第 24 章 基因工程
第 1 节 重组 DNA 技术的基本工具和 DNA 的粗提取
一、重组 DNA技术的基本工具
生物属名的第一个字母 种加词的前两个字母 某型菌株 分离出的第几种限制酶
命名 ＋ ＋ ＋
如 大肠杆菌 Escherichiacoli的 型菌株分离出的第一种限制酶 命名为 Eco
: ( ) R , : RⅠ
来源 主要是原核生物
具体作用 识别并切割双链 分子的特定核苷酸序列
DNA
“分子手 作用化学键 磷酸二酯键
术刀”———
限制酶切割 分子产生的末端通常有两种形式 如图所示
限制性内 作 DNA ( ):
切核酸酶 用
(限制酶) 作用结果
作用 将双链 片段 缝合 起来 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
DNA “ ” ,
“分子缝
Ec．oli 来自大肠杆菌 连接互补的黏性末端和平末端 但连接平末端的效率远低于
合针”——— DNA , , T４DNA
连接酶 连接酶
分
DNA
类
连接酶
T４DNA 来自 噬菌体 连接互补的黏性末端和平末端
连接酶 T４ ,
作用 将目的基因导入受体细胞
裸露的 不与组蛋白结合 结构简单 独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核
定义 ( )、 、 DNA
“分子运输 质粒
之外 并具有自我复制能力的环状双链 分子
, DNA
车”——— 种 最
(
结构 具有复制原点 在细胞中能够自我复制 标记基因 便于重组 分子的筛选 一
基因载体 类 常用 ) ( )、 ( DNA )、
特点 个至多个限制酶切割位点 供目的基因插入
( )
其他载体 噬菌体 动植物病毒等
、
易混易错 连接酶和 聚合酶的异同
DNA DNA
类型 连接酶 聚合酶
DNA DNA
作用化学键 磷酸二酯键
参与过程 基因表达载体的构建 、 复制
PCRDNA
作用时是否需要模板 不需要模板 需要模板
作用时是否需要引物 不需要引物 需要引物
作用机理 连接两个 片段 将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的 端
DNA ３′
１９２ 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学二、DNA的粗提取
不溶于酒精 但某些蛋白质溶于酒精 利用这一原理 可以初步分离 与蛋白质
粗提取 (１)DNA , , , DNA ;
实验
在不同浓度的 溶液中溶解度不同 它能溶于 的 溶液
(２)DNA NaCl , ２mol/L NaCl
原理
沸水浴
鉴定
二苯胺试剂 蓝色
DNA＋ →
-. =?UF%/" ;+B# '
K$"
.U0L4.UK2;+B0
实验 + B
步骤
%/"+ !"U*%/"#F1U;+B#F1+)U *F1!"
%/"+G *NPM-+/B$M#"86AU# !!&NJO
过滤时应选用纱布而不是滤纸 如果用滤纸 可能会把 分子吸附在滤纸上
注意 (１) , , DNA ;
沉淀时用等体积预冷的体积分数为 的酒精 主要是低温操作能防止 酶降解
事项 (２) ９５％ , DNA DNA;
粗提取的 中可能含有核蛋白 多糖等杂质
(３) DNA 、
学生用书 P167
真题选改判 切 分析可能的原因并提出解决方法 下列叙
, .
１( 湖南,)将质粒 进行限制酶酶切 述错误的是
．２０２４ ５ DNA
( )
时 发现 完全没有被酶切 可能的原因 限制酶失活 更换新的限制酶
, DNA , A． ,
有酶切位点被甲基化修饰 可换用对 甲 酶切条件不合适 调整反应条件如温度和酶
, DNA B． ,
基化不敏感的限制酶 的用量等
. ( )
１答案 质粒 突变导致酶识别位点缺失 更换正
． √ C． DNA ,
２( 山东, ) 的粗提取与鉴定 实验 常质粒
．２０２４ １３ “DNA ” DNA
中 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热 酶切位点被甲基化修饰 换用对 甲基化
, D． , DNA
后可能变蓝的干扰 不敏感的限制酶
. ( )
２答案 答案 B
． ✕
３( 安徽, ) 鉴定时 将溶解的 链接教材 选必 限制酶的来源与作用
．２０２４ １４ DNA , DNA ３P７１
粗提物与二苯胺试剂反应 可检测溶液中是 １限制酶存在于原核生物中的主要作用是
,
．
否含有蛋白质杂质 什么
. ( ) ?
３答案 １答案 原核生物中限制酶的作用是切割外源
． ✕ ．
４( 山东, )粗提取 时的过滤液沉淀 以保证自身安全 防止外源 的
．２０２２ １３ DNA DNA , DNA
过程在 冰箱中进行是为了防止 入侵
４ ℃ DNA .
