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5.生物技术与工程
[分值：50 分]
1．(14 分)科研团队为了研究番茄抗虫基因(SlJA2)的功能，进行了相关实验。图1 为SlJA2 基
因过表达番茄(OE)构建的过程，图2 为SlJA2 基因敲除突变番茄(KO)构建的部分过程。
(1)图1 中，为保证过程①获得的SlJA2 基因与载体正确连接形成重组质粒，需在SlJA2 基因
上游添加限制酶________的识别序列；在过程__________用钙离子可以提高SlJA2 基因导入
受体细胞的概率。在过程⑤中需通过调整__________(填激素名称)的比例获得SlJA2 基因过
表达番茄(OE)。
(2)图2 中，要准确敲除SlJA2 基因，需设计正确的向导RNA(sgRNA)，才能准确引导Cas9
蛋白切割SlJA2 基因。设计sgRNA 需要的信息及运用的原理是______________________。
(3)科研人员将OE、KO 以及未处理(WT)三组番茄进行一系列实验，定期测量相关数据，记
录如表(注：“＋”的数目代表程度或数量变化)：
组别
SlJA2 基因表达量
抗虫性
生长速率
产量
OE
＋＋＋
＋＋＋
＋＋＋
＋＋＋＋
KO
－
＋
＋
＋
WT
＋
＋＋
＋＋
＋＋
与WT 组相比，实验组OE 组和KO 组的设置分别采用了自变量控制中__________、
__________(填科学方法)。据表分析SlJA2 基因的表达量及性状的变化，可以得出结论：
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答2 点)。
答案 (1)BamH Ⅰ ③ 生长素和细胞分裂素
(2)SlJA2 基因的碱基序列、碱基互补配对原则
(3)加法原理 减法原理 基因的数量影响基因的表达量；一种基因可以控制多种性状
解析 (1)分析题图，图1 中，过程①获得的SlJA2 基因为逆转录。由于目的基因必须添加在
T－DNA 区段，并且位于启动子和终止子之间，不能用NdeⅠ酶切，会把终止子切掉，不能
用XhoⅠ酶切，因为下游添加相应限制酶后，会把潮霉素抗性基因切掉。因此为保证获得
的SlJA2 基因与载体正确连接形成重组质粒，需在目的基因上游添加限制酶BamH Ⅰ的识
别序列，下游添加SmaⅠ限制酶的识别序列；在过程③将重组质粒导入农杆菌，需要用钙
离子以提高SlJA2 基因导入受体细胞的概率。在过程⑤再分化过程中需通过调整生长素和细
胞分裂素的比例获得SlJA2 基因过表达番茄(OE)。(2)sgRNA 需要与目标基因(SlJA2 基因)的
特定序列互补配对，以确保精准识别和结合；sgRNA 通过碱基互补配对原则识别目标DNA
序列，并引导Cas9 蛋白切割SlJA2 基因。(3)实验组OE 组通过增加SlJA2 基因的表达量来观
察其功能，采用了自变量控制中的加法原理；实验组KO 组通过完全抑制SlJA2 基因的表达
来观察其功能缺失的影响，采用了自变量控制中的减法原理。据表分析，SlJA2 基因的表达
量与抗虫性、生长速率和产量呈正相关：OE 组中SlJA2 基因表达量最高，抗虫性、生长速
率和产量也最高；KO 组中SlJA2 基因表达缺失，这些性状均显著下降。由此可知，基因的
数量影响基因的表达量；一种基因可以控制多种性状。
2．(12 分)酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的技术平台。土壤
中存在产PG 酶(增大蛋白质的溶解性)的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效生产
PG 酶的方案，流程如图1 所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2 所示。回
答下列问题：
(1)过程①应用了PCR 技术，利用PCR 技术扩增时，需要________种引物，引物的作用是
__________________________________________________。一般还需要往PCR 反应缓冲液
中加入Mg2＋，其原因是__________________________。PCR 反应过程可在PCR 扩增仪中自
动完成，而后常用__________________来鉴定PCR 的产物。
(2)完成过程②需要先将PG 酶基因与pPIC9K 质粒重组，据图分析，该过程中最好选择限制
酶__________________________切割。
(3)结合图中过程③分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是________________________。
过程④中将重组质粒酶切后，整合在酵母菌染色体上。
答案 (1)2 使DNA 聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 DNA 聚合酶需要Mg2＋
激活 琼脂糖凝胶电泳 (2)Bgl Ⅱ和Not Ⅰ (3)利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间
内可获取大量的重组质粒
解析 (1)利用PCR 技术扩增时，DNA 聚合酶不能从DNA 链的一端直接开始合成子链，需
要在反应体系中添加2 种引物，分别与两条模板链结合，使DNA 聚合酶能从引物的3′端
开始连接脱氧核苷酸。DNA 聚合酶需要Mg2＋激活，故一般还需要往PCR 反应缓冲液中加
