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核心考点 DAY 08
姓名： 日期： 班级：
《基因工程》-1 专题
1.DNA 的粗提取和鉴定
(1)提取DNA 的原理：利用DNA 与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA,去
除
其他成分。
如：①DNA 在酒精溶液中的溶解性：DNA 不溶于 ，但某些蛋白质溶于酒精。
②DNA 在NaCI 溶液中的溶解性：DNA 在不同浓度的NaCI 溶液中的溶解度不同，它能溶于
的NaCl 溶液。
(2)鉴定DNA 的原理：在一定温度下( 加热)，DNA 遇二苯胺试剂会呈现 。
（2025·江苏·节选）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开
展了以下研究。请回答下列问题：
研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA 提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下
表：
实验目的
简要操作步骤
释放DNA
在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA
离心后取①
，加入乙醇
②
在沉淀物中加入纯水
扩增DNA
将③
、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR 管中，进行PCR
2.DNA 的电泳鉴定
（1）原理
电泳原理
DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电
场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电
泳。PCR 的产物一般通过 电泳来鉴定
迁移速率
在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的 、DNA 分子的 和 等有关
DNA 检测
凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为300nm 的 灯下被检测出来
（2）步骤
注入
将扩增得到的PCR 产物与 (内含指示剂)混合，再用微量移液器将混
合液缓慢注入凝胶(凝胶中含 )的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小
的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm,待
前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
（3）知识延伸
DNA 标准
参照物
一种用于确定目的DNA 片段大小的标准参照物，具有特定的DNA 分子大小，一般置于第
一个点样孔中，标识样品的DNA 大小
核酸染料
和指示剂
指示剂
是一种有颜色的标记物，相当于一个较小的DNA 分子，但 （与/不与）
DNA 结合，指示剂在电泳时移动较快且 （能/不能）被肉眼观察到，用于
指示样品的迁移过程，常用指示剂包括溴酚蓝(蓝紫色)和二甲苯青(蓝色)。
核酸染料
核酸染料是一类 （能/不能）够与DNA 或RNA 分子结合，并在特定条
件下显示颜色或荧光的化学物质，用于电泳后检测核酸的 。
（2024·黑吉辽）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
3.基因工程的定义：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生
物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA 分子水
平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA 技术。
（1）原理: 。
（2）操作对象:
。
（3）操作水平: 水平。
（4）操作环境: 生物 （体内/体外）进行。
（5）结果： 。
（6）优点：①
。（与诱变育种相比）
② 等。（与杂交育种相比）
（7）不同生物的DNA 能够链接成功的原因是 。
4.基因工程的工具酶
（1）功能
原理
能够识别 分子的 序列,并使每一条链中特定部位的 断
开。
特点
限制酶的 和 具有特异性（限制性，专一性），使用不同的限制酶可以切割不
同的核苷酸序列。
类型
黏性末端（如：EcoR I）
平末端(如：Sma I)
在中轴线（图中虚线）的两侧，限制酶在切断
DNA 时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，
碱基正好互补配对，因此称这些片段为
。
不产生单链的黏性末端。
应用
①限制酶一般用于切断DNA 片段，获取 ，为目的基因连接表达载体做准备。
②由于黏性末端具有特异性，可以保证DNA 连接时具有特异性，因此在实验设计中，通常选择
切割后形成 末端的酶，而避免使用切割后形成 末端的酶。
思考
①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
答：原核生物中限制酶的作用是切割 （内源/外源）DNA 以保证自身安全，防止外来
病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA 分子？
答：限制酶不切割自身DNA 的原因是原核生物DNA 分子中 或
。
（2）特殊限制酶
同裂酶
异裂酶
同尾酶
识别 序列，切割
位点，产生相同
识别 序列，但切
割
识别 序列，产生 的黏性末端。
的黏性末端（但反应条
件可能不同）
位点。
Sph I
Bbu I
Sma I
Xma I
异端同尾酶
异长同尾酶
Bam I
Bgl II
Sau 3A I
【教材深挖】
选择性必修
3P
74 ，拓展应用，
1
1.有2 个不同来源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶SpeI 进行切割，B 片段分别用限制酶Hind Ⅲ、
XbaI、EcoRV 和XhoI 进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1) 哪种限制酶切割B 片段产生的DNA
片段能与限制酶SpeI 切割A 片段产生
的
DNA 片段相连接?为什么?
