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电子科技大学汤丽霞教授团队Green Chem.:计算辅助热稳定性工程打造“耐热版”MHET水解酶,突破高温PET级联升级回收瓶颈
电子科技大学汤丽霞教授团队Green Chem.:计算辅助热稳定性工程打造“耐热版”MHET水解酶,突破高温PET级联升级回收瓶颈
PET 的高效生物降解依赖上游 PET 水解酶与下游 MHET 水解酶的协同作用。现有多数 MHET 水解酶热稳定性差，难以匹配高温高效 PET 水解酶的反应条件。针对上述瓶颈，电子科技大学汤丽霞教授团队在《Green Chemistry》发表重要研究成果。该研究针对活性高但热稳定性受损的 KLS‑MHETase，整合分子动力学模拟、蛋白质语言模型、序列保守性分析、二硫键工程开展计算辅助酶改造，得到突变体 Thermo‑MHETase。该突变体相比亲本 KLS‑MHETase熔解温度Tm提升20.4 ℃，高温下保留 MHET 水解活性。在双酶级联体系 60‑70 ℃反应条件下，可将 PET 降解中间产物 MHET 近乎完全转化为对苯二甲酸 TPA；相较于仅使用 PET 水解酶的单酶体系，TPA 释放量提升 2.83-10.36倍，总产物释放量提升约 1.3 倍。分子动力学表明稳定性提升来源于柔性区域局部相互作用增强、构象波动降低。研究进一步将酶解得到的 PET 来源 TPA 回收，用于合成高价值 Ni‑MOF 金属有机框架材料，为 PET 废弃物高温酶解级联降解与增值回收提供完整方案。 
汤丽霞，电子科技大学生命科学与技术学院教授、博士生导师。主要从事蛋白质工程与生物催化等方面的研究，聚焦酶工程与合成生物学，开展塑料酶促降解及降解产物资源化高值利用研究。近年来先后主持包括国家自然科学基金、科技部中克政府间合作项目等10余项科研项目，发表SCI论文60余篇，授权发明专利3项。相关研究发表于 Green Chemistry、Journal of Hazardous Materials、Bioresource Technology、Environmental Research 等权威期刊。 创新点： 与既往工作提升 MHETase 催化活性不同，本研究针对已经获得高活性、但改造后Tm下降的 KLS‑MHETase，专门开展热稳定性恢复改造，获得适配 60-70 ℃高温 PETase 级联体系的 MHET 水解酶。研究证明：在高温级联反应中，当 MHET 水解的催化能力已经满足基本需求时，热稳定性的重要性高于继续进一步提升酶的初始催化活性。 创新点2 多计算工具联合的热稳定性突变筛选框架 研究整合了分子动力学模拟、MM/PBSA 结合能分解、FoldX 虚拟饱和突变、AutoDock Vina 结合模式分析、ThermoMPNN、Pythia、序列保守分析和二硫键设计。通过多工具交叉筛选，识别关键热稳定位点，并在 M1 背景上逐步构建 M3 与 Thermo-MHETase，最终获得 Tm 提高 20.4℃的变体。 创新点3 PET酶解—单体回收—MOF材料合成完整闭环 直接利用 PET 酶解液酸化沉淀回收 TPA，不经复杂纯化即可作为有机配体制备 Ni‑MOF；同时探索酶解原液原位合成 MOF 的可行性，建立 “废弃 PET-酶促降解-芳香单体-高价值功能材料” 的升级回收路径。 结果与讨论 ⑵ 热稳定导向改造：从 M1 到 M3 再到 Thermo-MHETase 针对M1，研究人员通过分子动力学模拟、RMSF分析及ThermoMPNN、Pythia、FoldX和序列保守性分析筛选热稳定位点。K171I使Tm升至73.1 °C，E209K使其升至69.7 °C，二者组合为M3后Tm达77.5 °C，较M1提高12.3 °C。随后引入二硫键工程，其中M3-P7C/N28C稳定效果最佳，被命名为Thermo-MHETase，Tm达83.6 °C，较M1和野生型分别提高18.4 °C和20.4 °C。在活性方面，M3相对野生型活性为114.13 ± 6.6%，而Thermo-MHETase仅保留20.8 ± 2.3%，体现出明显的活性-稳定性权衡；但后者热稳定性最高，更适合长时间高温级联反应。 
⑶ PET 降解双酶级联性能评价 以无定形 PET 膜、商业 PET 粉和商业蛋糕盒 PET 为底物，将 M3 或 Thermo-MHETase 与 HotPETase、TurboPETase、DepoPETase 在 40–70 °C 下进行双酶级联。结果显示，加入 M3 或 Thermo-MHETase 后，TPA 成为主要产物，总产物释放量增加，其中 HotPETase 在 60 °C 和 70 °C 下 PET 解聚效率最高，在 60–70 °C 条件下，TPA 释放量提高 2.83–10.36 倍，总产物释放量提高约 1.3 倍。长期降解实验以商业蛋糕盒 PET 为底物，Thermo-MHETase + HotPETase 反应 6 天后，PET 材料出现明显崩解，最终 PET 转化率达到 72.1%，而 HotPETase 单独作用仅为 50.4%。值得注意的是，M3 与 Thermo-MHETase 在多个级联体系中性能相当，尽管二者 MHET 水解活性差异明显；M1 的相对活性虽然远高于Thermo-MHETase（M1 相对野生活性提升 3.79倍，Thermo-MHETase 仅保留野生酶 20.8% 活性），但Tm低 18.4℃，级联中总产物和 TPA/MHET 比例无明显提升。这表明在高温级联中，一旦 MHET 被充分清除，整体效率更多取决于上游 PET 解聚和 MHET 水解酶的热稳定性，而非进一步提高 MHET 水解活性。 
