文档文本内容
发酵工程
题型1
专题08 生物技术与工程
4 大题型概览
题型1 发酵工程
题型2 细胞工程
题型3 基因工程及应用
热点聚焦 PCR 技术及应用
1．（2026·江西萍乡·二模）浆水是西北地区的传统饮品，常以蔬菜和面汤为原料，主要利用乳酸菌自然发
酵而成，味道微酸爽口，有解暑开胃之效。传统发酵过程如下图，发酵工程则多采用人工接种，在现代发
酵罐内进行大规模生产。下列分析错误的是（ ）
A．两种发酵过程中，乳酸菌都是先无丝分裂快速增殖，再进行无氧发酵产生酸味物质
B．传统发酵时的热烫处理起到消毒作用，发酵工程则须对原料和发酵设备进行严格灭菌
C．发酵工程中接种扩大培养的优良纯种菌液，相当于传统发酵过程中的加“引子”
D．为监测发酵进程，利用细菌计数板进行菌种计数的结果通常高于稀释涂布平板法
2．（2026·河北保定·二模）科研团队从垃圾填埋场筛选高效降解聚乳酸（PLA）的微生物，流程为：①将
土壤样品稀释涂布到以PLA 为唯一碳源的固体培养基上；②挑取单菌落纯化；③刚果红染液处理，筛选
透明圈与菌落直径比值大的菌株。下列叙述错误的是（ ）
A．步骤①的培养基为选择培养基，可抑制非 PLA 降解菌生长
B．步骤①和②的接种方法均为稀释涂布平板法，需无菌操作
C．透明圈与菌落直径比值越大，一般说明菌株降解 PLA 能力越强
D．筛选出高效降解 PLA 的菌株后，常用液体培养基进行扩大培养
3．（2026·广东湛江·二模）“筛选”是分离和培养微生物中常用的方法。下列实验中筛选原理与其他三项
明显不同的是（ ）
A．从诱变处理的菌液中筛选高产菌株
B．从腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌
C．从被石油污染的土壤中筛选石油降解菌
D．从热泉中筛选水生栖热菌以提取Taq DNA 聚合酶
4．（2026·福建龙岩·二模）除草剂莠去津是一种含氮的有机物，长期使用易对土壤造成污染。研究人员从
土壤中筛选莠去津降解菌的过程如下图所示（含过量莠去津的固体培养基不透明）。下列叙述错误的是（
）
A．从A 瓶到C 瓶的目的是逐步稀释培养液中的目的菌
B．应选择固体培养基中出现的有透明带菌落进行再纯化
C．图中进行再纯化的接种过程至少需要灼烧6 次接种环
D．实验过程中需设置未接种的培养基作为对照
5．（2026·安徽马鞍山·二模）某谷氨酸发酵工厂遭遇专性噬菌体污染，技术人员采用双层平板法测定该噬
菌体浓度：先在无菌培养皿中倒入含2%琼脂的培养基凝固成底层平板，再将含1%琼脂的培养基与敏感指
示菌、待测噬菌体稀释悬液混匀后铺成上层平板（见下图）。恒温培养后，可根据噬菌斑数目计算原液中
噬菌体数量。下列叙述正确的是（ ）
A．该实验中选用的敏感指示菌为大肠杆菌
B．上下层培养基营养成分应保持一致
C．上层培养基琼脂浓度越低越利于计数
D．对生产空间的灭菌即可彻底杜绝噬菌体污染
6．（2026·天津·二模）动物细胞培养时操作不当会造成“黑胶虫”细菌的污染，该菌对氯霉素敏感，高温
会使氯霉素失活。下列叙述错误的是（ ）
A．配制细胞培养基时，湿热灭菌后加血清（含细胞生长必需蛋白）和氯霉素
B．在加入氯霉素防治“黑胶虫”污染过程中，需要同时考虑对细胞和细菌生长的影响
C．考察“黑胶虫”污染程度时，应取细胞培养液等比稀释后涂布在平板上培养计数
D．采用更换培养基、胰蛋白酶处理和分瓶培养等操作可清除“黑胶虫”污染
7．（2026·河北唐山·二模）某同学利用传统发酵技术酿制葡萄酒，下列操作错误的是（ ）
A．为了减少杂菌污染，对葡萄进行消毒处理
B．为防止杂菌污染，排气时没有完全打开罐口
C．为提高酒精发酵效率，控制发酵温度在18～30℃
D．若观察到发酵液表面形成一层菌膜，则应停止发酵
8．（2026·四川遂宁·二模）《尚书·说命》中“若作酒醴，尔惟曲蘖”的意思是如果你要酿造甜酒（酒