降解 ２限制酶来源于原核生物 为什么不能切割自
. ( ) ． ,
４答案 己的 分子
． √ DNA ?
教考衔接 ２答案 原核生物 分子中不存在该酶的
． DNA
识别序列或识别序列被甲基化修饰 使限制
典例 ( 湖南,, 分)某同学将质粒 ,
２０２４ ５２ DNA
酶不能切割自己的 分子
进行限制酶酶切时 发现 完全没有被酶 DNA .
, DNA
第 24章 基因工程 １９３
第 2 节 基因工程的基本操作程序和蛋白质工程
一、基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因 主要是指编码蛋白质的基因
目的基因 ,
也可能是基因调控序列等
( )
较为有效的筛选方法 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
目的基因的获取方法 人工合成法 基因文库法等
PCR、 、
2.基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤）
让目的基因在受体细胞中稳定存在 并且遗传给下一代
构建目的 (１) , ;
使目的基因能够表达和发挥作用
(２)
基因表达
载体的
组成型启动子 在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性
组成
启动子的 诱导型启动子 受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录 如乳糖操纵子
,
分类 具有组织特异性 在特定的组织或器官中驱动下游基因转录 或者发育时
特异型启动子 ( )
期特异性 在特定发育时期驱动下游基因转录 如水稻胚乳细胞启动子
( ),
构建基因
表达载体
过程
示意图
易混易错 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
位置
DNA DNA mRNA mRNA
聚合酶识别和结合 翻译的起始信号(编码氨 翻译的结束信号(一般不编码氨
作用 RNA 使转录停止
的部位,驱动基因的转录 基酸:甲硫氨酸) 基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
我国科学家独创 可以用微量注射器将含目的基因的 DNA 溶液直接注入
花粉管 .
子房中 也可以在植物受粉后的一定时间内 剪去柱头 将 DNA溶液滴加
通道法 . , ,
在花柱切面上 使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
,
植物细胞 农杆菌细胞内含 Ti 质粒 当农杆菌侵染植物细胞后 能将 Ti 质粒上的
受体细胞 . ,
农杆菌 TDNA 可转移的 DNA 转移到被侵染的细胞 并将其整合到该细胞的染色体
的种类及 Ｇ ( ) ,
转化法 DNA上 将目的基因插入 Ti 质粒的 TDNA中 TDNA不会因目的基因的插入
方法 . Ｇ (Ｇ
而丧失转移功能 通过农杆菌的转化作用 就可以使目的基因进入植物细胞
), ,
动物细胞 显微注射法 利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中
微生物 先用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子
Ca2+ 处理法 ,
细胞 的生理状态 然后再将重组的基因表达载体导入其中
,
１９４ 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学知识拓展 农杆菌转化法示意图
两次重组 两次导入
第一次重组 目的基因 与 Ti质粒构建重组载体;第二 第一次导入 将重组Ti质粒导入经Ca2+ 处理的农杆菌细胞
: (①) : ;
次重组 重组 Ti质粒上的 T DNA插入染色体 DNA 第二次导入 将TDNA导入植物细胞染色体DNA上
: Ｇ : Ｇ
易混易错 转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,实质是基因重组.
4.目的基因的检测与鉴定
操作方法 设计目的基因特异性引物 提取受体细胞内的 进行
检测目的 : , DNA PCR
PCR 扩增 如果能够扩增出目的基因片段 说明该基因已经导入受体细胞
基因是否 , ,
操作方法 把目的基因片段用放射性同位素 生物素或荧光进行标记 与
导入受体 : 、 ,
DNA 受体细胞的基因组 进行杂交 如果目的基因已经导入受体细胞 那
细胞 分子杂交 DNA , ,
么标记的基因片段就会与其结合 通过特殊的仪器就能够检测出来
分子水平 ,
逆转录 操作方法 提取受体细胞内的总 进行逆转录 得到 以获得的
的检测 检测目的 ＧPCR : RNA , cDNA,
为模板 设计目的基因特异性引物进行
基因是否 (RTＧPCR) cDNA , PCR
核酸分子 操作方法 从待测转基因生物细胞中提取 分子 用已标记的目的基
转录 : RNA ,
杂交 因片段作为探针与 杂交
RNA
检测目的基 抗原 抗体 操作方法 从受体细胞中提取蛋白质后 进行电泳分离 然后利用目的蛋
— : , ,
因是否翻译 杂交 白的抗体进行检测
个体生物
检测目标性状的有无等 如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫
学水平的 ,
特性以及抗性的程度
鉴定
二、基因工程的应用
D ; '
* E+*'
8*;+ 6'=D
D * ' 8 '36*8'
' + + 0AF3
*
D K8 ' M 'F*8' BUED"+"
/ '+ 1U*E 1
7 '+ B L + +
+ 5+D ' E!
