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发酵工程
考点1
专题08 生物技术与工程
3 大考点概览
考点1 发酵工程
考点2 细胞工程
考点3 基因工程
1．（2026·湖南常德·二模）下列关于传统发酵技术及发酵工程的叙述，正确的是（ ）
A．啤酒生产中，焙烤的目的是杀死种子胚并进行灭菌
B．在O2和糖源都充足时，醋酸菌能将糖分解成乙酸
C．谷氨酸发酵过程中，创设酸性条件有利于谷氨酸积累
D．利用某些嗜热菌可有效提高热敏性发酵产品的产量
【答案】B
【详解】A、啤酒生产中焙烤大麦的目的是杀死大麦种子胚，避免种子萌发消耗有机物，A 错误；
B、醋酸菌是好氧菌，当氧气和糖源都充足时，醋酸菌可以将糖分解为乙酸，B 正确；
C、谷氨酸发酵过程中，中性/弱碱性条件才有利于谷氨酸积累；酸性条件不利于谷氨酸积累，C 错误；
D、嗜热菌的发酵需要较高温度，而热敏性发酵产品对高温敏感，高温会破坏这类产品，因此无法提高其
产量，D 错误。
2．（2026·湖南怀化·二模）烟栖火叶菌是一种栖息在深海热液喷口附近的微生物，能耐受113℃的高温，
其最低生长温度为90℃，最适生长温度约为105℃，可利用硫化物等无机物氧化释放的能量合成有机物。
下列关于培养烟栖火叶菌的方法和应用，错误的是（ ）
A．烟栖火叶菌可能是厌氧型菌、化能自养菌
B．在液体培养基中培养时，温度应控制在105℃左右
C．培养基中只需加入氮源和碳源两类营养物质
D．烟栖火叶菌含有的耐高温酶可应用于需要高温反应条件的工业生产中
【答案】C
【详解】A、深海热液喷口环境氧气含量极低，因此烟栖火叶菌可能为厌氧型菌；题意显示其可利用硫化
物等无机物氧化释放的能量合成有机物，属于化能自养菌，A 正确；
B、微生物在最适生长温度下增殖速率最快，烟栖火叶菌最适生长温度约为105℃，因此液体培养时温度
控制在105℃左右是合理的，B 正确；
C、微生物培养基的基本营养成分通常包括碳源、氮源、水、无机盐，部分特殊微生物还需要额外添加生
长因子，但仅提供碳源和氮源无法满足烟栖火叶菌的生长需求，C 错误；
D、烟栖火叶菌可在100℃以上的高温环境中正常生长，其体内的酶具有耐高温的特性，可应用于需要高
温反应条件的工业生产，D 正确。
3．（2026·湖南常德·二模）通过在平板的不同区域添加不同营养物质的结晶或粉末可以选择出某种营养
缺陷型菌株。营养缺陷型菌株在基本培养基上不能正常生长，只能在完全培养基上正常生长。为分离诱
变菌液中氨基酸缺陷型菌株，现将诱变处理后的菌液稀释后接种于某培养基上培养，用灭菌牙签逐个挑
取待测菌，先后点接于A、B 培养基上，前后位置及号码相对应，培养后菌落生长情况如下图，下列操作
与判断正确的是（ ）
A．实验过程中需在培养皿的皿底划分区域并做好标记
B．过程①的接种方法为平板划线法，接种环需灼烧灭菌
C．确定氨基酸缺陷型时，应挑取A 中的目标菌落进行后续实验
D．后续实验中在不同区域添加氨基酸结晶或粉末的培养基为鉴别培养基
【答案】A
【详解】A、本实验需要保证A、B 培养基点接的位置、号码一一对应，才能对比生长情况，因此需要在
培养皿皿底划分区域并标记（培养皿倒置培养，标记在皿底可避免混淆），A 正确；
B、据图可知，过程①是将稀释后的菌液接种获得单个均匀分布的待测菌落，该接种方法是稀释涂布平板
法，B 错误；
C、氨基酸缺陷型不能在基本培养基A 上生长，A 中没有目标菌落，无法挑取，需要从B 培养基对应位置
挑取目标菌落，C 错误；
D、该培养基以基本培养基为基础，不同区域添加不同氨基酸，目的是筛选出特定的氨基酸缺陷型菌株
（只有对应缺陷型能在对应氨基酸区域生长），属于选择培养基，D 错误。