醴），关键在于用好曲和蘖（发芽的谷物）。以下说法错误的是（ ）
A．实验室纯培养“曲”中菌种使用牛肉膏蛋白胨培养基
B．“曲”中微生物能利用糖化后的有机物发酵产生酒精
C．“蘖”中产生的赤霉素促进淀粉酶合成从而完成糖化
D．在发酵工程制酒过程中代谢物生成在主发酵阶段完成
9．（2026·安徽宣城·二模）沙棘汁富含维生素C 和黄酮类物质，是天然抗氧化剂。桦树液中则含有桦木酸
等成分，两者混合发酵制酒，不仅能延长保质期，还增强了保健功能。桦树液沙棘复合酒发酵工艺加工流
程及优化结果如图所示，下列叙述正确的是（ ）
A．发酵工程的中心环节是灭菌，经过严格灭菌才能保证产品品质
B．若糖度过高会抑制酵母菌的生长，可通过添加适量纯净水调节
C．接种后的罐内发酵过程应保持严格的无氧环境，从而进行充分的酒精发酵
D．发酵结束后还可从酵母菌中提取单细胞蛋白作为食品添加剂
10．（2026·山东日照·二模）传统白酒多以泥窖为发酵基础，多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量
细胞工程
题型2
与酿酒相关的微生物。下列有关说法正确的是（ ）
A．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在密闭环境中进行
B．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
C．发酵过程中，可将发酵池温度调至30～35℃加快发酵进程
D．窖池密封不严使酒变酸可能是混入的乳酸菌产生乳酸引起的
1．（2026·山东济南·二模）科研人员提取患者自体CD34+造血干细胞，在体外通过CRISPR/Cas9 编辑
BCL11A 基因启动子上游的序列，从而抑制BCL11A 基因的表达，重新激活胎儿血红蛋白的表达，替代异
常的成人血红蛋白以根治镰状细胞贫血。下列有关说法正确的是（ ）
A．该治疗方案使用患者自体造血干细胞进行编辑和回输是由于干细胞在体外更容易增殖
B．经过该疗法治疗的患者，其生殖细胞的基因也被同步修复，后代将不再患病
C．在体外培养和编辑CD34+造血干细胞的过程中，需要严格保持无菌条件
D．若基因编辑过程中存在非目标位点被编辑的现象，其原因是BCL11A 基因发生了基因突变
2．（2026·广东韶关·二模）牧草紫花苜蓿富含蛋白，但易造成家畜鼓胀病。百脉根富含的单宁可结合蛋白，
避免鼓胀病。科学家以二者为材料培育了抗鼓胀病的牧草新品种，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：IOA 抑制细胞呼吸第一阶段，R-6G 抑制线粒体功能，两者均为不可逆抑制
A．为获得原生质体，需要在含有体细胞的清水中加入适量的纤维素酶和果胶酶
B．PEG 诱导原生质体融合后，未融合或同种融合的细胞无法继续生长和增殖
C．愈伤组织在固体培养基和黑暗条件下培养，可发生基因的选择性表达
D．该过程克服了远缘杂交不亲和的障碍，实现了基因组的重组，但不属于有性生殖
3．（2026·四川乐山·二模）核苷酸合成有两个途径，物质A 可以阻断其中的全合成途径（如图）。正常细
胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。现用
加入H、A、T 三种物质的“HAT 培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。下列说法正确的是（ ）
A．未融合的B 细胞及其同型融合细胞因全合成途径被A 阻断而在HAT 培养基上不能增殖
B．因为杂交瘤细胞可以进行上述两个途径，所以它能在HAT 培养基上大量增殖
C．未融合的骨髓瘤细胞及其同型融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT 培养基上不能增殖