* / +
P'+*JE( * U ED!! *L
*
N *N *F >+8'
* + B
L+* ! F 4*20
三、蛋白质工程
设计基础 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础
目的 改造现有蛋白质 或制造一种新的蛋白质
,
由于基因决定蛋白质 因此要对蛋白质的结构进行设计改造 最终还必须通过改造或合
简介 改造方法 , ,
成基因来完成
从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到并
基本思路 → → →
改变相对应的脱氧核苷酸序列 基因 或合成新的基因 获得所需要的蛋白质
( ) →
应用 速效胰岛素类似物的研发 延长干扰素的体外保存时间 枯草杆菌蛋白酶的改进等
、 、
易混易错 蛋白质工程中通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造的原因:蛋白质一般具有十分复杂的空间
结构,基因的结构相对简单,容易改造;改造后的基因可以遗传给下一代,而直接改造的蛋白质无法遗传.
第 24章 基因工程 １９５知识归纳 基因工程和蛋白质工程的判断
()基因工程是通过转基因等技术,将已有的 序列转移给其他生物;蛋白质工程是从对蛋白质的需求出发,在
１ DNA
水平上改变氨基酸的编码序列,定点诱变,改变特定的核苷酸,也可以进行蛋白水平上的改变,主要通过对制造
DNA
出的蛋白质进行加工、修饰,如磷酸化、糖基化等,从而改变蛋白质的功能.
()如果合成的蛋白质是天然蛋白质,则是基因工程;如果合成的蛋白质和天然蛋白质有差异,甚至是自然界中所没
２
有的,则为蛋白质工程.
学生用书 P170
真题选改判 基因 复制原点 启动子
、 、 、 、
１( 湖北,)用一种限制酶同时切割目的基 等组成 启动子位于基因的
．２０２３ ４
. ,
因和载体 目的基因转录的产物可能不同 作用是
, . .
诱导型启动子的作用是
( )
１答案 (选必 )
． √ ３P８０
２( 辽宁,)将红色荧光蛋白RFP 基因 ( 广东, )( 山东, )
．２０２３ ８ ２０２３ ２０ ２０２３ ２５ .
在下游 与CD１６３基因 在上游 拼接在 ５答案 标记基因 终止子 以上两空可调换
( ) ( ) ． ( )
一起 使其表达成一条多肽 该拼接过程的 上游 聚合酶识别和结合的部位 驱
, , RNA ,
关键步骤是除去CD１６３基因中编码起始 动基因的转录 当诱导物存在时 可以激活
,
密码子的序列 或抑制目的基因的表达
. ( )
２答案 ６将目的基因导入受体细胞 植物常采用农杆
． ✕ ． :
３( 山东, )新型冠状病毒的抗体检测法利 菌转化法 需将目的基因插入 质粒的
．２０２０ １５ , Ti
用了抗原与抗体特异性结合的原理 中(选必 )( 广东, ) 动物
. ( ) ３P８１ ２０２３ ２０ .
３答案 常采用显微注射技术将目的基因导入
． √
将目的基因导入大肠杆菌时需先用
从真题到教材 ;
处理 使之处于一种能吸收周围环
４利用 获取目的基因 需要 ,
． PCR : 境中 分子的生理状态(选必 )
作为原料 通过 方式打开 双 DNA ３P８２ .
, DNA ６答案 受精卵
２＋
链 利用 催化合成 子 ． TＧDNA Ca
, DNA ７目的基因的检测与鉴定 分子水平的检测 常
链 同时要加入一对引物 引物的作用是 ． : ,
, , 采用 等技术检测 和 检测
(选必 DNA RNA,
３ 是否表达出相应的蛋白质常采用
)( 天津, )( 山东, )
P７７ ２０２２ １５ ２０２２ ２５ . 最终还要进行
４答案 种脱氧核苷酸 加热 耐高温的 ;
． ４ 水平的鉴定(选必 )( 山东, )(
聚合酶 如Taq 聚合酶 使 ３P８２ ２０２３ ２５ ２０２２
DNA ( DNA ) 山东, )( 天津, )
聚合酶能够从引物的 端开始连接脱 ２５ ２０２２ １５ .
