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专题08 生物技术与工程
3 大考点概览
考点01 发酵工程和微生物培养技术及应用
考点02 细胞工程和胚胎工程
考点03 基因工程及生物技术综合应用
1．（2026·湖南长沙·一模）由单一个体繁殖获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯
培养。下列关于微生物纯培养的叙述错误的是（ ）
A．配制好的培养基应放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌
B．待培养基冷却至50℃时，在酒精灯火焰附近倒平板
C．完成平板划线后，需待菌液被培养基吸收后再放入恒温培养箱中培养
D．使用后的培养基在丢弃前无需进行灭菌处理
【答案】D
【知识点】微生物的培养与菌种保藏
【详解】A、配制好的培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，需放入高压蒸汽灭菌锅中处理，能够彻底杀
灭培养基中的微生物及芽孢、孢子，A 正确；
B、培养基温度过高倒平板易烫伤操作者，温度过低培养基会凝固无法完成倒平板操作，因此待培养基冷
却至50℃左右时，需在酒精灯火焰附近（避免杂菌污染）进行倒平板操作，B 正确；
C、完成平板划线后，待菌液被培养基充分吸收再放入恒温培养箱培养，可避免菌液流动影响单菌落的分
离效果，C 正确；
D、使用后的培养基仍残留有活性微生物，随意丢弃会造成环境污染，甚至可能感染操作者，因此丢弃前
必须进行灭菌处理，D 错误。
2．（2026·湖南·一模）我国传统文化源远流长，其中有许多蕴含着生物学相关知识的语句。下列有关叙述
错误的是（ ）
A．“螟蛉有子，蜾蠃负之”体现了螟蛉与蜾蠃之间存在互利共生关系
B．“霜打蔬菜分外甜”是指为抵御霜冻低温，蔬菜将体内储存的淀粉水解为葡萄糖等可溶性糖，使蔬
考点1
发酵工程和微生物培养技术及应用
菜变甜
C．“七月七日，取水作醋”，古人挑选的这天，是因为农历七月（夏末秋初）北方地区日温约25-
30℃，这正是醋酸菌和酵母菌共同适宜的温度区间
D．“谷连谷，坐着哭”指的是长期连作导致产量下降，原因可能是同种植物连续多年选择性吸收所需
物质，使土壤中谷子生长所必需的某些矿物质元素含量降低
【答案】A
【知识点】糖类的种类及分布、果酒和果醋的制作原理、群落中生物的种间关系、细胞中的无机盐
【详解】A、“螟蛉有子，蜾蠃负之”描述蜾蠃（寄生蜂）捕捉螟蛉（青虫）作为幼虫食物的现象，符合
捕食关系，A 错误；
B、为抵御霜冻低温，蔬菜将体内储存的淀粉水解为葡萄糖等可溶性糖，以降低冰点，防止细胞质结冰受
损，葡萄糖等可溶性糖的增多使蔬菜变甜，B 正确；
C、酵母菌进行酒精发酵的适宜温度为18～30℃，醋酸菌进行醋酸发酵的适宜温度为30～35℃，因此农历
七月（夏末秋初）北方地区日温约25-30℃是醋酸菌和酵母菌共同适宜的温度区间，C 正确；
D、谷子根系发达，吸肥力强，连年种植会大量消耗土壤中的同种营养元素，造成土壤中谷子生长必需的
矿物质元素含量降低，D 正确。
3．（2026·湖南·一模）某同学想从“陈泡菜水”中分离出耐高盐的乳酸菌，经过一段时间培养后得到图
A、B 两种结果（图中黑点表示菌落），下列说法正确的是（ ）
A．配制培养基时需添加维生素，并将pH 调至弱酸性
B．“陈泡菜水”利用图A 所示方法接种前需要稀释多次
C．图B 表示的是平板划线法接种培养后得到的结果
D．图中分离得到的菌落均为乳酸菌
【答案】A
【知识点】微生物的接种方法、培养基的类型及其应用
【详解】A、乳酸菌的最适生长pH 为6.2－6.5，且培养基需添加维生素，A 正确；
B、图A 所示接种方法为平板划线法，接种前不需要对菌液进行稀释，B 错误；
C、图B 表示的是稀释涂布平板法接种培养后得到的结果，C 错误；
D、“陈泡菜水”中乳酸菌数量最多，但还可能存在酵母菌等，D 错误。
4．（2026·湖南益阳·一模）我国科学家通过基因工程改造产甲烷古菌，利用工业废气中的CO2和H2为原
料合成生物可降解塑料PHA（PHA 是微生物在体内合成的高分子物质，用作能量储备），其工艺流程如
下图所示。相关叙述错误的是（ ）
A．改造后的产甲烷古菌的代谢类型是自养厌氧型
B．改造后的产甲烷古菌在接种前需要利用液体培养基扩大培养
C．发酵工程的中心环节是灭菌，尤其是发酵罐必须进行严格灭菌
D．用稀释涂布平板法对产甲烷古菌进行计数，计数的结果往往比实际活菌数少
【答案】C
【知识点】发酵工程的应用、发酵工程的基本环节、其他微生物的分离与计数
【详解】A、改造后的产甲烷古菌可利用工业废气中的CO2和H2为原料合成生物可降解塑料PHA，PHA
是微生物在体内合成的高分子物质，用作能量储备，再结合图可知，代谢类型是自养厌氧型，A 正确；
B、接种前需要扩大培养增加菌体的数量，扩大培养时使用液体培养基，有利于菌体增殖，B 正确；
C、发酵工程的中心环节是发酵罐中的发酵，C 错误；
D、用稀释涂布平板法对产甲烷古菌进行计数，当两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个
菌落，因此计数的结果往往比实际活菌数少，D 正确。
故选C。
5．（2026·湖南邵阳·一模）下列关于实验操作的叙述正确的是（ ）
A．检测豆浆中的蛋白质时，用未加双缩脲试剂的样液作对照
B．调查某土壤小动物种群数量时，打开诱虫器顶部的电灯以驱使土壤小动物向下移动
C．制作果酒和果醋时，当果酒制作完成后，需拧紧瓶盖，促进果醋的发酵
D．稀释土壤样品时，每个梯度稀释时都需更换移液器枪头
【答案】D
【知识点】果酒和果醋的制作原理、微生物的接种方法、群落的物种组成以及丰富度的相关探究实验、检
测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质
【详解】A、检测蛋白质时，双缩脲试剂本身含有碱性环境（NaOH）和铜离子（CuSO4），试剂本身可能
产生颜色干扰，因此对照实验应使用蒸馏水或空白缓冲液，而非未加试剂的样液（样液可能含其他色素），
A 错误；
B、调查土壤小动物种群数量时，利用土壤动物趋暗避光的特性，打开诱虫器顶部电灯可使动物向装置底
部收集瓶移动，但选项描述“向下移动”未明确指向收集器，操作目的表述不严谨，B 错误；
C、果醋发酵的微生物（醋酸杆菌）属于需氧型细菌，需持续通入氧气。拧紧瓶盖会形成无氧环境，抑制
醋酸杆菌发酵，正确操作应为敞开瓶口并通入无菌空气，C 错误；
D、梯度稀释土壤样品时，每次更换移液器枪头可避免交叉污染，确保稀释浓度的准确性，符合微生物实
验的无菌操作原则，D 正确。
故选D。
6．（2026·湖南株洲·一模）细菌素是某些细菌产生的具有抑菌活性的多肽类物质，可代替食品防腐剂使用。
研究人员将乳酸菌置于液体培养基中发酵，取发酵液上清液滴加到长有金黄色葡萄球菌的固体培养基的孔
洞中，测定所形成的抑菌圈直径，结果如下图。下列叙述错误的是（ ）
A．固体培养基孔洞中滴加的上清液体积需保持一致
B．培养约8h 收获细菌素相对节约成本
C．整个培养过程中上清液的抑菌活性与乳酸菌密度呈正相关
D．细菌素进入人体肠道可以被消化酶分解，相对来说，具有一定安全性
【答案】C
【知识点】培养基的类型及其应用、微生物的培养与菌种保藏
【详解】A、为了遵循单一变量原则，固体培养基孔洞中滴加的上清液体积需保持一致，A 正确；
B、培养约8h 抑菌圈直径相对较大并且对应的乳酸菌密度也较大，此时收获细菌素相对节约成本，B 正确；
C、结合图示可知，当液体培养基培养时间大于24h 时，乳酸菌密度基本不变而抑菌活性会减少，C 错误；
D、细菌素是某些细菌产生的具有抑菌活性的多肽类物质，进入人体肠道可以被消化酶分解，安全性较高，
D 正确。
故选C。
7．（25-26 高三上·湖北·月考）在家畜养殖过程中，某些微生物可使家畜粪便中的氨氮化合物转化为尿素
进而产生NH3，影响畜禽健康。为筛选粪便中既能利用氨氮化合物又能减少NH3产生的微生物，学习小组
进行实验获得目的菌株。影印法可确保在一系列平板培养基的相同位置上接种相同菌落。下列说法正确的
是（ ）
A．实验中的粪便样本和培养基都可以用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿一般用干热灭菌
B．用稀释涂布平板法检测①中活菌数时，平板上的一个菌落就是一个细菌
C．②可分别选取平板上的4、6 菌落进行培养用于后续实验
D．学习小组应选择菌株甲添加在粪便中以减少NH3的产生
【答案】C
【知识点】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、无菌技术
【详解】A、粪便样本用来提供目的菌种，不能灭菌，玻璃器皿一般用干热灭菌，A 错误；
B、用稀释涂布平板法检测①中活菌数时，平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，而不
是平板上的一个菌落是一个细菌，B 错误；
C、结合题意，②筛选的应是只能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌株用于后续的实验，应选择4、6，C
正确；
D、由图可知，甲不产生脲酶而乙可以产生脲酶，且乙同时分泌脲酶抑制剂，粪便中可能还含有其他能产
生脲酶的菌株使甲能够产生NH3，所以粪便中添加菌株乙比甲更有利于NH3的减少，D 错误。
故选C。
(不定项) 8．（2026·湖南怀化·一模）色氨酸是某种野生型细菌正常生长繁殖所必需的物质，在细菌内的部
分合成途径如图1 所示，已知3 种酶均不能进出细胞，而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可
分泌到胞外。突变株B、C、E 因仅缺乏酶1～酶3 中的某一种酶而不能合成色氨酸。实验人员分别将三种
突变株划线接种在图2 培养基的Ⅰ～Ⅲ区域，培养短时间内三个区域均有少量细菌生长增殖，继续培养后
发现Ⅰ区域两端和Ⅱ区域一端的菌株继续生长增殖，而Ⅲ区域菌株不再生长（菌株并未死亡）。下列叙述
正确的是（ ）
A．该培养基中含有琼脂和少量色氨酸，pH 为中性或弱碱性
B．突变株B 最可能因缺乏酶2 不能合成色氨酸
C．突变株C 能为突变株B 提供邻氨基苯甲酸