D．HAT 培养基所筛选出的杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度的目标抗体
4．（2026·重庆沙坪坝·二模）2009 年科学家利用小鼠肠道的成体干细胞培育出首个肠道类器官，类器官是
由干细胞在体外诱导分化形成的具有器官特性的细胞集合体｡下列叙述错误的是（ ）
A．对类器官中某种细胞的蛋白质种类进行分析，可判断其细胞类型
B．干细胞在体外培育形成类器官，证明动物细胞具有全能性
C．肠道成体干细胞具有组织特异性，一般只能分化成特定的组织或细胞
D．若类器官来源于自体细胞，移植回病人体内理论上可避免免疫排斥反应
5．（2026·广东江门·二模）我国科研团队利用体细胞核移植技术成功获得一批基因编辑克隆牛，实现了奶
牛优良种质的高效扩繁。科研团队首先从高产奶牛耳部采集成纤维细胞进行培养，再将细胞核移植到去核
卵母细胞中，从而构建重构胚，并移植到受体牛子宫内，最终获得克隆牛。下列相关叙述正确的是
（ ）
A．从高产奶牛耳部采集的成纤维细胞具有发育的全能性，可直接发育成完整个体
B．培养成纤维细胞时，若出现接触抑制现象，则常用胃蛋白酶处理后再进行传代培养
C．重构胚可以用电刺激或Ca2+载体等激活，使其完成细胞分裂和早期胚胎发育
D．克隆牛的核遗传物质与高产奶牛的完全一致，因此其性状与高产奶牛的完全相同
6．（2026·广东江门·二模）帕利珠单抗是一种用于预防呼吸道合胞病毒（RSV）感染的单克隆抗体药物，
其通过中和病毒发挥保护作用。下列叙述正确的是（ ）
A．该单克隆抗体可由细胞毒性T 细胞与骨髓瘤细胞融合制备
B．该单克隆抗体与RSV 特异性结合后，可直接裂解被病毒感染的靶细胞
C．该单克隆抗体进入机体后，可诱导机体产生长期免疫记忆
D．制备该单克隆抗体时，需要先用RSV 抗原对小鼠进行免疫
7．（2026·河北邯郸·二模）利用囊胚的细胞经过动物细胞培养获得大量的胚胎干细胞，从而获得多种类型
的体细胞，以下为培育的流程图。下列叙述正确的是（ ）
A．图中a、b 细胞的遗传物质完全相同，这两类细胞均发育为胎儿的组织
B．囊胚外面的透明带会一直保护着胚胎，否则胚胎将无法正常发育
C．a 处细胞需经胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理，胚胎干细胞在液体培养基中只能悬浮生长
D．②过程为细胞分化，胚胎干细胞可分化为各种组织细胞，这体现胚胎干细胞的全能性
8．（2026·广东东莞·二模）黄曲霉毒素（AFB）是黄曲霉产生的一种致癌物质。为准确检测环境中的
AFB，科研人员利用小鼠制备抗AFB 的单克隆抗体（AFB 单抗），过程如图示。下列叙述正确的是（
）
A．向小鼠注射AFB 的目的是刺激机体发生细胞免疫
B．病毒能诱导动物细胞融合，而灭活的病毒失去该能力
C．细胞乙和细胞丙都需先经过克隆化培养再进行筛选
D．悬浮生长的细胞丁传代培养时，可用离心法收集细胞
9．（2026·山西·二模）奶牛的自然繁殖率受遗传、营养、管理等多重因素制约，已成为限制高产奶牛种群
快速扩繁和牧场经济效益的瓶颈。科研人员利用如图所示的①②两种途径繁殖高产奶牛，以解决上述问题。
下列叙述错误的是（ ）
A．经①和②路径获得的子代中，仅①需进行性别鉴定
B．细胞甲处于MⅡ期，该细胞含有一个完整的细胞核
C．②路径中，获得重构胚与激活重构胚均可用电处理
D．为获得基因组成相同的子代，可运用胚胎分割技术
10．（2026·内蒙古赤峰·二模）科研人员通过植物体细胞杂交技术，利用甲种花卉（2N=18）和乙种花卉
（2N=24）培育出兼具二者优良性状的新品种。下列叙述正确的是（ ）
A．可用电融合法、PEG 融合法或灭活的病毒诱导原生质体融合