(2) 不同的限制酶切割可能产生相同的
黏性末端，这在基因工程操作中有什
么意义?
答：同尾酶使构建载体时，切割位点的
选
择范围 （缩小
/ 扩大）。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载
体，如果目的基因的核苷酸
序列中恰好没有该限制酶的识别序列，这时可以考虑用合适的 酶（目的基因的核苷酸序列中
不能有该酶的识别序列）来获取目的基因。
例1.某线性DNA 分子含有3000 个碱基对(bp)，先用限制酶a 切割，再把得到的产物用限制酶b 切
割，得到的DNA 片段大小如表所示。限制酶a 和b 的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正
确的是( )
A.在该DNA 分子中，a 酶与b 酶的识别序列分别有3 个和2 个
B.a 酶与b 酶切出的黏性末端不能相互连接
C.a 酶与b 酶切断的化学键不相同
D.用这两种酶和DNA 连接酶对该DNA 分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， 序
列会明显增多
(2)DNA 连接酶（连接两个DNA 片段）
E.coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶都能连接
（黏性末端/平末端/黏性末端
和平末端）。但E.coli DNA 连接酶连接双链
DNA 片段的平末端效率远比T4 DNA 连接酶的效
率 （低/高）。
例3.说出下列过程参与的酶（写在箭头下面）
例4.下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的（ ）
① ② ③ ④
A.1 种 B.2 种 C.3 种 D.4 种
图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？ 、 。
方法：将某一个黏性末端旋转 度。
提升：理解重组质粒和反义质粒
（3）运载体：
①基因在细胞中的稳定复制需要有 ，基因的表达则需要 和 ，在研究中一般
通过各种载体，提供不同的结构，从而促进基因的复制和表达，其中最常用的是 ，其他运载
体有 （病毒具有特异性）
②质粒
标记基
因的
标记基因是质粒上目的基因之外的另外一个基因，可以控制一些易于筛选和检测的性状，
便于重组DNA 分子的筛选。基因工程中常用的标记基因有四种，分别是抗生素抗性基因、荧
光基因、营养物质合成基因、LacZ 基因。
定义
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞 DNA 之外，并
具有自我复制能力的环状 （单链/双链）DNA 分子
原理
将目的基因插人质粒中，并导入 细胞，可以在受体细胞内稳定 和
来源
来自细菌或酵母菌，天然质粒 （需要/不需要）人工改造
种类
根据功能可以将质粒分为克隆载体和表达载体两种常用载体 。此外，有些载体还能起
到基因编辑、 基因敲除的功能，这里我们学习最常用的表达载体。
结构
功能
复制原点
复制起始位点，使目的基因稳定遗传
启动子和终止子促进目的基因的表达
标记基因
多个酶切位点
方便对基因进行插入或其他操作
类型
抗性
基因
将抗生素抗性基因的载体导人 （敏感型/抗性型）的宿主细胞中，并在培养基中
添加抗生素或除草剂，抗性基因在受体细胞内表达，表达产物使受体细胞对该抗生素产生抗
性可以淘汰转化失败的细胞，筛选出转化成功的细胞。在题目中最常出现的抗性基因有氨苄
青霉素抗性基因(AmpR)、 四环素抗性基因(TetR)及卡那霉素抗性基因(KanR)等
影印法：例5.某一质粒载体如图所示，外源DNA 插入到Ampr 或Tetr 中会导致相应的基因失活
（Ampr 衣示氨苄青霉素抗性基因，Tetr 表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH l
酶切后，与用BamH I 酶切获得的目的基因混合，加入DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混
合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三
种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆
菌。
(1）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，
在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅
含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是
(2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，
在上述四种大肠杆菌细胞中，
和
的细胞也是不能区分的，其原因是
。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使
用含 培养基。图中 （菌落号数）就是插入了目的基因的重组
质粒的大肠杆菌。
荧光 基
因
荧光基因可以表达出荧光蛋白，荧光蛋白可被激
发出荧光，从而被观察到。将荧光基因作为标记基因
转入各类细胞中，都可以通过荧光检测转入是否成
功。