D．Ⅱ区域接近Ⅰ区域一端的菌株能继续生长增殖
【答案】AC
【知识点】基因、蛋白质与性状的关系、培养基的类型及其应用
【详解】A、“培养短时间内三个区域均有少量细菌生长增殖”，推断培养基中存在少量色氨酸，培养细
菌一般将pH 调至中性或弱碱性，A 正确；
BC、已知当图1 所示物质在菌体内积累时，菌体会将部分积累的物质分泌到胞外，因此当菌体缺少某一种
酶时，该酶催化的底物就会在细胞内积累，进而释放到细胞外，释放出来的物质可被相邻的菌体吸收利用，
根据Ⅰ区域两端和Ⅱ区域一端的菌株继续生长增殖，而Ⅲ区域菌株不再生长（菌株并未死亡），可知菌株
C 和菌株E 释放到细胞外的物质可被菌株B 吸收利用，因此可推测突变株B 缺乏酶1 不能合成色氨酸，而
菌株C 缺少酶2 不能合成色氨酸，菌株E 缺少酶3，不能合成色氨酸，因此不再生长。由于突变株C 能为
突变株B 提供邻氨基苯甲酸，突变株E 能为突变株B 提供吲哚，突变株B 能以这两种物质为底物最终合成
色氨酸，因此Ⅰ区域两端的菌株能继续生长增殖，B 错误，C 正确；
D、菌株C 缺少酶2，不能转化形成吲哚，而菌株E 缺少酶3，会使细胞内的吲哚积累后而释放，因此菌株
C 会利用菌株E 释放的吲哚合成色氨酸而表现为生长，由于菌株B 释放出的分支酸不能被菌株C 利用合成
色氨酸，因此Ⅱ区域接近Ⅲ区域一端的菌株能继续生长增殖，D 错误。
故选AC。
(不定项) 9．（2026·湖南岳阳·一模）关于实验“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验，下列叙述正
确的是（ ）
A．该培养基应以尿素作为唯一氮源，与伊红-亚甲蓝培养基的作用原理相同
B．接种时需对接种环进行灼烧灭菌并冷却后，用其蘸取菌液在培养基表面划线
C．每个稀释倍数下，至少要接种3 个选择培养基
D．当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于稀释液中的一个活菌
【答案】CD
【知识点】无菌技术、微生物的接种方法、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【详解】A、该培养基以尿素为唯一氮源，属于选择培养基，可筛选分解尿素的细菌；伊红-亚甲蓝培养基
为鉴别培养基，用于鉴别大肠杆菌，二者作用原理不同，A 错误；
B、本实验采用稀释涂布平板法计数，需用涂布器将菌液均匀涂布于培养基表面，接种环灼烧灭菌适用于
平板划线法分离菌种，B 错误；
C、为减少实验误差，每个稀释度下需至少接种3 个平板（重复组），确保数据可靠性，C 正确；
D、依据稀释涂布平板法原理，当稀释度足够高时，一个单菌落由稀释液中的一个活菌增殖形成，可用于
活菌计数，D 正确。
故选CD。
(不定项) 10．（2026·湖南邵阳·一模）对某菌液进行诱变处理后，欲测定其中发生某营养缺陷型突变的菌
株比例，可采用夹层培养法。具体操作流程如下：（1）向培养皿中倒入一层M.M 培养基，待培养基凝固
后，接种上述诱变处理的菌液；（2）在菌液上方再覆盖一层薄的M.M 培养基，待培养结束后，对首次长
出的菌落进行标记与计数；（3）向培养皿中再倾倒一层C．M 培养基，继续培养后，对新出现的菌落进
行标记与计数，据此计算该菌液中营养缺陷型突变菌株的比例。下列叙述错误的是（ ）
A．上述M.M 是基本培养基，C．M 是选择培养基
B．上述培养基均需添加琼脂，待其完全冷却后进行倒平板操作
C．上述夹层培养法所使用的接种工具为接种环
D．培养基与培养皿均可采用干热灭菌法进行灭菌
【答案】BCD
【知识点】微生物的接种方法、培养基的类型及其应用
【详解】A、夹层培养法中，M.M（基本培养基） 含全面营养，营养缺陷型菌株可在其上生长；C.M（选
择培养基），营养缺陷型菌株无法在其上生长 ，A 正确；
B、培养基添加琼脂是为了使其凝固，但倒平板操作需在培养基冷却至50℃左右时进行（若完全冷却，培
养基会凝固，无法顺利倒平板），B 错误；
C、夹层培养法的接种方式是稀释涂布平板法（需将菌液均匀分散在培养基表面），对应的接种工具是涂
布器；而接种环是用于“平板划线法” 的工具，C 错误；
D、培养基含有水分，常用高压蒸汽灭菌法灭菌（干热灭菌法适用于玻璃器皿、金属工具等干燥物品，不
适用于含水分的培养基）；培养皿可采用干热灭菌，但培养基不能用干热灭菌，D 错误。
故选BCD。
考点2
细胞工程和胚胎工程
11．（2026·湖南邵阳·一模）细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动
植物细胞工程的叙述，正确的是（ ）
A．用离心法诱导植物细胞融合后，在液体培养基中加入激素，诱导愈伤组织形成
B．采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚
C．动物细胞在悬浮培养出现接触抑制后，需分瓶后进行传代培养
D．利用组织培养技术培养红豆杉细胞，可获得有药用价值的初生代谢物紫杉醇
【答案】B
【知识点】植物组织培养技术综合、植物细胞工程的实际应用、动物细胞培养技术
【详解】A、植物细胞融合需用物理法（如电激）或化学法（如聚乙二醇）诱导，离心法通常用于动物细
胞融合；融合后需在固体培养基中添加植物激素（如生长素和细胞分裂素）诱导形成愈伤组织，而非液体
培养基，A 错误；
B、胚胎分割属于无性繁殖（克隆），需选择发育良好、形态正常的桑葚胚（全能性细胞）或囊胚（含内
细胞团），分割后移植可获得遗传性状相同的后代，B 正确；
C、接触抑制是贴壁生长的动物细胞在铺满瓶壁后停止增殖的现象，此时需用胰蛋白酶处理并分瓶进行传
代培养；但悬浮培养的细胞（如杂交瘤细胞）不贴壁，无接触抑制，C 错误；
D、紫杉醇是红豆杉产生的次生代谢产物（具有药用价值），而初生代谢物是维持细胞基本生命活动的产
物（如糖类、氨基酸）。植物组织培养技术可工厂化生产次生代谢物，但紫杉醇不属于初生代谢物，D 错
误。
故选B。
12．（2026·湖南岳阳·一模）野生稻有抗稻飞虱和抗条纹叶特性，且这两种抗性相关系数高达99%以上，
采用野生稻（2n）和栽培稻（2n）体细胞杂交获得杂交后代，可实现野生稻遗传物质向栽培稻的定向转移。
下列叙述正确的是（ ）
A．野生稻的抗稻飞虱基因与抗条纹叶基因位于非同源染色体上
B．可借助灭活病毒诱导法实现两种水稻的原生质体融合
C．上述方法获得的杂交后代可育，说明野生稻和栽培稻之间不存在生殖隔离
D．选择体细胞中染色体数为4n 的杂种植株培育出的栽培稻不一定抗稻飞虱
【答案】D
【知识点】染色体数目的变异、隔离与物种的形成、植物体细胞杂交技术
【详解】A、题干指出两种抗性相关系数高达99%以上，说明抗稻飞虱基因与抗条纹叶基因可能位于同一
条染色体上（紧密连锁），而非非同源染色体。若位于非同源染色体上，两基因可能自由组合，相关系数
不会如此高，A 错误；
B、灭活病毒诱导法是动物细胞融合的常用方法，植物原生质体融合需采用物理法（如电刺激）或化学法
（如聚乙二醇诱导），B 错误；
C、体细胞杂交属于无性繁殖，后代可育仅说明杂交细胞染色体组加倍后能联会配对，不能证明野生稻与
栽培稻有性杂交时可育（即不存在生殖隔离）。生殖隔离特指有性生殖过程中的不亲和性，体细胞杂交不
能作为判断依据，C 错误；
D、体细胞杂交获得的杂种植株染色体数为4n（双亲各提供2n），但染色体组加倍后可能发生部分染色体
丢失或基因沉默，导致抗性基因未表达。此外，抗性可能受多基因控制或环境因素影响，因此培育出的栽
培稻不一定表现抗稻飞虱性状，D 正确。
故选D。
13．（2026·湖南益阳·一模）中国科学家团队利用优化的3D 悬浮系统，成功地将胚胎干细胞衍生的猴胚胎
体外培养到第25 天，实现了原肠胚形成后期发育过程的体外完整模拟。下列叙述正确的是（ ）
A．从胚胎干细胞到原肠胚后期发育过程，体现了干细胞的全能性
B．胚胎干细胞是一类未分化的细胞，可以从早期胚胎中分离
C．在动物干细胞培养中通常需要添加血清，并置于95%O2和5%的CO2条件下培养
D．原肠胚后期发育过程的体外模拟依赖于体外受精技术和早期胚胎的体外培养技术
【答案】B
【知识点】动物细胞培养技术、干细胞工程
【详解】A、干细胞的全能性是指其发育成完整个体的潜能，而题干中胚胎干细胞仅发育至原肠胚后期
（已出现细胞分化），未形成完整个体，故未体现全能性，A 错误；
B、胚胎干细胞（ES 细胞）是一类未分化的多能干细胞，可从囊胚期的内细胞团或原始生殖细胞中分离获
得，B 正确；
C、动物细胞培养的气体环境通常为95%空气和5%的CO2，C 错误；
D、题干明确使用"胚胎干细胞衍生的猴胚胎"，说明胚胎来源于干细胞分化而非受精卵，因此不依赖体外
受精技术，D 错误。
故选B。
14．（2026·湖南株洲·一模）制备单克隆抗体时，需经两次筛选才能获得产特定抗体的杂交瘤细胞。下列
关于该过程的叙述正确的是（ ）
A．第一次筛选利用选择培养基，目的是去除未融合的B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞
B．第二次筛选利用抗原-抗体杂交原理，需要先对待筛选的样本进行克隆化培养
C．向小鼠注射特定的抗原后，从小鼠的骨髓提取所需的B 淋巴细胞
D．杂交瘤细胞体外培养时需通入95%的空气和5%的CO2，目的是促进其呼吸作用
【答案】B
【知识点】动物细胞培养技术、动物细胞融合与单克隆抗体的制备
【详解】A、第一次筛选使用选择培养基，目的是去除未融合的细胞（包括未融合的B 淋巴细胞、未融合
的骨髓瘤细胞）以及同种细胞融合的细胞（B 淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞），
而不是仅去除未融合的B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞，A 错误；
B、第二次筛选利用抗原-抗体杂交原理，目的是筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。由于经过第一次筛
选得到的杂交瘤细胞可能有多种，所以需要先进行克隆化培养，使每一个杂交瘤细胞单独培养并增殖，然
后再通过抗原-抗体杂交检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，B 正确；
C、向小鼠注射特定的抗原后，小鼠会产生免疫反应，此时应从小鼠的脾脏中提取所需的B 淋巴细胞，而