4．（2026·湖南永州·二模）某科研小组从土壤中分离出一种解脂菌，它能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解
成甘油和脂肪酸。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，而脂肪不能。下列叙述正确的是（
）
A．配制好固体培养基后依次进行灭菌、调节pH 和倒平板等操作
B．可采用平板划线法对土壤中的解脂菌进行分离与计数
C．微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物
D．醇溶青琼脂平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
【答案】D
【详解】A、配制固体培养基时，需先调节pH 再灭菌，避免灭菌后pH 改变或污染，A 错误；
B、平板划线法用于菌种分离，但无法精确计数（需用稀释涂布平板法），B 错误；
C、纯培养物指仅含单一微生物的培养物，并非不含代谢废物（如脂肪酸等），C 错误；
D、由题干可知，脂肪酸使醇溶青琼脂变蓝，且脂肪酶分解脂肪产生脂肪酸。平板蓝色程度可反映脂肪酸
量，进而比较不同解脂菌分泌脂肪酶的能力，D 正确。
5．（2026·湖南邵阳·二模）我国是世界上最大的柠檬酸生产国。下图是利用黑曲霉通过深层通气液体发
酵技术生产柠檬酸的流程图，相关叙述错误的是（ ）
A．柠檬酸生产和果醋生产所选用的菌种呼吸类型相同
B．配制扩大培养的培养基时，应该加入质量分数为1.5%～2%的琼脂
C．培养皿采用的灭菌方法比培养基采用的灭菌方法温度低、时间短
D．选育菌种时，培养基灭菌后应该调节pH 至酸性后再培养
【答案】BCD
【详解】A、黑曲霉发酵时需通入空气，为异养需氧型，果醋生产使用的菌种是醋酸菌，也为异养需氧型，
A 正确；
B、扩大培养基为液体培养基，不加琼脂，B 错误；
C、培养皿常用干热灭菌，参数为1170℃灭菌2h，培养基常用高压蒸汽灭菌，参数为121℃灭菌30min，
因此培养皿灭菌法温度更高、时间更长，C 错误；
D、微生物培养基配制的操作流程为：计算→称量→溶解→调节pH→灭菌，若灭菌后再调节pH，会引入
杂菌污染培养基，D 错误。
6．（2026·湖南衡阳·二模）某科研小组计划在实验室分离纯化能高效降解聚苯乙烯的细菌（目标菌），
然后获取相关酶，以期实现塑料的生物酶降解，其基本思路如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．解剖并取肠道内容物是为了采集含目标菌的样品
B．富集培养时的培养基应以聚苯乙烯为唯一碳源
C．利用培养基Ⅱ分离目标菌的接种方法是稀释涂布平板法
D．观察菌落大小、颜色等可进一步鉴定某菌株是否为目标菌
【答案】D
【详解】A、解剖并取肠道内容物是为了采集含目标菌的样品，因为黄粉虫是经过PVC 塑料喂养的，因
而其肠道内存在目标菌，A 正确；
B、富集培养时的培养基应以聚苯乙烯为唯一碳源，这样该培养基兼具选择培养的作用，B 正确；
C、根据图示的操作和菌落的分布可知，利用培养基Ⅱ分离目标菌的接种方法是稀释涂布平板法，C 正确；
D、观察菌落大小、颜色等可鉴定菌种的类型，但不能进一步鉴定某菌株是否为目标菌，若需要进一步鉴
定是否为目标菌种则需要进行降解聚苯乙烯效率检测的实验，D 错误。
7．（2026·湖南张家界·二模）下列关于传统发酵技术的叙述，正确的是（ ）
A．制作泡菜时，泡菜坛坛口加水密封的目的是为了抑制乳酸菌的繁殖
B．制作果酒时，发酵液中酒精浓度升高会抑制酵母菌的发酵
C．制作腐乳时，毛霉产生的蛋白酶只能将豆腐中的蛋白质分解为氨基酸