（4）Thermo-MHETase热稳定机制的结构分析 在 340 K 和 350 K 下对 Thermo-MHETase 与野生型进行 100 ns 分子动力学模拟。结果显示，Thermo-MHETase 稳定性主要来自多种协同稳定作用，其中 K171I 疏水核心中 I171 与邻近疏水残基形成紧密接触，减少空腔和局部松散，并降低水分子可及性；C7-C28 二硫键连接 N 端与 β2-α1 间柔性区，限制局部构象波动；D179-K209 盐桥与氢键使 K209 与 D179 形成稳定静电相互作用和氢键，稳定 K209 周围 loop 区，而野生型中 E209 与 D179 均为负电，存在静电排斥；整体动态方面，RMSD 和 RMSF 分析表明 Thermo-MHETase 在高温下构象更稳定，lid 结构域、K209 周围 loop 以及活性位点邻近 loop 的柔性降低。这些稳定元素多位于活性位点附近，在提高热稳定性的同时可能增加局部刚性，从而部分解释 Thermo-MHETase 催化活性下降。 
（5）PET 衍生 TPA 升级回收为 MOF 材料 将酶级联降解产物 pH 调至约 2.0，使 TPA 沉淀并回收，HPLC 显示回收 TPA 纯度为 90.5%，FTIR 谱与商业 TPA 高度一致。以回收 TPA 为有机配体，与 NiCl₂·6H₂O 在 DMF 中 140 °C 溶剂热反应 12 h，合成 Ni-MOF 及负载于镍泡沫上的 Ni-MOF@NF。表征结果表明，FTIR 中游离羧酸信号减弱，出现 1358 cm⁻¹ 和 1578 cm⁻¹ 的 COO⁻ 对称/不对称伸缩振动，541 cm⁻¹ 出现 Ni-O 吸收带；XRD 中 Ni-MOF 在低角区出现衍射峰，Ni-MOF@NF 保留 9.60° 和 19.54° 的 MOF 特征峰，52.18° 峰归属于镍泡沫基底；XPS 中 Ni 2p₃/₂ 和 Ni 2p₁/₂ 分别位于 855.4 eV 和 873.2 eV，O 1s 分为 Ni-O 和 O=C-O，C 1s 分为 C-C、C-O、C=O；SEM 中 Ni-MOF 呈颗粒状或花状团簇，Ni-MOF@NF 在三维镍泡沫上形成片状或束状分级结构。此外，直接使用未分离的 PET 酶解液也可形成晶态 Ni(II) 羧酸配位材料，但衍射图案与回收 TPA 制备的 Ni-MOF 不同，说明甘氨酸等水解液组分影响 Ni²⁺ 配位与晶体形成。总体表明，PET 酶解产生的 TPA 可作为单体回收并用于 MOF 组装，实现了从废弃 PET 到高值材料的升级回收路径。 总结本研究针对 KLS-MHETase 热稳定性不足、难以兼容高温 PET 水解酶的问题，通过计算辅助酶工程策略开发了热稳定性显著提升的 Thermo-MHETase。该变体 Tm 较野生型提高 20.4 °C，并保留高温下的 MHET 水解活性。在双酶级联体系中，Thermo-MHETase 与 HotPETase、TurboPETase、DepoPETase 在 60–70 °C 下有效协作，促进 MHET 转化为 TPA，提高总产物释放量，并在 6 天反应中将 PET 转化率提高至 72.1%。分子动力学分析表明，K171I 疏水核心、C7-C28 二硫键和 D179-K209 盐桥/氢键共同增强了局部相互作用并降低柔性区波动。最后，PET 衍生 TPA 被回收并用于 Ni-MOF 合成，展示了酶法 PET 解聚与高值材料升级回收耦合的可行性。该工作提供了一种 MHET 水解酶热稳定性拯救策略，并强调高温级联中热稳定性是限制整体效率的关键因素。 文章链接 Lizhu Aer, Lingnan Ren, Duoduo Du, etc.Computationally assisted thermostability engineering of an MHET hydrolase for enhanced PET upcycling. Green Chemistry, 2026, 28, 14738–14751. DOI:https://doi.org/10.1039/d6gc04901j . 
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Computationally assisted thermostability engineering of an MHET hydrolase for enhanced PET upcycling
计算辅助的 MHET 水解酶热稳定性工程用于增强 PET 升级回收
导语
作者简介
创新点1 定向 “热稳定性救援” 的酶改造策略
⑴ 计算辅助活性工程及热稳定性瓶颈
基于 KLS-MHETase-MHET 复合物开展 100 ns 分子动力学模拟，并利用 gmx_MMPBSA 进行结合自由能分解，识别 MHET 结合热点残基。随后通过 FoldX 饱和突变和 AutoDock Vina 结合模式分析筛选候选变体。10 个测试突变体中，7 个活性高于野生型，其中 M195K 活性最高，相对活性提高 3.79 倍。以 M195K 为起始变体构建 M1。然而，M1 的 Tm 仅较野生型提高约 2 °C。将 M1 与 HotPETase 在 60 °C 和 70 °C 下级联反应 12 h，总产物释放和 TPA/MHET 比例均无明显改善，说明仅提高活性不足以解决高温级联瓶颈，热稳定性成为关键限制因素。
联系人：马老师
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责任编辑
马富强，黄忠实 中科院苏州医工所
李 晓，景 伟 中国科学技术大学