不是骨髓，C 错误；
D、杂交瘤细胞体外培养时通入95%的空气和5%的CO2，95%的空气是为细胞呼吸提供氧气，5%的CO2是
为了维持培养液的pH，不是促进其呼吸作用，D 错误。
故选B。
15．（2026·湖南株洲·一模）下列关于植物组织培养技术实验操作与原理的叙述，错误的是（ ）
A．外植体脱分化后，细胞会失去原有的特异性结构
B．再分化时，适当提高培养基中细胞分裂素的比例有利于诱导生芽
C．选取植株茎尖进行培养可获得脱毒苗，这利用了茎尖细胞抗病毒能力强的特点
D．花药离体培养获得完整植株的过程，体现了植物生殖细胞具有全能性
【答案】C
【知识点】植物组织培养技术综合、植物细胞工程的实际应用、植物组织的培养及基本过程
【详解】A、外植体脱分化是指已分化的细胞失去特有结构和功能，形成未分化的愈伤组织过程，该过程
细胞会失去原有特异性结构，A 正确；
B、再分化阶段，细胞分裂素与生长素的比例调控器官分化，提高细胞分裂素比例可促进芽的分化，B 正
确；
C、茎尖分生组织病毒含量低是因分生细胞分裂旺盛且维管束未成熟，病毒难以侵入，并非茎尖细胞具有
抗病毒能力，C 错误；
D、花药离体培养利用花粉（雄配子）发育成完整植株，证明生殖细胞具有全能性，D 正确。
故选C。
16．（2026·湖南长沙·一模）杜泊羊以其生长速度快、肉质好等优点，成为受广大消费者喜欢的绵羊品种。
科研工作者通过胚胎工程快速繁殖杜泊羊的流程如下图所示，相关叙述错误的是（ ）
A．为了获得较多的卵母细胞，可以对雌性杜泊羊进行超数排卵处理
B．要对采集到的卵母细胞进行成熟培养后，再与经过获能处理的精子进行共同培养
C．当地普通绵羊对移植的胚胎不会发生免疫排斥反应
D．在进行胚胎移植前，可取其内细胞团细胞做性别鉴定和遗传病筛查
【答案】D
【知识点】动物的体外受精、胚胎的体外培养、胚胎移植技术
【详解】A、为获得更多卵母细胞，可使用促性腺激素对雌性供体杜泊羊做超数排卵处理，A 正确；
B、采集到的卵母细胞未发育成熟，需要培养至减数第二次分裂中期才具备受精能力，同时精子需要经过
获能处理，之后才能共同培养完成体外受精，B 正确；
C、胚胎移植的生理学基础表明，受体子宫对外来移植的胚胎基本不会发生免疫排斥反应，C 正确；
D、胚胎移植前做性别鉴定、遗传病筛查时，应取滋养层细胞进行检测；内细胞团将来发育为胎儿的各类
组织，取内细胞团会损伤早期胚胎，影响后续发育，D 错误。
(不定项) 17．（2026·湖南·一模）我国科学家首次利用化学重编程多能干细胞（CiPSCs）分化而来的胰岛
细胞自体移植到一名糖尿病（T1DM）患者体内，患者在移植后75 天开始不再需要外源胰岛素治疗。具体
流程如图所示。下列分析正确的是（ ）
A．从患者体内抽取的脂肪组织，在制备成单个细胞时可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
B．脂肪细胞和CiPSCs 的培养都需要在CO2培养箱中进行
C．人的CiPSCs 转化为胰岛细胞的过程，类似于植物组织培养中的脱分化
D．该成果不仅治愈了患者的2 型糖尿病，还解决了免疫排斥问题
【答案】AB
【知识点】细胞的分化、血糖调节、植物组织培养技术综合、动物细胞培养技术
【详解】A、脂肪组织要经过胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，才能分散成单个细胞，A 正确；
B、动物细胞的培养均需在CO2培养箱中进行，以维持培养液的pH，B 正确；
C、CiPSCs 是分化程度低的多能干细胞，转化为胰岛细胞是细胞分化（形成功能特异的分化细胞），类似
于植物组织培养中的再分化，C 错误；
D、该成果解决的是患者胰岛B 细胞受损导致胰岛素缺乏的问题，属于1 型糖尿病，D 错误。
18．（2026·湖南株洲·一模）长期咀嚼槟榔会导致口腔黏膜纤维化（OSF）。槟榔碱能引发巨噬细胞参与
的口腔黏膜下炎症反应。
(1)槟榔碱具有驱虫作用，是一种_________（填“初级”或“次级”）代谢产物。
(2)槟榔碱能促进大脑释放多巴胺等兴奋性递质，同时对降解神经递质的相关酶起到_________（填“增
强”或“抑制”）作用，进一步放大兴奋效应。推测，长期咀嚼槟榔会导致中枢神经系统中突触后膜的多
巴胺受体_________（填“增多”或“减少”），进而导致成瘾。
(3)为确定槟榔碱引发OSF 的具体机制，研究人员以单核巨噬细胞（THP）和黏膜成纤维细胞（HOMF）为
材料进行了一系列实验，各组的处理和结果如下表所示。
组别
处理
α-SMA 蛋白
相对表达量
Ⅰ型胶原蛋
白相对表达
量
第一组
不处理
1.04
1.18
第二组
培养基中添加适量槟榔碱
1.05
1.20
第三组
？
1.98
3.11
第四组
HOMF 与槟榔碱刺激24h 的THP 混
合培养
3.1
5.8
注：各组的HOMF 量一致；α-SMA 蛋白和Ⅰ型胶原蛋白含量显著上升是细胞纤维化的重要标志
表中第三组实验的处理是_________。根据以上表中系列实验结果，可以得出的结论是_________。
(4)研究人员根据现有资料推测，巨噬细胞可能通过释放携带miR-155-5P 的外泌体，引发OSF。为此，以
HOMF 为材料重新设计了四组实验。A 组不作处理，B 组培养基中添加槟榔碱刺激THP24 小时后释放的外
泌体，C 组miR-155-5P 过量表达，D 组转染miR-155-5P 抑制剂同时在培养基中添加槟榔碱刺激THP24 小
时后释放的外泌体。
研究人员设计D 组的目的是______。为使实验更加严谨，还需检测槟榔碱刺激前后THP 释放的外泌体内
____的水平。
(5)综合上述实验，长期咀嚼槟榔易引发OSF 的原因是______。
【答案】(1)次级
(2)抑制 减少
(3) HOMF 与未经槟榔碱刺激的THP 混合培养 THP 能促进HOMF 纤维化，槟榔碱能显著增强THP 对
HOMF 纤维化的促进作用
(4)验证外泌体中miR-155-5P 是诱导纤维化的关键分子 miR-155-5P
(5)槟榔中含有大量的槟榔碱，能促进巨噬细胞释放携带miR-155-5P 的外泌体，从而使HOMF 纤维化，进
而引发口腔黏膜纤维化
【知识点】细胞癌变的原因及防治、植物细胞工程的实际应用、验证性实验与探究性实验、药物对兴奋传
导及传递的影响
【分析】由表可知，该实验的自变量是是否用槟榔碱刺激细胞，结合第二、四组可判断，第三组为HOMF
与未经槟榔碱刺激的THP 混合培养，表中各组均含α-SMA 蛋白和Ⅰ型胶原蛋白，添加槟榔碱后，α-SMA
蛋白和Ⅰ型胶原蛋白含量进一步提升。
【详解】（1）槟榔碱是不是槟榔细胞必需的代谢产物，属于次级代谢产物。
（2）槟榔碱能促进大脑释放多巴胺等兴奋性递质，同时对降解神经递质的相关酶起到抑制作用，从而使
得突触间隙长时间含有大量多巴胺等兴奋性递质，进一步放大兴奋效应。长期咀嚼槟榔会导致中枢神经系
统中突触后膜的多巴胺受体减少，为了保证神经系统的兴奋性，进而导致成瘾。
（3）由表可知，该实验的自变量是是否用槟榔碱刺激细胞，结合第二、四组可判断，第三组为HOMF 与
未经槟榔碱刺激的THP 混合培养，表中各组均含α-SMA 蛋白和Ⅰ型胶原蛋白，添加槟榔碱后，α-SMA 蛋
白和Ⅰ型胶原蛋白含量进一步提升，说明THP 能促进HOMF 纤维化，槟榔碱能显著增强THP 对HOMF 纤
维化的促进作用。
（4）B、C 两组对比可知，设置D 组是为了验证外泌体中miR-155-5P 是诱导纤维化的关键分子。为使实
验更加严谨，还需检测槟榔碱刺激前后THP 释放的外泌体内miR-155-5P 的水平，从而验证槟榔碱是通过
调节miR-155-5P 的表达量导致OSF 的。
（5）综上，由于槟榔中含有大量的槟榔碱，其可调控miR-155-5P 的表达量，促进巨噬细胞释放携带
miR-155-5P 的外泌体，从而使HOMF 纤维化，进而引发口腔黏膜纤维化。
考点3
基因工程及生物技术综合应用
19．（2026·湖南长沙·一模）下列关于中学生物学实验的叙述，错误的是（ ）
A．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用实验中，检测试剂可选用斐林试剂
B．尝试利用乙烯利催熟水果实验中，当溶液pH<3.5 时，它会分解释放出乙烯
C．DNA 的粗提取与鉴定实验中的提取过程可以不使用离心机
D．观察叶绿体和细胞质的流动实验过程均需保持细胞活性
【答案】B
【知识点】观察叶绿体、线粒体和细胞质流动实验、酶促反应的因素及实验、植物生长调节剂及应用、
DNA 的粗提取及鉴定
【详解】A、淀粉酶可水解淀粉产生还原糖（麦芽糖），但不能水解蔗糖，斐林试剂可与还原糖在水浴加
热条件下产生砖红色沉淀，能检测两种底物的水解情况，A 正确；
B、乙烯利在pH<3.5 的水溶液中性质稳定，当pH 升高时才会分解释放乙烯，选项表述错误，B 错误；
C、DNA 粗提取与鉴定实验中，若无离心机，可将细胞破碎后的混合液静置，取上层清液即可开展后续提
取步骤，因此提取过程可以不使用离心机，C 正确；
D、只有活细胞的细胞质才具有流动性，且叶绿体结构保持完整，因此两个实验均需保持细胞活性，D 正
确。
20．（2026·湖南·一模）生物学很多实验用到了酒精。下列有关实验中对酒精的叙述，正确的是（ ）
A．在绿叶中色素的提取和分离的实验中，要用到体积分数为50%的酒精，作用是洗去浮色
B．在低温诱导植物细胞染色体数目变化的实验中，体积分数为95%的酒精的作用只是和盐酸配成解离
液，对分生区细胞解离
C．在研究土壤中小动物类群的丰富度的实验中，采集的小动物必须放入体积分数为70%的酒精中，才
能再观察和分类
D．在DNA 的粗提取与鉴定的实验中，要用到体积分数为95%的冷酒精，作用是析出DNA，将DNA
与一些蛋白质分离
【答案】D
【知识点】绿叶中色素的提取和分离实验、低温诱导植物染色体数目的变化实验、群落的物种组成以及丰
富度的相关探究实验、DNA 的粗提取及鉴定
【详解】A、绿叶中色素的提取和分离实验中，使用无水乙醇（或95%酒精加无水碳酸钠除水）提取色素，
作用是溶解光合色素；体积分数50%的酒精洗去浮色是脂肪检测实验的操作，A 错误；
B、低温诱导植物细胞染色体数目变化的实验中，95%的酒精除了和盐酸配制成解离液解离分生区细胞外，
还可用于冲洗经卡诺氏液固定后的根尖，B 错误；