D．制作果醋时，醋酸菌在无氧条件下将酒精转化为醋酸
【答案】B
【详解】A、制作泡菜时，乳酸菌是厌氧菌，泡菜坛坛口加水密封的目的是营造无氧环境，以促进乳酸菌
的繁殖，而非抑制，A 错误；
B、制作果酒时，酒精浓度过高（超过 12%~16%）会抑制酵母菌的代谢和发酵，甚至导致酵母菌死亡，
B 正确；
C、毛霉产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，并非只分解为氨基酸，C 错误；
D、醋酸菌是好氧菌，制作果醋时需要在有氧条件下将酒精转化为醋酸，D 错误。
8．（2026·湖南岳阳·二模）尿素需要土壤中尿素分解菌将其分解后才能被农作物吸收，某科研小组欲对
某地土壤中尿素分解菌进行培养和研究。下列叙述正确的是（ ）
A．若要分离培养尿素分解菌，需要以尿素为唯一氮源的培养基进行培养，且培养基在灭菌后需要先
调整pH 再倒平板
细胞工程
考点2
B．若要获得能高效分解尿素的菌种，从富含哺乳动物尿液且植物生长茂盛的地方取样，获得目的菌
种的概率更高
C．土壤中尿素分解菌数量的统计可以通过稀释涂布平板法接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，其
上长出的菌落均来源于一个尿素分解菌
D．研究过程中所有用到的培养器具和使用后的培养基在丢弃前一定要进行消毒处理
【答案】B
【详解】A、分离尿素分解菌需要用以尿素为唯一氮源的选择培养基，但培养基pH 调整需在灭菌前完成，
A 错误；
B、富含哺乳动物尿液的土壤中尿素含量高，尿素分解菌的种群密度更高，因此在此类区域取样获得目的
菌种的概率更高，B 正确；
C、稀释涂布平板法统计菌落时，若两个或多个尿素分解菌粘连在一起，培养基上仅会长出一个菌落，因
此长出的菌落不一定都来源于单个尿素分解菌，C 错误；
D、为防止有害微生物扩散污染环境，使用后的培养器具和培养基丢弃前必须进行灭菌处理，消毒无法杀
灭芽孢和孢子，D 错误。
1．（2026·湖南怀化·二模）牛羊等反刍动物的育种技术是保障全球肉奶供应、提升畜牧业效益的关键。
我国科学家利用单倍体干细胞技术成功培育出世界首例基因编辑牛羊。该技术体系包括：①研发新型培
养液，建立牛羊孤雄单倍体干细胞系；②通过瞬时表达鱼精蛋白，将干细胞核“压缩”成类精子结构；
③利用非整合引导编辑技术一次性实现MSTN 基因100%敲除；④将修饰后的干细胞注入去核卵母细胞，
以获得健康活体牛羊。下列相关叙述错误的是（ ）
A．孤雄单倍体干细胞只有一套染色体，便于进行精准的基因编辑
B．对卵母细胞去核操作可以在减数分裂Ⅱ期进行
C．受体通常不会对移植的胚胎发生免疫排斥，这是胚胎移植的基础
D．获得的基因编辑牛羊的遗传信息全部来自单倍体干细胞
【答案】D
【详解】A、孤雄单倍体干细胞只含1 个染色体组，不存在等位基因，进行基因编辑时仅需修改单条染色
体上的目标基因即可实现性状改变，便于进行精准基因编辑，A 正确；
B、动物核移植操作中，通常将卵母细胞培养至减数分裂Ⅱ期再进行去核操作，该时期卵母细胞的细胞质
可诱导细胞核全能性表达，B 正确；
C、受体子宫对移入的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，是胚胎能够在受体内存活、胚胎移植技术实现
的重要生理学基础，C 正确；
D、基因编辑牛羊的细胞核遗传信息来自单倍体干细胞，但细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自
去核卵母细胞，并非全部遗传信息都来自单倍体干细胞，D 错误。
2．（2026·湖南湘一名校联盟·二模）直肠癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均较
