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压轴题05 生物技术与工程
命题预测
生物技术是高考中的重要板块，包括基因工程、细胞工程以及发酵工程、PCR 技
术应用广泛，可用于新冠病毒的核酸检测等基本内容，是近几年高考试题的命题热
点，在考试中经常会与细胞代谢、基因等进行综合考查，难度从简单到困难都有所涉
及，需要考生在复习中认真对待。
预计2025 年命题会继续在上述几个方面进行。通过近几年的高考题研究发现，生
物高考越来越重视在现实情景中考查考生运用知识解决实际问题的能力。从这个角度
看，生物技术和工程问题一直是考查的重点内容。这是因为，现代生物学的实际问
题，不论是科学研究还是生产实践，都要通过生物技术和生物工程解决。而生物技术
和生物工程又是建立在生命科学原理的基础上的。这样就形成了生物科学一生物技术
和工程一科学研究和生产实践一条主线。生物技术和工程起到连接科学原理和实际问
题的桥梁的作用。明白了这一部分的地位，考生的备考策略就要从生物科学原理出
发，理解生物技术与工程，再利用这些技术解决实际问题。
高频考法
（1）微生物的选择培养、鉴定和计数
（2）植物细胞工程和动物细胞工程的比较
（3）限制酶的选取与基因表达载体的构建
（4）分析基因编辑方案，学会科学探究、发现并解决问题
密押典例 01 微生物的选择培养、鉴定和计数
（2024·天津·高考真题）实验中常根据菌落外表特征鉴别微生物，进而对实验结果做出判断，下列实验不
是根据菌落外表特征做出判断的是（ ）
A．艾弗里证明肺炎链球菌的转化因子是DNA
B．判断分离酵母菌的固体培养基是否被毛霉污染
C．利用浸有抗生素的滤纸片筛选大肠杆菌中耐药性强的菌株
D．判断在尿素为唯一氮源的培养基上生长的尿素降解菌是否有不同种类
【答案】C
【分析】1、在艾弗里证明遗传物质是DNA 的实验中，艾弗里将S 型细菌的DNA、蛋白质、糖类等物质分
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离开，单独的、直接的观察它们各自的作用。另外还增加了一组对照实验，即DNA 酶和S 型活菌中提取
的DNA 与R 型菌混合培养。
2、培养酵母菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染．对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种
的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。
3、抗生素消灭细菌的原理是抑制细菌细胞壁的合成、与细胞膜相互作用、干扰蛋白质的合成以及抑制核
酸的复制和转录等。利用浸有抗生素的滤纸片筛选大肠杆菌中耐药性强的菌株可从抑菌圈边缘菌落挑取大
肠杆菌，可能获得目的菌株。
4、将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养。分解尿素的微生
物能在该培养基上生长繁殖，而不能利用尿素的微生物不能生长繁殖，这是因为只有能够分解尿素的微生
物能够产生脲酶，从中获取氮源。
【详解】A、艾弗里将S 型细菌的DNA、蛋白质、糖类等物质分离开，单独的、直接的观察它们各自的作
用进行对比，R 型肺炎双球菌没有荚膜（菌落表面粗糙），S 型肺炎双球菌有荚膜（菌落表面光滑），该
实验是通过观察培养基上形成的不同菌落特征，来判断转化是否成功的，A 不符合题意;
B、毛霉属于多细胞的真菌，由细胞形成菌丝，可根据毛霉的形态判定固体培养基是否是被毛霉污染了，B
不符合题意;
C、抗生素可消灭细菌，利用浸有抗生素的滤纸片筛选大肠杆菌中耐药性强的菌株是从抑菌圈边缘菌落挑
取大肠杆菌来获得目的菌株，没有依靠菌落外表形态特征做出判断，C 符合题意;
D、不同尿素降解菌降解尿素的能力不同，因此在分离出的以尿素为唯一氮源的尿素降解菌后，若要验证
其中是否有不同种类降解菌，可在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的
菌种，若根据菌落周围出现红色环带的大小判定其种类，D 不符合题意。
故选C。
思维建模
解题关键—破译新情境
情境信息
化新为熟
题图
信息
拟杆菌新菌株在以不同物质为碳
源时的细胞数：纤维素>木聚糖>
果胶>甘露聚糖>淀粉
拟杆菌可降解难降解的多糖物质：纤维素、木
聚糖、果胶等；拟杆菌新菌株在以纤维素为碳
源时生长状况最好
题肢
信息
设问(1)：为了获得纯种培养物
纯种培养需利用选择培养基筛选，接种方法有
稀释涂布平板法和平板划线法
设问(2)：将采集的样品置于各种
培养基中培养，仍有很多微生物
不能被分离筛选出来
深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷
泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的
特定环境中才能存活)
设问(3)：从生态系统组成成分的
角度考虑
拟杆菌为异养生物，可作为该生态系统的分解
者
设问(4)：深海冷泉环境特殊
深海冷泉附近温度较低，此环境下生存的拟杆
菌所分泌的各种酶，都应具有耐低温的特性
密押典例 02 植物细胞工程
（2024·江苏·高考真题）图示植物原生质体制备、分离和检测的流程。下列相关叙述正确的是（ ）
A．步骤①添加盐酸以去除细胞壁
B．步骤②吸取原生质体放入无菌水中清洗
C．原生质体密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间
D．台盼蓝检测后应选择蓝色的原生质体继续培养
【答案】C
【分析】植物的体细胞杂交是将不同植物的细胞通过细胞融合技术形成杂种细胞，进而利用植物的组织培
养将杂种细胞培育成多倍体的杂种植株。植物体细胞杂交依据的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能
性。
【详解】A、步骤①添加纤维素酶或果胶酶去除细胞，其原理是酶的专一性，A 错误；
B、步骤②吸取原生质体放入等渗液中清洗，否则会导致原生质体吸水涨破，B 错误；
C、结合图示可知原生质体处于甘露醇和蔗糖溶液之间，因而可推测原生质体的密度介于图中甘露醇和蔗
糖溶液密度之间，C 正确；
D、台盼蓝检测后应选择无色的原生质体继续培养，染成蓝色的原生质体活性差或死亡，D 错误。
故选C。
思维建模
解题关键—准确理解概念
信息
概念迁移
信息①
结合植物细胞培养的概念，该技术获得细胞代谢产物可利用发酵工程等手
段实现工厂化生产，且复杂的细胞代谢产物化学途径可能无法合成；该技
术也是通过细胞大量增殖获取产物，而不是利用单个细胞的产量增加
信息②
联系次生代谢物的概念，明确其不是植物生长所必需的
密押典例 03 动物细胞工程
（2024·重庆·高考真题）自然条件下，甲、乙两种鱼均通过体外受精繁殖后代，甲属于国家保护的稀有物
种，乙的种群数量多且繁殖速度较甲快。我国科学家通过下图所示流程进行相关研究，以期用于濒危鱼类
的保护。下列叙述正确的是（ ）
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A．诱导后的iPGCs 具有胚胎干细胞的特性
B．移植的iPGCs 最终产生的配子具有相同的遗传信息
C．该实验中，子一代的遗传物质来源于物种甲
D．通过该实验可以获得甲的克隆
【答案】C
【分析】胚胎移植的基本程序主要包括：①对供、受体的选择和处理。②配种或人工授精。③对胚胎的收
集、检查、培养或保存。④对胚胎进行移植。⑤移植后的检查。
体外受精主要包括：卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精。
【详解】A、胚胎干细胞具有发育的全能性，iPGCs 是诱导型原始生殖细胞，具有成为卵原细胞或精原细
胞的潜能，诱导后的iPGCs 不具有胚胎干细胞的特性，A 错误；
B、移植的iPGCs 分化形成卵原细胞或精原细胞后，通过减数分裂形成配子，在减数分裂过程中基因会发
生重组，最终产生的配子的遗传信息不一定相同，B 错误；
C、由图可知，将物种甲的囊胚期的iPGCs 移植到阻止PGCs 形成的乙鱼的胚胎中，培育出的乙鱼的生殖腺
中的细胞由甲鱼的iPGCs 增值分化而来，该乙鱼再与物种甲杂交，配子均是由物种甲的生殖腺细胞产生，
故子一代的遗传物质来源于物种甲，C 正确；
D、克隆属于无性繁殖，该实验过程中涉及到有性生殖，D 错误。
故选C。
思维建模
解题关键—科学思维
密押典例 04 限制酶的选取与基因表达载体的构建
（2024·广西·高考真题）β-地中海贫血是人11 号染色体上β-珠蛋白基因HBB 突变所造成的遗传病。如图为
HBB 几种常见的基因突变位点及功能区域示意图。回答下列问题：
注：-28A→C 中，“-”表示转录起始位点前，数值表示碱基位点，A→C 表示碱基A 突变为C；仅标示了非
模板链上的变化，模板链也发生对应变化，但没有标示出来。
(1)654C→T 突变， （选填“会”或“不会”）增加该基因嘌呤碱基总数量。-28A→C 突变，会导致
β-珠蛋白的表达异常，其原因是 。
(2)HBB 在转录形成mRNA 的过程中，细胞核内特定RNA 复合物能特异性识别初级转录产物（mRNA 前
体），并将内含子对应区域剪切以及拼接外显子对应区域，这表明上述RNA 复合物是一种 。
(3)含有17A→T 突变的HBB 转录出的mRNA，对应位点的碱基是 。
(4)某男性一条染色体上的HBB 存在突变位点W，其配偶无W 突变，他们生育的孩子 （选填“一
定”或“不一定”）存在该突变，从遗传概率角度分析，其原因是 。为有效降低人群中β-地中海贫
血的发病率，可以采取 和 等措施。
【答案】(1) 不会 启动子区域发生碱基替换，使RNA 聚合酶无法识别和结合，从而影响转录和
翻译水平，使B-珠蛋白合成异常。
(2)酶（特异性酶）
(3)U（尿嘧啶）
(4) 不一定 孩子有50%概率不含该突变 遗传咨询 产前检测
【分析】1、DNA 分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变。
基因突变若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代。若发生在体细胞中，一般不能遗传。但有些植物