C、研究土壤中小动物类群丰富度时，70%的酒精可对小动物起到固定、防腐的作用，适合长期保存后分
类观察，但若进行活体临时观察，可将小动物置于湿润棉花上，并非必须放入酒精中，C 错误；
D、DNA 不溶于酒精，而部分蛋白质杂质可溶于酒精，DNA 粗提取与鉴定实验中使用95%的冷酒精可以
析出DNA，实现DNA 与部分蛋白质的分离，D 正确。
21．（2026·湖南怀化·一模）进行生物实验时，正确选择实验材料是得出正确结论的前提。下列实验所选
材料最合适的是（ ）
A．选用鸡血细胞，进行DNA 的粗提取与鉴定
B．选用甘蔗，检测生物组织中的还原糖
C．选用月季的叶肉细胞，观察细胞的有丝分裂
D．选取新鲜菠菜叶的下表皮细胞，观察叶绿体的形态和分布
【答案】A
【知识点】检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质、观察叶绿体、线粒体和细胞质流动实验、有丝分裂实
验、DNA 的粗提取及鉴定
【详解】A、鸡血细胞含有细胞核，DNA 含量丰富，且细胞易吸水涨破释放内容物，是DNA 粗提取与鉴
定实验的合适材料，A 正确；
B、斐林试剂可用于鉴定还原糖，而甘蔗富含的蔗糖属于非还原糖，无法与斐林试剂发生砖红色反应，B
错误；
C、月季叶肉细胞是高度分化的成熟细胞，已丧失分裂能力，无法观察到有丝分裂各时期的特征，观察有
丝分裂应选择分裂旺盛的根尖分生区等材料，C 错误；
D、菠菜叶的下表皮细胞不含叶绿体，观察叶绿体的形态和分布需选取稍带叶肉细胞的菠菜叶下表皮，D
错误。
故选A。
(不定项) 22．（2026·湖南岳阳·一模）酶对细胞代谢起着非常重要的作用，可以降低化学反应的活化能。
下列叙述正确的是（ ）
A．DNA 聚合酶与限制酶作用的化学键相同
B．有氧呼吸三个阶段所需要的酶种类相同
C．淀粉分支酶异常导致圆粒豌豆的形成
D．在酶参与的生命活动中，酶只起催化作用
【答案】AD
【知识点】酶的作用及机理、有氧呼吸过程、基因、蛋白质与性状的关系、DNA 重组技术的基本工具
【详解】A、DNA 聚合酶催化脱氧核苷酸间形成磷酸二酯键（合成DNA），限制酶水解磷酸二酯键（切
割DNA），二者作用的化学键相同但作用方向相反，A 正确；
B、有氧呼吸第一阶段在细胞质基质进行（需多种酶催化），第二阶段在线粒体基质（需三羧酸循环相关
酶），第三阶段在线粒体内膜（需电子传递链酶系），各阶段酶种类不同，B 错误；
C、圆粒豌豆因淀粉分支酶正常合成支链淀粉（吸水膨胀），皱粒豌豆因该酶异常导致直链淀粉积累，吸
水量少，因而表现皱缩，C 错误；
D、在酶参与的生命活动中，酶只起催化作用，通过降低化学反应活化能实现，D 正确。
故选AD。
(不定项) 23．（2026·湖南岳阳·一模）植物细胞常用RNA 沉默机制来防御外源基因干扰，几乎所有植物
病毒均能编码RNA 沉默抑制子来抵抗寄主的这种防御反应。基因CYP76AD、DODA1 是甜菜苷（呈红
色）生物合成的必需基因，研究人员用农杆菌转化法将多基因表达盒（如图所示）成功转入烟草，结果显
示只有注射菌液的位置变红而未注射菌液位置并未变红。下列叙述错误的是（ ）
A．一个DNA 分子上有多个基因串联时，均以同一条链作为转录的模板
B．植物通过阻碍RNA 聚合酶与启动子识别与结合来实现RNA 沉默
C．基因P19 的存在有利于加强植物对外源基因的防御反应
D．甜菜苷只在农杆菌侵染的部位合成，在植物体内不会转运
【答案】ABC
【知识点】遗传信息的转录、遗传信息的翻译、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
【详解】A、一个DNA 分子上串联的多个基因，转录时并不一定以同一条链作为模板，不同基因的模板链
可能不同，A 错误；
B、RNA 沉默机制通常是通过降解mRNA 或抑制翻译来实现的，而不是阻碍RNA 聚合酶与启动子的识别
与结合，B 错误；
C、P19 蛋白是RNA 沉默抑制子，它的作用是抵抗宿主的RNA 沉默防御反应，也就是削弱植物对外源基
因的防御反应，而非加强，C 错误；
D、只有注射菌液的位置变红而未注射菌液位置并未变红，这表明甜菜苷只在农杆菌侵染的部位合成，在
植物体内不会转运，D 正确。
故选ABC。
(不定项) 24．（2026·湖南怀化·一模）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，控制该相对性
状的基因为A/a。为研究控制该性状的基因，研究人员将一个紧凑株型的植株与纯合松散株型植株杂交，
均为松散株型，
中松散株型：紧凑株型=3 1∶。研究得知，a 基因由A 基因内部插入一段序列而来（图
1），研究人员设计了3 条引物（P1～P3），位置如图1（→表示引物5′→3′方向）。以3 个
单株（甲、
乙、丙）的DNA 为模板，使用不同引物组合进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A 和2-B
（图2-B 中乙、丙电泳条带未标出）。不考虑PCR 结果异常，下列说法正确的是（ ）
A．若a 基因表达的肽链比A 基因表达的肽链短，原因是插入导致转录提前终止
B．图2-A 中的条带代表a，丙单株无扩增条带的原因是其基因型为AA
C．图2-B 使用的引物组合是P1、P2，乙、丙植株对应的条带均有两条
D．使用图2-A 中的引物组合扩增
全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型=2 1∶
【答案】BD
【知识点】基因分离定律的实质和应用、遗传信息的翻译、基因突变、PCR 扩增的原理与过程
【详解】A、在A 基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a 基因（图1），a 基因表达的肽链比A 基因
表达的肽链短，应是终止密码子提前出现，a 基因转录产生的mRNA 提前终止翻译，A 错误；
B、根据图示可知，A 和a 基因上均含有P1 和P2 引物互补的序列，而P3 引物识别的序列只有a 基因中才
存在，即图2-A 中使用的引物组合是P2 和P3，丙的基因型为AA，B 正确；
C、图2-B 是利用引物P1 和P2 扩增的产物电泳的结果，由于a 基因扩增出来的产物长度大于A 基因扩增
的产物，因此AA（松散株型）、aa（紧凑株型）基因的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带，Aa（松
散株型）的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带。所以乙和丙都只有一条带，C 错误；
D、使用图2-A 中的引物组合（P3 和P2）扩增
全部样本，由于只有含a 基因的个体才能扩增出相应产物，
且A 为松散株型，而子二代中Aa AA=2 1
∶
∶，所以使用图2-A 中的引物组合扩增
全部样本，有扩增条带松
散株型（Aa）：无扩增条带松散株型（AA）=2 1∶，D 正确。
故选BD。
25．（2026·湖南长沙·一模）蚊子传播疟疾等疾病，每年影响全球超20 亿人。传统化学杀虫剂因蚊虫产生
广泛抗性而效果下降，急需开发新型环保防控手段。昆虫病原真菌对蚊虫致病力强，对环境较安全，但自
然传播效率低。为此，科研人员通过在昆虫病原真菌中表达长叶烯基因（L）以吸引蚊虫，构建了传播能
力更强的基因工程菌。请回答下列问题：
限制酶
识别序列和酶切位点
BglⅡ
A↓GATCT
EcoRⅠ
G↓AATTC
BamHⅠ
G↓GATCC
HindⅢ
A↓AGCTT
URA3：真菌筛选标记基因，缺失该基因真菌无法合成尿嘧啶
Ampr：大肠杆菌的筛选标记基因编码氨苄青霉素抗性基因
(1)L 基因可通过人工合成获取，也可以通过________（写出两种方法）获取。
(2)构建重组DNA 分子时，图中质粒还缺少的必备元件是________。为使基因L 能正确连接到图中质粒，
应选用限制酶________来处理质粒。
(3)培育基因工程菌的关键步骤是构建长叶烯基因表达载体，其目的是________（答两点）。将长叶烯基因
表达载体导入野生真菌中后，应在________的培养基上筛选工程菌。通过PCR 鉴定是否成功导入目的基因
时，若模板DNA 分子上两个引物结合区之间有一个与引物识别序列高度相似的序列，则电泳结果除目的
基因所在条带外，还出现一个与加样孔距离更________（填“远”或“近”）的条带。
(4)利用真菌消灭蚊虫属于________防治。为进一步提升工程菌的防控效果，科学家准备将继续改造真菌使
其能定殖于蚊虫滋生地（如水体边缘），持续释放吸引物质。请分析其可能带来的潜在风险：________
（答1 点）。
【答案】(1)构建基因文库、PCR
(2)复制原点 BamHⅠ、EcoRⅠ
(3)让长叶烯基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；使长叶烯基因能够表达和发挥作用 缺少
尿嘧啶 远
(4)生物 基因工程菌在环境中持续存活和扩散，可能对局部生态系统产生未知影响；存在基因向环境
中其他微生物发生水平转移的潜在风险，造成基因污染
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、基因工程在农牧业、
制药及环境等方面的应用
【详解】（1）基因工程菌是指用基因工程方法，使外源基因得到高效表达的菌类；L 基因可通过人工合成，
也可以通过构建基因文库、利用PCR 扩增获取。
（2）构建重组DNA 分子时，质粒有启动子、终止子，质粒还缺少的必备元件是复制原点；
由于模板链两端具有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点，而BglⅡ会切掉启动子，因此选择与BglⅡ具有相同酶切末端
的BamHⅠ，质粒上具有BamHⅠ和EcoRⅠ，选择限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ，基因L 能正确连接，因此应选用限
制酶BamHⅠ和EcoRⅠ处理质粒。
（3） 获得转基因真菌的关键步骤是构建长叶烯基因表达载体，目的主要有两点： 使长叶烯基因在受体
细胞中稳定存在，并遗传给下一代； 使长叶烯基因能够表达和发挥作用。
由于质粒上含有URA3，是真菌筛选标记基因，缺失该基因真菌无法合成尿嘧啶，因此转入该质粒的真菌