高。为研究直肠癌细胞通过其微环境诱导肝星状细胞分化进而促进肿瘤生长和转移的机制，研究人员进
行了相关实验（实验细胞均贴壁生长，所用培养基中添加500μL 的青链霉素）。下列说法错误的是（
）
A．培养基中添加青链霉素的目的是抑制细菌增殖
B．对直肠癌细胞进行传代培养时，可直接用离心法收集细胞
C．直肠癌细胞应置于含95%空气和5%CO2混合气体、37℃的恒温培养箱中培养
D．收集直肠癌细胞培养上清液，与肝星状细胞共培养，可判断其是否有诱导作用
【答案】B
【详解】A、青链霉素属于抗生素，动物细胞培养时添加青链霉素可抑制细菌增殖，避免杂菌污染培养体
系，A 正确；
B、题干明确说明实验细胞均贴壁生长，传代培养时首先需要用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理，使贴壁
细胞从培养瓶壁上脱落下来，再用离心法收集细胞，B 错误；
C、动物细胞培养的适宜条件为：温度控制在37℃左右，气体环境为95%空气（为细胞有氧呼吸提供氧
气）和5%CO₂（维持培养液的pH 稳定），C 正确；
D、若直肠癌细胞可分泌相关物质诱导肝星状细胞分化，则其培养上清液会含有该类物质，将上清液与肝
星状细胞共培养，观察肝星状细胞的分化情况即可验证诱导作用是否存在，实验设计合理，D 正确。
3．（2026·湖南湘一名校联盟·二模）百香果含有132 种以上的芳香物质，是世界上已知最芳香的水果之
一，有“果汁之王”的美誉，但百香果多采用嫁接、扦插等方式进行无性繁殖，易携带母株病毒，导致
果实品质下降、产量降低，生产中可采用脱毒处理加以解决。下列说法错误的是（ ）
A．离体的百香果组织必须经过消毒后才能接种到培养基上
B．植物茎尖几乎不含病毒，分裂旺盛的茎尖是合适的脱毒材料
C．可在培养基中添加2．0mg·L⁻¹ 的BA 和0．15mg·L⁻¹ 的NAA 诱导生芽
D．经植物组织培养获得的脱毒百香果幼苗不需要进行病毒检测即可扩大繁殖
【答案】D
【详解】A、离体的百香果组织作为外植体，表面携带大量微生物，必须经过消毒处理后接种，避免杂菌
污染培养基，A 正确；
B、植物茎尖的分生区细胞分裂旺盛，病毒难以在该部位积累，几乎不含病毒，是制备脱毒苗的合适材料，
B 正确；
C、BA 是细胞分裂素类生长调节剂，NAA 是生长素类生长调节剂，当生长素与细胞分裂素的比值较低时，
可诱导外植体分化生芽，该培养基中细胞分裂素占比远高于生长素，符合诱导生芽的激素配比要求，C 正
确；
D、经组织培养获得的脱毒幼苗仍存在携带病毒的可能性，必须经过病毒检测确认无毒后，才能进行扩大
繁殖，避免后续繁殖的植株仍带毒，D 错误。
4．（2026·湖南衡阳·二模）草莓的营养繁殖易将所感染的病毒传给后代，导致产量降低、品质变差。
利用MS 培养基运用植物组织培养技术可以培育出无病毒植株。科研人员研究了草莓茎尖长度对分化苗的
形成及脱毒效果的影响，结果如下表。下列叙述正确的是（ ）
处理
外植体
数
分化苗数
脱毒苗数
小于0.3mm
20
1
1
0.3～0.5mm
20
10
7
大于0.6mm
20
13
4
A．草莓茎尖培养脱毒的关键原因是茎尖病毒含量极低甚至无病毒
B．据表分析，选取0.3～0.5mm 的茎尖有利于培养脱毒草莓苗
C．提高MS 培养基中细胞分裂素和生长素的比例有利于诱导生根
D．优化培养基成分和严格控制无菌培养环境，都能提高茎尖培养脱毒效果
【答案】ABD
【详解】A、选用草莓茎尖作材料，主要是因为茎尖分生区细胞不含病毒或所含病毒数量少，一般不会受
到病毒侵染，因而可获得无毒苗，A 正确；
B、表格数据可知，0.3~0.5 mm 的茎尖，既满足脱毒效果，又确保能得到较多的分化苗，所以最适宜选取
