形式与图1 末端相同
C．T4DNA 连接酶可以将两个图1 所示结构连接成为一个DNA 片段
D．基因工程的载体必须具有图2 所示的碱基序列
10．（2024·湖南永州·三模）HA 蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋
白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA 蛋白
鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列叙述正确的是（ ）
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A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4 种游离的核糖核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入EcoRI 和HindⅢ的识别序
列，拼接前载体用MfeI 和HindⅢ切割
C．利用PCR 扩增目的基因时，反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是维持渗透压稳定
D．利用鸡输卵管生物反应器生产HA 蛋白可以大规模用于禽流感疫苗制备
11．（2024·河南三门峡·一模）多溴联苯醚（分子式C12H5Br4O，简称BDE-47）是一种电子垃圾分解后产
生的环境污染物，进入人体会对神经系统、生殖系统等产生毒害。为了提高好氧细菌的降解效率，将GB-2
细菌内获取的BDE-47 降解基因导入WT-G 受体菌，构建成基因工程菌1、2、3，如图是对三种菌相关基因
的电泳结果。下列叙述错误的是（ ）
A．由图可知，工程菌2 为降解BDE-47 能力强的目的菌株
B．从GB-2 细菌内获取的BDE-47 降解基因可通过PCR 技术进行扩增
C．将含有BDE-47 降解基因的重组质粒导入WT-G 受体菌时，用Ca2+处理会增大导入率
D．若要增加筛选GB-2 细菌的可能性，应从多溴联苯醚污染区取样并进行菌体培养
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12．（2024·北京朝阳·一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表
达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。
下列相关分析不正确的是（ ）
A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因
B．该方法需利用限制酶和DNA 连接酶实现目的基因与载体的连接
C．扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA 序列
D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果
13．（2024·广东韶关·二模）科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素（一种可用于预防和治疗血栓的蛋白
质）第47 位的天冬酰胺替换为赖氨酸，显著提高了它的抗凝血活性，流程图如下。已知天冬酰胺对应的密
码子为AAU、AAC，赖氨酸对应的密码子为AAA、GUA 等。下列叙述错误的是（ ）
A．上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的
B．在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因
C．上图中大分子物质a 和b 的单体序列均是唯一的
D．用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质
14．（2024·重庆九龙坡·二模）中国科学家发展了一种可工作于活细胞环境的框架核酸状态智能机（如
图），可以在活细胞中实现人为添加的时序信号调控的CRISPR（基因编辑）系统的分级运输、基因组定
位与基因编辑功能。下列说法正确的是（ ）
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A．核仁蛋白不能分布到细胞膜上，参与细胞的识别作用
B．有限状态机与向导RNA 结合后，进入细胞的过程不需要消耗能量
C．cas9（核酸编辑酶：一种蛋白质）/向导RNA 复合物能通过核孔进入细胞核
D．向导RNA 能够通过碱基互补配对定位到特定的基因位置并切断磷酸二酯键
15．（2024·安徽安庆·模拟预测）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是（
）
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA 聚合酶参与
B．③导入④后，重组Ti 质粒整合到④的染色体DNA 上
C．②到③过程，需要钙离子处理，有助于促进重组Ti 质粒转化到农杆菌细胞中
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了不可遗传变异
二、多选题
16．（2024·黑龙江大庆·模拟预测）研究人员将PCR 扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方
向）插入图中载体P 区，构建表达载体，转入大肠杆菌，获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述不
正确的是（ ）
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A．PCR 扩增时，应在启动子两侧引入EcoRⅠ、BamHI 识别序列
B．用Mg2+处理大肠杆菌以便转入构建好的表达载体
C．在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株不一定为所需菌株
D．可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物