DNA ３′ ７答案 抗原 抗体杂交技术 个体生
氧核苷酸 ． PCR —
物学
５基因表达载体的构建 基因表达载体由目的
． :
１９６ 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
学生用书 P170
一、限制酶的选择
1.限制酶选择的基本原则：
限制酶不能破坏目的基因的完整结构 也
(１) ,
不能破坏载体上的启动子 终止子 复制原点
、 、
等必要元件
;
应使目的基因按照正确的转录方向插入载
(２)
体的启动子和终止子之间 图
; ２
为避免目的基因和质粒的自身环化和反向
(３)
连接 尽量选用不同的限制酶切割目的基因和
,
质粒 即双酶切
, .
图
如图 应分别用Bam 和Sal 两种不 ３
１, HⅠ Ⅰ 限制酶选择分析 图 质粒中含 个Eco
同的限制酶处理质粒和 基 因 目 的 基 : ２ ２ RⅠ
X ( 识别位点 选用Eco 会切去终止子 选用
因 再用 连接酶连接构建基因表达 , RⅠ ,
), DNA Bam 会破坏启动子 故可选用的限制酶有
载体 HⅠ ,
.
Mfe Hin Kpn 基因以乙链为转
#BN) Ⅰ、 dⅢ、 Ⅰ;W
4BM 录模板链 聚合酶从模板链的 端开始
,RNA ３′
(2
转录 故 基因乙链的 端与启动子相连
!L2 , W ３′ ,
3 端与终止子相连 为保证 基因与质粒正
５′ , W
#BN) 4BM
确连接 质粒的终止子一侧应选用与 基因
, W
%
右侧相同的Hin 故切割质粒可选的限制
9 dⅢ,
酶为Mfe Hin 图 中选用Mfe 会
图 Ⅰ、 dⅢ. ３ Ⅰ
１ 破坏 基因 故只能选择同尾酶Eco 因
2.同尾酶的使用 W , RⅠ,
此选用Eco Hin 切割图 中的
同尾酶是指识别 分子中不同核苷酸序 RⅠ、 dⅢ ３ DNA.
DNA
典例 1 双酶切的作用 ( 全国甲, 节选)某
列 但能切割产生相同末端的限制酶 如图
２０２４ ３８
, , :
同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白
回答下列问题
E. .
该同学利用 扩增目的基因 的每
由同尾酶产生的黏性末端 能够通过碱基互补 (１) PCR .PCR
,
次循环包括变性 复性 延伸 个阶段 其中
配对彼此连接 可用于基因表达载体的构建 、 、 ３ ,
, .
双链打开成为单链的阶段是
实例分析 图 质粒为载体 图 为克隆得到 DNA .
: ２ , ３
质粒载体上有限制酶 的酶切位点 限
的含 基因的 片段 基因以乙链为 (２) a、b、c ,
W DNA ,W
制酶的切割位点如图所示 构建重组质粒时
转录模板链 Mfe 和Eco 为同尾酶 可 . ,
( Ⅰ RⅠ ,
与用酶 单酶切相比 用酶 和酶 双酶切的
切出相同的黏性末端 a , a b
).
优点体现在
答出 点即可 使用酶 单
( ２ ); c
酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是
第 24章 基因工程 １９７
蛋白基因表达 需在引物末端添加限制酶识别
. ,
序列 据图可知 在 末端添加的序列所
. , F１~F７
对应的限制酶是 在 末端添加的序
, R
列所对应的限制酶是 本实验中 从
FB FC FD
. ,
产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要
将重组质粒转入大肠杆菌前 通常先将受体
(３) ,
种酶
细胞处理成感受态 感受态细胞的特点是 .
,
将构建的载体导入除去BCL１１A基因的受
若要验证转化的大肠杆菌 (２)
.
体细胞 成功转化后 含 与 扩增产物
中含有重组质粒 简要的实验思路和预期结果 , , F１~F６ R
,
的载体表达荧光蛋白 受体细胞有荧光 含
是 , , F７
与 扩增产物的受体细胞无荧光 含 与
R . F７ R
.
扩增产物的受体细胞无荧光的原因是
答案 变性 避免载体自连 保证目的
(１) (２) ,
基因连接方向正确 连接酶 易 .
T４DNA (３)
向培养液中添加适量的雌激素 含 与
于吸收外源 分子 提取质粒 用特异性引 (３) , F１~F４
DNA ,
扩增产物的受体细胞不再有荧光 而含
物进行 电泳出现目的条带 R , F５~
PCR,
与 扩增产物的受体细胞仍有荧光 若γ
变式 1 同方法不同情境 同尾酶的使用 ( 山 F６ R .
