文档文本内容
专题18 基因工程
考点
三年考情（2023-2025）
命题趋势
考点1
基因工程
的基本工
具
2025 江苏卷：基因突变 DNA 重组技术的基本工
具；
2025 云南卷：基因分离定律的实质和应用 PCR 扩
增的原理与过程 DNA 重组技术的基本工具；
2025 山东卷：PCR 扩增的原理与过程 DNA 重组技
术的基本工具 基因表达载体的构建 目的基因的检
测与鉴定；
2024 湖南卷：酶的特性 DNA 重组技术的基本工
具；
2024 安徽卷：DNA 的粗提取及鉴定；
2024 山东卷：DNA 的粗提取及鉴定；
2024 山东卷：基因分离定律的实质和应用 DNA 重
组技术的基本工具 目的基因的检测与鉴定；
2023 福建卷：DNA 的粗提取及鉴定 PCR 扩增的原
理与过程；
2023 重庆卷：DNA 重组技术的基本工具 筛选、获
取合适的目的基因；
2023 湖北卷：DNA 重组技术的基本工具 基因表达
载体的构建 目的基因的检测与鉴定；
2023 广东卷：DNA 的粗提取及鉴定；
2023 山西卷：DNA 重组技术的基本工具 基因表达
载体的构建；
1.基因工程的基本工具高考考查频
率较高的知识主要表现在
①DNA 重组技术的基本工具
②DNA 的粗提取及鉴定
2.基因工程的基本操作程序高考考
查频率较高的知识主要表现在
①电泳鉴定
②PCR 扩增的原理与过程
③将目的基因导入受体细胞
④目的基因的检测与鉴定
⑤基因表达载体的构建
⑥筛选、获取合适的目的基因
3.基因工程和蛋白质工程的应用高
考考查频率较高的知识主要表现
在
①蛋白质工程原理及操作流程
②基因工程在农牧业、制药及环
境等方面的应用
③基因诊断和基因治疗
考点2
基因工程
的基本操
作程序
2025 全国卷：电泳鉴定；
2025 广东卷：DNA 分子的结构和特点 PCR 扩增的
原理与过程；
2025 安徽卷：将目的基因导入受体细胞 目的基因的
检测与鉴定；
2025 河北卷：伴性遗传的遗传规律及应用 PCR 扩
增的原理与过程；
2025 河南卷：基因表达载体的构建 将目的基因导入
受体细胞 目的基因的检测与鉴定 蛋白质工程的应
用及实例分析；
2025 广东卷：PCR 扩增的原理与过程 基因表达载
体的构建 目的基因的检测与鉴定 基因工程在农牧
业、制药及环境等方面的应用；
2025 黑吉辽蒙卷：遗传信息的翻译 PCR 扩增的原
理与过程 基因表达载体的构建 目的基因的检测与
鉴定；
2025 河北卷：PCR 扩增的原理与过程 基因表达载
体的构建；
2024 江西卷：基因表达载体的构建 基因工程在农牧
业、制药及环境等方面的应用；
2024 浙江卷：PCR 扩增的原理与过程 电泳鉴定；
2024 山东卷：PCR 扩增的原理与过程；
2024 吉林卷：PCR 扩增的原理与过程 电泳鉴定；
2024 湖南卷：基因突变 PCR 扩增的原理与过程；
2024 天津卷：基因工程的操作程序综合 电泳鉴定；
2024 福建卷：PCR 扩增的原理与过程 基因表达载
体的构建 将目的基因导入受体细胞 胚胎移植技
术；
2024 重庆卷：基因表达载体的构建 目的基因的检测
与鉴定 基因工程的操作程序综合；
2024 贵州卷：PCR 扩增的原理与过程 基因表达载
体的构建 将目的基因导入受体细胞；
2024 北京卷：细胞的分化 基因表达载体的构建 目
的基因的检测与鉴定；
2024 全国甲卷：PCR 扩增的原理与过程 DNA 重组
技术的基本工具 将目的基因导入受体细胞 目的基
因的检测与鉴定；
2024 吉林卷：DNA 的粗提取及鉴定 基因表达载体
的构建 目的基因的检测与鉴定 蛋白质工程原理及
操作流程；
2024 新课标卷：PCR 扩增的原理与过程 DNA 重组
技术的基本工具 基因表达载体的构建 基因编辑技
术；
2023 辽宁卷：基因表达载体的构建；
2023 浙江卷：遗传信息的翻译 PCR 扩增的原理与
过程；
2023 河北卷：PCR 扩增的原理与过程 基因表达载
体的构建 筛选、获取合适的目的基因；
2023 江苏卷：微生物的接种方法 PCR 扩增的原理
与过程 DNA 重组技术的基本工具 目的基因的检
测与鉴定；
2023 山东卷：PCR 扩增的原理与过程 DNA 重组技
术的基本工具 基因表达载体的构建 目的基因的检
测与鉴定；
考点3
基因工程
2025 全国卷：蛋白质的结构及多样性 蛋白质工程原
理及操作流程；
2025 云南卷：微生物的接种方法 基因工程在农牧
和蛋白质
工程的应
用
业、制药及环境等方面的应用；
2025 重庆卷：自然选择与适应的形成 基因表达载体
的构建 将目的基因导入受体细胞 蛋白质工程原理
及操作流程；
2025 浙江卷：DNA 的粗提取及鉴定 PCR 扩增的原
理与过程 目的基因的检测与鉴定 蛋白质工程原理
及操作流程；
2024 天津卷：蛋白质的基本组成单位--氨基酸 内分
泌系统的组成和功能 基因表达载体的构建 蛋白质
工程原理及操作流程；
2024 河北卷：基因工程在农牧业、制药及环境等方面
的应用 基因工程的操作程序综合 疫苗；
2024 上海卷：蛋白质的结构及多样性 基因突变 人
类基因组计划 基因诊断和基因治疗；
2023 天津卷：基因工程在农牧业、制药及环境等方面
的应用 动物体细胞核移植技术和克隆 胚胎移植技
术；
2023 广东卷：细胞癌变的原因及防治 基因突变 基
因诊断和基因治疗；
2023 北京卷：DNA 分子的复制过程、特点及意义
基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用；
考点01 基因工程的基本工具
1．（2025·云南·高考真题）冬瓜果面有蜡粉可提高果实抗病、耐日灼和耐储性。为探究冬瓜果面蜡粉的遗
传方式并对蜡粉基因（用“A”“a”表示）进行定位，科研人员进行了一系列杂交实验，结果如表。
群
体
植株总数/株
果面有蜡粉株数/株
果面无蜡粉株数/株
P1
30
30
0
P2
30
0
30
F1
523
523
0
F2
574
430
144
注：F1为P1和P2杂交后代，F2为F1自交后代。
回答下列问题：
(1)根据杂交结果可知，果面蜡粉的遗传遵循基因的 定律，依据是
。
(2)实验证明蜡粉性状的改变是由基因突变引起的，突变基因上出现了一个限制酶H 的切割位点，可用于在
苗期筛选出果实表面有蜡粉的植株，据此设计引物后进行植株基因型鉴定的步骤为：提取基因组DNA→
目的DNA 片段→限制酶H 切割扩增产物→电泳。结果显示P1植株为1 条条带，P2植株为2 条条带，则F2
中有蜡粉的植株为 条条带，限制酶H 的切割位点位于 （填“A”“a”或“A 和a”）上。
(3)用表中材料设计实验，验证（1）中得到的结论，写出所选材料及遗传图解。
【答案】(1) 分离 F2中出现3:1 的性状分离比，符合一对等位基因的遗传规律
(2) PCR 扩增 1 或3 a
(3)选用材料：F1植株和P2植株
遗传图解
【分析】基因分离定律：在生物的体细胞中，控制同一性状的遗传因子成对存在，不相融合；在形成配子
时，成对的遗传因子发生分离，分离后的遗传因子分别进入不同的配子中，随配子遗传给后代。
【详解】（1）根据杂交结果可知，果面蜡粉的遗传遵循基因的分离定律，因为F1自交得到的F2中，果面
有蜡粉株数与果面无蜡粉株数之比约为3：1（430：144≈3：1），符合基因分离定律中杂合子自交后代性
状分离比3：1 的比值。
（2）要进行植株基因型鉴定，在提取基因组DNA 后，需要通过PCR 扩增目的DNA 片段。P1植株为1 条
条带，P2植株为2 条条带，说明P1为纯合子且其基因不能被限制酶H 切割（假设P1基因型为AA），P2为
纯合子且其基因能被限制酶H 切割（假设P2基因型为aa），限制酶H 的切割位点位于a 上。F1基因型为
Aa，F2中有蜡粉的植株基因型为AA 或Aa。AA 只有1 条条带（不能被切割），Aa 会有3 条条带（A 不能
被切割为1 条，a 被切割为2 条），所以F2中有蜡粉的植株为1 条或3 条条带。
（3）验证分离定律，采用测交的方法，所选材料：F1Aa 与P2aa（测交实验可以验证基因的分离定律）。
2．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，利用农杆菌转化
法将Ti 质粒上的T-DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2 个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变
体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI 对抗除草剂基因X 进行完
全酶切，再选择SmaI 和 对Ti 质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是
。利用DNA 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载
体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳
结果呈现一长一短2 条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA 插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后
产生含有T-DNA 的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR 难以扩增大片段DNA，最好使
用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA 中应不含该酶的酶切位点。需首先
将图乙的片段 ，才能利用引物P1 和P2 成功扩增未知序列。PCR 扩增出未知序列后，进行了一系列
操作，其中可以判断出2 条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”
或“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，
（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA 聚合酶 SmaI 和SpeI 550bp
(2) 4 环化 测序和序列比对
(3)不能
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）DNA 复制的起点是复制原点，因此Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制
原点。根据SmaI 限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI 酶切，抗除草剂基因和质
粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需
要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶
会破坏终止子，因此可选择XbaI 和SmaI 进行酶切，XbaI 酶切会形成黏性末端，需要用DNA 聚合酶聚合
脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI 酶切后产生的黏性末端无法用
DNA 聚合酶抹平，因为DNA 聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因
X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA 片段上含有一
个SmaI 酶切位点和一个SpeI 酶切位点，可以选择用SmaI 和SpeI 进行酶切，转录的方向是从模板的
3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2 条带，较短的条带长度近似为
550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。
（2）由于后续PCR 难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4 个碱基的限制酶，原因是识别序列
越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR 扩增。由于引物是根据已知序列设
计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序
列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序
和序列比对。
（3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野
生型。
3．（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA 进行限制酶酶切时，发现DNA 完全没有被酶切，分析可能
的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA 突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA 甲基化不敏感的限制酶
【答案】B
【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高
效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA 上的特定位点。
【详解】A、限制酶失活会使DNA 完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A 正确；
B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH 等，调整酶的用量没有作用，B 错
误；
C、质粒DNA 突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，
C 正确；
D、质粒DNA 上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA 甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用
对DNA 甲基化不敏感的限制酶，D 正确。
故选B。
4．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低
B．利用DNA 和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA 在不同浓度NaC1 溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA 粗提物
D．将溶解的DNA 粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
【答案】D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精溶
液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
（2）DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、研磨液有利于DNA 的溶解，换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低，A 正确；
B、DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B 正确；
C、DNA 在NaCl 溶液中的溶解度随着NaCl 浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl 溶液对DNA 进
行粗提取，C 正确；
D、在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D 错误。
故选D。
5．（2024·山东·高考真题）关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
【答案】A
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同 浓度
的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出， 从
而达到分离的目的;
DNA
②
不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将
蛋白质和DNA 进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA 遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、在DNA 的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分
钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A 正确；
B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA 在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B 错误；
C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA 双螺旋结构会发生改变，C 错误；
D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5 分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察
到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D 错误。
故选A。
6．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L 能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程
技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI 切点处插入大豆基因L 的向导DNA 序
列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体
信息、目标基因L 部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目标基因L 时，所用的引物越短，引物特异性越 （填
“高”或“低”）。限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI 酶切大豆基
因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI 酶切后，载体上保
留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴
定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，部分序列信息及可选
用的酶切位点如图乙所示，PCR 产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是
，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1 株基因L 成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1 条染
色体有T-DNA 插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占
比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3'
(2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④
(3)1/4