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的体细胞发生了基因突变，可以通过无性生殖遗传。
2、通过遗传咨询和产前诊断等手段，对遗传病进行检测和预防，在一定程度上能够有效地预防遗传病的
产生和发展。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合
酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）依题意，654C→T 突变是指非模板链上的第654 位碱基C 突变为T，模板链也发生对应的
654G→A 变化，故654C→T 突变不会增加该基因呤碱基总数量。据图可知，基因的第28 位碱基位于基因
的启动子上，-28A→C 突变，启动子区域发生碱基替换，使RNA 聚合酶无法识别和结合，从而影响转录和
翻译水平，使B-珠蛋白合成异常。
（2）依题意，RNA 复合物能特异性识别mRNA 前体，并将内含子对应区域剪切以及拼接外显子对应区域，
则该复合物使RNA 的化学键发生了断裂和形成，故上述RNA 复合物应是一种酶（特异性酶）。
（3）依题意，17A→T 表示基因非模板链上的变化，基因非模板链的碱基排序与对应的mRNA 碱基排序相
同，故含有17A→T 突变的HBB 转录出的mRNA，对应位点的碱基变化是由17A→U，即对应位点的碱基
是U。
（4）β-地中海贫血是人11 号染色体上β-珠蛋白基因HBB 突变所造成的遗传病，即β-地中海贫血为常染色
体上基因控制的遗传病。该男性一条染色体上的HBB 存在突变位点W，另一条染色体上基因是正常的，
且其配偶无W 突变，故其子代有50%概率不含该突变，他们生育的孩子不一定存在该突变。通过遗传咨询
和产前诊断等手段，对遗传病进行检测和预防，在一定程度上能够有效地预防遗传病的产生和发展。故为
有效降低人群中β-地中海贫血的发病率，可以采取遗传咨询和产前检测等措施。
思维建模
解题关键—破译新情境
情境信息
化新为熟
题干
信息
某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白
UBC 可使P 被蛋白酶识别并降解，药物
A 可通过影响这一过程对该病起到治疗
作用
FLAG 是一种短肽，连接在P 或P△的氨
基端，使融合蛋白能与含有FLAG 抗体
的介质结合
融合蛋白FLAG-P 和FLAG-P△可与FLAG 抗体
特异性结合，被筛选或识别出来
题肢
信息
设问(1)：为构建重组载体，需先设计引
物，通过PCR 特异性扩增P 基因
引物是一小段能与DNA 模板链互补的短单链核
酸；DNA 延伸方向是模板链的3′端→5′端
图甲：DNA 编码链为转录时所用模板链
的互补链
DNA 编码链中核苷酸序列与该基因转录的
mRNA 序列一致(RNA 中U 取代DNA 中的T)
设问(3)：各组样品混匀后分别流经含
FLAG 抗体的介质，分离出与介质结合
只有同时含有FLAG-P 和UBC 的复合物才能与
FLAG 抗体和 UBC 抗体特异性结合，即检测结
的物质并用 UBC 抗体检测
果中有显示
密押典例 05 分析基因编辑方案，学会科学探究、发现并解决问题
（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD 构
建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA
片段，序列为：限制酶a 识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b 识别序列，50 为重复次数。请
回答下列问题：
(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a 和限制酶b 分别是 。
(2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有
的培养基进行筛选。用PCR 技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA 聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基
酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD 抗体进行杂交，显
示的条带应是 （从图2 的“A~D”中选填）。
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl 对SOD-ELP50蛋白纯化效
果的影响，部分结果如图3。
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（ⅰ）20℃时，加入NaCl 后实验结果是 。
（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。
（ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。
【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ
(2) CaCl2 卡那霉素 S-F 和P-R
(3) 启动子 C
(4) SOD-ELP50 组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl 有利于SOD 蛋白纯
化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持
【分析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图
可知，PCR 扩增SOD-ELP50 时，应选择引物S-F 和E-R。
【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50 应插入pET-SOD 之后，由图
可知，限制酶a 和限制酶b 分别是EcoR I、Hind Ⅲ。
（2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2 处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA 分子的状态。由图可知，
重组DNA 含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。
成功导入pET-SOD-ELP50 同时含有pET-SOD 和ELP50，结合图示可知，引物S-F 和P-R 对应序列包含
SOD 和ELP50 的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50 进行扩增，根据扩增产物相对的分子质量的大小
判断大肠杆菌中是否导入pET-SOD-ELP50。由于ELP50 中含有重复序列，使用E-F 或E-R 对导入普通质粒
和重组质粒的大肠杆菌进行PCR 扩增，得到的产物可能无法区分。
（3）RNA 聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50 融合蛋白的基因长度为
462+750=1212bp，编码1212÷3=404 个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为
0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。
（4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl 后纯化蛋白数量更多。
（ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。
（ⅲ）20℃，加入NaCl 时，较SOD，SOD-ELP50 组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl
有利于SOD 蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。
思维建模
解题关键—破译新情境
1．（2025·江西·二模）羊乳的成分更接近于人乳，可作为牛乳过敏体质者最理想的替代乳品。但研究表明
山羊乳中
乳球蛋白也是引起人体过敏反应的一种主要致敏原，为实现羊乳“人源化”改造，研究人员
利用CRISPR/Cas9 系统敲除了山羊乳腺细胞中致敏原β-乳球蛋白（BLG）基因，同时在相应位点导入人乳
铁蛋白（hLF）基因。该研究为培育羊乳中低致敏原和富含人乳铁蛋白功能营养成分的转基因山羊新品种
提供了科学依据。下图为研究人员利用该技术获得转基因山羊的操作过程。回答下列问题：
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(1)上述技术中的目的基因是 ，可通过PCR 技术快速扩增目的基因，扩增时引物的作用是 。
(2)CRISPR/Cas9 系统主要包含向导RNA 和Cas9 蛋白两个部分，利用CRISPR/Cas9 系统敲除山羊乳腺细胞
中致敏原β-乳球蛋白（BLG）基因时，科研人员设计了sgBLG 引导序列，sgBLG 能够通过 与山羊基
因组中BLG 基因座的第一外显子（Ex1）中的靶位点序列为5'-TATACTGGCGAGCCGTA-3'结合。则
sgBLG 引导序列3'端的前7 个碱基为 。
(3)Cas9 蛋白类似于基因工程中常用到的 酶，但Cas9 蛋白特性与该酶的区别是 。
(4)检测发现过程②中，hLF 基因成功插入在母羊乙成纤维细胞中的一条常染色体上。上图过程①②运用到
的技术有 ，过程③④⑤中，运用到的技术有 （编号选填）。
①显微注射技术②动物细胞培养技术③胚胎移植技术④DNA 重组技术⑤动物细胞融合技术⑥细胞核移植
技术
(5)筛选后得到的早期胚胎细胞中没有检测到该蛋白，能否说明目的基因没有成功导入并表达，理由是
。
【答案】(1) 人乳铁蛋白基因（HLF 基因） 使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷
酸
(2) 碱基互补配对 AUAUGAC
(3) 限制性内切核酸（限制） Cas9 蛋白没有限制性内切核酸酶所具有的专一识别DNA 分子特定
核苷酸序列的特性
(4) ①④ ②③⑥