0.3~0.5 mm 的茎尖进行繁殖，B 正确；
C、降低MS 培养基中细胞分裂素和生长素的比例有利于诱导生根，因为生长素能促进生根，C 错误；
D、植物组织培养技术需要在无菌、无毒的环境中进行，且培养基中的激素的含量和比例会影响分化的方
向，据此可知，优化培养基成分和严格控制无菌培养环境，都能提高茎尖培养脱毒效果，D 正确。
5．(2026・湖南长郡二十校联盟・二模)某农业科技公司为抢救濒危药用植物“红豆杉”，启动了组织培
养快速繁殖项目。在实验中，技术人员发现：当外植体取自树皮部位时，脱毒效果差；而取自茎尖分生
组织时，可获得高纯度脱毒苗。同时，为研究生殖细胞全能性，团队还进行了花粉离体培养实验。下列
关于该过程的叙述，错误的是（ ）
A．外植体脱分化过程中，细胞逐渐失去原有形态和功能特异性，形成不定形的薄壁组织团块
B．再分化阶段，若培养基中细胞分裂素与生长素比例较高，则有利于芽的形成，但会抑制根的发育
C．单倍体植株幼苗经秋水仙素处理后恢复可育性，体现了植物生殖细胞的全能性
D．选择茎尖分生组织作为外植体获得脱毒苗，是因为该区域的病毒极少，甚至无病毒
【答案】C
【详解】A、脱分化过程中，已分化的细胞会逐渐失去原有形态和功能特异性，形成愈伤组织，愈伤组织
就是不定形的薄壁组织团块，A 正确；
B、再分化阶段，细胞分裂素与生长素的比例会调控分化方向，比例较高时有利于芽的分化，同时抑制根
的发育，比例较低时有利于根的分化，B 正确；
C、细胞全能性的判断标准是已分化的细胞发育为完整个体，花粉（生殖细胞）发育为单倍体幼苗的过程
已经体现了生殖细胞的全能性，秋水仙素处理使染色体加倍恢复可育性的过程不体现全能性，C 错误；
D、茎尖分生组织细胞分裂速度快，病毒极少甚至没有病毒，因此选择该部位作为外植体可以获得高纯度
脱毒苗，D 正确。
6．(2026・湖南长郡二十校联盟・二模)为研发针对某病毒变异株的中和抗体，某生物制药企业采用杂交
瘤技术进行单克隆抗体制备。在实验过程中，技术人员需通过两次关键筛选获得目标杂交瘤细胞。下列
关于该过程的叙述，正确的是（ ）
A．第一次筛选的目的是直接获得能分泌所需要的特异性抗体的杂交瘤细胞
B．第二次筛选前需对杂交瘤细胞进行克隆化培养，再利用抗原—抗体杂交技术鉴定目标细胞株
C．将新冠病毒S 蛋白注射到小鼠体内后，应从小鼠骨髓中分离经免疫的B 淋巴细胞用于融合
D．杂交瘤细胞体外培养时，需通入95%的纯氧和5%的二氧化碳，以满足高耗氧细胞的呼吸需求
【答案】B
【详解】A、第一次筛选是利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，去除未融合的亲本细胞和同种细胞融合的
杂种细胞，该步骤不能直接获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，A 错误；
B、第二次筛选的目的是获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞，筛选前需先对杂交瘤细胞进行克隆化
培养，再通过抗原—抗体杂交技术鉴定，出现阳性反应的即为目标细胞株，B 正确；
C、将抗原注射到小鼠体内后，经免疫的B 淋巴细胞（浆细胞）主要分布在小鼠脾脏中，应从小鼠脾脏中
分离该细胞用于融合，而非骨髓，C 错误；
D、杂交瘤细胞体外培养的气体环境为95%的空气和5%的二氧化碳，纯氧会造成细胞氧化损伤，无法用
于细胞培养，5%二氧化碳的作用是维持培养液的pH，D 错误。
7．（2026·百师联盟·二模）人参果（2n=24）因低糖、低脂、高蛋白深受人们喜爱，但人参果种植过