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
黏性末端的种类
基因工程的工具
BsaI 切割产生的黏性末端是
NNNN，四个碱基最多可能有
256 种排列顺序
抗生素筛选
目的基因的检测与鉴
定
重组载体通过农杆菌导入大豆细
胞当中的片段包含了卡那霉素抗
性基因，因此可以通过使用卡那
霉素筛选到具有该抗生素抗性的
植株
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR 的引物长度
通常为20~30 个核苷酸。由此可知，在利用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目的基因时，所用的引物
越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性
末端，若用BsaI 酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根
据理论来推测，BsaI 切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256 种排列顺序，故答案应为
256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI 酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-
GTTT-3'。
（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此
可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L 的目标序列跟突变序
列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及
题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，并对
PCR 产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，
限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会
出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l 成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经
过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA 插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA 片段
上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-
DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为
1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用
于后续的品种选育。
7．（2023·福建·高考真题）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”(实验I)和“DNA 的粗提取与鉴定”(实
验Ⅱ)的实验操作，下列相关叙述正确的是（ ）
A．实验I 中，PCR 实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B．实验I 中，将扩增得到的PCR 产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源
C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA
【答案】C
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：（1）DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶
液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA 对酶、高温和洗涤剂的
耐受性。（2）DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、实验Ⅰ中，PCR 实验所需的枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压
蒸汽灭菌处理，A 错误；
B、实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR 产物进行凝胶电泳，应先加样后接通电源，B 错误；
C、实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，由于DNA 不溶于酒精溶液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的
DNA，C 正确；
D、实验Ⅱ中，将丝状物溶于2mol/L 的NaCl 溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺会
被染成蓝色，用于鉴定DNA，D 错误。
故选C。
8．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有目的基
因的DNA 片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误
的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
【答案】B
【分析】E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。
【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇
TGCGCAGT-3＇，A 正确；
B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI 切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI 切割形成
的，B 错误；
C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI 和CfoI 进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA 的
序列，切割之后至少获得了2 个片段，C 正确；
D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA 连接酶能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又可
连接黏性末端，D 正确。
故选B。
9．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建
的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组
质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
【答案】D
【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI 和PvuI 的酶切位点，四环素抗性基因
（TetR）内含有HindIII、SphI 和SalI 的酶切位点。
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A 正
确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的
菌落，不一定含有目的基因，B 正确；
C、DNA 凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA 片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒
构建成功与否，C 正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因
（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet 的培养
基中不能形成菌落，D 错误。
故选D。
10．（2023·广东·高考真题）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列
叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在0.14mol/L 的
氯化钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA 等物质，A 正确；
B、DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L 的NaCl 溶液， 将溶液过滤，即可将混合
物中的多糖、蛋白质等与DNA 分离，B 正确；
C、DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA 纯度，C 正
确；
D、将DNA 溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D 错误。
故选D。
11．（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将目的
基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶
的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
【答案】C
【分析】DNA 连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA 连接酶、T4DNA 连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外
T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3 切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA 连接酶连接，A 错误；
B、质粒用酶3 切割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B 错误；
C、质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目的基因
在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C 正确；
D、若用酶2 和酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺
少标记基因，无法进行后续的筛选，D 错误。
故选C。
考点02 基因工程的基本操作程序
1．（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4 的电泳结果如图所示
（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1 和2 中的DNA 分子分别是甲和乙，甲只有限制酶
R 的一个酶切位点，样品3 和4 中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（ ）
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA 分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA 分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3 可能是甲被酶R 完全酶切后的产物
【答案】D
【分析】限制酶酶切其基本原理是利用限制酶对DNA 上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，
从而获得所需的特定序列。
【详解】A、配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH 稳定，保证核酸分子正常
泳动，A 正确；
B、电泳时，样品向+极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电
泳中的带电特性，B 正确；
C、电泳中，DNA 分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相
同，但影响DNA 分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C 正确；
D、甲只有限制酶R 的一个酶切位点，若被酶R 完全酶切，只会得到2 种DNA 片段（2 个条带），这两个
条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4 才是甲被酶R 完全酶切后的产
物，D 错误。
故选D。
2．（2025·广东·高考真题）Solexa 测序是一种将PCR 与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该
PCR 过程中，DNA 聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA 链不继续延伸，应保护底物中
脱氧核糖结构上的（ ）
A．1'-碱基
B．2'-氢
C．3'-羟基
D．5'-磷酸基团
【答案】C
【分析】在DNA 复制过程中，在DNA 聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯
键，使子链延伸，但是DNA 聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。
【详解】已知DNA 聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下
一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA 聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA
链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基
团，C 正确。
故选C。
3．（2025·安徽·高考真题）质粒K 中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶
可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工
程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（ ）
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K 中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K 经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质
粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），
都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A 正确；
B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝
色物质，故生长出的菌落均为白色，B 正确；
C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但
目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C 错误；
D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K 经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化
的质粒K 中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal 形成蓝色菌落，D 正确。
故选C。
4．（多选·2025·河北·高考真题）X 染色体上的D 基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，
某患病男孩（其母亲没有患病）X 染色体上的基因D 和H 内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠
倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA 进行了PCR 检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他
变异，下列分析错误的是（ ）
注：引物组合S1 和S2，R1 和R2 可分别用于对正常基因D 和H 序列的扩增检测
A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500
B．用R1 和R2 对母亲和患儿DNA 进行PCR 检测的结果相同
C．与正常男性相比，患病男孩X 染色体上的基因排列顺序发生改变
D．利用S1 和S2 进行PCR 检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病
【答案】AB
【分析】分析题意可知，某患病男孩（其母亲没有患病）X 染色体上的基因D 和H 内各有一处断裂，断裂
点间的染色体片段发生颠倒重接，故出现染色体倒位。
【详解】A、某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X 染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于
女性，在男性中发病率为1/3500，则该致病基因d 频率为1/3500，正常基因D 基因频率为3499/3500，女
性中携带者的占比为2×1/3500×3499/3500，A 错误；
B、该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1 和R2
不能扩增出产物来，母亲有正常的H 基因，有产物，故对母亲和患儿DNA 进行PCR 检测的结果不同，B
错误；
C、该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X 染色体上的基因排列顺序发生改变，C 正确；
D、利用S1 和S2 进行PCR 检测，有产物则含有正常D 基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲
再次孕育的胎儿是否患该病，D 正确。
故选AB。
5．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用
前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下
列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接
种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG 活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg（CG 的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg 的PCR 扩增产物和质粒进行双酶