(5)不能，人乳铁蛋白（目的）基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达
【分析】基因工程的操作步骤
（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因
导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定
等。
【详解】（1）本研究是为了培育羊乳中低致敏原和富含人乳铁蛋白功能营养成分的转基因山羊新品种，
因此目的基因是人乳铁蛋白基因（HLF 基因），可通过PCR 技术快速扩增目的基因，扩增时引物的作用是
使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（2）sgBLG 通过碱基互补配对与山羊基因组中BLG 基因座的第一外显子（Ex1）中的靶位点结合。
sgBLG 靶位点的5′端的7 个碱基为TATACTG，根据碱基互补配对原则，该sgBLG 引导序列的3′端的前7
个碱基为AUAUGAC。
（3）Cas9 蛋白可切割DNA，类似于基因工程中常用到的限制酶，但Cas9 蛋白特性与该酶的区别是Cas9
蛋白没有限制性内切核酸酶所具有的专一识别DNA 分子特定核苷酸序列的特性。
（4）上图过程①是基因替换，属于DNA 重组技术，②是将目的基因导入受体细胞，用到显微注射技术，
因此运用到的技术有①②，过程③是核移植，④是早期胚胎培养，即需要动物细胞培养技术，⑤为胚胎移
植，因此运用到的技术有②③⑥。
（5）人乳铁蛋白（目的）基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达，因此在的早期胚胎细胞中不表达，
没有检测到该蛋白不能说明目的基因是否成功导入。
2．（2025·河南·模拟预测）水稻基因组中的B 基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不能转录。
为研究B 基因表达对卵细胞的影响，科研人员设计了如图所示的实验。回答下列问题：
(1)构建表达载体时，将水稻B 基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc 基因拼接成B—Luc 融合基因，其目的
是 。表达载体中潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为 ，可用于筛选含有表达载体的水
稻细胞。启动子是 识别和结合的部位，能驱动基因转录。
(2)图中①过程常采用感受态细胞法，是利用 处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中
DNA 分子的生理状态。②过程中，农杆菌侵染水稻愈伤组织，使T-DNA 整合到水稻细胞的 上。
鉴定筛选水稻幼苗时，检测指标除了幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还可以检测 。
(3)若转基因植株中B 基因在卵细胞中正常表达，与野生型相比，其受精能力可能发生改变。为验证这一推
测，可进行杂交实验：让转基因植株作母本，野生型植株作父本进行杂交，同时设置 作为对照，
统计并比较 。
【答案】(1) 便于检测B 基因在卵细胞中的表达情况 标记基因 RNA 聚合酶
(2) Ca2+ 染色体DNA 是否有荧光
(3) 野生型植株作母本，野生型植株作父本的杂交实验 两组实验的子代数量
【分析】图中①表示将目的基因导入农杆菌，②表示采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，之后再
采用植物组织培养技术获得转基因植株。
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【详解】（1）荧光素酶Luc 基因表达的产物可通过特定方法检测，将水稻B 基因编码蛋白的序列与荧光
素酶Luc 基因拼接成B—Luc 融合基因，就能通过检测荧光来判断B 基因在卵细胞中是否表达以及表达情
况。潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为标记基因，使含有表达载体的水稻细胞能在含有潮霉素或卡
那霉素的培养基中存活，可用于筛选。启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，只有结合后才能驱动基
因转录。
（2）采用感受态细胞法将表达载体导入农杆菌时，通常利用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收
周围环境中的DNA 分子的生理状态。农杆菌中的Ti 质粒上的T—DNA 可转移至受体细胞，并整合到水稻
细胞的染色体DNA 上。因为构建了B—Luc 融合基因，所以除了检测幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，
还能通过检测是否有荧光（或荧光强度）来判断融合基因是否表达，进而判断B 基因的表达情况。
（3）为验证转基因植株中B 基因在卵细胞中正常表达时其受精能力可能发生改变的推测，可让转基因植
株作母本，野生型植株作父本进行杂交，同时设置野生型植株作母本，野生型植株作父本的杂交实验作为
对照，通过统计并比较两组实验的子代数量，如果两组子代数量有明显差异，就可以说明转基因植株卵细
胞的受精能力发生了改变。
3．（2025·辽宁抚顺·模拟预测）重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是一种新型恒温核酸扩增技术，它利用重
组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶，在39℃条件下实现对核酸的快速扩增。其具体过程如下图所示，请
回答下列相关问题：
(1)新型核酸扩增技术——RPA 是在PCR 技术的基础上发展而来的，它极大的简化了实验流程。据上图可
知，RPA 的原理是 。除快速之外，RPA 还具有的其它优势是 （答出1 点即可）。
(2)在RPA 反应中，首先 与重组酶结合，在重组酶作用下识别并与模板DNA 结合。在子链延伸的过
程中，被置换出的 （模板链/非模板链）与单链结合蛋白暂时结合。
(3)某实验兴趣小组在进行RPA 实验前设计了两对引物，如下表所示。应选择 （引物对1/引物对2）
更适合，原因一是 ；原因二是引物越短，其特异性越 （高/低）。
引物对1
5’-GACCACTCTGAA-3’
5’-TTCAGAGTGGTC-3’
引物对2
5’-CGTTAGATCTTTTACAACTGCATAATG-3’
5’-GATATTGAGAATTCGCCAAAGGCTACC-3’
(4)冬季患流感的人数增多， （能/不能）直接利用RPA 扩增流感病毒的核酸，其理由是 。
【答案】(1) DNA 半保留复制 RPA 恒温扩增，PCR 三个阶段温度不同
(2) 引物 非模板链
(3) 引物对2 引物对1 碱基互补配对无法结合模板DNA 低
(4) 不能 流感病毒遗传物质为RNA，不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA 再进行扩增
【分析】PCR 技术：（1）概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合
成技术。（2）原理：DNA 半保留复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一
对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）（5）过程：
高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低
温复性：引物结合到互补链DNA 上；中温延伸：合成子链。
【详解】（1）据题干信息和题图分析可知，RPA 是在PCR 技术基础上发展而来的新型恒温核酸扩增技术。
故RPA 的原理是DNA 半保留复制。除了快速扩增这一显著优势外，RPA 还具有操作简便（因为RPA 恒温
扩增，PCR 三个阶段温度不同）、对设备的要求低（不需要高精度的热循环仪等复杂设备）以及对样本的
适应性强（可以扩增各种来源的DNA，包括复杂样本中的微量DNA）等优势。
（2）据题干信息和题图分析可知，在RPA 反应中，首先引物会与重组酶结合，形成引物-重组酶复合物。
这个复合物在重组酶的作用下能够识别并结合到模板DNA 的一条链上（这条链被称为模板链，而另一条
被置换出的链则被称为非模板链）。在子链延伸的过程中，被置换出的非模板链会与单链结合蛋白暂时结
合，以防止其干扰新链的合成。这样，RPA 反应就能够持续进行，实现核酸的快速扩增。
（3）RPA 是一种恒温核酸扩增技术，它要求引物能够特异性地识别并结合到模板DNA 上，从而启动扩增
反应。因此，在选择引物时，需要考虑引物的长度、特异性以及与其他序列的互补性等因素。故应该选择
引物对2 更适合，因为引物对1 可能存在与其他序列非特异性结合的风险，导致其碱基互补配对无法结合
模板DNA，同时引物越短，其特异性越低。
（4）冬季患流感的人数增多时不能直接利用RPA 扩增流感病毒的核酸。因为RPA 技术是基于DNA 的扩
增技术，它需要双链DNA 模板来进行扩增。而流感病毒的遗传物质是RNA。因此，在利用RPA 扩增流感
病毒的核酸之前需要先将流感病毒的RNA 逆转录成cDNA，然后再以cDNA 为模板进行RPA 扩增。所以
不能直接利用RPA 扩增流感病毒的原始RNA 核酸。
4．（2025·四川遂宁·二模）A 蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研
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团队利用无缝克隆技术将A 蛋白结合蛋白基因（P 基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS 基因）融合，构建A
蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥（一种草本植物）进行实验。相关原理、过程及质粒的结构
如图所示。请分析回答：