例6. （2021 年6 月浙江选考试题）采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白
（EGFP）基因定点插入到受精卵的Y 染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型
雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B．基因编辑处理的受精卵在体外培养至2 细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可
获得表达EGFP 的小鼠
C．分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP 的即为雄性小鼠胚胎
例7.（2023 年6 月浙江选考试题,T19）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）
基因整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合
子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生
小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。下列叙
未被转化的大肠杆菌；
含有环状目的基因的大肠杆菌；
含有质粒载体的大肠杆菌；
含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
述正确的是（ ）
A.Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B.翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C.2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D.若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合
营养物
质合成
基因
用营养缺陷型的微生物作为转基因的
时，可以使用营养物质合成基因
作为标记基因，例如，与野生型相比，亮
氨酸合成缺陷型酵母菌在 (含/不
含）亮氨酸的培养基中不能生存，将亮氨
酸合成基因作为标记基因导入亮氨酸合成
缺陷型酵母菌，在不含亮氨酸的培养基上
转入成功的酵母菌可以形成菌落，转入失
败的酵母菌不能生存。
没有找到病毒作为运载体的题目，以缺陷型细菌的筛选为例了解一下营养合成缺陷基因。
例7. 菌种M 和茵种N 在发酵工程应用上具有不同的优越性，为了获得具有它们共同优良性状
的融合菌，进行了下图所示的实验。已知菌种M 为组氨酸依赖(组氨酸合成相关基因突变为
B-),菌种N 为色氨酸依赖(色氨酸合成相关基因突变为A-),下列分析错误的是( )
A.菌种M 和N 可通过人工诱变和选择性培养选获得
B.用PEG 诱导融合之前需要去除菌种M 和N 的细胞壁
C.在培养基X 中添加组氨酸和色氨酸以筛选出杂种融合菌
D.从培养基X 中分离出的杂种融合菌P 对两种氨基酸均不依赖
LacZ 基
因（显
色
法），
常用蓝
白斑筛
选法
图示中,菌落1、2、5、6 呈蓝
色，是导入 的受体菌。
【教材深挖】选择性必修
3P
98，复习与提高，
1
例8.1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基
因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保
存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ
基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如
下图所示。回答问题：
LacZ 基
因（显
色
法），
常用蓝
白斑筛
选法
【我们假设：在②步中使用单酶切】
（1）在②步中，应怎样选择限制酶？
答：第一，应选择用 （相同
/ 不同）的限制酶或切割能产生 （相同
/ 不同）末端的
限制酶切割质粒和含有目的基因的
DNA
片段；
第二，注意限制酶的切割位点 （能
/ 不能）位于目的基因的内部，以防破坏目的基
因
, 限制酶也不能破坏质粒的
、 、 、复制原点等结构。
（2）在第③步中，为了使质粒DNA 与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质?
（3）选用含有AmpR 和LacZ 基因的质粒进行实验有哪些优势?
答：该质粒便于进行 筛选。标记基因
AmpR
基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，
一般只有导入了 的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于
LacZ
基因的
效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒
( 没有连接目的基因的质粒
) 的大肠杆菌
菌落呈 色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈 色。
（4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什!么颜色?为什么?