程中容易遭受病毒侵害，产量低。苦参（2n=18）产生的苦参碱、氧化苦参碱能干扰病毒RNA 的合成，
对烟草花叶病毒（TMV）等多种病毒有效。科研人员利用人参果和苦参进行植物体细胞杂交，培育抗病
毒的人参果—苦参杂种植株。下列叙述正确的是（ ）
A．苦参分生组织细胞培育出不定根的过程体现了植物细胞的全能性
B．将人参果细胞和苦参细胞进行融合时，可采用灭活病毒进行诱导
C．得到杂种细胞后继续培养，常用生长素、细胞分裂素诱导愈伤组织的形成和分化
D．与紫草宁一样，苦参碱属于初生代谢物，可采用植物细胞培养技术大量获得
【答案】C
【详解】A、不定根属于器官，不是个体，故该过程未体现植物细胞的全能性，A 错误；
B、与植物细胞融合相比，灭活病毒诱导法是动物细胞融合特有的，B 错误；
C、融合细胞在培养基中培养，培养基中需要加入（一定浓度的）植物激素，通常是生长素和细胞分裂素，
促进形成愈伤组织和再分化形成杂种植株，C 正确；
D、紫草宁是紫草的次生代谢物，次生代谢物不是植物生命活动所必需的物质。苦参碱与紫草宁一样，是
次生代谢物，可采用植物细胞培养技术大量获得。植物细胞培养是在离体条件下对单个植物细胞或细胞
团进行培养，使其增殖的技术，D 错误。
8．（2026·湖南邵阳·二模）下列关于细胞工程相关的叙述正确的是（ ）
A．诱导愈伤组织分化时，调节培养基中激素浓度和比例，使其先生根后生芽
B．利用花药离体培养获得玉米幼苗后，直接筛选出具有优良性状的个体
C．选择发育良好的桑葚胚进行胚胎分割时，要注意将内细胞团均等分割
D．PEG 融合法和电融合法均可用于动物细胞融合以及植物原生质体的融合
【答案】D
【详解】A、植物组织培养诱导愈伤组织再分化时，生长素与细胞分裂素的比值低时诱导芽分化，比值高
时诱导根分化，通常先诱导生芽再诱导生根，A 错误；
B、花药离体培养获得的玉米幼苗是单倍体，植株弱小且高度不育，需经秋水仙素处理使染色体加倍后才
能筛选优良性状个体，不能直接筛选，B 错误；
C、内细胞团是囊胚时期特有的结构，桑葚胚阶段尚未分化出内细胞团，只有囊胚分割时需要将内细胞团
均等分割，C 错误；
D、PEG 融合法属于化学融合法，电融合法属于物理融合法，二者均可用于植物原生质体融合和动物细胞
融合，D 正确。
9．（2026·湖南永州·二模）细胞工程在社会生产中的应用日益广泛。下列叙述正确的是（ ）
A．原生质体需在低渗溶液中长期保存，以防止过度失水而死亡
B．胚状体是愈伤组织再分化的结果，受基因选择性表达的调控
C．动物细胞通常置于含有95%O2和5%CO2的培养箱中培养
D．动物克隆过程中，核移植的受体细胞通常是去核的卵原细胞
【答案】B
【详解】A、原生质体（去除细胞壁的植物细胞）因无细胞壁保护，在低渗溶液中会吸水涨破，故需在等
渗溶液中保存以维持形态，A 错误；
B、胚状体是植物组织培养中愈伤组织脱分化后再分化形成的结构，该过程受基因选择性表达调控，可发
基因工程
考点3
育成新个体，B 正确；
C、动物细胞培养需在含5% CO₂ 的培养箱中维持pH，但O₂ 浓度通常为95%空气（约21% O₂），而非
95% O₂（高氧会抑制细胞代谢），C 错误；
D、动物核移植的受体细胞是去核的MⅡ期卵母细胞（次级卵母细胞），卵原细胞尚未成熟，不用于核移
植，D 错误。
1．（2026·湖南张家界·二模）CRISPR/Cas9 基因编辑技术可对目标基因进行定点编辑，下列相关叙述
错误的是（ ）
A．Cas9 蛋白的作用是切割DNA 分子，属于限制性内切核酸酶
B．该技术需要根据目标基因的序列设计向导RNA
C．基因编辑过程中，细胞可通过DNA 修复机制修复断裂的DNA
D．该技术可用于治疗人类的单基因遗传病，不会产生任何安全风险
【答案】D