能合成尿嘧啶，因此应在缺少尿嘧啶的培养基上筛选；
通过PCR 鉴定是否成功导入目的基因时，若模板DNA 分子上两个引物结合区之间有一个与引物识别序列
高度相似的序列，则可能有部分引物与该高度相似的序列结合，扩增出比模板DNA 更短的一系列DNA 分
子，则电泳结果除目的基因所在条带外，还出现一个与加样孔距离更远的条带。
（4） 生物防治包括利用生物之间的种间关系达到防治的目的，因此利用真菌消灭蚊虫属于生物防治；该
方法可能带来的潜在风险：基因工程菌在环境中持续存活和扩散，可能对局部生态系统产生未知影响；存
在基因向环境中其他微生物发生水平转移的潜在风险，造成基因污染。
26．（2026·湖南·一模）水稻基因OsPRX 编码的过氧化物酶在干旱胁迫下会加剧活性氧积累，导致细胞损
伤。某科研团队利用CRISPR/Cas12a 技术敲除OsPRX 基因中的部分片段，以增强水稻的抗旱性。
CRISPR/Cas12a 系统由crRNA 与Cas12a 蛋白组成，利用crRNA 介导Cas12a 蛋白能准确切割目标DNA。
该系统的作用机理如图甲所示。Cas12a 蛋白需要识别PAM(5'-TTTN-3'，N 表示任意碱基）才能切割目标
DNA，为此，科研人员在OsPRX 基因中选定一段靶序列：5'-AGCTTGGCCTGAACTTTAAGCG-3'（仅显
示一条链）。请分析回答下列问题：
注：PAM 可以帮助Cas12a 识别和切割目标DNA 序列；“x”表示在相应位置剪切DNA
(1)该靶序列中，PAM 序列最可能位于该条链的____（填“左端”或“右端”），其碱基序列为____。根
据该靶序列设计的crRNA，其碱基序列为____（填10 个碱基序列）。
(2)将编码Cas12a 蛋白的基因和crRNA 编码序列构建到同一个植物表达载体中，且利用潮霉素抗性基因
（Hpt）作为筛选标记。为了达到最好的基因编辑效果，图乙中U6 启动子应该属于__________（填“组成
型”或“诱导型”）。
（说明：诱导型启动子，通常在光、盐等信号的作用下，使目的基因的转录水平有所提高；组成型启动子，
驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达）
(3)为提取野生型（WT）和转化植株（1~4 号）的基因组DNA，设计一对引物扩增OsPRX 基因中包含靶位
点的片段，已知野生型扩增片段长度为500bp。如果植株转化成功，则发生了基因敲除，OsPRX 基因长度
将变短，形成了500bp 突变体植株。扩增片段电泳结果如图丙所示：
①在扩增OsPRX 基因的过程中，需要设计一对合适的引物，已知其中的一个引物序列为5'-
GCATCCACTTAGCG-3'，能否确定另一个引物的序列？____（填“能”或“不能”），理由是____。根据
电泳结果，推测植株____（填编号）为OsPRX 基因纯合突变体，判断依据是____。
②该团队培育的抗旱水稻若要进行商业化种植，从生物安全角度考虑，你认为需要重点关注的问题有哪些？
____（答出1 点即可）。
【答案】(1)右端 5′－TTTA－3′ 5′－CGCUUAAAGU－3′
(2)组成型
(3)不能 由于两段引物的碱基序列没有相关性(既不相同，也不互补)，因此不能依据已知的引物Ⅰ序列
设计出另一段引物Ⅱ的序列 2 号和4 号 PCR 产物只有300bp 条带，说明两条染色体上的OsPRX
基因均被编辑（缺失相同片段） 需要重点监测是否产生过敏原或毒性物质；同时需要评估转基因是
否会漂移至野生近缘种，引起基因污染等问题、是否符合法规等
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、转基因生物安全性、基因编辑技术
【详解】（1）题目信息指出，Cas12a 蛋白需要识别PAM（5'-TTTN-3'）才能切割目标DNA。在给定的靶
序列5'-AGCTTGGCCTGAACTTTAAGCG-3'中，可以在序列的右侧找到一个5'-TTTA-3'序列，这符合PAM
序列的特征，故PAM 序列最可能位于该链的右端。有甲图可知crRNA 与靶序列的互补链进行配对，所以
根据靶序列的顺序可以推测出前10 个碱基为5'-CGCUUAAAGU-3'。
（2）根据题意，U6 启动子应该要在所有细胞中得以表达，协助CRISPR/Cas12a 系统敲除OsPRX 基因。
组成型启动子可驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达，而诱导型启动子仅在特定信号下激活，无
法满足持续编辑的需求，因此选择组成型启动子。
（3）①PCR 的一对引物分别结合模板DNA 的两条链，序列无相关性、不互补，因此仅已知一个引物序列，
无法确定另一个引物的序列。野生型（WT）扩增片段为500bp，若为纯合突变体，两条染色体上的
OsPRX 基因均被敲除，仅能扩增出300bp 的突变体片段；若为杂合突变体，会同时出现500bp（野生型）
和300bp（突变型）两条带。电泳图中2 号和4 号仅出现300bp 条带，因此为纯合突变体。
②转基因作物商业化种植的生物安全核心关注点包括：食品安全（是否产生过敏原、毒性物质，营养成分
是否改变）、生态安全（外源基因是否漂移至野生近缘种，造成基因污染，是否影响非靶标生物、破坏生
物多样性）、 合规性（是否符合国家转基因安全法律法规）。
27．（2026·湖南怀化·一模）噬菌体侵染细菌时会发生如图1 所示的重组反应。科学家基于此过程开发了
新型分子克隆技术，以快速构建基因表达载体，该克隆技术依赖于BP 反应和LR 反应，通过BP 反应将目
的基因连接到质粒1 上，获得克隆质粒2，再通过LR 反应将目的基因连接到载体质粒3 上，获得表达载体，
具体流程如图2 所示。请回答下列问题。
(1)为构建基因表达载体，除含有图示的目的基因和标记基因外，还必须有____。（写出至少两个）
(2)BP 反应中，attB 位点与attP 位点间的片段会发生交换，反应后的体系中可能含有未交换的质粒1 和交换
后的质粒2，因此需将反应体系转入对ccdB 基因的表达产物____（填“敏感”或“不敏感”）的大肠杆菌，
并添加卡那霉素以获得质粒2。LR 反应中则发生attL 位点与attR 位点间的片段交换，继续将LR 反应混合
体系导入大肠杆菌，并接种到添加____的固体培养基上，在平板上长出菌落的大肠杆菌中所含质粒即为质
粒4。
(3)科学家为研究A 基因的表达产物蛋白质A 在细胞内的定位，拟利用上述技术构建含有A-GFP 融合基因
的载体（GFP 为绿色荧光蛋白基因）。请在图3 所示的流程中填入合适的位点：①____；②attL2；
③attR3。为了使融合蛋白顺利表达，对A 基因的末端可能需要去除其编码____的序列。
(4)获得的质粒2 具有广泛的应用价值。若研究人员希望将A 基因转入哺乳动物细胞中进行高效表达，只需
利用质粒2 与含有____（填“大肠杆菌”或“哺乳动物”）启动子（位于attR1 位点的上游）的质粒3 进行
LR 反应即可快速完成构建。与传统的限制酶切割、连接酶连接的方法相比，该克隆技术在构建不同表达
载体时的主要优势是____。
【答案】(1)启动子、终止子和复制原点
(2)敏感 氨苄青霉素（或Amp）
(3) attL1 终止密码子
(4)哺乳动物 无需使用限制酶进行酶切连接
【知识点】基因表达载体的构建
【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA 分子水平上进
行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
【详解】（1）基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。
（2）题图中质粒2 含有卡那霉素抗性基因且不具有ccdB 基因，导入该质粒的大肠杆菌能在含卡那霉素的
平板上增殖；而质粒1 含有ccdB 基因，为了使其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖，导入的大肠杆菌应对
ccdB 敏感。用Ca2+处理后的大肠杆菌会处于能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态。题图中质粒1 和质
粒3 中均含有ccdB 基因，其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖；质粒2 只含有卡那霉素抗性基因而不含氨
苄青霉素抗性基因，因而含有该质粒的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的平板上生存；质粒4 含有氨苄青
霉素抗性基因且不含有ccdB 基因，因而含有该质粒的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的平板上增殖。
（3）由图2 可知，LR 反应中则发生attL 位点与attR 位点间的片段交换，因此attR1 与attL1 重组。若A 基
因转录的mRNA 含有内源的终止密码子，可能导致翻译提前终止，无法与GFP 构成融合蛋白。
（4）如果A 基因要在哺乳动物细胞表达，载体上必须具备哺乳动物的启动子。质粒2 一旦构建成功，就
可以作为“通用供体”，通过LR 反应将基因A 转移到任何具有attR 位点的载体上，无需对目的基因进行
重复的PCR 扩增和酶切连接，只需通过一步LR 反应即可将同一个目的基因转移到不同的表达载体中，通
用性强，操作简便。
28．（2026·湖南怀化·一模）Léri-Weill 软骨骨生成障碍综合征（LWD）可影响身高。某女性LWD 患者经
基因检测，其一条X 染色体上SHOX 基因发生碱基替换突变，使相关蛋白表达量不足，导致软骨生成障碍，
身材矮小。通过对其家系成员进行基因检测，该女性Ⅲ-5（如图1）致病基因源自其外祖父Ⅰ-1，外祖母
Ⅰ-2 不携带致病基因。图中各家系成员染色体数目正常，且患病成员的致病基因均有同一位点的碱基替换
突变。
回答下列问题。
(1)LWD 的致病基因为____性基因，理由是____。
(2)选用某种限制酶对Ⅲ-5 四位亲属的SHOX 基因中某区域进行酶切，图2 甲为经酶切后的电泳结果，图2
乙为该段中含突变（或未突变）位点的部分序列，图2 丙为选用的限制酶。据图分析，未突变的正常序列