２０２１ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置
东, , 分)人类γ基因启动子上游的调控序
２５１２ 不含有 蛋白的结合位点序列 据此结
列中含有 蛋白结合位点 该位点结合 BCL１１A ,
BCL１１A , 果可推测 蛋白结合位点位于
蛋白后 γ基因的表达被抑制 通过
,BCL１１A
BCL１１A , .
改变该结合位点的序列 解除对γ基因表达的
, 理由是
抑制 可对某种地中海贫血症进行基因治疗
,
, .
科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段
,
将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧
光检测 以确定 蛋白结合位点的具体
, BCL１１A
位置 相关信息如图所示
. .
.
答案 Sal Eco 与 扩
(１) Ⅰ RⅠ ６ (２)F７ R
增产物不含完整的启动子 荧光蛋白基因不表
,
达 引物 与 在调控序列上所对应序
(３) F４ F５
列之间的区段上 根据有无荧光情况判断
,F１
与 扩增产物上均有结合位点 因此结合
~F４ R ,
位点位于 所对应调控序列的下游 右侧
F４ ( );F５
与 扩增产物上均无结合位点 可知结合
~F６ R ,
位点位于 所对应调控序列的上游 左侧 所
F５ ( ),
以结合位点位于引物 与 在调控序列上所
F４ F５
对应序列之间的区段上
为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光
(１)
１９８ 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
二、标记基因的筛选原理
5FU3
1.标记基因的常见类型及基本筛选方法 "NQ3 #BN)
1TU
3
标记基因
筛选方法 %
常见类型 EB1
.
,+
基因表达载体上携带的抗生素抗性基
,+
因进入受体细胞并表达后 可以使受 "NQ3 / 5FU
标记基因为 ,
体细胞表现出对相应抗生素的抗性 E=,+
抗生素的抗 . 3 "
在受体细胞的培养体系中加入致死浓 % "NQ
性基因 F3B1
度的相应抗生素后 , 存活的便是转化 ,+ "NQ
成功的细胞
首先 利用含氨苄青霉素 的培养基选择培
基因表达载体上携带某种必需营养物 , (Amp)
养 能生长繁殖成菌落的大肠杆菌只有 和 两
标记基因为 质的合成基因 而受体细胞本身不能
, , B C
必需营养物 合成这一营养组分 将细胞在不含有 种 然后 利用灭菌的绒布影印接种 菌落位置不
. ; , (
质合成基因 此营养组分的培养基中培养 存活的 变 至含四环素 的培养基选择培养 消失的
,
) (Tet) ,
便是转化成功的细胞
菌落即为 最后 从含氨苄青霉素的培养基上
标记基因为 基因表达载体上携带的GFP基因表 C; ,
找出上述消失的菌落进行扩大培养 就成功筛选
报告基因 如 达的绿色荧光蛋白 在一定条件下可 ,
[ ,
出了导入重组质粒的大肠杆菌
绿色荧光蛋 发出绿色荧光 将携带该标记基因的
. .
白基因GFP 重组质粒导入细胞后 若细胞可发出绿 蓝白斑筛选法 载体上携带有抗生素抗性
( , (２) :
基因 色荧光 则说明转化成功
)] ,
基因及lacZ基因 lacZ基因表达产物可分
.
以抗生素抗性基因为例 筛选过程如图所示 解 产生蓝色物质 使菌落呈现蓝色 否
, . XＧgal , ,
,+ E !7L 则菌落为白色 该载体上仅在lacZ基因中存
.
"NQ3 L2+
36 在目的基因插入位点 若目的基因插入lacZ
,
基因 则lacZ基因失去相应功能 在培养基中
DU , .
!7L
D+ 加入相应抗生素和 后 未导入质粒的菌株
L2 36 + =D XＧgal ,
+B1 DEU 不能生长 白色的菌落便是成功导入目的基因的
+ 36
+! DE ,
6"
大肠杆菌 呈现蓝色的菌落则是转入空质粒的大
"U 36,+*2 ,
肠杆菌
2.利用双标记基因筛选空质粒 .
典例 2 利用必需营养物质合成基因筛选 ( 天
影印法 ２０２１
(１)
津, 节选)乳酸菌是乳酸的传统生产菌 但耐酸
以含有氨苄青霉素抗性基因 AmpR 四环素 １６ ,
( )、
能力较差 影响产量 酿酒酵母耐酸能力较强
抗性基因 TetR 的普通质粒为载体 利用双 , . ,
( ) ,
但不产生乳酸 研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶
酶切法构建基因表达载体 一个标记基因 .