(1)无缝克隆原理图中，过程①中T5 核酸外切酶沿 的方向水解DNA，其目的是形成 。过程③
所需的酶有 。
(2)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术可实现多个片段的连接，且操作时间短、成功率高。NEB 官方
的无缝克隆线上设计软件强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp。请推测无缝克隆
技术不适合连接小于50bp 小片段的原因： 。
(3)图中利用无缝克隆技术构建GUS-P 融合基因的关键是引物F1与引物 的 端互补。
(4)图中利用双酶切法将融合基因插入Ti 质粒，应选用
限制酶为 。扩增GUS-P 融合基因所需的引
物R1序列（5'→3'）的设计依据为 （填序号：①同源序列②限制酶的识别序列③P 基因的部分序列
④GUS 基因的部分序列）。据图分析，引物R1和F2应分别为下列引物 。
①5'-TAAGTTGTCT……-3' ②5'-CTTGGATGAT……-3'
③5'-TCTGTTGAAT……-3' ④5'-ATTCAACAGA……-3'
(5)利用农杆菌转化法将目的基因导入拟南芥细胞后，进行植物组培。用 对组培苗进行筛选。已知葡
萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc 呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位
的组织分别加入X-Gluc 进行鉴定，结果如下表所示：
部位
根
茎
叶
完全培养液
蓝
色
浅蓝
浅蓝
缺磷培养液
深
蓝
蓝色
浅蓝
根据上表实验结果分析，该激素最主要的合成部位是 ，该激素的生理作用是 。
【答案】(1) 5'→3' 黏性末端 DNA 聚合酶和DNA 连接酶
(2)小片段的DNA 黏性末端之间容易随机结合，导致连接效率低且错误率高
(3) R2 5'
(4) BclI 和SmaI ②③ ②③
(5) 草甘膦 根 促进植物对磷元素的吸收
【分析】PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的
双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
2、模板DNA 与引物的退火（复性）：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板
DNA 单链的互补序列配对结合。
3、延伸：DNA 聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA 链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA 聚
合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA 片段长度。
【详解】（1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5 核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末
端。过程③缺口处DNA 链的补齐，可以看作DNA 分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA 聚合
酶将脱氧单核苷酸加到子链3′-OH 末端）和DNA 连接酶（将两个DNA 片段进行连接）。
（2）无缝克隆技术不适合连接小于50bp 的小片段，原因可能是小片段的DNA 黏性末端之间容易随机结
合，导致连接效率低且错误率高。此外，小片段的DNA 在操作过程中也更容易丢失或损坏，进一步降低
了连接的成功率。因此，NEB 官方的无缝克隆线上设计软件会强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示
最好不低于110bp，以确保连接的效率和准确性。
（3）DNA 的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS-P 融合基因的关键是引物F1 的3'端序列与
R2 引物的5'端序列互补。
（4）利用双酶切法将GUS-P 融合基因插入Ti 质粒的T-DNA 区，如果使用BamHI，会破坏抗性基因Tet'和
抗性基因Amp，故选择BclI 和SmaI。扩增GUS−P 融合基因所需的引物R1 序列的设计需要依据P 基因的
部分序列和限制酶的识别序列，故选②③。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA 的两条链分别作
模板，扩增融合基因所需的引物R1 和F2 应选用下列引物组合为3' 端序列可以与③5'-…
TCTGTTGAAT-3'配对，5'端序列的互补链可以与②5'-…CTTGGATGAT-3'配对，因此选用的引物组合为
②③。
（5）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别
是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培
养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc 呈蓝色，根据表格可知，在完全培
养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根
的颜色变为深蓝，而在含磷的完全培养液中出现蓝色，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收，
促进葡萄糖苷酸酶合成，水解X-Gluc 呈蓝色。
5．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E 蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的
表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1 中的vtg 基因与
图2 中Luc 基因载体连接，形成vtg-Luc 基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水
体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc 表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori 为复
制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI 为限制酶，→表示转录方向。
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注：图1DNA 片段不含有图2 所示限制酶的识别序列
(1)为使vtg 基因与Luc 基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc 基因载体可降低“空载”概
率。通过PCR 技术获取vtg 基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1 包含的碱基序列为5′
3′。（写出已知的所有碱基序列）
(2)将“vtg-Luc 基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含
的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。
(3)Luc 基因载体上有一段P2A 序列，其功能如图所示，据此推测P2A 的作用 。
(4)进一步研究发现，E 蛋白能与vtg 基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg 基因启动子
含区域1 和区域2，为研究E 蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1 和区域2
的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc 基因载体连接，连接位点位于Luc 基因的上游，形成两种重组载
体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。
【答案】(1) Bcl I 和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3'
(2) 卡那霉素 vtg 基因在肝脏中特异性表达
(3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质
(4) 受精卵 雌激素和荧光素
【分析】基因工程的步骤：
（1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA 文库中获取。
（2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA 重新组合的过
程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然
后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相
同效果）。
（3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与
运载体在生物体外连接形成重组DNA 分子后，下一步是将重组DNA 分子引入受体细胞中进行扩增。
（4）目的基因的检测和表达。
【详解】（1）由图可知，限制酶BsrGI 会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc 基因载体上存在两个
BamHI 识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种
限制酶，即选择BelI、HindIII 切割Luc 基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限
制酶的位置，因此需要在引物1 上添加限制酶BelI 识别序列，因此引物1 包含的碱基序列为