B．对两种动物细胞进行相似的操作也可在体外诱导多倍体产生
C．整个培育过程需要无菌操作，故不需要更换培养基
D．该过程利用了细胞的全能性和细胞膜的流动性
基因工程及应用
题型 3
1．（2026·陕西榆林·二模）科研人员从耐旱植物拟南芥中分离出耐旱基因DREB1A，并利
用基因工程技术将其导入水稻，培育抗旱水稻。大致流程为：利用PCR 技术扩增DREB1A
基因后，将其与含有花椰菜花叶病毒35S 启动子、终止子和潮霉素抗性基因的Ti 质粒连接，
构建成基因表达载体；随后通过农杆菌转化法导入水稻细胞，经过筛选、培养和鉴定获得
转基因水稻植株。下列叙述错误的是（ ）
A．PCR 扩增DREB1A 基因时，需根据DREB1A 基因两端的碱基序列设计两种引物
B．构建基因表达载体时，35S 启动子应位于DREB1A 基因的上游，终止子位于其下游
C．农杆菌转化法中，水稻细胞作为受体细胞时，需先用酶去除其细胞壁制备成原生质
体
D．用潮霉素对导入质粒的农杆菌进行筛选，能存活的不一定成功导入了DREB1A 基因
2．（2026·广东韶关·二模）关于“DNA 的粗提取与鉴定”和“DNA 片段的扩增及电泳鉴
定”的实验原理及操作步骤。下列叙述错误的是（ ）
A．DNA 溶于酒精，加入冷酒精析出的白色丝状物即为蛋白质杂质
B．DNA 在沸水浴条件下遇二苯胺试剂显蓝色，此时DNA 的双螺旋结构已解开
C．DNA 片段在电泳时的迁移速率与DNA 分子量的大小和构象有关
D．指示剂不会使DNA 着色，待指示剂前沿接近凝胶边缘时停止电泳
3．（2026·广东佛山·二模）BUF1 基因是稻瘟病菌的关键基因，其功能正常时病菌为深色。
Cas12a 系统包含向导RNA 和Cas12a 蛋白，向导RNA 识别特定DNA 位点（靶点）后，
Cas12a 蛋白可对该位点进行剪切。为获得弱致病性的稻瘟病菌突变体，研究者利用Cas12a
系统对BUF1 基因进行编辑，如图a。将转化后的稻瘟病菌进行选择培养，并进行PCR 和
电泳检测，结果如图b。下列分析错误的是（ ）
A．Cas12a 蛋白通过水解DNA 上的磷酸二酯键发挥作用
B．选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株
C．根据电泳结果，可确定菌株2 为编辑成功的目标菌株
D．筛选得到的目标菌株可用于培育抗稻瘟病水稻的研究
4．（2026·山西运城·二模）大肠杆菌的pBR322 质粒常用于重组质粒的构建，该质粒上限
制酶识别位点如图1 所示。受体菌可能导入重组质粒或pBR322 质粒，需要在培养基中添
加抗生素进行初筛和复筛。将初筛培养基上的菌落原位影印（将菌落按原有位置影印到另
一培养基上）到复筛培养上培养，1～6 表示菌落，结果如图2 所示。下列有关分析正确的
是（ ）
A．若目的基因和pBR322 质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则初筛培养基要添加四环素
B．若目的基因和pBR322 质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则复筛培养基要添加氨苄青霉素
C．若目的基因和pBR322 质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ切割，则菌落3、4、6 导入的是重组
质粒
D．若目的基因和pBR322 质粒用BclⅠ、HindⅢ切割，则菌落1、2、5 导入的是pBR322
质粒
5．（2026·山东日照·二模）基因工程中，使用单个限制酶酶切构建的表达载体易出现连接
方向错误和重复插入目的基因片段等现象，可通过酶切及筛选标记鉴定出符合预期的重组
质粒。研究人员将目的基因CDS 插入质粒P 的SacⅡ位点后，对重组质粒进行扩增、筛选