【详解】A、Cas9 蛋白可识别切割特定序列的DNA，功能与限制性内切核酸酶一致，A 正确；
B、向导RNA 需要通过碱基互补配对定位目标基因，因此需要根据目标基因的序列设计特异性向导
RNA，B 正确；
C、Cas9 切割使DNA 断裂后，细胞可通过自身的DNA 修复机制修复断裂的DNA，以此完成基因编辑，
C 正确；
D、CRISPR/Cas9 技术仍存在脱靶效应等问题，可能引发基因突变、染色体异常等安全风险，并非不会产
生任何安全风险，D 错误。
2．(2026・湖南长郡二十校联盟・二模）重组人胰岛素是首个通过基因工程实现产业化的医用蛋白，科
研人员以人胰岛素基因为目的基因，利用大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌生产重组胰岛素，其部
分过程如下图。回答下列问题：
限制酶
酶切序列5′→3′
BamHⅠ
G↓GATCC
BglⅡ
A↓GATCT
NheⅠ
G↓CTAGC
SmaⅠ
CCC↓GGG
XmaⅠ
C↓CCGGG
(1)图中过程①中需要从_____细胞中提取RNA，得到的人胰岛素基因中_____（填“含有”或“不含
有”）启动子；过程②需要的酶有_____。
(2)已知胰岛素基因的A 链为编码链，其部分碱基序列为5′-CAGCTT……AAGATCTT……TACGCT-3′。为
了使目的基因与载体正确连接，应该选择限制酶_____切割质粒，扩增目的基因时的PCR 引物是_____。
A．5′-GGCCCGGGCAGCTT-3′ B．5′-GGAGATCT CAGCTT-3′
C．5′-GGGGATCCCAGCTT-3′ D．5′-GGGCTAGCAGCGTA-3′
(3)将质粒导入大肠杆菌后，还需要进行筛选。需要先将大肠杆菌置于含_____的A 培养基中培养，再从A
培养基中选取菌落接种于含_____的B 培养基，能够_____的菌落即为成功导入胰岛素基因的大肠杆菌。
(4)为鉴定导入的人胰岛素基因是否成功表达，可以用_____技术进行检测。
【答案】(1)胰岛B 不含有 限制酶、DNA 连接酶
(2) BglⅡ、NheⅠ（顺序可颠倒） CD（顺序可颠倒）
(3)氨苄青霉素 四环素 在A 培养基中存活而不能在B 培养基中存活
(4)抗原—抗体杂交
【详解】（1）过程①为逆转录法获取目的基因，人胰岛素基因仅在人胰岛B 细胞中选择性表达产生胰岛
素mRNA，因此需要从该细胞提取RNA。启动子是DNA 上调控转录的序列，不会被转录进成熟
mRNA，因此逆转录得到的人胰岛素基因不含有启动子。过程②是构建重组质粒（基因表达载体），需要
限制酶切割目的基因和质粒，再用DNA 连接酶连接二者，因此所需酶为限制酶和DNA 连接酶。
（2）根据题意：目的基因编码链（A 链）5'端起始序列为CAGCTT，序列中含BglⅡ的识别位点
A↓GATCT，3'端末端序列为TACGCT。为了使目的基因与载体正确连接，应该选择限制酶BglⅡ、NheⅠ切
割质粒，SmaⅠ、XmaⅠ的识别序列相同，若选用XmaⅠ，会破怀目的基因；PCR 扩增目的基因时，上游引
物与A 链5'端序列匹配，需要在5'端添加BamHⅠ酶切位点，对应选项C（5′-GGGGATCCCAGCTT-3′ ，
可与BglⅡ切出相同的黏性末端）；下游引物与A 链3'端互补，需要添加NheⅠ酶切位点，对应选项D（5'-
GGGCTAGCAGCGTA-3'，含NheⅠ识别序列+互补的目的基因末端序列）。目的基因两端形成 BglⅡ和
NheⅠ的粘性末端，因此质粒需要选这两种酶切割，保证目的基因正确连接。
（3）由质粒结构可知，BglⅡ和NheⅠ的酶切位点都位于四环素抗性基因（ Tet′）内部，目的基因插入后