是____（填“a”或“b”），使用的限制酶是____。
(3)根据基因突变的特点分析，可排除Ⅱ-3 患病原因是自身基因突变，理由是____。
(4)Ⅰ-1 的基因型最可能为____，Ⅱ-3 的基因型最可能为____。（致病基因用A 或a 表示）
【答案】(1)显 女性Ⅲ-5（或Ⅱ-5）（为杂合子，）一条X 染色体上携带致病基因即患病（或答：如
致病基因为隐性基因，则女性Ⅲ-5 的父亲Ⅱ-6 也是患者）
(2) a RsaⅠ
(3)基因突变具有不定向性、随机性，且突变频率低，Ⅱ-3 与Ⅰ-1 致病基因均在同一位点出现相同碱基替换
的概率小
(4)
【知识点】遗传系谱图中遗传方式的判定及应用、基因突变、DNA 重组技术的基本工具
【分析】伴性遗传：性染色体上的基因在遗传时总是与性别相关联的现象。
【详解】（1）LWD 的致病基因为显性，理由是女性Ⅲ-5（或Ⅱ-5）（为杂合子，）一条X 染色体上携带
致病基因即患病（或答：如致病基因为隐性基因，则女性Ⅲ-5 的父亲Ⅱ-6 也是患者）。
（2）据图2，正常个体的序列（a）均能被酶切，而患者的序列只有部分能被酶切，说明突变（C→A）导
致限制酶RsaⅠ能识别的序列GTAC 变为不能识别的序列GTAA。
（3）排除Ⅱ-3 患病原因是自身基因突变，理由是基因突变具有不定向性、随机性，且突变频率低，Ⅱ-3
与Ⅰ-1 致病基因均在同一位点出现相同碱基替换的概率小。
（4）根据Ⅱ-1、Ⅱ-2 表型正常，而Ⅱ-5 患病，推测Ⅰ-1 的基因型最可能为
，Ⅰ-1 的致病基因传递给
Ⅱ-3 的原因是：Ⅰ-1 减数分裂产生配子时，X 和Y 染色体发生片段交换（互换）而导致Y 染色体上出现致
病基因，故Ⅱ-3 的基因型为
。
29．（2026·湖南益阳·一模）在选育高产优质的蛋鸡新品系过程中，科研人员将W 品系鸡（黑羽、胫部真
皮层为黑色）与农大3 号商品鸡（黄羽、胫部真皮层为白色）进行杂交，再将F1中某一性别的个体与亲本
进行回交得到F2，后代胫部真皮层颜色如下表所示。已知鸡的性别决定方式为ZW 型，胫部真皮层颜色的
控制基因用D/d 表示，本题涉及的所有基因均不考虑性染色体的同源区段，请回答下列问题：
白色
黑色
雄性
雌性
雄性
雌性
F1
780
0
0
759
F2
386
201
0
189
(1)鸡的胫部真皮层颜色的______为显性性状，基因位于______染色体上。回交实验为F1个体与基因型为
______的亲本进行杂交。
(2)研究发现d 基因发生碱基对的替换后突变为D 基因，对亲本及F1的雌雄个体D/d 基因进行扩增，并经限
制酶酶切后电泳，四种个体的电泳结果如图所示。由图可知电泳方向为______（填“由上向下”或“由下
向上”），D 基因对应条带为______（填序号）。
(3)若F1中黑羽：黄羽=1：1，则就羽毛颜色的显隐性关系以及基因的位置可作出______种合理的假设。
【答案】(1)白色 Z ZDW
(2)由下向上 ③
(3)3
【知识点】伴性遗传的遗传规律及应用、基因在染色体上位置的判定方法问题、电泳鉴定
【分析】ZW 型性别决定的基本规则 雄性：性染色体组成为ZZ（同型性染色体） 雌性：性染色体组成为
ZW（异型性染色体）。
【详解】（1）从表格数据可知，F1代所有雌性（759 只）为黑色胫，所有雄性（780 只）为白色胫，F1的
表型与性别完全关联，F2代的表型分离也仅在雌性中出现，符合伴Z 染色体遗传的特点，因此控制胫部真
皮层颜色的基因位于Z 染色体上。 回交得到的 F2代中，雄性均为白色胫（386 只），雌性则出现白色
（201 只）和黑色（189 只）两种表现型，说明白色胫为显性性状。 F1代基因型为：雄性ZDZd（白色胫），
雌性ZdW（黑色胫），可推出亲本为ZdZd、 ZDW。 回交后F2代中，雄性全为白色胫，雌性出现白色胫
（ZDW）和黑色胫（ZdW），这表明回交是F1代中ZDZd基因型个体与亲本中基因型为ZDW 的个体进行杂
交。
（2）由小问1 分析可知亲本基因型为ZdZd、 ZDW，F1代基因型为：ZDZd、ZdW，ZdZd和ZdW 均只有d 基
因，四种个体中，Ⅰ和Ⅲ酶切条带相同，因此①②条带对应d 基因，③条带对应D 基因。d 基因发生碱基
对的替换后突变为D 基因，1 和2 是d 酶切后短片段，3 是D，片段长。DNA 越短，跑得越远，所以点样
孔在下方。
（3）已知F1中黑羽：黄羽 = 1:1，可作出以下3 种合理假设： 常染色体遗传，黑羽为显性：亲本组合为
黑羽（Bb）× 黄羽（bb），子代基因型为Bb（黑羽）和bb（黄羽），比例 1：1。 常染色体遗传，黄羽
为显性： 亲本组合为黄羽（Bb）× 黑羽（bb），子代基因型为Bb（黄羽）和 bb（黑羽），比例 1：1。
Z 染色体遗传，黑羽为显性：亲本组合为黑羽（ZBW）× 黄羽（ZbZb），子代基因型为ZBZb（黑羽，雄
性）和 ZbW（黄羽，雌性），比例 1：1。
30．（2026·湖南益阳·一模）野生大豆是宝贵的野生植物资源，耐盐碱能力优异。研究人员将野生大豆中
的耐盐碱基因OsMYB56 导入粳型常规水稻以提高水稻耐盐碱能力。图1 是农杆菌 Ti 质粒部分结构，OCS
基因是农杆菌 Ti 质粒特有的报告基因，能在植物根茎叶中表达，检测时经电泳、染色后在紫外光下观察
到荧光。图2 是含OsMYB56 基因的DNA 片段，其中R1、R2、 R3 表示引物，其余箭头处表示相关限制
酶的识别位点。相关限制酶的识别序列及切割位点如图3 所示。请回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是______。已知OsMYB56 基因转录得到的mRNA 前三个碱基为起始密码子
AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG 之前加入序列 GCCACC，会显著提高基因的表达效率。利用
PCR 技术获取OsMYB56 基因时，为保证OsMYB56 基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物R1 外，
还需要选择引物______（填“R2”或“R3”），并在该引物5’端增加碱基序列5’_______3’。
(2)将重组质粒导入农杆菌并侵染水稻细胞，可将外源基因导入水稻细胞内并维持稳定，原因是______。
(3)对转化是否成功进行检测时，利用OCS 基因检测得到的电泳图谱如下。检测中需用______作为阴性对
照，为进一步检测OsMYB56 基因是否表达出相关蛋白质，常用______技术进行检测。
【答案】(1) 基因表达载体的构建 R2 5′-GAATTCGCCACC-3′
(2)Ti 质粒上的T-DNA 能转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA 上。
(3)未转化的水稻植株 抗原一抗体杂交
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、DNA 重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测
与鉴定
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤；已知OsMYB56 基因转录得到的mRNA 前三
个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG 之前加入序列 GCCACC，会显著提高基因
的表达效率。利用PCR 技术获取OsMYB56 基因时，为保证OsMYB56 基因能正确插入载体并高效表达，
除选择引物R1外，还需要选择引物“R2”，并在该引物5’端增加碱基序列5′-GAATTCGCCACC-3′。因为图
中显示，在Ti 质粒的T-DNA 区域的启动子和终止子之间含有XhoⅠ、MunⅠ、SalⅠ三种限制酶识别位点，抗
病基因上含有XhoⅠ、EcoRⅠ、MunⅠ、SalⅠ四种限制酶识别位点，但MunⅠ会破坏目的基因。根据题图给出
的限制酶识别序列和切割位点可知，MunⅠ和EcoRⅠ能切出相同的黏性末端，XhoⅠ和SalⅠ能切出相同的黏
性末端。如果选了SalⅠ酶切目的基因上游，并且切质粒用的是MunⅠ和XhoⅠ，由于SalⅠ与XhoⅠ是同尾酶，
那么目的基因的上游就会跟质粒上XhoⅠ酶切后的黏性末端相连，这会导致目的基因反方向插入质粒， 应
该在R2 上加EcoRⅠ识别序列，用EcoRⅠ与XhoⅠ切目的基因，用MunⅠ和XhoⅠ切质粒。又知抗病蛋白基因
转录得到的mRNA 前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子前加入5′-GCCACC-3′序列，
会显著提高基因的表达效率。需在上游的引物的5′端增加碱基序列5′-GAATTCGCCACC-3′。
（2）将重组质粒导入农杆菌并侵染水稻细胞，可将外源基因导入水稻细胞内并维持稳定，这是因为含重
组Ti 质粒的农杆菌导入水稻细胞后，Ti 质粒上的T-DNA 能转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的
染色体DNA 上。
（3） 对转化是否成功进行检测时，利用OCS 基因检测得到的电泳图谱如下。从图中可以看出，加重组
质粒组是阳性对照，会产生电泳条带；空白对照（加水组）和阴性对照不会产生条带，故阴性对照是用未
转化的水稻植株为材料做的。从图中可知没有条带的是没有转化成功的植株，故植株2、3、6、8 是没有
转化成功的植株。为进一步检测OsMYB56 基因是否表达出相关蛋白质，可以从转基因水稻中提取出蛋白
质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测抗病基因是否翻译出相应的抗性蛋白。
31．（2026·湖南岳阳·一模）原花青素在植物的生长发育、抵御紫外线辐射、增强抗逆性以及防御病虫害
等方面发挥着重要作用，无色花青素还原酶编码基因SpLAR 是多根紫萍合成原花青素的关键基因，为提
高原花青素的产量，研究人员构建了pCAMBIA1301-SpLAR 植物表达载体，以获得过表达SpLAR 基因多
根紫萍株系。回答下列问题：
(1)原花青素是多根紫萍中重要的类黄酮化合物（次生代谢物），可利用______技术对其进行工厂化生产。