和检测。P 和CDS 结构如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：X-gal 被LacZ 基因表达产物分解成蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则为白色。
A．重组质粒被PstⅠ完全酶切后电泳可能会获得长度为9.4kbDNA 片段
B．用EcoRⅠ与SacⅡ完全酶切重组质粒，可得到2 个长度的DNA 片段
C．用EcoRⅠ与PstⅠ完全酶切重组质粒，可判断CDS 基因的连接方向
D．将含重组质粒的细胞涂布在含X-gal 的培养基上，菌落颜色为白色
6．（2026·陕西商洛·二模）基因工程中常用不同限制酶切割DNA，下表为几种限制酶的识
别序列及其在某质粒上的切割位点数。下列叙述正确的是（ ）
限制酶
识别序列及切割位点
质粒上切割位点数
EcoRⅠ
5′G↓AATTC3′
1 处
HindⅢ
5′A↓AGCTT3′
0 处
BamHⅠ
5′G↓GATCC3′
1 处
BclⅠ
5′T↓GATCA3′
1 处
Sau3AⅠ
5′↓GATC3′
3 处
A．Sau3AⅠ可切割BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，说明Sau3AⅠ不具有专一性
B．质粒经BamHⅠ和BclⅠ双酶切后，在DNA 连接酶作用下可重新环化
C．构建重组质粒时，可选择EcoRⅠ和HindⅢ对该质粒和目的基因进行双酶切
D．用BamHⅠ和Sau3AⅠ完全切割该质粒，该质粒可被切割为4 段
7．（2026·广东广州·二模）为探究猪流行性腹泻病毒蛋白Nsp15 是否与宿主蛋白SLC25a3
结合，研究人员构建两种重组质粒分别表达融合蛋白Flag-Nsp15 和Myc-SLC25a3，转化后
获得三组细胞（①、②、③）。利用抗Flag 抗体分别收集各组中能与之结合的蛋白，再分
别用抗Flag、抗Myc 的单克隆抗体检测，同时取各组细胞总蛋白进行相同检测，结果如图
所示。下列分析正确的是（ ）
A．制备抗Flag 单克隆抗体时需在已免疫动物体内分离得到记忆B 细胞作为材料
B．若使用抗Myc 抗体收集蛋白，则①组中同样会出现Flag 条带
C．②组IP 产物中无Myc 条带，说明细胞内不表达SLC25a3 蛋白
D．③组IP 产物中有Myc 条带，表明Nsp15 能与SLC25a3 结合
8．（2026·山东德州·二模）亚硫酸氢钠可以使DNA 中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，
经过PCR 扩增，该位置的胞嘧啶将被胸腺嘧啶替代，甲基化的胞嘧啶不受影响。如图为某
基因单链部分初始序列和经亚硫酸氢钠处理并进行PCR 后的序列。下列叙述错误的是（
）
A．该基因转录时，图中单链作为转录模板链
B．经亚硫酸氢钠处理并PCR 后的序列为a 链
C．RNA 聚合酶移动到114 位对应碱基序列时终止转录
D．图示单链初始序列中共有3 个未被甲基化的胞嘧啶
9．（2026·陕西榆林·二模）利用转基因小鼠生产人源抗体的技术首先要敲除小鼠的抗体基
因，再转入人的全套抗体基因，使得小鼠能够产生人源抗体。回答下列问题：
(1)科研人员采取同源重组方法将小鼠胚胎干细胞（ES）中的鼠源抗体基因敲除。该方法需
构建携带同源重组序列的载体，所用的载体需要含有标记基因，目的是________。
(2)获得敲除小鼠抗体基因的ES 细胞后，需将人的抗体基因转入该细胞。该过程所用的
BAC 载体与含人抗体基因的DNA 上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2 所示。
①为获得人抗体基因，需从人的________细胞中获取mRNA，在________酶的作用下获得