切，随后用E.coliDNA 连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有 酶切
位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA 连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒
分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。
限制酶的识别序列和切割位点如下：
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含
和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG 的耐热性，研究
人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2
所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。
【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
(2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
(3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 卡拉胶 四环素
(4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功
能的影响较小
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉
胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海
泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得
了CG 活性最高的菌种。
（2）E.coliDNA 连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的
限制酶，即不能选择EcoRV 酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与
XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只
能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA 形
成的方向是5’→3’，且mRNA 与DNA 的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证
连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有BamHI 酶切位点。T4DNA 连接酶既可以连接平末端，
也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA 连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连
接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合
进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA 连接酶重复上述实验，获得的部分重
组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连
接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能
吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，便于重组DNA 进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）
的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因
的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目
的菌株。
（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44 位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容
易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44 位的氨基酸替换成半胱氨酸
最合适。
6．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两
个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段
的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2 为模式蛋白。测试质粒功
能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA 短肽的mKate2，将质粒导入感受态细
胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR 及 检测，筛选
获得重组菌株W1。
(2)将W1 在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种
前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强
度快速下降，原因是 。
(3)研究者选用启动子PX、X 基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入
野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2 的生长趋势不变，培养期间荧光强度的
变化趋势为 。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A 活性弱，且
莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在
生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提
出重组生产菌株构建思路： 。
【答案】(1)荧光
(2) 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长
稳定期停止基因转录，且带有SsrA 短肽的mKate2 被降解
(3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定
(4)先敲除野生菌株中的酶B 基因，再将质粒①中的mKate2 基因替换为酶B 基因，将质粒②中的mKate2
基因替换为酶A 基因，并将两种质粒导入野生菌株中
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
样。（4）目的基因的检测与鉴定。
2、引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA 聚合酶能够从引
物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR 的引物长度通常为20—30 个核苷酸。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合
酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋
白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，
进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前
检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳
定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA 短肽的mKate2，同时C-末端带有
SsrA 短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
（3）在重组菌株W2 中，启动子PX 被阻遏蛋白X 阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏
mKate2 基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X 停止表达并被降解，对PX 启动子的阻遏作用
降低，mKate2 基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强
度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 。
（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，
结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除
酶B 基因；然后将质粒①中的mKate2 基因替换为酶B 基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表
达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2
基因替换为酶A 基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累
莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。
7．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母
菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询基因N 的编码序列，设计特定引物。如图1 所示，a 链为转录模板链，为保证基因
N 与质粒pYL 正确连接，需在引物1 和引物2 的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR
扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA 片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基
对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4 号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1 和引物2 进行PCR 扩增，电泳
PCR 产物，结果如图2。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR
反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因
N，理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨
酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA 等。a 是诱变第240 位脯氨酸编码序列的引物（GCA 为诱变序
列），b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a 的配对模板相同。据此分析，
丙氨酸的密码子除GCA 外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改
造方案。
【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶
(2) 外源DNA 1 目的基因N 大小为2.3kb
(3)GCC
(4)香树脂醇
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要
原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）GenBank 是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测
序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序
列数据库或基因数据库中查询基因N 的编码序列，设计特定引物。保证基因N 与质粒pYL 正确连接，需
要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目
的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1 可知，质粒pYL 应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶
切，由于目的基因N 含有Spe Ⅰ识别序列，故N 基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末
端，基因N 酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N 基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N
基因a 链为转录模板链，才有引物1 和引物2 扩增N 基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1 序列，而编
码链的5'端含有引物2 序列，结合质粒pYL 上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2 需要5'端添加
Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR 扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA 连接酶连接DNA 片
段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基
本不变。
（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基
本不变，而质粒pYL 本身7.2kb，可知目的基因N 大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1 的质
粒中成功插入了基因N。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR
反应体系是否存在污染，即检验PCR 反应中是否有外源DNA 污染。
（3）编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子
有GCA；密码子位于mRNA 上，mRNA 上的序列与编码链序列相似，而a 是诱变第240 位脯氨酸编码序
列的引物（GCA 为诱变序列），可知a 引物延伸后的序列为编码链；b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯
丙氨酸的引物，其配对模板与a 的配对模板相同，分析题图bcd 序列可知c 是诱变第243 位苯丙氨酸的引
物，且c 引物延伸后的序列为编码链，根据a 引物5'-端首位GCA 为240 位，则c 引物5'-端GCC 为243
位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA 外，还有GCC。
（4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，
进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造
方案。
8．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子
结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1 和黄色荧光蛋白YFP 编码序列融合表达的载体，转入单细胞
衣藻，实现CADR 大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：
(1)在DNA 聚合酶、引物、模板DNA 和脱氧核苷酸中，随着PCR 反应进行，分子数量逐渐减少的是
和 。模板与引物在PCR 反应的 阶段开始结合。PCR 中使用的DNA 聚合酶需耐高温，其原因为
。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1 所示。在将CADR、GP1 和YFP 基因逐个构
建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl 两端应添加
（填两种限制酶）的识别序列。用DNA 连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。
(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生
型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量
，则表明融合蛋白能结合镉离子。
(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6 天后，检测细胞密度，结果见图2。转
基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离
子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。
(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是
和 。（填标号）
①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富
营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递
【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 -
95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶
能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。
(2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键
(3) 细胞表面发出黄色荧光 高
(4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过
高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用
(5)
①
③
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引
物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物
和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA
单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下
进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐
高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。