,
基因LDH 导入酿酒酵母 获得能产生乳酸的
TetR 被 限 制 酶 破 坏 另 一 个 标 记 基 因 ( ) ,
( ) ,
工程菌株 如图 为乳酸和乙醇发酵途径示意
AmpR 则保持完整 导入大肠杆菌 对氨苄 . １
( ) , (
图 图 为构建表达载体时所需的关键条件
青霉素和四环素均敏感 完成基因工程操作 , ２ .
).
后 理论上此时的大肠杆菌共有 没有成功
, A(
导入质粒的 导入普通粒的 和 导入重
)、B( ) C(
组质粒的 三种 可通过影印接种技术进行
) ,
筛选
.
第 24章 基因工程 １９９
提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵
③
母菌株 在 的固体培养基上筛选出
,
转基因酿酒酵母 并进行鉴定
, .
答案 包含Bam 的识别序列 将
(２)① HⅠ
改为 原核生物复制原点 不能
GTG ATG ②
缺失尿嘧啶
图
１ ③
变式 2 同知识不同考查角度 利用双标记基因筛选
( 湖北,, 分)用氨苄青霉素抗性基因
２０２３ ４２
AmpR 四环素抗性基因 TetR 作为标记基
( )、 ( )
因构建的质粒如图所示 用含有目的基因的
.
片段和用不同限制酶酶切后的质粒 构建
DNA ,
基因表达载体 重组质粒 并转化到受体菌中
( ), .
下列叙述错误的是
图 ( )
２
获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下 若用Hin 酶
(２) : A． dⅢ
设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列 切 目的基因转
① . ,
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序 录的 产 物 可 能
列由原核生物偏好的 转变为真核生物偏 不同
GTG
好的 且能通过双酶切以正确方向插入质 若用Pvu 酶切 在含 四环素 培养基中
ATG, B． Ⅰ , Tet( )
粒 需设计引物 和 其中引物 的 端序列 的菌落 不一定含有目的基因
, １ ２. １ ５′ ,
应考虑 和 若用Sph 酶切 可通过 凝胶电泳技术
. C． Ⅰ , DNA
将上述 产物和质粒重组后 导入大肠杆 鉴定重组质粒构建成功与否
② PCR ,
菌 筛选 鉴定 扩增重组质粒 若用Sph 酶切 携带目的基因的受体菌在
, 、 , . D． Ⅰ ,
重组质粒上有 所以 含 氨苄青霉素 和 的培养基中能
, Amp( ) Tet
能在大肠杆菌中扩增 启动子存在物种特异性 形成菌落
. ,
易被本物种的转录系统识别并启动转录 因此重 答案 D
,
组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 能 不
( /
能 在大肠杆菌中高效表达
) .
２００ 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
第 3 节 PCR 和电泳
一、PCR（聚合酶链式反应）
原理 半保留复制和 的热变性
DNA DNA续表
模板 一般为含目的基因的双链 片段 或含目的基因的基因组
DNA ( DNA)
原料 四种游离的脱氧核苷酸或脱氧核苷三磷酸
(dNTP)
一般为根据目的基因两端序列设计的能与之互补配对的短单链核酸片段 一般需要选择 种引
PCR 引物 ( ２
的条件 物分别扩增两条模板链 作用是使 聚合酶从引物的 端开始连接脱氧核苷酸
), DNA ３′
酶 耐高温的 聚合酶 如Taq 聚合酶 作用是催化 子链的合成
DNA ( DNA ), DNA
缓冲液 需含有 以激活 聚合酶
２＋
Mg , DNA
的
PCR
步骤和
结果
小表达 (选必 改编) 技术操作中为什么需要用 种不同的引物? .