cDNA。
②用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，分别只需要一种限制酶和DNA 连接酶便
可实现，处理目的基因的限制酶是________，用该方法切割目的基因、质粒后可能出现目
的基因的反向连接或________。
③现已获得A 和B 两个重组质粒，欲要通过PCR 扩增的方法，检测目的基因“正向”还是
“反向”插入质粒，可选择图中“甲、丙”处碱基序列设计引物，若A 重组质粒扩增出的
片段长于B 质粒，则_______质粒是“正向”接入的质粒。
(3)将重组的ES 细胞注入野生型小鼠的________期胚胎，再通过________技术能够建立嵌
合型小鼠，最后经过一系列操作能够产生人源抗体。
10．（2026·安徽淮南·二模）促红细胞生成素(EPO)是一种由肾脏和肝脏分泌的激素样物质，
能够促进红细胞生成，用于治疗多种类型的贫血，包括肾性贫血、肿瘤相关性贫血等疾病。
科学家拟用某质粒构建EPO 基因表达载体，将其转入含有限制酶Xho Ⅰ和限制酶Sal Ⅰ的受
体细菌，结合发酵工程来生产人类EPO，质粒上限制酶的酶切位点及这两种限制酶的识别
序列如图所示。回答下列问题：
(1)一般在肾脏或肝脏细胞中获取___________，再以其为模板合成不带内含子的EPO 基因
充当目的基因，并进行PCR 扩增。
(2)基因表达时，3′端在启动子端的单链为转录模板，已知EPO 基因的模板链是①链，为了
能在所用受体菌中稳定存在并表达，应该在引物P1、P2 的5′端分别添加___________酶的
识别序列，原因是___________。
(3)经限制酶处理后的质粒和目的基因，在DNA 连接酶的作用下，只带有一个目的基因的
重组质粒有___________种类型，将这种重组质粒转入受体菌，一般要先用___________处
理这些受体菌。
(4)从质粒上所带抗性基因角度分析，在含有氨苄青霉素的培养基上能够生长的受体菌不一
定能合成EPO，理由是___________。
11．（2026·山东济宁·二模）为培育耐盐碱大豆新品种，科研人员把耐盐碱基因OsJRL40
和荧光素酶基因构建成融合基因，荧光素酶可催化荧光素产生荧光以检测融合基因表达产
生融合蛋白的情况，部分操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中DEX 启动子在
DEX 诱导下才可发挥作用；AUG 为起始密码子，UAA、UGA、UAG 为终止密码子。回答
下列问题。
(1)图中构建基因表达载体时，切割载体用到的限制酶有________。与单酶切相比，双酶切
的优点是________（答出1 点）。已知OsJRL40 基因转录的非模板链的序列为：5'-
ATGATCCAG……GCTGACTAG-3'，为构建融合基因，引物2 的前10 个碱基序列为
________。
A．5'-AGATCTCTAG-3'
B．5'-AGATCTGTCA-3'
C．5'-GATCCTAGTC-3'
D．5'-GATCGTCAGC-3'
(2)在培养大豆细胞的基本培养液中添加________，若检测结果为________说明转化成功。
成功后需要去除荧光素酶基因，已知Cre 酶可以将DNA 上两个相同loxP 序列位点之间的
片段切除，因此在设计引物3 和引物4 时需要在限制酶识别序列的________（填“5'端”或
“3'端”）添加loxP 序列。
(3)为检测荧光素酶基因是否被成功敲除，可用PCR 技术进行鉴定。
实验组：首先提取在有DEX 环境下培养的转基因大豆细胞质中的总RNA，进行逆转录获
得cDNA，然后加入上图中的一对引物________进行PCR 扩增后用BglⅡ完全切割，再进
行琼脂糖凝胶电泳，观察有无OsJRL40 基因和荧光素酶基因的条带。