5′TGATCAAACTAT3′。
（2）Kanr 为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆
菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg 基因只在
肝脏中特异性表达。
（3）由图可知2A 肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A 有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白
质。
（4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因
斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。
6．（2025·山东青岛·一模）绿花百合生长在海拔1400 米至2250 米的山坡林下，花呈绿白色，气味芳香，
观赏性强，具有较高的研究和开发利用价值，是国家二级重点保护野生植物。
(1)绿花百合所在生物群落中决定地上植物分层的环境因素主要是 ；决定植物地下分层的环境因
素则是 等。绿花百合除观赏外，它的鳞茎也可供药用，这体现了生物多样性的 价值。
(2)百合叶螟会在百合叶子背面产卵，导致叶子出现褐色的斑点，影响其生长和美观。调查虫卵密度的常用
方法是 。百合叶螟大量繁殖会导致百合大量死亡，从生态平衡的角度分析，生态系统的
平衡受到破坏。
(3)研究小组研究了百合叶螟种群数量与被捕食率、补充率的关系，模型如图所示。被捕食率是指百合叶螟
被其天敌捕食的比率；补充率是指在没有被捕食的情况下，百合叶螟增长的比率。当其种群数量介于m 与
n 之间时，种群数量会逐渐稳定在 （填“m”或“n”），判断依据是 。
(4)某研究小组从百合生长的土壤中分离到一种单细胞真菌，配制了5mL 样液，对样液进行100 倍稀释后，
用血细胞计数板对其进行计数，结果如图。样液中真菌的个数约为 个。
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【答案】(1) 光照、温度 水分、无机盐 直接
(2) 样方法 结构
(3) m 被捕食率大于补充率，种群数量会逐渐下降而后稳定在m
(4)3 109
【分析】题图分析：图中显示的种群数量变化情况为，m 点之前种群数量增加，m 点之后种群数量下降，
逐渐在m 点稳定下来，n 点时种群数量达到平衡，高于n 点之后种群数量增大，p 点达到新的平衡点，高
于p 点之后，种群数量下降，然后在p 点稳定。
【详解】（1）绿花百合所在生物群落中决定地上植物分层的环境因素主要是光照、温度；决定植物地下
分层的环境因素则是水、无机盐等。绿花百合除观赏外，它的鳞茎也可供药用，这体现了生物多样性的直
接价值。
（2）虫卵几乎无活动能力，所以调查虫卵密度的常用方法是样方法。百合叶螟大量繁殖会导致百合大量
死亡，会打破生态系统的各组分的平衡，进而使生态系统的结构平衡遭到破坏。
（3）当吹绵蚧种群数量介于m 与n 之间时，补充率小于被捕食率，种群数量减少，最后维持在m 点。
（4）据图可知，一个中方格内有24 个单细胞真菌，因此一个大方格内单细胞真菌的数量为24 25=600 个，
一个方格的样本的体积为0.1mm3，0.1mm3=0.0001cm3=0.0001mL，则1mL 样液中真菌的数量为600 104
100=6 108 个，5mL 样液中，单细胞真菌的数量为5 6 108=3 109 个。
7．（2025·河北石家庄·一模）草甘膦是一种广泛使用的除草剂，对大多数植物都具有杀灭作用。为在作物
生长期间定向除草，研究人员改变芥菜EPSPS 基因特定位点，将其导入芥菜，培育出了抗草甘膦的新品种，
操作流程如图。回答下列问题：
(1)过程①为 ，其需要在缓冲液中进行，缓冲液的作用是 ；①与②（PCR）的反应体系相比不
同点有 （答出两点即可）。
(2)以cDNA 为模板扩增EPSPS 基因后一般通过 鉴定产物，并置于 下观察结果。
(3)芥菜EPSPS 基因定点突变原理如图2 所示，引物2 的部分核苷酸序列为5'－
GAATAGTCATGCGTTCACTC…－3'，请据此补充引物3 的核苷酸序列5'－GTGAACGCATGA …－
3'，引物3 与反义链相应的核苷酸序列 （填“相同”或“不同”）。
(4)研究人员将突变基因插入T－DNA 的绿色荧光蛋白基因上游，如图3。为使两个基因融合表达以确定
EPSPS 在细胞的位置，需要去除突变基因的 序列。
【答案】(1) 逆转录 维持反应体系的pH 稳定，并提供酶所需的离子环境（如Mg²⁺） ①
（反转录）需要逆转录酶，而PCR 需要耐高温的DNA 聚合酶（如Taq 酶）；反转录的引物为oligo(dT)或
随机引物，而PCR 需要特异性引物
(2) 琼脂糖凝胶电泳 紫外灯
(3) CTATTC 不同
(4)终止子
【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将
目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）过程①将RNA 转化为cDNA，属于逆转录。 缓冲液为酶反应提供适宜环境，包括pH 和
离子条件，缓冲液的作用是维持反应体系的pH 稳定，并提供酶所需的离子环境（如Mg²⁺）。 反转录
与PCR 的差异主要体现在酶、引物类型及反应温度（如反转录无需高温循环），①（反转录）需要逆转录
酶，而PCR 需要耐高温的DNA 聚合酶（如Taq 酶）；反转录的引物为oligo(dT)或随机引物，而PCR 需要
特异性引物。
（2）PCR 产物通常通过琼脂糖凝胶电泳分离，DNA 与溴化乙锭（EB）结合后，在紫外灯下显示荧光条带。
（3）根据图示信息可知，引物2 和引物3 有部分序列是互补的，由此可知引物3 需补充序列为5'－
CTATTC…－3'，在PCR 中，引物需与模板链的3'端互补。若反义链为模板，引物3 的序列应与反义链互补
（即与正义链相同）。题目中引物3 的序列设计为与反义链互补，但是由于是进行基因定点突变，所以引
物3 与反义链对应区域的核苷酸序列不同。
（4）为使EPSPS 突变基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达，需确保转录连续进行。去除EPSPS 基
因的终止子可防止转录提前终止，使两个基因共同表达为融合蛋白。
8．（2025·山西晋中·三模）全球气候的异常变化、水资源的短缺，使耐旱作物成为一个重要的育种目标。
在植物中，冷休克蛋白（CspB）被证明能够在逆境条件下发挥作用。科学家将来自枯草芽孢杆菌的CspB
基因导入玉米中，可以提高玉米的抗旱能力，并且在干旱处理条件下，转基因植株的光合速率和生长状态
明显优于对照组，相关操作流程如下图所示。请回答下列问题：
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(1)为了获取足够量的CspB 基因，常用PCR 技术进行扩增。扩增时设计引物的目的是 。
(2)构建重组Ti 质粒时，需要使用限制酶切割Ti 质粒的 片段，通过① 菌的转化作用，可使
目的基因进入玉米叶片细胞。为提高转化效率，转化前需用
处理该菌，使其处于 的生理状态。
(3)②技术影响细胞发育方向的关键激素有 ，欲探究上述激素的使用比例对细胞发育方向的影响，
实验组对激素比例的处理分别为 。
(4)CspB 基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，还需要进行个体生物学水平的鉴定，请
简要写出鉴定思路： 。
【答案】(1)使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(2) T—DNA 农杆 一种能吸收周围环境中DNA 分子
(3) 生长素、细胞分裂素 生长素与细胞分裂素用量的比值为1、比值大于1、比值小于1
(4)在干旱处理条件下，比较转基因玉米与常规玉米的光合速率和生长状态
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）为获取足够量的CspB 基因，常用PCR 技术特异性获取并快速扩增目的基因，此技术需要设
计严格与目的基因互补的引物序列，目的是使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（2）农杆菌细胞中含有的Ti 质粒上的T—DNA 可转移并整合到受体细胞的染色体DNA 上，根据这一特
点，使用限制酶切割Ti 质粒的T—DNA 片段，将目的基因插入Ti 质粒的T—DNA 中，通过农杆菌的转化
作用，可使目的基因进入玉米叶片细胞。转化前用
处理该菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA
分子的生理状态，可提高转化效率。
（3）②为植物组织培养技术。在植物组织培养的不同时期，培养基中生长素、细胞分裂素的浓度和比例
是影响玉米叶片细胞发育方向的关键激素。欲探究上述激素的使用比例对细胞发育方向的影响，需要设计
生长素与细胞分裂素用量的比值为1、比值大于1、比值小于1 等组别的实验。
（4）CspB 基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，还需要进行个体生物学水平的鉴定，
可在干旱处理条件下，比较转基因玉米与常规玉米的光合速率和生长状态。
9．（2025·贵州毕节·二模）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存
在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT 基因导入大肠杆菌构建工
程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA 的核苷酸序列设计了相应的引物（如下图），通过PCR 扩增MT 基因。已知A 位
点和B 位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置，选用的引物组合应为 。
(2)本实验中，PCR 所用的DNA 聚合酶扩增出的MT 基因的末端为平末端。由于载体E 只有能产生黏性末