３P７７ PCR ２
答案: 分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成, 扩增时只能从各自模板链的 端开始,故需碱基序列不
DNA PCR ３′
同的 种引物
２
二、琼脂糖凝胶电泳
电泳的 分子具有可解离的基团 在一定的 下 这些基团可以带上正电荷或负电荷 在电场的作用下 这
DNA , pH , . ,
定义 些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动 分子的迁移速率与其大小成反比
,DNA
检测 在凝胶中 分子的迁移速率与凝胶的浓度 分子的大小和构象等有关 凝胶中的 分子通
DNA 、DNA . DNA
原理 过染色 可以在波长为 的紫外灯下被检测出来
, ３００nm
电泳 琼脂糖凝胶制备 观察
凝胶板制备 点样 电泳
过程 加适量核酸染料混匀 → → → → 在紫外灯下观察
( ) ( )
未出现扩增条带的可 模板 含有杂蛋白或Taq 聚合酶的抑制剂 Taq 聚合酶失活 引物
DNA DNA ; DNA ;
能原因 出现质量问题 引物浓度不合适 浓度过低 变性温度过低 变性时间过短等
２＋
异常情 ; ;Mg ; ;
模板 出现污染 Taq 聚合酶出现质量问题 引物特异性不强 如与非目
况分析 出现非特异性扩增条 DNA ; DNA ; (
的序列有同源性 或形成引物二聚体 浓度过高 复性时的温度过低 循
２＋
带的可能原因 ) ;Mg ; ;PCR
环次数过多等
学生用书 P174
真题选改判 ４( 湖北, )利用 技术获取目的基因
．２０２１ １６ PCR
１( 黑、吉、辽,)琼脂糖凝胶电泳鉴定 时 可以通过提高复性的温度来减少反应中
．２０２４ ７ PCR ,
产物的实验中 凝胶载样缓冲液中指示剂的 非特异条带的产生
, . ( )
作用是指示 分子的具体位置 ４答案
DNA . ( ) ． √
１答案
从真题到教材
． ✕
２( 湖南, )电泳时产物的片段越小 迁移
．２０２４ １５ , ５利用 扩增 片段使用的酶是
速率越慢 ． PCR DNA
. ( ) 使用该酶的原因是
２答案
,
． ✕ ( 安徽, )该酶需要
３( 福建,) 实验所需的移液器 枪头 ２０２４ ２０ ,
．２０２３ ４PCR 、 、 缓冲液中的 来激活 的每次循环
蒸馏水等必须进行高压灭菌处理 .PCR
. ( ) 可分为变性 复性 三步 其中复性的结
３答案 、 、 ,
． ✕
第 24章 基因工程 ２０１
果是 ( 全国 引物的 端( 山东, )
２０２１ ２０２２ ２５.
甲, )(选必 — ) ６答案 能与目的基因母链的一段
３８ ３P７７ ７８ . ． ２ ５′→３′
５答案 耐高温的 聚合酶 如Taq 碱基序列互补配对的短单链核酸
． DNA ( DNA ５′
聚合酶 该 聚合酶能耐高温并催化合 ７ 技术遵循的基本原理是
) DNA ．PCR
成 子链 延伸 引物通过碱基 ( 湖南, )( 河北, )(选必
２＋
DNA Mg ２０２２ ２２ ２０２３ ２２ ３
互补配对与单链 结合 — ) 的基本原理是先以
DNA P７７ ７８ .RTＧPCR RNA
６ 扩增目的基因时需要 种引物 引物 为模板合成 这一过程需要的酶是
．PCR , cDNA,
链的延伸方向为 [ 福建, (一)] 再通过 技术扩增相应的
２０２２ ２１ . , PCR DNA
用于扩增目的基因的引物需满足的条件是 片段( 全国乙, )
２０２２ ３８ .
为使 产物 ７答案 半保留复制 逆转录酶
, PCR ． DNA
能被限制酶切割 该限制酶识别序列应添加在
,
２０２ 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
学生用书 P175
一、PCR引物设计原则和选择
长度适宜 适量的 含量 保证有较高的复性温度
(１) ;(２) C—G ( );
引物设 引物的 端可以被修饰 而 端需与 模板链严格互补配对 故不可被修饰 端常见的修饰
(３) ５′ , ３′ DNA , .５′ :
计原则 加酶切位点 加荧光标记 引入突变位点等
、 、 .
过程中 引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对
(４)PCR ,
*
判断引物的 端 端 引物与 模板链的 端互补 方向 B
(１) ３′ 、５′ : DNA ３′ ,
判断引物 相反 ,+ 3
;
的方向 复制从引物的 端继续向前进行 C
(２)DNA ３′ ;
由此可知 甲 乙 丙 丁四个引物的扩增方向如图 所示 图
(３) , 、 、 、 １ １
若扩增目的基因序列 则应选择图 中的引物乙 丙 B
根据扩增 (１) , １ 、 ;
若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点 应设计一 ,+ 3
目的选择 (２) ,
个引物与目的基因外部序列 即质粒序列 碱基互补配对 另一个引物 C
引物 ( ) ,
与目的基因内部序列碱基互补配对 如图 所示的引物 图
, ２ １、２ ２
典例 1 引物的选择 ( 北京, , 分)为了对重金属污染的土壤进行生物修复 研究者将从杨树
２０２０ １２２ ,
中克隆的重金属转运蛋白 HMA３ 基因与外源高效启动子连接 导入杨树基因组中 如图
( ) , ( ).
