文献分享 | 从AI设计到递送验证:PE8研究中RNA-LNP表征

今年5月，David R. Liu团队在Nature Biotechnology发表研究，通过AI辅助重设计逆转录酶，开发出PE8系列先导编辑器。研究中，Unchained Labs的Stunner用于RNA-LNP总RNA浓度和粒径测量，为递送实验提供了制剂层面的信息。

先导编辑将可编程的Cas9切口酶与逆转录酶结合，在向导RNA的引导下完成特定DNA序列的改写。此前，实验室进化已显著提高逆转录酶的功能，但部分优化也伴随着热稳定性和可溶性表达的损失，可能限制细胞内有效编辑器的水平。

研究者使用ProteinMPNN对已有编辑器的逆转录酶进行序列重设计，同时约束与催化和底物结合密切相关的区域。经筛选获得的PE8变体，在不同实验条件下表现出可溶性表达、热稳定性或编辑效率的改善。例如，PE8c逆转录酶的熔解温度较PE6c提高约8 ℃；在小鼠肝脏实验中，PE8c、PE8d和 PE8max的平均编辑效率分别达到相应前代变体的约1.4、2.9和2.5倍。^①

图1：PE8 的研究背景

图2：PE8 编辑器的功能表现

为检验优化后的编辑器能否发挥作用，研究者采用了mRNA电转、工程化病毒样颗粒及LNP等递送方式。其中，RNA-LNP被用于细胞筛选和动物实验，将编码编辑器的mRNA及相关向导RNA递送至目标细胞。

对于采用RNA剂量设定实验条件的研究，制备时的投料量并不等同于处理后样品的实测浓度。同时，RNA浓度也不能描述颗粒尺寸。因此，在功能评价之前获得这两类信息，有助于明确递送材料的基本状态，并为不同实验条件之间的比较提供依据。

研究者使用Stunner的RNA-LNP Screen应用，通过UV/Vis分光光度法测量LNP配方的总RNA浓度，并通过DLS (动态光散射) 测量颗粒尺寸。实验采用默认设置，每个样品测量两次，以水作空白，随后使用配套软件分析数据。^①

总RNA浓度首先服务于剂量计算。对于设定的RNA质量，实测浓度可用于换算所需样品体积，或调整工作液浓度。尤其在经历稀释、透析或浓缩后，以处理后样品的浓度作为依据，可以减少仅凭初始投料量估算所带来的不确定性。

粒径提供另一维度的制剂信息。两个样品即使具有相近的RNA 浓度，也可能具有不同的颗粒尺寸。将粒径与浓度结合考察，有助于发现值得进一步检查的制剂差异，为后续功能结果的解释补充依据。粒径本身仍需结合其他表征及生物学结果解读。

在同一平台获得RNA含量与颗粒尺寸，有助于把核酸定量和纳米颗粒表征纳入同一分析流程。对于需要比较多个编辑器或多批递送样品的项目，浓度可作为剂量计算的依据，粒径则提供独立的颗粒状态信息。两类数据与功能结果对应记录，才能支持后续分析。

图3：Stunner在RNA-LNP实验流程中的应用

类似的表征需求也出现在LNP工艺开发中。2025年，上海交通大学医学院附属仁济医院的研究人员在Journal of Nanobiotechnology发表研究，系统考察mRNA水相、稀释液、置换液和储存液对SM-102型mRNA-LNP的影响，使用Stunner测定mRNA浓度，包封率则采用RiboGreen法测定。^②

这项研究显示，在所测试条件下，mRNA水相pH为4时，DC2.4细胞中的报告蛋白表达约为pH为6时的2.9倍。研究也发现，置换与储存条件会影响颗粒性质和稳定性。^②对实验设计的启示是：比较功能表现时，应记录制备与后处理条件，并把核酸浓度、颗粒表征和生物学读数对应到同一批样品。上述最佳条件属于该研究体系，不能直接视为所有 LNP 的通用工艺参数。

总RNA浓度包含游离及已包封RNA。Stunner AF通过UV/Vis测总RNA，Unmix算法分离RNA与颗粒、缓冲液及浊度等信号贡献；同时用RiboGreen测游离RNA，再计算包封率。该流程将总RNA定量从染料法中分离出来，同时保留游离RNA的荧光检测。^③

包封率 (%)＝(总RNA浓度－游离RNA浓度)÷总RNA浓度×100%。计算时，两项浓度需换算到相同稀释基准。包封率有助于比较工艺条件下的载荷保留状态，但并不直接代表RNA完整性、胞内释放或最终编辑效率。

对于核酸递送研究，可围绕同一批样品关联三类记录：制备与后处理条件、浓度与颗粒表征数据，以及后续功能结果。当实验表现出现差异时，这些记录能帮助研究者定位值得进一步验证的因素。

例如，RNA浓度不同，应先核对实际给药质量是否一致；粒径出现变化，应结合制备和储存记录判断是否需要进一步表征。当基础制剂信息具有可比性后，再讨论编辑器序列、细胞状态等因素对功能表现的影响，分析会更有依据。

PE8研究展示了AI辅助设计改善基因编辑工具的潜力，也呈现了从分子设计走向递送验证的完整研究思路。在这一过程中，Stunner提供的总RNA浓度和粒径信息，为样品剂量设定和制剂比较提供基础。将这些信息与功能数据关联，有助于研究者更清楚地理解实验差异，并为下一轮设计与验证提供依据。