（2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1 和
YFP 基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入
载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接
的顺序在将GPl 连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA 连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间
形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。
（3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有
黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培
养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离
子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升
高。
（4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达
的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻
和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生
了严重的毒害作用。
（5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是
①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营
养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。
9．（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）
催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S 的L-谷氨
酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株
E．coliB。下列叙述正确的是（ ）
A．上图表明，可以从酿酒酵母S 中分离得到目的基因gadB
B．E．coliB 发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．coliA 和E．coliB 都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法；
（4）目的基因的检测与鉴定：包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】 A、上图表明，可以从酿酒酵母S 中分离得到目的基因gadB，A 正确。
B、题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，
E．coliB 中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．coliB 发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨
酸钠的作用不是供能，B 错误；
C、E．coliA 中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB 中含有该酶的基
因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生产γ-氨基丁酸，C 错误；
D、图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，但无法判断能否用
其他酶代替，D 错误。
故选A。
（2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt 基因编码的蛋白，在第76
位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和
氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt 基因的序列，设计了F1、F2、R1 和R2 等4 种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲
所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA 为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
10．下列关于引物F1、F2、R1 和R2 的叙述，错误的是（ ）
A．F1-R1 引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1-R2 引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2 为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2 引物可用于特异性地扩增目的片段
11．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6 份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶
ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6 号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A．1 号和6 号
B．2 号和4 号
C．3 号和5 号
D．1 号、2 号、4 号和6 号
【答案】10．D 11．B
【分析】引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR 的引物长度通常
为20~30 个核苷酸。
10．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1 引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A 正
确；
B、根据图乙信息可知，F1-R2 引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B 正确；
C、根据图乙信息可知，F1-R1 能扩增目的1 条带，F2-R1 无法扩增目的条带，所以F2 为无效引物，没有
扩增功能，无法使用，C 正确；
D、根据图乙显示可知，F1-R1 引物只扩增出一条片段，F1-R2 引物扩增条带为三条，说明R2 引物无法特
异性的扩增目的条带，D 错误。
故选D。
11．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt 基因编码的蛋白，在第76 位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获
得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组
中具有该酶切位点，因此对6 份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两
条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6 号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2 号和4 号，B 正
确，ACD 错误。
故选B。
12．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA 探针时，需要模板、引物、DNA 聚合酶等。在只含大
肠杆菌DNA 聚合酶、扩增缓冲液、H2O 和4 种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP 和碱基被荧光标记的
dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA 区遵循碱基互补配
对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9 个连续碱基对的双链DNA 区。能得到带有荧光标记的
DNA 探针的反应管有（ ）
反应
管
加入的单链DNA
①
5'-GCCGATCTTTATA-3'
3'-GACCGGCTAGAAA-5'
②
5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③
5'-ATTTCCCGATCCG-3'
3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④
5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A．①②
B．②③
C．①④
D．③④
【答案】D
【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9 个连续碱基对的
双链DNA 区，要能得到带有荧光标记的DNA 探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含
有A。
【详解】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA 可知，①中两条单链DNA 分子之间具有互补的序
列，但双链DNA 区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA 合成，不能得到带有荧光标记的DNA 探针；
②中单链DNA 分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9 个连续碱基对的
双链DNA 区，故一条单链DNA 分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA 区，由于DNA 合成的
链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA 探针；③中两条单链DNA 分子之间具有互补的序列，且
双链DNA 区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA 合成能得到带有荧光标记的DNA 探针；④中单链
DNA 分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA 分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA 区，
且双链DNA 区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA 合成能得到带有荧光标记的DNA 探针。
综上，能得到带有荧光标记的DNA 探针的反应管有③④。
故选D。
13．（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（
）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的原理主要基于DNA 分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝
胶的特性。
【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA 分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根
据所需分离的DNA 片段大小来选择的。对于较大的DNA 片段，比如基因组DNA 或质粒DNA，通常选择
较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA 片段，比如PCR 产物
或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A 正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝
胶2/3 处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B 错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA 片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，
DNA 片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段越长，迁移速率越慢，C 错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA 分子需染色后，才可在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来，D 错误。
故选A。
14．（多选·2024·湖南·高考真题）最早的双脱氧测序法是PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧
核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP 或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对
原则，以加入ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸
（dATP），继续延伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结
果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．上述PCR 反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为G
【答案】AC
【分析】1、PCR 技术：
（1）概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。
（2）原理：DNA 复制。
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可
自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
2、双脱氧测序法的原理：在DNA 聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四
管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA 链合成反应过程中 ddNTP 与dNTP 处
于一种竞争状态，即新合成DNA 链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP 并使新合成链终止延伸。
这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物
的5'端，但有不同的ddNTP 终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同
长度的DNA 片段，检测DNA 片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的
新的链序。
【详解】A、利用双脱氧测序法时，PCR 反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引
物，A 正确；
B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B 错误；
C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA 片段）的3'终端的碱基，如
+ddATP 的泳道中出现的条带（DNA 片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终
止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA 序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→
下，即对应的DNA 片段为长→短，则对应的DNA 测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带
为+ddCTP 泳道组的条带，则说明该DNA 片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-
CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C 正确；
D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T，D 错误。
故选AC。
15．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现
多重抗药性Sa。
(1)Sa 产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2 点）。
(2)推测Sa 产生头孢霉素抗性与其R 基因有关。为验证该推测，以图1 中R 基因的上、下游片段和质粒1
构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2 中的上、下游片段分别与Sa 基因组中R 基因上、下游片段配对，
并发生交换）敲除Sa 的R 基因。
①根据图1 信息，简述质粒2 的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片
段，再与SacII 酶切质粒1 所得大片段连接，获得质粒2。
②用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培
养获得含质粒2 的Sa 单菌落。
③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R 基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛
选并获得不再含有质粒2 的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，
若无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基因疑似被敲除。
④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图2，表明R 基因已
被敲除的是 。
【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等
(2) 采用引物1 和4 进行PCR 扩增（或采用引物1 和3 以及引物2 和4 分别进行PCR 扩增），用SacⅡ
和EcoRⅠ对PCR 产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素
D
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
判断可遗传变异的
来源
可遗传变异来源有：基
因突变、基因重组、染
色体变异及表观遗传
Sa 是原核生物，没有染色体
简述基因表达载体
构建过程
利用PCR 扩增目的基
因时，需要目的基因两
端的一段已知序列构建
引物
质粒1 及Sa 的基因组中都含有SacII 酶