17．（2024·辽宁·三模）研究发现，若将第52 位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为
ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1 所示，箭头下方
的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程
如图2 所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“ ”代表突变位点。改造过程中PCR2 所使用的引物组合不
可能为（ ）
A．引物1 和引物4
B．引物2 和引物6
C．引物2 和引物4
D．引物3 和引物5
18．（2024·黑龙江大庆·模拟预测）通过PCR 的定点诱变技术获得的改良基因两侧的碱基序列和大肠杆菌
的质粒（有氨苄青霉素抗性基因、LacZ 基因及一些酶切位点）结构如下图所示，研究者欲将改良基因导入
大肠杆菌的质粒中保存。下列叙述错误的是（ ）
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A．使用PCR 技术扩增时需要一种引物、四种脱氧核苷酸及Mg2+等
B．实现质粒和改良基因的高效连接应选用限制酶SmaI
C．在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的培养基上，白色菌落的大肠杆菌含重组质粒
D．构建重组质粒需用到的酶有XmaI、NheI 和DNA 连接酶
19．（2024·江西景德镇·模拟预测）反向PCR 是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，
其过程如下图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．应选择引物1 和引物4 进行PCR 扩增
B．设计的引物中GC 碱基含量越高，复性的温度越高
C．PCR 产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA 分子
D．整个过程需用到限制酶、DNA 连接酶、耐高温DNA 聚合酶及逆转录酶
20．（2024·河北·模拟预测）某大肠杆菌的质粒上含有AmpR基因（氨苄青霉素抗性基因）和LacZ 基因
（编码的酶能使含X-gal 的平板上的菌落变蓝），科研人员欲利用该质粒构建L-天冬酰胺酶高表达载体，
并利用含氨苄青霉素和X-gal 的平板对受体菌进行筛选，该受体菌在普通平板上形成的菌落为白色，目的
基因结构和质粒结构如图，图中的多种限制酶识别序列各不相同。选用的限制酶和菌落应为（ ）
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A．EcoRⅠ和BamHⅠ
B．EcoRⅠ和KpnⅠ
C．白色菌落
D．蓝色菌落
三、非选择题
21．（2024·陕西榆林·模拟预测）细胞中NF-kB 蛋白的活性水平与肿瘤的发生发展密切相关。为了高效地
筛选出以NF-kB 为靶点的抗肿瘤药物，利用基因工程构建NF-kB 的报告基因载体。具体原理为把已确定的
NF-kB 基因的调控序列（响应元件）正确地剪切到报告基因GFP（其表达产物荧光蛋白可被实时检测）上，
使报告基因能与NF-kB 基因同步表达，其工作模式见下图。构建载体过程中，报告基因GFP 由pcDNA3．
1-Flag-GFP 质粒提供，NF-kB 基因由pGL6-NF-kB-Luc 质粒提供。请回答下列问题：
(1)构建pGL6-NF-kB-CFP 报告基因质粒时，首先以pcDNA3．1-Flag-GFP 质粒为模板，利用PCR 技术扩增
GFP 基因，PCR 扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、 （至少答两点）等。在PCR 循环的3
个步骤中，温度设置最高的是 。
(2)用BamHI 和HindⅢ限制性核酸内切酶（二者切割后的黏性末端不同）对上述PCR 产物及pGL6-NF-kB-
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Luc 质粒进行双酶切，该方法的优点是 ，然后还需要使用 酶，才能得到
pGL6-NF-kB-GFP 报告基因质粒。
(3)将pGL6-NF-kB-CFP 报告基因质粒导入肿瘤细胞常用的方法是 ；体外培养肿瘤细胞除了
需要使用合成培养基外，还需要加入 等一些天然成分；再放入气体组成成分为
的培养箱中进行培养。
(4)将转染成功的肿瘤细胞置于含待检测抗肿瘤药物的培养基中培养一段时间，并通过特定方法检测细胞中
GFP 蛋白表达量的变化，以显示NF-kB 的活性水平。若药物抗肿瘤效果显著，可观测到的现象为
。
22．（2024·新疆·二模）动物细胞生物反应器旨在复现动物体内的生理条件，以便在实验室环境中进行有
效的细胞培养。该系统特别适用于生产特定蛋白质，例如人乳铁蛋白。实验人员构建了人乳铁蛋白基因表
达载体，然后将该重组载体导入奶牛体内以生产人乳铁蛋白相关过程如图所示。回答下列问题：
(1)获取人乳铁蛋白基因是实施人乳铁蛋白动物细胞生物反应器工程的第一步。实验人员利用PCK 技术材
增人乳铁蛋白基因过程中，需要使用TaqDNA 聚合酶，而不能使用普通的DNA 聚合酶，其原因是
。
(2)图中标注了三种限制酶BamHI、HindⅢ、SmaI 及其酶切位点，TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨
苄青霉素抗性基因。据图分析，构建人乳铁蛋白基因表达载体时，应选择的两种限制酶是 ，同
时，要将人乳铁蛋白基因导入启动子和 之间。
(3)将人乳铁蛋白基因表达载体导入供体牛受精卵后培养至早期胚胎，然后将早期胚胎移植到代孕牛体内。
此过程中，一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂，这是因为 。
(4)为检测人乳铁蛋白基因是否在雌性转基因牛中表达，研究人员提取了A、B、C 三头转基因牛的乳汁，
