应用分享 | 用Stunner AF同步获取pDNA-LNP的粒径与包封率 (EE%)

脂质纳米颗粒 (LNP) 的表征很容易变得难以掌控。通常需要在多台仪器上、通过繁琐复杂的流程，并对LNP进行破坏或稀释，方能评估六项甚至更多的关键质量属性 (CQA)。若再叠加逐个样品采集的粒径信息，研发进度将明显放缓。

继COVID-19 mRNA-LNP疫苗取得成功之后，业界对拓展至其他核酸载荷的关注日益增加。其中包括质粒DNA (pDNA)：其成本低于mRNA，却更易于运输，且可沿用相似的LNP配方^①。一套平台化的LNP表征方案，若能提供多项测量并兼容不同的核酸载荷，将简化研发流程并加速pDNA-LNP的应用推广。

pDNA-LNP的包封率 (EE%) 定量尤为困难。用表面活性剂破坏pDNA-LNP可能改变载荷的异构体形态 (isoform)，进而改变其与EE%检测常用荧光染料之间的亲和力^②。因此，单一标准曲线往往难以同时满足破坏前游离pDNA与破坏后总pDNA的定量需求，可能导致EE%结果失真、延误增加，甚至引发更严重的问题。

Stunner AF将高通量UV/Vis、旋转角度动态光散射 (RADLS) 与荧光检测集成于一体，可同时获得EE%、总核酸、游离核酸、粒径、多分散性及颗粒浓度；全部在一个低样品量、高通量、基于微孔板的平台上完成 (图1)。尤为重要的是，无需稀释、也无需用表面活性剂破坏LNP即可获得结果，且对RNA与DNA同样适用。表征流程的简化，意味着可在更短时间内检测更多样品，更早确定最优的pDNA-LNP。

图1：Stunner AF——LNP定量与粒径表征的理想工具

本应用文章详细阐述Stunner AF如何简化pDNA-LNP的表征：无需表面活性剂、无需破坏样品，单次读取即可获得5项CQA的精确结果。

为制备LNP，将SM-102、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DSPC)、胆固醇和DMG PEG-2000按50:10:38.5:1.5的比例配制，在乙醇中的浓度为6.2 mg/mL。质粒DNA (pAAV-Helper，GenScript) 溶于50 mM、pH 4的乙酸盐缓冲液中，最终浓度为90 µg/mL，氮磷比 (N/P) 为6.4。LNP在Sunscreen 上使用Sunny 190X，以3:1 (水相:有机相) 的流速比 (FRR) 和10 mL/min的总流速 (TFR) 一式三份合成。合成后，每个LNP样品于4 °C下隔夜透析至1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中。所有指标均一式三份测量，在Stunner AF的 Nanoparticle EE或DNA-LNP应用上，使用纯水或自动空白扣除 (auto-blanking) 完成。

将透析前的平均总pDNA浓度与每个LNP样品67.5 µg/mL的预期产出浓度相比较，按下式计算产率 (% yield)：

产率 (%) = [总 pDNA] / [预期产出 pDNA] × 100

LNP样品的流体力学粒径、多分散性，以及总pDNA、游离pDNA和颗粒浓度均于透析后测定。包封pDNA与EE%由Stunner Analysis软件根据总pDNA和游离pDNA的中位数计算得出。为制备用于荧光法测量游离pDNA的LNP，将Unchained Master Mix与RiboGreen®按1:60稀释混合，配成工作液 (Working Solution)。取每个LNP样品或参比标准品5 µL，加入20 µL工作液中。总pDNA则由未稀释的LNP样品测定，使用经解卷积 (deconvoluted) 的A260值和50 (ng/µL)*cm的浓度系数。Stunner AF将自动校正增色效应 (hyperchromicity)，以补偿包封对UV/Vis定量pDNA时所带来的影响。

所有粒径、PDI和颗粒浓度数据均由RADLS采集。所用缓冲液的黏度和折射率分别为20 °C下的1.002 cP和1.334，并采用7个角度、5次采集、每次1秒的默认采集设置。所示的Z-average直径取自162°的最大角度，颗粒浓度则取自数量分布 (numbers distribution) 的目标峰 (PkOI)。

Stunner AF在单台仪器、单个应用中即可提供5项CQA，缩短手动操作时间、简化工作流程，从而显著加快pDNA-LNP的表征。一式三份pDNA-LNP样品的流体力学粒径与多分散性 (图2A) 为115±2.7 nm，PDI为0.15±0.02。粒径的相对标准偏差 (RSD) 为2.3%，PDI低于0.2，表明pDNA-LNP中不含大粒径聚集体。

不同异构体的质粒DNA与荧光染料的相互作用各不相同，从而导致荧光输出的差异^②。而标准EE%检测所必需的“用表面活性剂破坏pDNA-LNP”这一步骤，可能改变载荷的异构体形态。这使得pDNA-LNP的EE%测定颇具挑战，因为单一标准曲线对裂解前、后的核酸定量未必都准确。Stunner AF测量总pDNA 浓度时无需裂解步骤，因其采用UV/Vis定量，即使pDNA仍处于包封状态亦可正常测定。由此消除了上述难题，并大幅简化工作流程。以Sunscreen制备的一式三份pDNA-LNP，其EE%表现优异：三份样品均超过96%，平均达97±0.9% (图2B)。包封pDNA浓度同样保持一致，三批LNP制备的平均值为38.8±0.8 µg/mL (图2C)。

单角度DLS可提供粒径和多分散性，而RADLS还能测定颗粒浓度——后者与剂量、生物利用度和效力密切相关。Stunner AF的LNP应用提供两种选择：以单角度DLS快速获得粒径结果，或在需要更全面表征时采用RADLS。以Sunscreen制备的三批LNP，其平均颗粒浓度为8.0e10±2.7e10 particles/mL (图2D)。

图2：以Sunscreen制备的一式三份pDNA-LNP样品的粒径、多分散性 (A)、EE% (B)、包封载荷浓度(C) 和颗粒浓度(D)。误差棒为Stunner AF上3次重复测量的标准偏差

Sunscreen能以可重现的高产率稳定制备pDNA-LNP，从而节省宝贵的核酸载荷。所有pDNA-LNP的产率均不低于80%，平均为87±5.6% (图3)。

图3：以Sunscreen制备的一式三份pDNA-LNP样品的平均产率。误差棒为标准偏差

当必须使用多台仪器、采用复杂流程时，pDNA-LNP的表征会相当繁琐，尤其是在需要建立多条荧光标准曲线以测量裂解前后pDNA浓度的情况下。而 Stunner AF仅需单个应用、单台设备、单一流程即可完成粒径、多分散性、载荷浓度、EE%和颗粒浓度的测定，且无需裂解。Sunscreen则是Stunner AF的理想搭档，可高通量稳定地产出pDNA-LNP。二者协同，能以更少的时间与精力胜任各类LNP项目，并适用于任何载荷。