入适量的Mg2＋。PCR 反应过程可以在PCR 扩增仪中自动完成，PCR 的产物的分子量大小等
不同，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物。(2)过程②是将目的基因导入受体细胞的过
程，在此之前需要先构建基因表达载体，即将PG 酶基因与pPIC9K 质粒重组。在构建基因
表达载体时，需要用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶分别切割质粒和目的基因，根
据图1 和图2 分析，PG 酶基因两端序列分别含有Bgl Ⅱ和Not Ⅰ识别序列，故最好选择限
制酶Bgl Ⅱ和Not Ⅰ切割能产生和目的基因相同的末端。(3)大肠杆菌繁殖速度快，将重组
质粒导入大肠杆菌内，短时间内可获取大量的重组质粒。
3．(12 分)重叠延伸PCR 技术是采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，从而
在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通
过定点诱变在体外改造DNA 分子(图中黑色正方形代表替换的碱基)，并将改造后的目的基
因导入质粒构建目的基因表达载体。回答下列问题：
(1)图中所示的重叠延伸PCR 技术中，PCR1 的引物是__________。PCR4 可获得大量定点诱
变目的基因，此时的引物为__________________。PCR3 时模板DNA 不能选择DNA 分子③
的原因是________________________________________________。
(2)为使重叠延伸PCR 技术改造后的目的基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)能与
载体正确连接，PCR4 时，应在基因上、下游引物的__________ 端分别添加限制酶
__________的识别序列。
(3)将目的基因、质粒及大肠杆菌混合，温育一段时间后涂在含四环素的平板上培养，一段
时间后平板上长出菌落。这些菌落的菌体内不一定含有目的基因，理由是___________
________________________________________________________________________。
答案 (1)引物A、引物C 引物C、引物D
子链的延伸方向只能从5′端→3′端，以DNA 分子③作模板时子链不能延伸 (2)5′
KpnⅠ、EcoRⅠ
(3)含有空白质粒的大肠杆菌也能在该培养基上生长
解析 (1)由于DNA 合成的方向是从子链的5′端到3′端，根据PCR1 的产物，可知引物是
引物A、引物C，根据PCR2 的产物，可知PCR2 的引物为引物B、引物D，将DNA 分子
②④混合后加热变性、复性可得到③⑤，PCR3 获得DNA 分子⑥，DNA 分子⑥为改造后的
DNA 分子，所以PCR4 的引物为引物C、引物D；PCR3 为了延伸重叠链，模板DNA 不能
选择DNA 分子③的原因是子链的延伸方向只能从5′端→3′端，以DNA 分子③作模板时
子链不能延伸。(2)为使重叠延伸PCR 技术改造后的目的基因能与载体正确连接，PCR4 时，
应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶KpnⅠ、EocRⅠ的识别序列。(3)目的基因、
质粒及大肠杆菌混合，可能有一些质粒与目的基因成功连接，也有些质粒没有与目的基因连
接，即空质粒，这些质粒若成功导入大肠杆菌，由于这些质粒上都有四环素抗性基因，所以
都能在含四环素的平板上长出菌落，但这些菌落的菌体内不一定含有目的基因。
4．(12 分)(2025·常德二模)金黄色葡萄球菌(Sa)可引起败血症、细菌性肺炎等疾病。不规范
使用抗生素易出现多重抗药性Sa，推测Sa 产生头孢霉素抗性与其质粒上的R 基因有关。为
验证该推测，以图1 中R 基因的上、下游片段和质粒1 构建质粒2，然后通过同源重组(质粒
2 中的上、下游片段分别与Sa 基因组中R 基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除Sa 的R
基因。回答下列问题：
(1)利用PCR 技术扩增出较多的R 基因及其上、下游序列，应在引物的________(填“3′
端”或“5′端”)添加相应的限制酶识别序列。若要扩增出较多DNA 单链序列，在添加引
物时需做怎样的处理？_____________________________________________________。
(2)质粒2 的构建过程中需选择__________(填限制酶)对PCR 扩增产物进行酶切。
(3)用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，涂布在含有氯霉素的
平板上，经培养获得含质粒2 的Sa 单菌落，再经多次传代增加同源重组敲除R 基因的概率，
随后稀释涂布在含__________的平板上，筛选并获得不再含有质粒2 的菌落。从这些菌落中
分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌
的R 基因可能被敲除。
(4)以上述获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图
2，表明R 基因已被敲除的是__________。
答案 (1)5′端 一种引物的比例显著多于另一种引物 (2)SacⅡ和EcoRⅠ (3)脱水四环
素
头孢霉素 (4)D