对照组：用未经DEX 环境下培养的转基因大豆细胞，其余同实验组。
若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为________。
12．（2026·内蒙古赤峰·二模）杜氏盐藻是一种具有极强耐盐性能的微生物，细胞内含有
大量类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、叶黄素等，现通过基因工程技术大量制备类胡萝卜素。
回答下列问题。
(1)β-胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，可作为膳食补充剂延缓细胞衰老，推测其作用原理
为_____。
(2)DsOR 基因参与类胡萝卜素的合成，为将该基因导入杜氏盐藻内，需利用Golden Gate 技
术构建重组pDTK001 载体，过程如图1 所示。BsmBⅠ是Golden Gate 技术的核心工具酶，
该酶的识别序列（5′-CGTCTC-3′）及切割位点如图2。
由图可知，BsmBI 酶能识别特定DNA 序列，而且切割位点在识别序列_____（填“内”或
“外”），切断DNA 中的_____键，产生_____（类型）末端，BsmBI 酶切产生的末端最
多有_____种。使用BsmBI 酶可有效避免质粒自身环化、目的基因反向连接，原因是_____。
(3)将重组载体转入大肠杆菌后，接种在含氯霉素的培养基上，如果可以生成菌落，说明
_____，但无法确认目的基因是否插入，需进一步筛选颜色为_____（填“红”或“白”）
的菌落，即含有目的基因的重组质粒，理由是_____。
13．（2026·山西临汾·二模）免疫调节因子白细胞介素-2（IL-2）对机体的免疫应答和抗病
毒感染等有重要作用。某科研团队将IL-2 基因和质粒pPIC9K 构建成重组质粒，并导入酵
母菌GS15（组氨酸缺陷菌株，不能合成组氨酸）中，筛选出能分泌IL-2 的工程菌。回答
下列问题。
(1)为保证连接的准确性，构建携带IL-2 基因的重组质粒时应选择限制酶______和______对
目的基因和质粒pPIC9K 进行双酶切。若限制酶切割后产生了平末端，最好选用______酶
进行连接。
(2)PCR 扩增IL-2 基因需要两种引物。将一个IL-2 基因进行PCR 扩增，进行30 次循环，每
种引物至少需要______个。引物的作用是______。
(3)根据题中信息分析，若要筛选出导入质粒的酵母菌，可采用______的培养基培养酵母菌。
(4)制备能分泌IL-2 的工程菌选用酵母菌作为受体细胞，而不用大肠杆菌，从细胞结构与功
能的角度分析，原因是______。
14．（2026·西藏拉萨·二模）烟草花叶病毒（TMV）是导致烟草花叶病的病原体之一，对
烟草产量影响极大。为培育抗TMV 的转基因烟草，科研人员进行了如图所示的操作。
据图回答下列问题：
(1)Ti 质粒中启动子的基本组成单位是______；启动子的功能是___________；载体中人工
构建的诱导型启动子，在诱导物存在时，可以______目的基因的表达。
PCR 技术及应用
热点聚焦
(2)农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内______的过程。
为将抗TMV 基因整合到烟草细胞的染色体DNA 上，应将其插入Ti 质粒的T-DNA 序列中，
该基因能整合到烟草细胞的染色体DNA 上的原理是____________________。
(3)过程①中应选择下列引物中的______（填字母），通过PCR 技术在抗TMV 基因的上游
加入限制酶SpeⅠ的识别序列。为构建正确的重组质粒，还应在该基因的下游加入限制酶
______的识别序列。
a.
b.
c.
d.