(2)提取多根紫萍的总RNA，逆转录合成cDNA，通过PCR 筛选出SpLAR 基因的cDNA 序列，该过程中使
用的引物1 序列是5’-GGTCACCCTAT-3’，则引物2 应设计为______（写出10 个碱基即可）。SpLAR 基因
转录时的模板链是______链。
(3)成功构建pCAMBIA1301-SpLAR 表达载体后，将其导入受体细胞常用的方法是______。
(4)提取受体细胞DNA，并选择合适引物进行PCR 鉴定，电泳结果如下图。
注：M 为参照样品；标号1 为SpLAR 质粒的PCR 产物；标号2 为野生型株系PCR 产物；标号3 为SpLAR
转基因株系；标号4 为阴性对照
分析结果可知SpLAR 基因cDNA______（填“是”或“否”）成功整合到受体细胞DNA 中。为确保获得
过表达SpLAR 基因多根紫萍株系，还应补充的实验操作是______。
【答案】(1)植物细胞培养
(2) 5’-CCATGGATGG-3’ a
(3)农杆菌转化（法）
(4)是 检测转基因株系和野生型的由SpLAR 基因转录得到的mRNA 含量/无色花青素还原酶含量/原花
青素含量，对比分析两组数据
【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、植物细胞工程的实
际应用
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；
目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）原花青素是多根紫萍中重要的类黄酮化合物，可利用植物细胞培养技术对其进行工厂化生
产，这是植物组织培养的过程。
（2）提取多根紫萍的总RNA，逆转录合成cDNA，通过PCR 筛选出SpLAR 基因的cDNA 序列，该过程中
使用的引物1 序列是5’-GGTCACCCTAT-3’，该引物中包含了BstEⅡ的识别序列，且与a 链的左侧配对，则
引物2 需要与b 链的右侧配对，且需要加上限制酶NcoⅠ的识别序列，应设计为5’-CCATGGATGG-3’。根
据启动子的位置和子链的延伸方向可判断，SpLAR 基因转录时的模板链是a 链。
（3）成功构建pCAMBIA1301-SpLAR 表达载体后，将其导入受体细胞常用的方法是农杆菌转化（法），
因为受体细胞是植物细胞。通过农杆菌转化法可将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA 上。
（4）根据图示结果可知，SpLAR 基因cDNA 已经成功整合到受体细胞DNA 中，因为转基因植株3 中呈现
出SpLAR 质粒的PCR 产物。为确保获得过表达SpLAR 基因多根紫萍株系，还应补充的实验操作是检测转
基因株系和野生型的由SpLAR 基因转录得到的mRNA 含量/无色花青素还原酶含量/原花青素含量，对比分
析两组数据，上述操作是为了检测目的基因是否进行了正常表达，以及是否表现了相应的性状。
32．（2026·湖南邵阳·一模）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我
国科研人员发现，野生马铃薯中S 基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著
增强其抗寒能力。回答下列问题。
可能用到的部分限制酶识别序列及酶切位点
限制
酶
HindⅢ
SmaⅠ
KpnⅠ
SalⅠ
NheⅠ
XhoⅠ
序列
及切
割位
点
A↓AGCTT
CCC↓GGG
GGTAC↓C
G↓TCGAC
G↓CTAGC
C↓TCGAG
(1)过程①中使用了RT-PCR 技术。这是一种特殊的PCR 技术，以RNA 为模板通过多个反应获得所需的
cDNA，该反应过程中需要的酶有______。
(2)在过程②中，为了实现目的基因与质粒的结合，需在引物1 的5′端添加特定碱基序列______，同时，对
质粒进行切割时所选用的限制酶为______。
(3)研究人员设计引物用PCR 方法验证重组质粒是否构建成功（引物1~4 结合位置如图所示，→表示引物
5′→3′方向），应该选择的引物是______。
(4)过程③将重组质粒导入农杆菌，应用______处理农杆菌。
(5)过程④用携带S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织后，应该在愈伤组织的培养基中加入______检测
是否成功。愈伤组织培养过程中添加蔗糖的作用是______，该愈伤组织经______形成芽、根，继续培育可
获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
【答案】(1)逆转录酶和Taq 酶
(2) 5´-CTCGAG-3´ SalⅠ和NheⅠ
(3)引物2 和3 或者引物1 和4
(4)Ca2+
(5)氯霉素 调节渗透压，提供碳源，提供能源 再分化
【知识点】目的基因的检测与鉴定、植物组织的培养及基本过程、基因工程的操作程序综合
【分析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的
基因的检测与鉴定。
2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。
【详解】（1）RT-PCR（逆转录 PCR）分为两步： 逆转录：以 RNA 为模板合成 cDNA，需要逆转录酶。
PCR 扩增：以 cDNA 为模板进行 DNA 复制，需要Taq 酶（热稳定 DNA 聚合酶）。
（2）子链延伸方向为
，所以只能在引物1 的
添加限制酶的识别序列；由于限制酶HindⅢ切割质
粒上的氯霉素抗性基因，限制酶KpnⅠ切割质粒上的复制原点，所以只能选用SalⅠ和NheⅠ切割质粒，根据
基因转录方向，可判断下面链为模板链，模板链
应靠近启动子，引物1 要加上SalⅠ的识别序列，但基因
内部有SalⅠ的识别序列，所以在目的基因的左侧的引物1 的
构建与SalⅠ能产生相同黏性末端的限制酶识
别序列，即为
。
（3）选用引物2 和3 或者引物1 和4 均可，要验证重组质粒构建成功，就要确保目的基因连接的位置和方
向均正确，引物1 和2 可以扩增目的基因或者目的基因与目的基因的连接的片段，引物3 和4 可以扩增质
粒或者质粒与质粒的连接的片段，都不能扩增目的基因与质粒的重组片段。
（4）将重组质粒导入农杆菌时，需要用 Ca²⁺（氯化钙） 处理农杆菌，使其处于感受态，易于吸收外源
DNA。
（5）质粒上携带氯霉素抗性基因作为标记基因，因此需在愈伤组织的培养基中加入氯霉素来筛选成功导
入的细胞。 培养基中添加蔗糖的作用： 提供碳源和能源，供细胞代谢使用 调节渗透压，维持细胞的正
常形态 愈伤组织通过再分化过程形成芽、根，最终发育为完整植株。
33．（2026·湖南株洲·一模）番茄红素的合成场所在植物细胞的有色体中。八氢番茄红素合成酶（PSY）
是该代谢途径的关键酶，其N 端含有一段转运肽，负责引导PSY 蛋白进入有色体。科研人员拟利用绿色荧
光蛋白（GFP）作为标签，构建“GFP-PSY”融合蛋白表达载体，以监控PSY 蛋白在细胞内的分布及表达
量，进而培育高产红果番茄。研究人员选用In-Fusion 技术构建载体。（In-Fusion 酶具有3′→5′外切活性，
能去除双链DNA 分子3′末端的15 个核苷酸，暴露5′端单链。）
关键密码子对应氨基酸表
密码子
氨基酸
UAG（终止密码子）
—
AUG（起始密码子）
甲硫氨酸
CAG
谷氨酰胺
(1)设计扩增PSY 基因的N 端引物5'端碱基序列（部分）为：5′-…CTGCAGATGGCT…-3′。该引物包含
____基因的序列，是为保证在外切酶的作用下，两者产生相同黏性末端；还包含____基因的序列，是为保
证引物能与模板结合。
(2)用In-Fusion 技术构建载体并导入受体细胞后，荧光显微镜观察发现，转基因植株的细胞质基质中充满
了绿色荧光，但有色体中几乎无荧光。
①推测失败的原因是：融合在PSY 蛋白N 端的GFP 蛋白，遮挡了PSY 的_________，导致PSY 无法
_________。
②解决此问题的方案是：___________________。需要重新扩增PSY 基因和GFP 基因，对GFP 基因重新设
计扩增引物的核心部分分别是：5′……CTACTG3′和5′_________ATGAGT3′（写出6 个碱基）。
(3)另外一个小组使用酶切法正确构建重组质粒如图2，需筛选正向插入PSY 的阳性克隆。研究人员设计了
三条引物（图2），并利用“三引物共扩增”体系对单菌落进行PCR 鉴定。
注：在上图中，F0 距连接点：100bp，R0 距连接点：500bp，R1 距连接点：100bp，PSY 长度：1680bp。
为区分“正向插入”和“反向插入”菌落，研究人员将上述三种引物（F0、R0、R1）同时加入PCR 反应
体系。①若对应菌落为正向插入，电泳结果应出现两条条带，其中较短的特异性条带大小约为_________。
②若PSY 基因反向插入，则电泳结果为：_________。（要求写出条带数目及各条带的大小）
【答案】(1) GFP PSY
(2)转运肽 进入有色体 将GFP 的N 端与PSY 的C 端相连 GAATTC
(3) 200bp 出现600bp 和2280bp 的两条条带
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定
【分析】1、根据题干信息，构建“GFP-PSY”融合蛋白表达载体，即需要将GFP 基因和PSY 基因连接。
在设计扩增PSY 基因的N 端引物时，要保证在外切酶作用下两者产生相同黏性末端，所以该引物需包含
GFP 基因的序列，同时，为保证引物能与模板结合，引物还需包含PSY 基因的序列。
2、题干中“用In-Fusion 技术构建载体并导入受体细胞后，荧光显微镜观察发现，转基因植株的细胞质基
质中充满了绿色荧光，但有色体中几乎无荧光”，结合“八氢番茄红素合成酶（PSY）是该代谢途径的关
键酶，其N 端含有一段转运肽，负责引导PSY 蛋白进入有色体”内容，推测失败的原因是融合在PSY 蛋
白N 端的GFP 蛋白遮挡了PSY 的转运肽，所以导致PSY 无法进入有色体，解决此问题的方案是将GFP 的
N 端与PSY 的C 端相连。对GFP 基因重新设计扩增引物，其中一个引物需要包括GFP 基因的N 端和PSY