识别位点，质粒2 上含有R 基因上下游
片段
筛选含质粒2 的Sa
菌落
用标记基因筛选目的菌
质粒2 上有氯霉素抗性基因
筛选并获得不再含
有质粒2 的菌落
用标记基因筛选目的菌
质粒2 中的上、下游片段分别与Sa 基因
组中R 基因上、下游片段配对，并发生
交换，R 基因被交换至质粒2 上，则Sa
的基因组中没有了R 基因；Sa 产生头孢
霉素抗性与其R 基因有关，失去R 基
因，Sa 没有头孢霉素抗性；质粒2 上含
有的Y 是可被脱水四环素诱导表达的
Sa 致死基因，则含质粒2 的Sa 在含脱
水四环素的培养基中会死亡
筛选R 基因被敲除
的Sa
PCR 扩增目的基因时
需要目的基因两端的一
段已知序列构建引物
发生同源重组时，质粒2 中的上、下游
片段分别与Sa 基因组中R 基因上、下
游片段配对，并发生交换，敲除Sa 的R
基因，但R 基因两端的上、下游片段仍
在Sa 基因组中
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）Sa 为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。
（2）①由图1 可知，质粒2 上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1 上只有SacⅡ酶切位
点，R 基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1 和
4 进行PCR 扩增可得到整个R 基因，以及上下游片段（或采用引物1 和3 以及引物2 和4 分别进行PCR 扩
增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR 产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII 酶切质粒1 所得大片段
连接，获得质粒2。
②用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2 上含有氯霉素抗性
基因，所以可以将重组后的含质粒2 的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下
来的菌落就是，含质粒2 的Sa 单菌落。
③推测Sa 产生头孢霉素抗性与其R 基因有关。为验证该推测需要敲除R 基因，因为质粒2 上含有Y 可被
脱水四环素又到表达的Sa 致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R 基因的几
率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R 基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基
因疑似被敲除。
④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图2，表明R 基因已
被敲除的是D 组，由图1 可知，R 基因两侧含有的引物为2 和3，所以扩增后含有引物2 或3，或者2 和3
的可能含有R 基因，所以表明R 基因已被敲除的是D 组。
16．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体
内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原
因是 。
【答案】(1)两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结合
(2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ
(3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床
(4)排除PCR 体系中外源DNA 的污染
(5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR 以应对感染
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写。PCR 是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。通
过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR 扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4 种脱氧核苷
酸）、酶（耐高温的DNA 聚合酶）。PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条
模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结
合
（2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI 的识别序列，且这两个序列位
于启动子和终止子之间，因此，将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效
率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为
这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。
（3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将
胚胎移植到小鼠c 的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚
胎的存活率。
（4）利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组作为空白对照，这
样可以排除PCR 体系中外源DNA 的污染，提高实验结果的可信度。
（5）若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进
而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR 无法表达，因而
干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。
17．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研
究人员发现，基因S 在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基
因（两品种中基因S 序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S 启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN 克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S 的优质大豆品种YZ。根据题19
图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制
酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳
时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农
杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ 所得再生植株YZ-1 的种子变大。同时将从TL 克隆的“启动子T+基因
S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2 的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN 较TL 种
子大的原因是 。
【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）
(2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接
（反向链接）
(3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S 片段 PCR
(4)品种DN 的基因S 上游启动子效应比TL 强，使得基因S 表达量更高，种子更大
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
启动子的基本组成
单位
基因的结构
启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，
用于启动DNA 的转录，是一段DNA 片段，
其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸
电泳时，对照样品
除指示分子大小的
标准参照物外，还
应有哪些成分
PCR 及琼脂糖凝胶
电泳
电泳可以分离不同大小的DNA 片段，用限
制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有
“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空
载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分
子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空
载体片段和“启动子D+基因S”片段
检测转入是否成功
的技术
检测目的基因是都
导入受体细胞的方
法
在分子水平上检测目的基因是否转入成功可
通过PCR 等技术检测受体细胞的DNA 上是
否插入目的基因或目的基因是否转录出
mRNA
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA 的转录，是一段DNA 片段，其基
本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
（2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA 序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶
EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；
②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，
形成的DNA 片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单
向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
（3）①DNA 电泳可以分离不同大小的DNA 片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动
子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，
还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；
②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR 等技术检测受体细胞的DNA 上是否插入目的基因
或目的基因是否转录出mRNA。
（4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1 导入的目的基因为取自品种DN 的“启动子D＋基因S”序
列，再生植株YZ-2 导入的目的基因为取自品种TL 的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中
基因S 序列无差异”可推测：品种DN 的基因S 上游的启动子D 的效应强于品种TL 的启动子T，启动子D
使基因S 表达量更高，因而种子更大。
18．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A 的野生型（含NV 基
因）、突变体（NV 基因突变）和转基因菌株（转入NV 基因），检测三种菌株NV 酶的生成与培养液中的
葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。
检测用菌
株
蔗糖
NV 酶
葡萄糖（培养液中）
野生型
+
+
+
野生型
—
—
—
突变体
+
—
—
转基因菌
株
+
+
+
回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV 基因表达。NV 酶的作用是 。检测NV 酶活性时，需测
定的指标是 （答出1 点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA 随机插入野生型菌株基因组DNA 筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组
DNA 作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV 基因”）配对的引物进行PCR 扩增。若突变体
扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因
序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将NV 基因导入 细胞获得的。在构建
NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量
（或蔗糖的减少量等）
(2) NV 基因 > T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列
(3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
表中有蔗糖一组则有NV 酶
蔗糖诱导了NV 基因表达，产
生NV 酶
测NV 酶活性时，可用
单位时间内，蔗糖的消
耗量或葡萄糖的增加量
来表示
表中有NV 酶一组则有葡萄
糖
NV 酶可催化蔗糖水解，产生葡
萄糖
表中突变体由T-DNA 随机
插入野生型菌株基因组DNA
筛选获得
野生型无T-DNA，扩增时选与
NV 基因配对的引物
扩增片段突变体长度大
于野生型长度，说明突
变体构建成功
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV 酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV
基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV 酶可能参与蔗糖的分解代谢
过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少
量等。
（2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR
扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组
DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因
片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物
进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增
片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序
列。
（3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由
于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导
入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实
具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入
NV 基因的细胞。
19．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组
织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因
上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包
含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表
达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图
B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活
报告基因的表达（图C）。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过
PCR 扩增含有捕获载体序列的DNA 片段。对PCR 产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定
载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其
在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是
基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA 片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体
的插入位点后，发现位点附近有两个基因G 和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检
测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获
载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B 所示载体进行了改造，期望改造后的载
体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功
能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达
(2)C
(3)各组织器官中G 和H 的mRNA
(4)
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
细胞分化
细胞分化是指在个体发育中，由一个
或一种细胞增殖产生的后代，在形
态、结构和生理功能上发生稳定性差
异的过程
分化是基因选择性表达的结
果
基因表达
包括转录和翻译
若要确定这两个基因是否为
心脏特异表达的基因，可通
过PCR 等技术检测其他器官
细胞中G 和H 两个基因是否
转录出相应的mRNA
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功
能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。
（2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,
增强子是含有特定碱基序列的DNA 片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体
上，AB 正确；
C、由图C 可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C 错误；
C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D 正确。