(4)过程②中，一般要用
处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一种____的生理状态，从
而提高重组质粒进入农杆菌细胞的效率。
(5)为培育转基因烟草植株，过程④⑤的培养基中需添加生长素和细胞分裂素，原因是
________。
1．（2026·湖北襄阳·二模）华中科技大学朱斌团队从深海火山细菌体内的噬菌体中发现了
一种不依赖于引物的DNA 聚合酶，该聚合酶可在没有引物的情况下参与DNA 合成，与
PCR 反应相比，下列叙述正确的是（ ）
A．PCR 反应中，DNA 聚合酶可在引物的5'端添加游离的脱氧核苷酸
B．该DNA 聚合酶易在噬菌体中引入基因突变和染色体变异，利于在复杂多变的深海
环境中生存
C．PCR 反应包括变性、复性、延伸三个阶段，延伸阶段的温度最高，复性阶段的温度
最低
D．深海火山的环境有利于DNA 解旋成单链，该噬菌体的DNA 复制过程可能需要
Mg2+的参与
2．（2026·山东济宁·二模）下列关于DNA 的粗提取、鉴定、扩增与电泳的叙述，正确的
是（ ）
A．提取到的白色丝状物直接与二苯胺试剂混合，沸水浴加热后变蓝
B．DNA 电泳后，被染色的DNA 需置于波长为300nm 的紫外灯下观察
C．凝胶载样缓冲液中加入的指示剂能与DNA 分子结合，用于观察电泳进程
D．PCR 扩增时a 个DNA 模板分子完成30 轮循环共需要a×（230-2）个引物
3．（2026·内蒙古包头·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的
是（ ）
A．PCR 扩增DNA 片段时DNA 双链的解聚原理与细胞内相同
B．耐高温的DNA 聚合酶可直接在模板链的3′端从头合成子链
C．电泳可鉴定不同长度的DNA 分子是因为它们在凝胶中的迁移速率不同
D．染色后的凝胶条带的位置可以反映DNA 分子碱基序列的组成
4．（2026·河北保定·二模）实时荧光定量PCR（qPCR）通过在反应体系中加入荧光探针，
实时监测PCR 产物量的变化，进而实现核酸的定量分析（其中荧光强度与PCR 产物量呈
正相关）。Ct 值指荧光信号达到设定阈值时的循环数。下列关于qPCR 的叙述错误的是
（ ）
A．qPCR 实验结果中，Ct 值越大，说明初始模板核酸的量越少
B．可通过该技术检测样本中病毒核酸的含量，为传染病的诊断提供依据
C．不同浓度的初始核酸样品与其所对应的 Ct 值绘制成的坐标曲线属于数学模型
D．qPCR 实验中，引物需与模板DNA 互补配对，且引物含量越多越好
5．（2026·浙江嘉兴·二模）人类X 染色体上的DMD 基因发生某些外显子缺失会导致DMD
症。检测方法是针对每个外显子的特定序列，设计二段独特的单链DNA 探针，每段探针
包含两部分序列：特异性序列和通用引物序列。检测时先对受检者的DNA 进行变性，再
加入探针并退火，如果受检者该外显子序列正常存在，退火时对应的探针两部分会紧邻地
结合上去，退火后加入连接酶将两段探针连接成一个完整的探针分子（如图所示）。连接
后加入通用引物等物质进行PCR，最后将扩增产物进行电泳分离并分析结果。
下列叙述正确的是（ ）
A．PCR 时，用于扩增不同外显子的引物是不同的
B．PCR 时，未成功连接的探针不能与引物结合
C．电泳分离时，女性携带者会出现某个外显子对应条带的缺失
D．电泳分离时，男性患者会出现某个外显子对应条带的缺失
6．（2026·山东枣庄·二模）荧光定量PCR 技术是在常规PCR 基础上添加了荧光探针，可
以通过荧光强弱来反映DNA 合成量的多少。荧光探针是一段单链的与目的基因特异性互
补片段，其5′端含荧光基团（R），3′端含淬灭基团（Q）。由于淬灭基团与荧光基团距离
太近，荧光探针不发荧光如图一，随着DNA 的合成，探针被降解，从而发出荧光如图二。
PCR 的产物一般通过电泳技术进行分离，下列说法错误的是（ ）
A．如图所示PCR 进行n 轮，分解的探针数量为2n-1
B．相同长度的线性DNA 和质粒的电泳速度不同
C．电泳缓冲液可以用于配制琼脂糖溶液
D．探针被降解是由于DNA 聚合酶可以从其3′端切开磷酸二酯键