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA３基因 同时避免内源HMA３基因的干扰
, ,
在进行 扩增时 应选择的引物组合是
PCR , ( )
A．①＋③ B．①＋② C．③＋② D．③＋④
答案 B
变式 1 同方法不同情境 引物的选择与设计 ( 江苏, 节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白
２０２３ ２２
基因融合表达 运用重组酶技术构建质粒 如图 所示 请回答下列问题
, , １ . :图
１
分 别 进 行 扩 增 片 段 与 片 段 时 配 制 的 两 个 反 应 体 系 中 不 同 的 有
(１) PCR F１ F２ ,
扩增程序中最主要的不同是
, .
有关基因序列如图 引物 应在下列选项中选用
(２) ２. F２ＧF、F１ＧR .
图
２
A．ATGGTG－－－－－－CAACCA C．GACGAG－－－－－－CTGCAG
B．TGGTTG－－－－－－CACCAT D．CTGCAG－－－－－－CTCGTC
答案 模板和引物 退火 复性 温度
(１) ( ) (２)CD
二、电泳图像分析
电泳
结果
示意图
常规
(
结果
)
电泳
结果及 泳道 为 由一些分子大小已知的 片段组成 可以作为电泳结果中
(１) １ Marker, DNA ,
初步 根据条带 的参考系 以反映出待测片段的分子大小 如泳道 中的 片段在 到
, . ４ DNA ３０００bp ５
分析 位置判断 之间
０００bp .
分子 当 构象相同 电泳条件基本一致时 相对分子质量大的 分子迁移速率
DNA (２) DNA 、 , DNA
结果 大小 较小 相对分子质量小的 分子迁移速率较大 故泳道 的片段 的相对分子质
, DNA , ３ ①
初步 量 片段 的相对分子质量
＞ ②
分析
根据电泳 泳道 和泳道 为同一个质粒经不同限制酶处理得到的结果 泳道 只有 条条
２ ３ . ２ １
条带判断 带 说明质粒只含 或 个相应限制酶切割位点 泳道 含 条条带 说明质粒含
, ０ １ . ３ ２ , ２
限制酶酶 个相应限制酶切割位点 假设泳道 中 分子大小为 则泳道 中
. ２ DNA ４８００bp, ３
切位点数量 分子的大小分别为 片段 和 片段
DNA ３０００bp( ①) １８００bp( ②)
第 24章 基因工程 ２０３典例 2 根据条带位置判断基因型 ( 新课标, 知野生型水稻叶片绿色由基因 控制 突变型
２０２４ C , １
是由基因 突变为 该过程中产生了一个限
, 分)某种二倍体植物的 和 植株杂交得
５６ P１ P２
C C１,
制酶酶切位点 基因 纯合幼苗期致死 突变
自交得 对个体的 进行 检
F１,F１ F２. DNA PCR , C１ .
基因 转录产物编码序列第 位碱基改变
测 产物的电泳结果如图所示 其中 为部
, , ①~⑧ C１ ７２７ ,
由 变为 将单个
分 个体 上部 条带是一对等位基因的扩增
F２ , ２ ５′ＧGAGAGＧ３′ ５′ＧGACAGＧ３′.
基因以及从突变型 叶片细胞中获取的相关基
产物 下部 条带是另一对等位基因的扩增产
, ２ １
因片段 用限制酶处理后进行电泳 结果如下
物 这 对等位基因位于非同源染色体上 下列
, .
, ２ ,
图 下列有关突变体的分析错误的是
叙述错误的是
( )
, ( )
1 1 ' ' 部分密码子及对应氨基酸 谷氨酸
( :GAG ;
精氨酸 天冬氨酸 苏氨酸
*#B AGA ;GAC ;ACA ;
谷氨酰胺
CAG )
*#
.
个体均为杂合体 中 所占的比例大 CQ
A．①② ,F２ ③
CQ
于
⑤ CQ
还有一种 个体的 产物电泳结果有
CQ
B． F２ PCR ３
条带 .U %/"'
和 杂交子代的 产物电泳结果与 由题干信息可推知突变型 为显性突变
C．③ ⑦ PCR ② A． １
电泳结果相同 基因 突变为 导致第 位氨基酸转变
⑧ B． C C１, ２４２
自交子代的 产物电泳结果与 电泳 为谷氨酸
D．① PCR ④
结果相同的占 突变型 叶片细胞中获取相关基因片段电泳
１/２
C． １
答案 D 的结果为
Ⅲ
变式 2 同方法不同情境 根据电泳条带数及酶切位 突变型 连续自交 代 成年植株中黄色
D． １ ３ ,F３
点判断基因型 ( 长沙师大附中月考,)培育水 叶植株占
２０２４ ４
２/９
稻中发现了一种叶片为黄色的突变型水稻 已 答案 B
.
２０４ 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