故选C。
（3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR 等技术检测其他器官细胞中G 和H 两
个基因是否转录出相应的 mRNA。
（4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体
中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因
突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研
究某目的基因的功能，可将图B 所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如
下：
。
20．（2024·全国甲卷·高考真题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR 扩增目的基因。PCR 的每次循环包括变性、复性、延伸3 个阶段，其中DNA 双链打开
成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA 链碱基之间的化学键是 。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c 的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a 单
酶切相比，用酶a 和酶b 双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c 单酶切构建重组质粒
时宜选用的连接酶是 。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若要验
证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。
(4)蛋白E 基因中的一段DNA 编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG 开
始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G 缺失，则突变后相应肽链的序列是 。
氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
精氨酸
AGA
丝氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
终止
UGA
【答案】(1) 变性 氢键
(2) 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA 连接酶
(3) 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 利用DNA 分子杂交技术，将大肠杆菌
的基因组DNA 提取出来，在含有目的基因的DNA 片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探
针与基因组DNA 杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
(4)甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
PCR 过程打开成为
单链的阶段
PCR 的每次循环包括变
性、复性、延伸3 个阶
段
PCR 的每次循环包括变性、复性、延
伸3 个阶段，其中变性时高温解旋，
DNA 双链打开成为单链的阶段是变性
双酶切的优点
基因工程的基本工具
双酶切方法，可以形成不同的黏性末
端，双酶切可以避免目的基因和质粒
的反向连接、目的基因和质粒的自身
环化
感受态细胞的特点
目的基因导入受体细胞
的方法
大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：
首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一
种能吸收周围环境中DNA 分子的生理
状态，这种细胞称为感受态细胞。
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）PCR 的每次循环包括变性、复性、延伸3 个阶段，其中DNA 双链打开成为单链的阶段是变
性，引物与模板DNA 链碱基之间的化学键是氢键。
（2）构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以
避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c 单酶切后形成平末端，需用T4DNA 连
接酶连接。
（3）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA
分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA 分
子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA 提取出来，在含有目的基因的DNA 片段上用放射性同位素等作标
记，以此作为探针，使探针与基因组DNA 杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）蛋白E 基因中的一段DNA 编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链
与mRNA 互补，因此mRNA 上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G 缺失，则
mRNA 上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。
21．（2024·吉林·高考真题）将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒（辅助T-DNA 转移）和不含有
Vir 基因、含有T-DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，
为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3 表示引物；T-DNA-LB 表示左边界；T-DNA-RB 表示右边界；Ori 表示复制原点；KanR
表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷
酒精，其目的是 。
(2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。
(3)穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其目的可能
是 。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛选转化
的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
和 。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C．将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【答案】(1) 除去蛋白质杂质 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
(2) PCR 技术扩增 人工合成
(3) RNA 聚合酶识别并结合的部位 增强目的基因的表达
(4)HygBR
(5) F3 R2
(6)D
【分析】（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
从苏云金杆菌提取
DNA 时，需加入蛋白
酶
酶具有专一性
从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋
白酶，其作用是除去蛋白质杂质
提取过程中加入体积
分数为95%的预冷酒
精
DNA 在冷酒精中溶解
度较低
提取过程中加入体积分数为95%的预冷
酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析
出不溶于酒精的DNA
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质。研磨液中的SDS 能
使蛋白质变性，因此无需担心DNA 酶水解DNA。但即使有蛋白质变性剂使蛋白质变性改变其理化性质，
仍然有可溶性、不溶性的蛋白质杂志通过沉淀、过滤等物理方式难以去除，因此为了获得较纯的DNA，保
证提取的DNA 作为PCR 模板的品质，需要加入蛋白酶。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其
目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
（2）本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR 技术扩增。
（3）穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是RNA 聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个
p35s 启动子，其目的可能是增强目的基因的表达。
（4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR
基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
F3和R2。
（6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，
来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术
属于蛋白质工程，理由是用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-
1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。
ABC 不符合题意，D 符合题意。
故选D。
22．（2024·新课标卷·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建
高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N 基因的质粒中插入B1基因组的M1 与M2 片段；再经限制
酶切割获得含N 基因的片段甲，片段甲两端分别为M1 与M2；利用CRISPR/Cas9 基因组编辑技术将片段
甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图
所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是 。为保证N 基因能在菌株B2 中表达，在构建片段甲时，应将M1 与M2
片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。
(2)CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1 基因组中与向导RNA 结合的DNA。向导RNA 与B1基因组DNA 互
补配对可以形成的碱基对有G－C 和 。
(3)用引物P1 和P2 进行PCR 可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与
引物P3 和P4 进行PCR，实验结果是 。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2 点即可）。
【答案】(1) 磷酸二酯键 片段甲含有启动子和终止子
(2)A-T、U-A
(3) 菌株B2 的基因组DNA 无扩增产物
(4)实现废物利用，减少环境污染
【分析】信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
向导RNA 与B1 基因
组DNA 互补配对可
以形成的碱基对
RNA 的碱基组成有A、
U、G、C，DNA 的碱基组
成为A、T、G、C
向导RNA 与B1 基因组DNA 互
补配对可以形成的碱基对有G-C
和C-G、A-T、U-A
利用高效降解纤维素
产生废气少，分解后剩余
实现废物利用，减少环境污染
的细菌处理秸秆
的无机盐留在土壤中
【详解】（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1 与M2 片段分别插入质粒的
Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，保证片段甲含有N 基因启动子、N 基因、N 基因终止子，保证N 基因正常
发表达。
（2）RNA 的碱基组成有A、U、G、C，DNA 的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA 与B1 基因组DNA
互补配对可以形成的碱基对有G-C 和C-G、A-T、U-A。
（3）用引物P1 和P2 进行PCR 可扩增N 基因，验证片段甲插入了细菌B1 基因组，所用的模板是菌株B2
的基因组DNA；用该模板与引物P3 和P4 进行PCR，因为P3 对应的模板序列未插入B1的基因组，实验结
果是无扩增产物。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是实现废物利用，减少环境污染。
23．（2023·辽宁·高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达
和转运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该
拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记
基因等。
【详解】为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基
因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163 基因转录形成的mRNA 中不能出现
终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP 基因转录形成的mRNA 不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因
此该拼接过程的关键步骤是除去CD163 基因中编码终止密码子的序列，B 符合题意，ACD 不符合题意。
故选B。
24．（2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小
鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获
得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于
PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【分析】PCR 技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA
复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合于Gata3 基因的右侧，启动子启动转录后，可
以使GEP 基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA 从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译
时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
C、整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只
有小片段，是野生型，C 错误；
D、用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，杂合子和Gata3—GFP 基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法
区分杂合子和纯合子，D 错误。
故选B。
25．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹
果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR 扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR 扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1 所示的两条引物，对非
转基因硅藻品系A 和转ME 基因硅藻候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1
为本实验的 组，样品2 有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检
测结果。据图分析，相对于品系A，品系B 的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较
在相同发酵条件下品系A 与B 的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME 催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B 线粒体中
ME 含量显著高于品系A。据此分析，ME 基因超表达使线粒体中NADH 水平升高， ，最终促进胞内脂
质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
【答案】(1)溶解度
(2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME 基
因”）
(3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME 基因序列整合
到硅藻细胞基因组中”）
(4) 增加 细胞数量
(5)有氧呼吸生成的ATP 增多
(6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生
产”）
【分析】1、PCR 的含义：PCR 是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在生物
体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2、PCR 原理：DNA 半保留复制。
3、PCR 基本条件：DNA 模板、4 种脱氧核苷三磷酸、2 种引物、耐高温的DNA 聚合酶、缓冲液。
【详解】（1）DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA 和蛋白
质。因此，根据DNA 和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法
得到的粗提DNA 可以作为PCR 扩增目的基因的模板。
（2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有
特殊序列结构的DNA 片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果
酸酶（ME）基因。
（3）PCR 是一项根据DNA 半保留复制原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的
基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链