基因的C 端两部分，所以该引物的核心部分是5′GAATTCATGAGT3′。
3、正向插入时，F0 与R1 可扩增出片段，长度为F0 到连接点的100bp + R1 到连接点的100bp = 200bp；同
时F0 与R0 可扩增出包含PSY 的片段，长度为100bp + 1680bp + 500bp = 2280bp。因此较短条带为200bp。
反向插入时，R1 与R0 可扩增出有效片段，长度为R1 到连接点的100bp + R0 到连接点的500bp=600bp，
F0 与R0 之间可扩增出长度为500+1680+100=2280bp 的条带。
【详解】（1）根据题干信息，构建“GFP-PSY”融合蛋白表达载体，即需要将GFP 基因和PSY 基因连接。
在设计扩增PSY 基因的N 端引物时，要保证在外切酶作用下两者产生相同黏性末端，所以该引物需包含
GFP 基因的序列，同时，为保证引物能与模板结合，引物还需包含PSY 基因的序列。
（2）题干中“用In-Fusion 技术构建载体并导入受体细胞后，荧光显微镜观察发现，转基因植株的细胞质
基质中充满了绿色荧光，但有色体中几乎无荧光”，结合“八氢番茄红素合成酶（PSY）是该代谢途径的
关键酶，其N 端含有一段转运肽，负责引导PSY 蛋白进入有色体”内容，推测失败的原因是融合在PSY
蛋白N 端的GFP 蛋白遮挡了PSY 的转运肽，所以导致PSY 无法进入有色体，解决此问题的方案是将GFP
基因的N 端与PSY 基因的C 端相连。对GFP 基因重新设计扩增引物，其中一个引物需要包括GFP 基因的
N 端和PSY 基因的C 端两部分，所以该引物的核心部分是5′GAATTCATGAGT3′。
（3）正向插入时，F0 与R1 可扩增出片段，长度为F0 到连接点的100bp + R1 到连接点的100bp = 200bp；
同时F0 与R0 可扩增出包含PSY 的片段，长度为100bp + 1680bp + 500bp = 2280bp。因此较短条带大小约
为200bp。反向插入时，R1 与R0 可扩增出有效片段，长度为R1 到连接点的100bp + R0 到连接点的
500bp=600bp，F0 与R0 之间可扩增出长度为500+1680+100=2280bp 的条带，因此出现600bp 和2280bp 的
两条条带。
34．（2025·湖北武汉·模拟预测）稻瘟病是水稻生产中重要的病害，选育抗病品种是防治稻瘟病最有效的
方式之一。品系丙具有高产等多种优良农艺性状，但不抗稻瘟病；抗病品系甲是具有稻瘟病抗性基因A 的
纯合子；抗病品系乙是具有稻瘟病抗性基因B 的纯合子。基因A/a 和B/b 位于染色体上。利用品系甲和品
系乙对品系丙进行改良获得双抗性基因的纯合个体，育种流程包括三个部分，如图所示。
回答下列问题：
(1)育种流程的第一部分中，分别对品系甲、品系丙、BC1F1群体进行抗性基因分析，部分电泳结果如下图
所示。BC1F1中可以选择1~5 号中的______号个体与品系丙杂交，并根据电泳结果保留合适的BC2F1。
(2)育种流程的第二部分中，利用三种引物对品系乙和品系丙的B/b 基因依次进行PCR 扩增、电泳鉴定。基
因B 扩增出长度为1009bp 和629bp 的两条带，基因b 仅扩增出1009bp 的一条带。已知其中一种引物只与
B 基因的特有序列结合，那么B 基因的该特有序列位于另外两种引物扩增区域的______（填“内侧”或
“外侧”）。
(3)育种流程的第三部分中，复交F1的电泳结果如下图所示。其中3 号、4 号个体的基因型分别为_______。
应选择1~4 号中的______号个体继续自交得F2。若基因A/a 和B/b 独立遗传，F2个体中，电泳结果和复交
F1中1 号个体相同的比例为______。若基因A/a 和B/b 位于一对同源染色体上，F2中出现了双抗性基因纯
合的个体，分析最可能的原因是_______。
【答案】(1)2、3、4
(2)内侧
(3) aabb、aaBb 1 1/4 复交F1在减数分裂时，发生了染色体互换，形成了基因型AB 的雌雄
配子，受精作用后得到双抗性基因纯合的个体
【知识点】基因分离定律的实质和应用、基因自由组合定律的实质和应用、杂交育种、PCR 扩增的原理与
过程
【分析】自由组合定律的实质：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减数分
裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
【详解】（1）品系甲是具有稻瘟病抗性基因A 的纯合子（AA），品系丙不抗稻瘟病（aa），从电泳结果
看，1~5 号个体中，2、3、4 号个体含有与品系甲相同的抗性基因 A 的条带，即2、3、4 号个体基因型为
Aa，所以BC1F1中可以选择2、3、4 号个体与品系丙（aa）杂交，并根据电泳结果保留合适的BC2F1。
（2）基因B 扩增出长度为1009bp 和629bp 的两条带，基因b 仅扩增出1009bp 的一条带，且有一种引物只
与B 基因的特有序列结合。因为B 基因能扩增出两条带，说明在扩增时，以B 基因特有序列结合的引物与
另外两种引物共同作用，使得扩增产物有两种长度，所以B 基因的该特有序列位于另外两种引物扩增区域
的内侧，若在外侧，则不会出现两种不同长度的扩增产物（只有一种长度，即另外两种引物扩增的长度）。
（3）品系甲为AAbb，品系乙为aaBB，品系丙为aabb，复交F1中，根据电泳结果，3 号个体不含基因A
和B 的条带，基因型为 aabb，4 号个体含有基因B、b 的条带，基因型为aaBb。要获得双抗性基因的纯合
个体（AABB），应选择同时含有A 和B 基因的个体，即1 号个体（AaBb）继续自交得F2。若基因A/a 和
B/b 独立遗传，1 号个体（AaBb）自交，F2中电泳结果和复交F1中1 号个体（AaBb）相同的比例为1/4，
因为AaBb 自交后代的基因型及比例为A-B-：A-bb：aaB-：aabb=9：3：3：1，其中AaBb 占1/4。若基因
A/a 和B/b 位于一对同源染色体上，正常情况下不会出现双抗性基因纯合的个体（AABB），F2中出现了双
抗性基因纯合的个体，最可能的原因是复交F1在减数分裂时，发生了染色体互换，形成了基因型AB 的雌
雄配子，受精作用后得到双抗性基因纯合的个体。
35．（2026·湖南怀化·一模）高温强光下，光合吸收的光能超出自身最大利用能力时，就容易使PSⅡ（光
合色素与蛋白结合的复合体）受损，致使光合速率降低，称为“光抑制”现象。光抑制现象严重影响作物
产量。
(1)叶绿体中，PSⅡ的分布场所为____。
(2)叶绿体psbA 基因编码的D1 蛋白是PSⅡ的核心蛋白。科研人员使用凝胶电泳技术检测不同光照条件下
的D1 相对含量，结果如图1 所示，分析可知：____。
(3)进一步研究发现，高温或强光会造成叶绿体内活性氧（ROS）的大量累积，攻击叶绿素和PSⅡ反应中心
中的D1 蛋白，使得D1 极易受到破坏；同时，ROS 积累显著抑制psbA mRNA 的翻译，影响D1 蛋白的从
头合成，因此D1 蛋白含量减少。
为提高PSⅡ的修复效率，科学家将原本位于叶绿体基因组的D1 蛋白编码基因（psbA），与编码转运肽的
DNA 片段及高温响应启动子连接，构建成图2 所示的融合基因，并将其导入水稻的核基因组中，从而获得
了转基因水稻。
分析以上资料，回答下列问题：
①该研究建立的D1 蛋白合成“双途径”机制是指转基因植物细胞中具有内源和外源的两种psbA 基因在不
同部位进行____。
②转基因水稻在受到高温胁迫时，核基因组中的psbA 基因表达优势为____（选择并正确排序表达）
a．响应高温信号及时启动表达 b．在叶绿体中高效转录和翻译
c．定向转运至叶绿体 d．精确定位并整合至类囊体膜
③为验证“核编码的D1 蛋白能成功补充并修复叶绿体中的PSⅡ”，研究者利用叶绿体蛋白质合成抑制剂林
可霉素处理野生型与转基因水稻幼苗。实验结果发现，转基因幼苗的生长受抑制程度显著低于野生型。请
分析该实验的设计逻辑：使用林可霉素的目的是模拟____；实验结果____（填“支持”或“不支持”）实
验结论。
【答案】(1)类囊体（薄膜）（或基粒）
(2)强光下，D1 蛋白含量降低
(3)转录、翻译（或表达） acd 高温胁迫下叶绿体中翻译过程受(ROS 积累)抑制 支持
【知识点】光反应、暗（碳）反应的物质变化和能量变化、影响光合作用的因素、基因表达载体的构建、
验证性实验与探究性实验
【分析】叶绿体呈扁平的椭球形或球形，具有双层膜，主要存在绿色植物叶肉细胞里，叶绿体是植物进行
光合作用的细胞器，是植物细胞的“养料制造车间”和“能量转换站”，含有叶绿素和类胡萝卜素，还有
少量DNA 和RNA，叶绿素分布在基粒片层的膜上．在片层结构的膜上和叶绿体内的基质中，含有光合作
用需要的酶；叶绿体是半自主细胞器。
【详解】（1）PSⅡ是光合色素与蛋白结合的复合体，故 PSⅡ 的分布场所为类囊体（薄膜）（或基粒）。
（2）科研人员使用凝胶电泳技术检测不同光照条件下的D1 相对含量，由凝胶电泳结果可知，与适宜光照
（CK）相比，较强光照（W2）条件下D1 蛋白的条带更浅，说明其相对含量更低，因此可得出结论：强
光下，D1 蛋白含量降低。
（3）①D1 合成双途径是指转基因植物细胞中既有内源的叶绿体基因组中的psbA 基因，也有外源转入的
细胞核基因组中的psbA 基因，因为两基因的转录和翻译的部位均不相同。
②通过基因工程手段，将原本位于叶绿体的基因“转移”到细胞核，首先，基因在细胞核内被高温信号特
异性激活并转录；接着，翻译出的蛋白质前体凭借其携带的“地址标签”（信号肽）被运送到叶绿体；最
后，蛋白质在叶绿体内被送达并安装到其工作的精确位置——类囊体膜上的PSⅡ复合体。这一策略的优势
在于，它巧妙地规避了高温下叶绿体内活性氧（ROS）对D1 蛋白翻译过程的抑制，通过建立这条新的
“核途径”，确保了在逆境下修复光合机构的关键原料（D1 蛋白）能够持续、充足地供应，从而显著提
高了水稻的光合效率、高温抗性和产量。因此，答案为acd。
③叶绿体蛋白质合成抑制剂林可霉素特异性抑制叶绿体自身（内源）的D1 蛋白合成，模拟题干信息中
“高温胁迫下，ROS 积累显著抑制psbA mRNA 的翻译”；实验结果能够支持结论：当叶绿体途径受阻时，
核编码的D1 蛋白能够被成功转运至叶绿体，并发挥功能，维持PSⅡ修复和植物生长。