端的酶切位点，需借助载体P 才能将MT 基因接入载体E 中。载体P 和载体E 的酶切位点及相应的酶切序
列如下图所示。
①选用 酶将载体P 切开，再用 （选填“T4 DNA”或“E.coli DNA”）连接酶将MT 基因与载
体P 相连，构建重组载体P'。
②载体P'不具有表达MT 基因的 ，选用 酶组合对载体P'和载体E 进行酶切，将切下的MT
基因和载体E 用DNA 连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 处理的大肠杆菌，筛选出工程菌。
(3)将普通大肠杆菌和MT 工程菌分别培养在含 的培养液中，从个体水平检测MT 工程菌是否培育
成功。
【答案】(1)引物2 和引物3
(2) EcoR V T4 DNA 启动子和终止子 XhoI 和PstI Ca2+
(3)重金属
【分析】1、PCR 扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列。
2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的
基因的检测与鉴定。
【详解】（1）密码子位于mRNA 上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和
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结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A 和位点B 的两侧，故选择引物1 和引物4。
（2）①MT 基因的末端为平末端，根据图中不同限制酶识别的序列和切割位点可知，需要用EcoRⅤ或
SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E 连接，故需将MT 基因插入Xho I 和Pst I 两个酶
切位点之间，故选EcoRⅤ将载体P 切开；由于E·coli81DNA 连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA 连接酶
可以连接平末端，而MT 基因的末端为平末端，故需要用T4DNA 连接酶将MT 基因与载体P 相连，构成重
组载体P′。
②据图可知，载体P 不含启动子和终止子，构建的载体P′是重组质粒，也不含有有表达MT 基因的启动子
和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E 均含有
XhoI 和PstI 酶，故可选用XhoI 和PstI 酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法，可
以增大细胞膜的通透性，使目的基因更容易转入宿主细胞。
（3） 金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用，将普通
大肠杆菌和MT 工程菌分别培养在含重金属的培养液中，从个体水平检测MT 工程菌是否培育成功。
10．（2025·河南·二模）我国科研人员利用多种现代生物技术，在猪的体内培育出了一个“人-猪嵌合中期
肾”，且维持到胚胎第28 天（实验过程如图1 所示），该研究实现了世界首例人源化肾脏异种再生的壮举。
回答下列问题。
(1)据图1 分析，在“人源化中肾”的培养过程中，运用了 等动物细胞工程的技术（答出3 点即
可）。
(2)过程②常用的去核方法为 ，所谓的“核”实际上是 。过程③中，获得单细胞悬液时，猪
胚胎剪碎后需用 处理。
(3)过程④运用基因编辑技术（见图2，Cas9 蛋白在向导RNA 引导下，切割目标DNA 双链）敲除成纤维细
胞中的猪肾发育的关键基因SIX1，可以为后续人iPS 细胞的生长和分化提供更合适的生存环境。下列对于
该过程的分析，正确的有 。
A．Cas9 蛋白由相关基因指导在核糖体上合成，向导RNA 可在逆转录酶催化下合成
B．Cas9 蛋白识别并切割SIX1 基因特定位点的磷酸二酯键，其作用方式与限制酶相同
C．向导RNA 的部分序列是根据SIX1 基因设计的，其双链区遵循碱基互补配对原则
D．敲除SIX1 基因的猪胚胎可避免猪细胞与人iPS 细胞竞争肾脏发育的环境
(4)过程⑧中，选用iPS 细胞作为肾脏供体细胞的原因是 。在早期胚胎阶段，猪胚胎的细胞尚未完
全分化成各种类型的细胞和组织，细胞之间的连接较松散，这使得导入的人iPS 细胞较容易在猪胚胎中整
合，胚胎的可塑性也较强，据此判断在构建嵌合胚胎过程中，可在猪胚胎发育至 （填“桑葚胚”
或“囊胚”）期注射人源供体细胞。合适的培养基是提高iPS 细胞嵌合能力的关键，下列有关叙述错误的
是 。
A．培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等营养物质
B．为保证体外培养细胞处于无菌、无毒的环境，除无菌操作外，培养液还需定期更换
C．动物细胞应放入含5%CO2培养箱中培养，CO2的主要作用是刺激细胞呼吸
D．维持动物细胞体外生存必须有适宜的温度、pH 和渗透压等环境条件
【答案】(1)动物细胞培养、细胞核移植技术、胚胎移植和干细胞培养
(2) 显微操作法 MⅡ期卵母细胞中的纺锤体-染色体复合物 胰蛋白酶/胶原蛋白酶
(3)CD
(4) iPS 细胞具有与胚胎干细胞类似的分裂和分化能力，在特定条件诱导下能定向分化为特定的组织器
官 桑葚胚 C
【分析】细胞全能性是指已经分化的细胞，仍然具有发育成完整生物体的潜能。在多细胞生物中，每个体
细胞的细胞核都含有个体发育的全部基因，只要条件许可，都可发育成完整的个体。
诱导多能干细胞技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。分化的细
胞在特定条件下被逆转后，恢复到类似胚胎干细胞。分化是基因选择性表达的结果，并没有改变遗传物质，
而重编程在某种意义上就是分化的一个逆转。
【详解】（1）依据图1 可知，在“人源化中肾”的培养过程中，运用了动物细胞培养技术、细胞核移植技
术、胚胎移植技术等动物工程技术。
（2）过程②表示去除卵母细胞的细胞核，采用的方法是显微操作法，所谓的“核”实际上是指MⅡ期卵母
细胞中的纺锤体-染色体复合物。过程③中，获得单细胞悬液时，猪胚胎剪碎后，需用胰蛋白酶处理，将组
织细胞分散开。
（3）A、Cas9 蛋白是以mRNA 为模板，在核糖体上合成的，向导RNA 以DNA 为模板在RNA 聚合酶的作
用下合成，逆转录酶催化合成的是RNA
DNA 的过程，A 错误；
B、限制酶具有识别并切割特定的脱氧核糖核苷酸序列的作用，打开磷酸二酯键，Cas9 蛋白在向导RNA 引
导下，切割目标DNA 双链，说明不具有识别作用，打开的是磷酸二酯键，B 错误；
C、向导RNA 的部分序列是根据SIX1 基因设计的，其双链区遵循碱基互补配对原则，C 正确；
D、SIX1 基因是控制猪肾发育的关键基因，若不敲除，则会与人iPS 细胞竞争肾脏发育的环境，D 正确。
故选CD。
（4）之所以选用iPS 细胞作为肾脏供体细胞，主要由于iPS 细胞具有与胚胎干细胞类似的分裂和分化能力，
在特定条件诱导下能定向分化为特定的组织器官。依据题干信息，猪胚胎的细胞尚未完全分化成各种类型
的细胞和组织，细胞之间的连接较松散，这使得导入的人iPS 细胞较容易在猪胚胎中整合，所以在构建嵌
合胚胎过程中，可在猪胚胎发育至桑葚胚（分化程度较囊胚低）期注射人源供体细胞。
A、对动物细胞进行培养，培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等营养物质，A
正确；
B、为保证体外培养细胞处于无菌、无毒的环境，除无菌操作外，培养液还需定期更换，以补充营养物质，
减少细胞代谢废物的积累，B 正确；
C、CO2 的主要作用是维持培养液的pH，不是刺激细胞呼吸，C 错误；
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D、维持动物细胞体外生存必须有适宜的温度、pH 和渗透压等环境条件，D 正确。
故选C。
11．（2025·宁夏石嘴山·一模）亚洲玉米螟、黏虫是造成我国玉米减产的主要害虫。我国科研人员通过图
示过程将Bt 基因（能够控制合成Bt 毒蛋白）转入玉米细胞培育出了抗虫转基因玉米。回答下列问题：
(1)用PCR 扩增下面的Bt 基因的DNA 片段：5'-GACCTGTGGAAGC．.....CATACGGGATTG-3' 3'-
CTGGACACCTTCG......GTATGCCCTAAC-5'供选择的引物有：①5'-GACCTGTGGAAGC-3' ②5'-
CTGGACACCTTCG-3' ③5'-GTTAGGCATAC-3'④5'-CAATCCCGTATG-3'共四种，应选择________（填字
母）。
A．①②
B．②③
C．③④
D．①④
(2)据图分析，为确保目的基因能够与Ti 质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti 质粒，科研人员应选
用限制酶 切割Ti 质粒和含Bt 基因的DNA 片段。在获得重组Ti 质粒后，可将其加入经 处
理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 成为转基因玉米植株。
(3)为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员首先利用 法检测Bt 基因是否成功翻译：在进行个
体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，
多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3:1 和15:1
两种情况。出现15:1 的原因是 。
(4)某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，
棉铃虫并没有被杀死，这说明 ，为此，科学家对棉花植株中的Bt 毒蛋白基因进行了修饰，结果食
用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt 毒蛋白基因的修饰属于 。
【答案】(1)D
(2) XbaⅠ和HindⅢ Ca2+ 植物组织培养