核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA 作为
PCR 模板，而在实验组中以转ME 基因的硅藻细胞基因组DNA 作为模板。如此比较两个实验扩增结果可
以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME 基因序列是否整合到硅藻细胞基
因组中。
（4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3 分
析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B 的胞内脂质含量平均值显著提高。在测
定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A 与B 的硅藻细胞数量，从而可筛选获得
高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。
（5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B 线
粒体中ME 含量显著高于品系A。据此分析可知，ME 基因的超表达导致线粒体中的NADH 水平升高，
NADH 进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。
（6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生
产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
26．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质
粒，如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的
不同是 。
(2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度
(2)CD
(3)限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA 连接酶
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR
扩增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR 过程
需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR 反应体系中，模板和
引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，
尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq
DNA 聚 133 合酶为例，催化DNA 延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小
在 30s~2min 的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-GACGAG-3'能
与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中
的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载体混合
后，由于PCR 产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内
切核酸酶（限制酶）和DNA 连接酶。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于
30，A 错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，
故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落
无需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序
列，因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
27．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因
的 （填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
【答案】(1) RNA 聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2
a 链
(3) J-V5 融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此
RNA 聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位
点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；
④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还
需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连接
到质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。
b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是
3’-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯
定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b
链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是J-V5 融合蛋白。
抗J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的蛋白不是由重组质粒上
的融合的J 基因表达的。
考点03 基因工程和蛋白质工程的应用
1．（2025·全国卷·高考真题）蛋白质是结构和功能多样的生物大分子。下列叙述错误的是（ ）
A．二硫键的断裂不会改变蛋白质的空间结构
B．改变蛋白质的空间结构可能会影响其功能
C．用乙醇等有机溶剂处理可使蛋白质发生变性
D．利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质
【答案】A
【分析】蛋白质的空间结构易受外界条件影响，空间结构破坏可导致蛋白质失去生物活性，二硫键很容易
被还原而断裂，断裂后可以再次氧化重新形成二硫键。
【详解】A、二硫键是连接不同半胱氨酸残基的化学键，属于蛋白质一级结构的一部分。若二硫键断裂，
会破坏蛋白质的空间结构，导致其功能丧失，A 错误；
B、蛋白质的功能依赖其特定的空间结构，若空间结构改变（如高温、强酸强碱导致的变性），其功能通
常也会受到影响，B 正确；
C、乙醇等有机溶剂可破坏蛋白质分子中的氢键，导致其空间结构改变而变性，C 正确；
D、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来
改造现有蛋白质，或合成一种新的蛋白质，因此利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质，D 正
确。
故选A。
2．（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C 的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化
葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原
始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS 和IR3C 单菌培养时，
活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C 分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，
产物含量变化曲线如图丙。
回答下列问题：
(1)要使基因ccdB 在IR3C 中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有
。
(2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因
ccdB 编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是
，判断理由是 。
(3)基于图丙，利用IR3C 三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS 三菌混菌发酵的
产量，其原因是 。
【答案】(1)标记基因、目的基因、终止子、复制原点
(2) 稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h 时，IR3C 数量下降，而MSC 数量上
升
(3) 高于 IR3C 转入了ccdB 基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更
多山梨糖被用于合成维生素C。
【分析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞
内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传
性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。
【详解】（1）基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有标记基因、目的基因、终止子、复
制原点等。
（2）统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图2 看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h 时，
IR3C 数量下降，而MSC 数量上升，所以推测转入的基因ccdB 编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细
菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。
（3）从图丙看出，IR3C 三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MSC 三菌混菌发酵产量高，因此可以
推测，IR3C 三菌混菌发酵维生素C 产量更高，可能的原因是IR3C 转入了ccdB 基因，诱导细菌死亡，减
少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
3．（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素
类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。
(1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1 对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1
蛋白的差异，可设计开展如下实验：
① ；
②将 分别进行酶切并连接；
③将重组DNA 分子导入大肠杆菌；
④分离表达的TR1 蛋白质测定 ，明确蛋白之间的差异。
(2)树鼩及一些哺乳动物的TR1 蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是
由于TR1 第579 位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是 。
(3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件
是 。
【答案】(1) 克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1 基因 目的基因与载体 氨基酸序列
(2)利用基因编辑技术改变树鼩的TR1 基因，使编码的TR1 蛋白的第579 位氨基酸由M 变为T，检测树鼩
对辣椒素的敏感性是否提高。
(3)树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择
【分析】基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体
细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导
入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。据此分析①为克隆树鼩和其他哺乳动物TR1 蛋白基因。②为将树
鼩、其他哺乳动物TR1 蛋白基因和载体分别进行酶切并连接构建基因表达载体。由(2)中展示的蛋白质之间
的差异推测④为检测树鼩和其他哺乳动物TRI 蛋白质的氨基酸序列。
（2）树鼩TRI 蛋白第579 位氨基酸为M，人和小鼠TR1 蛋白第579 位氨基酸为T，利用基因编辑技术改变
树鼩的TR1 基因，使编码的TR1 蛋白的第579 位氨基酸由M 变为T，若替换后树鼩对辣椒素的敏感性升
高，则可以证实树鼩对辣椒素的敏感性降低是由TRI 蛋白第579 位氨基酸序列差异造成的。
（3）适应形成的必要条件是树鼩群体出现可遗传的变异，含辣椒素类物质的植物可以拓宽树嗣的食物来
源，环境对树鼩进行定向选择，使得树鼩种群中对辣椒素敏感度低的基因频率升高，让树鼩适应含辣椒素
类物质的植物。
4．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母
菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1 次
PCR 扩增出该基因的中间部分，再通过第2 次PCR 分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序
列，如图所示，回答下列问题：
(1)分析不同物种的GPD 蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的
，确定DNA 序列，进而设计1 对引物。以该菌株基因组DNA 为模板进行第1 次PCR，利用 凝胶
电泳分离并纯化DNA 片段，进一步测定PCR 产物的序列。在制备PCR 反应体系时，每次用微量移液器吸
取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。
(2)若在上述PCR 扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是
__________。
A．DNA 模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染
B．每个引物与DNA 模板存在2 个配对结合位点
C．在基因组中Gpd 基因有2 个拷贝
D．在基因组中存在1 个与Gpd 基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd 基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA 后，各自用DNA 连接
酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR
产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA 为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第
二次PCR 的一对引物，其序列应是DNA 链上的 （A．P1 和P2 B．P3 和P4 C．P1 和P4 D．P2
和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd 基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd 基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd
基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利
用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头
(2)C
(3) 预冷的体积分数为95%的酒精 C 调控
(4) 基因数据库/序列数据库 表达载体
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子、复制原点和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物
细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检
测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技
术；②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体
杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）分析不同物种的GPD 蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应
的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA 序列，进而设计1 对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化
目标DNA 片段。在制备PCR 反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪
头，以避免交叉污染。
（2）A、DNA 模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条
带，A 不符合题意；
B、每个引物与DNA 模板存在2 个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA 片段，从而出现另外一条条
带，B 不符合题意；
C、在基因组中Gpd 基因有2 个拷贝，扩增出的DNA 是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C 符合题
意；
D、在基因组中存在1 个与Gpd 基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另
外一条条带，D 不符合题意。
故选C。
（3）DNA 在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA 经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷
的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。因为引物P1 与P2 的序列从左向右为3’→5’，与图中上边的DNA 链
部分序互补配对，引物P3 与P4 的序列从左向右为5’→3’，与图中下边的DNA 链部分序互补配对。 以环
形DNA 为模板进行第二次PCR 时，应选择对已知序列反向，但对未知序列却是相向的引物，即P1 和
P4，从而得以扩增出未知序列。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功