四环素抗性基因被破坏失活，而氨苄青霉素抗性基因（ Amp′）保持完整。因此筛选时：先将大肠杆菌放
在含氨苄青霉素的A 培养基培养，存活的都是导入了质粒的大肠杆菌；再将存活的菌落接种到含四环素
的B 培养基，导入重组目的基因的大肠杆菌四环素抗性失活，因此不能生长的菌落就是成功导入目的基
因的工程菌。
（4）鉴定导入的人胰岛素基因是否成功表达出蛋白质产物，核心技术为抗原 — 抗体杂交。利用抗人胰
岛素的特异性抗体，与大肠杆菌提取液进行杂交，若出现杂交带，说明目的基因成功表达。
3．（2026·百师联盟·二模）新疆省是我国核心棉花种植区，转Bt 基因抗虫棉的推广大幅降低了棉铃虫
危害与化学农药使用量，但棉铃虫对Bt 蛋白的抗性进化是制约抗虫棉长效应用的关键问题。科研团队以
新疆主栽棉花品种为材料，结合组织特异性启动子实现Bt 毒蛋白基因（抗虫基因）的精准表达，相关操
作如图，请回答下列问题：
(1)构建重组Ti 质粒时，为保证目的基因完整且定向插入T—DNA 区域，应选用的限制酶是______。
(2)目的基因表达过程中，棉铃组织特异性启动子的作用是______；Ti 质粒中能介导目的基因整合到棉花
细胞染色体DNA 上的核心序列是______。
(3)将含目的基因的棉花愈伤组织培育为完整抗虫棉植株，利用的核心生物技术是______，该技术的理论
基础是______。
(4)为筛选转化成功的棉花细胞，进行愈伤组织培养的培养基中需加入______进行初步筛选。在进行抗虫
活性检测时，科研人员将获得的某株转基因棉花进行自交，统计其子代中抗虫与不抗虫的比例为15∶1，
出现该比例的原因是______。为延缓棉铃虫对Bt 蛋白的抗性进化，可在行间种植一些______棉花等其他
农作物，供棉铃虫取食。
【答案】(1)BamHI、SacI
(2)（作为RNA 聚合酶识别和结合的位点，）驱动Bt 毒蛋白基因仅在棉花棉铃组织中特异性转录（表
达） T—DNA（或可转移DNA）
(3)植物组织培养技术 植物细胞的全能性
(4)氨苄青霉素 在两对同源染色体的各一条染色体上转入了Bt 毒蛋白基因（抗虫基因） 非转基
因（或普通）
【详解】（1）根据题意，用农杆菌转化法构建重组表达载体，结合组织特异性启动子实现Bt 毒蛋白基因
（抗虫基因）的精准表达，因此构建重组Ti 质粒时，为获得携带棉铃组织特异性启动子的Bt 毒蛋白基因，
并使其添加到T—DNA 的区间中，应选择BamHI 和SacI 两种限制酶处理含Bt 毒蛋白基因的DNA 片段和
Ti 质粒的特定位点。
（2）棉铃组织特异性启动子的作用是驱动Bt 毒蛋白基因仅在棉花棉铃组织中特异性转录和表达，避免在
非靶标组织中表达造成资源浪费或生态风险。Ti 质粒上的T—DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细
胞的染色体DNA 上，是农杆菌转化法的核心结构。
（3）将转化后的棉花细胞培育为完整抗虫棉植株，是将已经分化的棉花细胞培育成完整个体的过程，利
用了植物细胞的全能性，所依赖的技术为植物组织培养技术。
（4）由于T—DNA 上具有氨苄青霉素抗性基因，因此转化成功后的棉花细胞的染色体上应具有氨苄青霉
素抗性基因，因此进行愈伤组织培养的培养基中需加入氨苄青霉素进行筛选。子代中抗虫与不抗虫的比
例为15∶1，为9∶3∶3∶1 的变式，说明目的基因转入了两条非同源染色体上，即在两对同源染色体的各一条
染色体上转入了抗虫基因，进而通过自交产生了性状分离比为15∶1 的后代表现。行间种植一些非转基因
（或普通）棉花等其他农作物，供棉铃虫取食，这样可以使没有抗性的害虫有更多生存机会，降低抗性
基因在种群中的扩散速度，达到延缓棉铃虫对Bt 蛋白的抗性进化的目的。