(3) 抗原-抗体杂交 在两对同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因
(4) Bt 毒蛋白基因没有成功表达 基因重组
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。目的基因的检测与鉴定包括分子水平上的检测与个体水平
上的鉴定两种方式。
【详解】（1）PCR 引物应分别与待扩增片段两端的互补链3′端结合，且引物序列与其结合处应保持“正
向一致”。Bt 基因的DNA 片段的上链(5′→3′)是GACCTGTGGAAGC…CATACGGGATTG，对应的下链
(3′→5′)是CTGGACACCTTCG…GTATGCCCTAAC。前向引物通常与上链5′端相同序列（①），后向引物
则与上链3′端互补且方向为5′→3′（④），应选①和④。
故选D。
（2） 据图分析，在构建目的基因表达载体外，由于BamHⅠ能将目的基因切割，因此不能用BamHⅠ切割，
因此对于目的基因的左侧只能用XbaⅠ切割，而右侧HindⅢ和EcoRⅠ是目的基因和终止子近侧共有的限制
酶，但目的基因的左侧有EcoRⅠ的识别序列，因此目的基因右侧需要用HindⅢ切割，因此，为确保目的基
因能够与Ti 质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti 质粒，科研人员应选用限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割
Ti 质粒和含Bt 基因的DNA 片段；在获得重组Ti 质粒后，可将其加入经Ca2+处理（使其处于易于吸收周
围环境DNA 分子的状态）的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经植物组织培养成为转基因玉米植株，该
操作的原理是植物细胞的全能性。
（3）翻译的产物是蛋白质，由于抗原与抗体的结合具有特异性，故为检测转基因玉米是否培育成功，可
在分子水平条件下，科研人员首先利用抗原—抗体杂交法检测Bt 基因是否成功翻译；在进行个体生物学水
平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的
子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3∶1 和15∶1 两种情况。
其中15∶1 为9∶3∶3∶1 的变式，说明目的基因转入了两条具有非同源染色体的两条染色体上，即在两对
同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因，进而通过自交产生了性状分离比为15∶1 的后代表现。
（4） 科学家最初做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，
棉铃虫并没有被杀死，这说明Bt 毒蛋白基因没有成功表达；为此，科学家对棉植株中的Bt 毒蛋白基因进
行了修饰，结果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt 毒蛋白基因的修饰是蛋白质
工程的应用，是第二代基因工程，其原理是基因重组。
12．（2025·广东湛江·一模）柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重危害柑橘产量。科研人
员将M 基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。如图是培育转基因
柑橘的过程示意图，已知限制酶HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ的识别序列及切割位点分别为5'-A↓AGCTT-3′、5′-
G↓GATCC-3′、5-G↓TCGAC-3'。请回答下列问题：
(1)构建的基因表达载体，除了含有目的基因外，还必须含有 （回答2 点）等。据图分析，在基因表
达载体构建过程中，应使用 对M 基因和质粒进行切割，原因是 。
(2)利用PCR 技术克隆M 基因时，应选择下图中的引物 （填序号），引物的作用是 。
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(3)将图中农杆菌先后置于含 的培养基中培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测转基因柑橘
幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染，在个体生物学水平上，操作方法是 。
(4)图中由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了 技术，该技术的原理是 ，由柑橘细胞获得愈
伤组织的过程称为 。
【答案】(1) 标记基因、启动子、终止子、复制原点 SalⅠ和HindⅢ 切割后的目的基因完整，
和质粒具有相同的黏性末端可以连接且可以防止目的基因和质粒自身环化
(2) 2 和3 使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(3) 氨苄青霉素、四环素 对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况
(4) 植物组织培养 植物细胞的全能性 脱分化
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因表达载体必须包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等；据图分析，
用限制酶BamHⅠ会破坏M 基因，因此应使用SalⅠ和HindⅢ对M 基因和质粒进行切割；因为目的基因和质
粒用的是相同的两种限制酶切割，所以具有相同的黏性末端可以连接在一起构成重组质粒且使用两种限制
酶切割可以防止目的基因和载体自身环化。
（2）根据子链延伸方向为5'→3'，引物需要与模版的3'端结合，可判断出扩增M 基因应选择引物2 和引物
3；引物的作用是使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（3）用限制酶SalⅠ和HindⅢ对质粒进行切割时，破坏了抗四环素基因，在重组质粒上只有抗氨苄青霉素
基因，因此应先将农杆菌置于含氨苄青霉素的培养基中培养，此时导入空质粒和重组质粒的农杆菌均可存
活，再将存活的农杆菌接种于含四环素的培养基中，此时导入重组质粒的农杆菌由于没有四环素抗性而死
亡，从原来含氨苄青霉素的培养基中原位置可筛选出含重组质粒的农杆菌；在个体生物学水平上，通过对
柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况，可以检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性
菌的感染。
（4）由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了植物组织培养技术，该技术的原理是植物细胞的全能性，
其中由柑橘细胞获得愈伤组织的过程称为脱分化。
13．（2025·广东深圳·一模）在植物基因组中天然存在着一类自私的基因或遗传元件，能够使得自身传递
给后代的比例大大提高，被称为基因驱动元件。受天然基因驱动元件的启发，我国研究团队开发了一种名
为CAIN 的基因驱动系统，如图。
CRISPR/ Cas9 能够靶向切割NPG1 基因的编辑工具；NPG1 表示花粉萌发所必需的基因
回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 由人工合成的短链RNA 和一种来自细菌的核酸酶Cas9。短链RNA 作为“向导”；核酸酶
Cas9 切割目的DNA，使DNA 双链断裂。短链RNA 作为“导向”作用的具体原理是 。
(2)CAIN 系统基于“毒药—解药”机制，据图分析，通过 的作用在植物花粉中产生毒药效应；再以
作为解药，让花粉正常萌发。图中重新编码后的NPG1 需要具备的条件是 ，为实现这一目的，研究
人员利用了密码子的 现象对NPGI 进行重新编码，最终实现了 的花粉能够正常萌发。
(3)研究人员选用了自交繁殖的拟南芥作为材料，研究结果如下图。
①若是双剪切，基因驱动工具CAIN 系统在人工杂交世代中表现出了显著的高效遗传，理论上后代带有
CAIN 个体为100%，远高于孟德尔遗传的期望比例 。
②若是单剪切，如下图所示，则可以产生 种雄配子，理论上后代带有CAIN 个体的比例为 。
【答案】(1)部分序列通过碱基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑的DNA 序列相结合
(2) CRISPR/Cas9 重新编码的NPG1 使花粉重新萌发且不受CRISPR/Cas9 切割 简
并性 携带CAIN 系统
(3) 50% 3 67%/2/3/66.7%
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
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基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因——PCR 检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR 检测等技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）短链RNA 作为“导向”作用是部分序列通过碱基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑
的DNA 序列相结合。
（2）CRISPR/Cas9 是能够靶向切割NPG1 基因的编辑工具，NPG1 表示花粉萌发所必需的基因，CAIN 系
统是通过CRISPR/Cas9 的作用将NPG1 基因切除，从而在植物花粉中产生毒药效应。CAIN 系统可以编辑
NPG1 基因，该基因是花粉形成必需的基因，再将重新编辑的NPG1 基因导入到细胞中，重新编辑后的
NPG1 需要具备的条件是使花粉重新萌发且不受CRISPR/Cas9 切割；重新编辑后的NPG1 基因功能是一样