从中提取了蛋白质，结果发现A、C 两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B 转基因牛提取
的乳汁中检测到了人乳铁蛋白。进一步提取A、C 两头转基因牛的基因组DNA 和mRNA 进行检测，A 转
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基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但不能检测到相关mRNA，C 转基因牛则都不能检测到。以上两次检测
结果说明了 。
23．（2024·湖南·二模）肌肉生长抑制素MSTN 是骨骼肌生长发育负调控因子，MSTN 在肌肉组织中特异
性表达，其活性的丧失或降低会引起动物肌肉的过度发育，表现为肌纤维直径变大或肌纤维数增加，口感
良好。因此，通过基因敲除获得具有育种能力的MSTN 基因突变牛十分必要。
限
制
酶
KpnI
MfeI
HindIII
EcoRI
BamHI
识
别
序
列
及
切
割
位
点
图2
(1)科研人员利用打靶载体敲除牛MSTN 基因（以下简称M 基因），载体构建及M 基因敲除过程如图1 所
示。为构建能够敲除M 基因的打靶载体，需先设计引物，通过PCR 技术扩增M 基因。在引物上添加PstI
限制酶识别序列，限制酶识别序列添加至引物的 （填“5'端”或“3'端”），据图1 应选择的引物是
（从a、b、c、d 中选择），将得到的PCR 产物酶切后连入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。
(2)为将抗生素抗性基因neo（抵抗抗生素新霉素）从原载体中切下，随后插入M 基因中。据上图1 及表中
限制酶信息，应选择限制酶 分别对M 基因和neo 基因进行酶切，并用 连接，完成打靶载体构建。
(3)将构建好的打靶载体通过 法导入牛受体细胞中。据图1，受体细胞基因组中的M 基因通过交换被替
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换为打靶载体上插入neo 基因的M 基因片段。交换后的打靶载体以及未成功交换的打靶载体（线形DNA
片段）很不稳定，在相关酶的作用下随即降解。
(4)载体可整合到受体细胞基因组DNA 的其他部位，引发K 基因表达，使细胞在加入物质Q 的培养基上无
法存活。在选择培养基中除有细胞培养的必需成分外，还需要加入物质Q 和 ，可筛选出成功敲除M 基
因的受体细胞，其原因是 。
24．（2024·福建三明·一模）表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷（m6A）是
真核生物mRNA 上最常见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达
和STC2（癌症相关基因）mRNA 的m6A 修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现
ALKBH5 基因沉默和STC2 基因的过表达，以研究ALKBH5 介导的m6A 甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影
响（其中STC2 基因的α 链为转录的模板链）。研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞
迁移标志蛋白含量如图3 所示。
STC2 基因：
注：A、B、C、D 为四种引物序列；BamHI、HindⅢ、SacI 为限制酶
(1)图1PCR 反应体系中需加入4 种dNTP、耐高温的DNA 聚合酶、模板和 ，还需加入引物
（选“A、B、C、D”）等。
(2)为达到图1 目的需要对上述引物进行设计，你的设计思路是 。
(3)为确保扩增的准确性，设计的引物不能太短，太短会导致 。
(4)据图2 可知，应在培养基中添加 来初步筛选含重组DNA 分子的癌细胞。
(5)据图3 可知，ALKBH5 基因过表达导致 。
25．（2024·黑龙江大庆·模拟预测）草甘膦是一种非选择性除草剂，杀死杂草的同时也杀死农作物。它与
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植物体内的PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）结构相似，可与PEP 竞争结合EPSP 合酶，阻止PEP 转化，影响植
物细胞正常代谢。我国科学家从草甘膦施用土壤中的微生物体内获取草甘膦抗性基因GR29，并将其导入
大豆体细胞中获得抗草甘膦的转基因大豆。
(1)结合上述信息推测GR29 发挥抗草甘膦作用的途径可能是GR29 表达的产物 （答出1
点即可）。
(2)将GR29 导入大豆细胞前，需将其与酶切后的质粒P 连接获得 。因GR29 基因序列两端无所需的
限制酶切位点，图1 与引物1 互补的为基因的非模板链，据图推测扩增该基因时需向引物1 和引物2 的5′
端分别加上 限制酶的识别序列。
(3)荧光定量PCR 技术可实现对转基因大豆中目的基因的定量检测。在PCR 反应体系中，加入的荧光探针
与模板DNA（目的基因）的某条链互补结合，当合成的子链延伸至探针处，探针被酶切降解，此时荧光监
测系统就会接收到荧光信号，具体原理如图2 所示。
①若样品中不含模板DNA，则实验现象是 。荧光达到某一特定强度所需的循环次数越 ，模
板DNA 含量越高。
②通过上述技术定量检测目的基因，需从设计的多对引物和多种探针中选择特异性最好的组合，为此需进
行多组实验，每个实验组需向反应体系中加入转基因大豆的DNA 模板外，还需加入 。（填字母）
a、足量的待测引物
b、定量的待测引物
c、定量的待测荧光探针
d、耐高温的DNA 聚合酶
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e、解旋酶
h、足量的脱氧核苷酸（dNTP）
③预期随时间变化，荧光强度达到一定值后将不再增加，这是由于 （答出2 点即可）。
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