能。
（4）为确定克隆获得的Gpd 基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二
者相同，则说明克隆获得的Gpd 基因准确。将Gpd 基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重
组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
5．（2024·天津·高考真题）胰岛素的研发走过了：动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物
生产等历程。有关叙述错误的是（ ）
A．动物体内胰岛素由胰岛B 细胞合成并胞吐出细胞
B．氨基酸是化学合成胰岛素的原料
C．用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子
D．利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物
【答案】C
【分析】胰岛素是由胰脏内的胰岛B 细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血
糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋
白质合成。外源性胰岛素主要用来治疗糖尿病。
【详解】A、胰岛素在动物体内由胰岛B 细胞合成后，经过胞吐作用释放出细胞，A 正确；
B、胰岛素属于蛋白质激素，所以化学合成胰岛素的原料是氨基酸，B 正确；
C、用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素不需要使用相同的启动子，因为两者属于不同的表达系统，
大肠杆菌是原核生物表达系统，而乳腺生物反应器属于真核生物表达系统，启动子要求不同，C 错误；
D、利用蛋白质工程技术可以对胰岛素进行改造，生成具有不同作用特性的胰岛素类似物，包括速效胰岛
素，D 正确。
故选C。
6．（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造
为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN 疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1 所示。其中GtP 为启动子，若使r2HN 仅在水稻胚
乳表达，GtP 应为 启动子。Nos 为终止子，其作用为 。r2HN 基因内部
不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN 基因与载体进行酶切，用
于表达载体的构建。
(2)利用 方法将r2HN 基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN 表达情况，可通过PCR 技术检测
，通过 技术检测是否翻译出r2HN 蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN 纯
合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。
(4)制备r2HN 疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内
抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的
细胞（细胞毒性T 细胞）水平，结果如图2 所示。据此分析，
获得的r2HN 疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN 疫苗的优点是 。（答出两点即
可）
【答案】(1) 胚乳特异表达基因的 终止转录 HindIII EcoRI
(2) 农杆菌转化 r2HN 是否转录 抗原抗体杂交
(3) 1/4 纯合体自交后代不发生性状分离
(4) 体液 细胞
(5)生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基
因污染”）
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
启动子的类型的判
断
启动子是RNA 聚合酶
识别并结合的部位，
驱动转录
载体中可人工构建诱导型启动子，当诱
导物存在时，可以激活或抑制目的基因
的表达。终止子相当于一盏红色信号
灯，使转录在所需要的地方停下来，它
位于基因的下游，也是一段有特殊序列
结构的DNA 片段。
将r2HN 基因导入水
稻愈伤组织的方法
可利用农杆菌转化法
将目的基因导入植物
细胞
水稻是植物细胞，可利用农杆菌转化法
将目的基因导入植物细胞；可利用显微
注射技术将目的基因导入动物细胞
病毒进入体内发生
特异性免疫包括体液
根据图示，抗体和T 细胞的数量都增加
的免疫
免疫和细胞免疫
了，说明病毒进入体内既引发了体液免
疫又引发了细胞免疫
（2）逻辑推理与论证：
【详解】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN 的水稻胚乳细胞生物反应器，在水稻胚乳特异表达基因的的
启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA 聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos 为终止子，终止子可以终止转
录。r2HN 基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI 破坏了启动子序列不能选用，SacI 位于终止子序列
之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII 和EcoRI 对
r2HN 基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN 表达
情况，可通过PCR 技术检测转录的r2HN 是否转录，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗
原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN 蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植
株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN 基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状
分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。
（4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T 细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通
过细胞免疫产生了细胞毒性T 细胞，即r2HN 疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
（5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN 疫苗具有生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或
“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）等优点。
7．（2024·上海·高考真题）图1 显示了人体结缔组织中弹性纤维的形成机制。弹性蛋白借助E 蛋白定位在
微纤维束上，并由P 蛋白协助L 酶交联弹性蛋白形成弹性纤维。
(1)弹性蛋白与弹性纤维的相同之处在于___（单选）。
A．多肽链的数量
B．肽键的结构
C．氨基酸的数量
D．肽键的数量
弹性纤维合成受阻，对结缔组织中的血管会产生严重后果，如全身性动脉迂曲。某家庭有两男两女四个孩
子，两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，双亲和两个女儿均表型正常。对全体家庭成员进行基因测
序，发现所有人均含有致病E 基因。图2 显示了致病E 基因表达的部分氨基酸序列，其中一个字母表示一
种氨基酸，*表示终止。
(2)据题中信息分析，该家庭成员所含的致病E 基因是 （显性/隐性）基因，该病属于 （伴X/常）染
色体遗传病。
(3)不考虑分裂异常，下列关于大儿子的致病E 基因的来源与分布，正确的是___（单选）。
A．其所有次级精母细胞均含有
B．仅源自其父亲的精子
C．仅其部分次级精母细胞含有
D．仅源自其母亲的卵细胞
(4)据图2 分析，致病E 基因所表达的蛋白功能异常，其可能原因是由于E 基因 （编号选填）。
①转录后的翻译提前终止
②替换了一个碱基对
③缺失了一个碱基对
④插入了一个碱基对
(5)理论上，下列基因治疗方案中对缓解大儿子的全身性动脉迂曲最有效的是___（单选）。
A．修复P 蛋白的基因
B．修复LOX 酶的基因
C．降低致病E 基因表达量
D．修复致病E 基因
(6)大女儿与表型正常的男性结婚后，为预防患全身性动脉迂曲的孩子出生，所采取的措施中应包括
（编号选填）。
①孕前对大女儿配偶做基因检测
②孕后开始高蛋白饮食
③孕前评估该疾病的再发风险率
④孕前对大女儿配偶做血管 B 超检查
【答案】(1)B
(2) 隐性 常
(3)A
(4)①③④
(5)D
(6)①②③④
【分析】遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。遗传病是指完全或部
分由遗传因素决定的疾病，常为先天性的，也可后天发病。如先天愚型、多指（趾）、
先天
性聋哑、血友病等，这些遗传病完全由遗传因素决定发病，并且出生一定时间后才发病，有时要经过几
年、十几年甚至几十年后才能出现明显症状。
【详解】（1）弹性纤维是弹性蛋白借助E 蛋白定位在微纤维束上，并由P 蛋白协助L 酶交联弹性蛋白形
成的，因此弹性蛋白与弹性纤维是两种蛋白质，多肽链的数量、氨基酸的数量、肽键的数量均不同，但所
有蛋白质中肽键的结构均一样。
故选B。
（2）双亲和两个女儿均表型正常，两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，说明该病为隐性病，而所有
人均含有致病E 基因，因此为常染色体隐性，若为伴X 隐性，则父亲为XBY，不含致病基因，因此致病E
基因为隐性基因， 位于常染色体上。
（3）A、两个儿子均出现全身性动脉迂曲的症状，故基因型为EE，所有次级精母细胞均含有，A 正确；
B、大儿子的致病E 基因一个来自于母亲，一个来自于父亲，B 错误；
C、所有次级精母细胞均含有E 基因，C 错误；
D、致病E 基因也来自于精子，D 错误。
故选A。
（4）①致病E 基因所表达的蛋白后面氨基酸序列全部改变，可能是转录后的翻译提前终止导致，①正
确；
②如果是替换了一个碱基对，氨基酸只改变一个，后面的氨基酸序列不会变，②错误；
③基因中缺失了一个碱基对，会导致后面的氨基酸顺序全部改变，③正确；
④基因中插入了一个碱基对，也会导致后面的氨基酸顺序全部改变，④正确。
故选①②③④。
（5）A、P 蛋白只是弹性纤维的一部分，修复P 蛋白的基因不一定可以有效缓解大儿子的全身性动脉迂
曲，A 错误；
B、P 蛋白协助L 酶交联弹性蛋白形成弹性纤维，修复LOX 酶的基因不一定可以有效缓解大儿子的全身性
动脉迂曲，B 错误；
C、大儿子的基因型为EE，降低致病E 基因表达量也可能较严重，C 错误；
D、大儿子的全身性动脉迂曲是致病基因E 引起的，基因控制性状，修复致病E 基因对缓解大儿子的全身
性动脉迂曲最有效，D 正确。
故选D。
（6）①大女儿表型正常，含致病E 基因，表型正常的男性，也可能含致病E 基因，因此为预防患全身性
动脉迂曲（EE）的孩子出生，可以在孕前对大女儿配偶做基因检测，①正确；
②全身性动脉迂曲是由于弹性纤维合成受阻，孕后开始高蛋白饮食有助于蛋白质的合成，②正确；
③孕前评估该疾病的再发风险率，预防患全身性动脉迂曲的孩子出生，③正确；
④孕前对大女儿配偶做血管 B 超检查，看是否存在血管动脉迂曲的情况，④正确。
故选①②③④。
8．（2023·天津·高考真题）多种方法获得的早期胚胎，均需移植给受体 才能获得后代。下图列举了几项
技术成果。
下列叙述正确的是 （ ）
A．经胚胎移植产生的后代与受体均保持一致
B．①需获得MII 期的去核卵母细胞
C．②能大幅改良动物性状
D．③可通过②技术实现扩大化生产，①②可通过③技术实现性状改良
【答案】D
【分析】动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发
育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物。
【详解】A、子代动物的遗传性状与供体基本一致，但与受体无关，A 错误；
B、核移植过程中需要处于MII 中期的去核卵母细胞，而过程1 是培育试管动物，需要培育到适宜时期
（桑葚胚或囊胚等时期）进行胚胎移植，B 错误；
C、过程2 得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C 错误；
D、过程2 克隆技术可得到大量同种个体，为过程3 提供了量产方式；过程3 是转基因技术，转基因可导
入外源优良基因，为过程1、2 提供了改良性状的方式，D 正确。
故选D。
9．（2023·广东·高考真题）中外科学家经多年合作研究，发现circDNMT1（一种RNA 分子）通过与抑癌
基因p53 表达的蛋白结合诱发乳腺癌，为解决乳腺癌这一威胁全球女性健康的重大问题提供了新思路。下
列叙述错误的是（ ）
A．p53 基因突变可能引起细胞癌变
B．p53 蛋白能够调控细胞的生长和增殖
C．circDNMT1 高表达会使乳腺癌细胞增殖变慢
D．circDNMT1 的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究
【答案】C
【分析】人和动物细胞中的DNA 上本来就存在与癌变相关的基因：原癌基因和抑癌基因。一般来说，原
癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质
活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞
凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。
【详解】A、p53 基因是抑癌基因，这类基因突变可能引起细胞癌变，A 正确；
B、p53 基因是抑癌基因，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或促进细胞凋亡，B 正确；
C、依据题意，circDNMT1 通过与抑癌基因p53 表达的蛋白结合诱发乳腺癌，则circDNMT1 高表达会使乳
腺癌细胞增殖变快，C 错误；
D、circDNMT1 的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究，D 正确。
故选C。
10．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径
I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了
L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA 的EdU 和
BrdU 均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一
组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU 标记细胞的百分
比（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从 点到 点。
(3)为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小
鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基因：源自噬菌
体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；③Er 基因：编码的Er 蛋白位于
细胞质，与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细
胞核。请完善制备小鼠IK 的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选
目标小鼠→ →获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的
三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，再过t2时间后检测B 细胞被标
记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
【答案】(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3) 将Ce 酶基因和Er 基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B 细胞没有被BrdU 标记
【分析】DNA 分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA 的双链）、能量（ATP 水
解提供）、酶（解旋酶和DNA 聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：
一条DNA 复制出两条DNA；特点：半保留复制。
【详解】（1）分析题意可知，EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，
掺入DNA 的EdU 和BrdU 均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA 分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞
混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU 会与A 结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定
时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU 也会与A 结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到
峰值，故结合题图可知，图中反映DNA 复制所需时长的是从Q 点到R 点。
（3）分析题意，要制备IK 小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲
除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK 的技术路线为：将Ce 酶基因和Er 基因连接（Ce 酶可作
用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T
（诱导Er 蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增
殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先
用EdU 饲喂小鼠IK，各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞
应都含有EdU 标记，实验假设是变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过
程已经复制的B 细胞直接分裂，不会再有DNA 复制过程，故t2时间后用BrdU 饲喂则不起作用，即大多数
B 细胞没有被BrdU 标记。