的，碱基序列上有差异，主要是利用同义编辑，也就是利用密码子的简并性，最后使携带CAIN 系统可以
形成成熟花粉，即实现了携带CAIN 系统的花粉能够正常萌发。
（3）①若是如图中CAIN 系统导入到一条染色体上，这样与野生型杂交后代，只有50%个体后代携带
CAIN 系统；
②若是单剪切则可以产生3 种类型花粉，其中有一种不可育（无法形成），带有CAIN 系统的花粉是两种，
所以后代有该系统的占了2/3，约为67%。
14．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E 蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因
（如图1 所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑
马鱼的vtg 基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2 所示）连接，形成vtg-
Luc 基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2 中Luc 表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧
化产生荧光；
为氨苄青霉素抗性基因，
表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ
为限制酶。
(1)为使vtg 基因与Luc 基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc
基因载体，其优点是 。
(2)为使vtg 基因与Luc 基因载体形成重组载体，通过PCR 技术扩增vtg 基因时，需设计合适的加端引物。
依据图1、图2 信息推测引物2 包含的碱基序列为
。一个vtg 基因经过4 轮循环后，得到的子
代DNA 分子中，只含有1 种引物的DNA 分子所占的比例为 。
(3)若筛选导入vtg-Luc 基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养
基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加
进行检测。
【答案】(1) EcoRI、HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接
(2) 5'-AAGCTTAGAGGC-3' 1/8
(3) 能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长 雌激素和荧光素
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因--DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译
成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）要使vtg 基因与Luc 基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，应选用两种不同的限制酶
进行双酶切。观察图2，EcoRI 和HindⅢ的酶切位点分别位于Luc 基因载体的不同位置，用这两种酶双酶
切可以满足要求，可以防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接；
（2）引物2 要与vtg 基因的模板链互补配对，并且要包含与Luc 基因载体双酶切后相同的黏性末端
（HindⅢ的黏性末端）。根据图1 中vtg 基因的序列以及图2 中HindⅢ的识别序列，引物2 包含的碱基序
列为5'-AAGCTTAGAGGC-3'；一个vtg 基因经过4 轮循环后，共得到24 = 16 个DNA 分子。其中只含有1
种引物的DNA 分子有2 个，只含有1 种引物的DNA 分子所占的比例为1/8；
（3）重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因，而四环素抗性基因因酶切被破坏，所以导入vtg - Luc 基因重
组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，不能在含有四环素的培养基中生长，筛选能在氨
苄青霉素培养基中生长，不能在四环素培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌；水体中的雌激素能使斑马鱼
细胞产生E 蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。因为
转基因斑马鱼含有萤火虫荧光素酶基因，该酶可以催化荧光素氧化产生荧光，所以若要判断斑马鱼转基因
是否成功，可在水体中添加雌激素和荧光素进行检测。
15．（2025·广西·一模）塑料的主要成分为聚氯乙烯（PVC）、聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）等，会造成
难以降解的“白色污染”。自然界有多种细菌可以降解塑料的不同成分，研究人员欲通过筛选，并利用基
因工程技术培育能降解多种塑料成分的“超级菌”。
(1)研究人员欲比较大肠杆菌YT1 和芽孢杆菌YP1 两类细菌降解PE 塑料的能力，配置固体培养基，接种菌
株后表层覆盖0.1 mm 厚的PE 塑料。分组实验结果如表所示：
培养基及接种菌株
培养基1
培养基2
培养基3
30 / 31
单独培养并
接种YT1
单独培养并
接种YP1
提取YT1 和YP1 的核酸，并
与YT1 和YP1 混合，培养一
段时间后选取YP1 接种
降解圈（直径D/mm）
3.5
1.8
4.2
①筛选能分解PE 塑料的菌株时，应将菌株接种到以 为唯一碳源的培养基，从功能上讲，属于
培养基。
②培养基3 中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是 。
(2)研究人员发现一种胞外酶基因A，有降解PVC 塑料的功能。对A 基因测序可知，其调节功能区增加一
个碱基对A/T，可增强其表达能力。通过PCR 定点诱变技术在体外改造A 基因（如图1），然后构建表达
载体（如图2），导入受体菌培育“超级菌”。
注：LacZ 基因编码产生的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色
①图1 所示，大引物②是指以 （选填“引物1”或“诱变引物”）延伸得到的DNA 链为模板，
（选填“引物1”或“诱变引物”）与之结合延伸得到的DNA 子链。获得图1 中的改良A 基因至少需要
个PCR 循环。
②图2 中要实现质粒和改良A 基因的正确连接，应选用的限制酶是 。将构建的表达载体导入受体菌
后，在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养，长出的 （选填“蓝色”或“白色”）菌落是成功
导入重组质粒的菌株，依据是 。
【答案】(1) PE/聚乙烯 选择 混合培养过程中发生了转化，YT1 的对PE 塑料分解能力更高
的基因整合到了YP1 菌株中
(2) 诱变引物 引物1 4/四 XmaI 和BgIⅡ 白色 含有改良基因A 的重组质粒上
LacZ 基因被破坏，受体菌不能产生相应的酶，无法分解β-半乳糖苷，不能产生蓝色物质
【分析】1、PCR 技术的原理是模拟生物体内DNA 分子复制的过程，利用DNA 分子热变性原理，通过控
制温度控制控制DNA 分子的解聚和结合，过程：①高温变性：DNA 解旋过程；②低温复性：引物结合到
互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自
动解开。
2、基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子.
终止子和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微
注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的
检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因：DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转
录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴
定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）①在筛选分解PE 塑料能力大小的菌株时，应将两类菌株接种到以PE 塑料为唯一碳源的培
养基，不能分解PE 塑料的细菌，因为缺少营养物质碳源死亡；该培养基属筛选出能分解PE 塑料类的细菌，
所以从功能上讲属于选择培养基。
②原本YP1 对PE 塑料的分解能力弱于YT1，而培养基3 中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加
大，其原因可能是YP1 菌株整合了YT1 的对PE 塑料高分解力的基因，发生了转化。
（2）①观察图1，根据大引物的方向，PCR1 大引物②是指以引物1 延伸得到的DNA 链为模板，诱变引物
与之结合延伸得到的DNA 子链；经过PCR1 得到大引物需要2 次PCR，再利用大引物和引物2 至少2 个
PCR 循环才能获得完整的改良A 基因，共需经过4 次PCR。
②构建改良基因表达载体时，为实现质粒和改良基因的准确连接，应选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ，酶切
位点在目的基因两侧，且在质粒中这两个酶切位点在启动子和终止子之间，不破坏氨苄青霉素抗性基因，
复制原点等重要原件，两种限制酶，形成的黏性末端不同，所以不会出现目的基因和质粒的自我环化以及
目的基因的反向连接；在含氨苄青霉素和β 半乳糖苷的平板上培养一段时间后，其中白色菌落含有重组质
粒，判断的依据是含有改良基因A 的重组质粒不含有完整的LacZ 基因，受体菌不能分泌分解β-半乳糖苷
而使培养基变蓝的酶。