答：有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因插入 了
LacZ
基因的结构，使其不
能正常表达成
β-
半乳糖苷酶，底物
X-gal
也就不会被分解。
附：我们可以看到单酶切会产生目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒的反向连
接，为克服该缺点，保证目的基因和质粒的正确（正向）连接，采取的方法是
。
③病毒载体：动物细胞不含质粒，如果要向动物细胞导人外源基因，通常需要用到DNA 病毒或RNA 病
毒。病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，因此它是功能强大的基因转移载
体。如腺病毒载体、慢病毒载体等，但目前对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟。除质粒外，噬菌
体载体也是常用工具之一。
图示中,菌落1、2、5、6 呈
黑色，是 的
受体菌。
图示中,菌落3 呈蓝色，是
导入 的受体
菌。
慢病毒是一种RNA 逆转录病毒，可以将目的基因导入宿主细胞基因组DNA 上，从而实现稳定的遗
传
腺病毒是一种DNA 病毒。它通过内吞进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色
体外， 不整合进入宿主细胞基因组中。可以利用其DNA 进行转基因、基因编辑、基因沉默等操
作
λ 噬菌体是一种温和噬菌体，可以将基因整合到宿主细胞基因组DNA 上，经过改造的 λ 噬 菌 体
可 以 不 裂解宿主细胞，从而作为基因载体
没有找到病毒作为运载体的题目，以噬菌体的筛选为例了解一下双层平板法。
例8.双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。
具体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量是1%
的培养基熔化并冷却至45-48℃,然后加
入宿主
细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，
充分混
匀后立即倒入底层平板上形成双层平
板。培
养一段时间后，在上层平板上看见由于
噬菌体
侵染周围细菌而使宿主细胞裂解死亡形
成的空
斑即噬菌斑。通常一个噬菌斑来自原液
中的一
个噬菌体，根据噬菌斑的数目计算原液
中噬菌
体的数量，如图所示。下列叙述正确的
是(
)
A.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择
培养基选择出噬菌体的宿主细胞
B.加入混合液后，使用灭菌后的涂
布器将混合液均匀地涂布在培养基表面
C.上层培养基中琼脂浓度较高，因
此形成的噬菌斑较大，更有利于计数
D.双层平板法获得的噬菌斑不易
发生上下重叠现象
5. 目的基因的筛选与获取
（1）真核生物、原核生物基因的结构和表达
（2）目的基因的筛选与获取
随着 技术的发展，以及 （如GenBank）、 （如BLAST）等的
应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
①
从基
因文
库中
直接
获取
文
库的构建
部分基因
文库（如
cDNA 文
库）构建
②
人工
合成
前提：基
因比较
（大/小
）、核苷
酸序列
（未
知/已
知）
方法：通
过
用化学方
法直接合
成目的基
因
逆转
录法
即以 作为模板，在 酶的作用下合成 ，若
要运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的 细胞中提取
到胰岛素的mRNA 进行逆转录获取胰岛素基因；原因是
。上述方法获得的胰岛素基因
（cDNA）在基因结构的特点是
。
化学
合成
法(蛋
白质
工程)
P94
A.蛋白质工程运用化学合成法合成目的基因的基本途径是
→ →
→ 。
B. 化学法合成的目的基因 （含/不含）内含子、启动子和终止子？
。
C.若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可
能有 （一种/多种）；理由是
。
D.化学合成法 （能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物
产生新的性状以满足人类的要求
③
利用
PCR
获取
和扩
A. RCR 概念：PCR 是 的缩写，是一
项根据 的原理，在 提供参与
DNA 复制的 与 ，对
进行 的技术。
B. 条件: 前提条件： 。
C. 过程：P78
变性：温度上升到 ℃以上，双链
DNA 解聚为
复性：当温度下降到 ℃左右时，
种引物通过碱基互补配对与
基因组文库
cDNA 文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间的基因交流
增目
的基
因
一定的缓冲溶液(含 )、DNA 模板、 种引
物、4 种 （dNTP）、
的DNA 聚合酶、控制温度使DNA 复制在 反复进
行
a.引物：
【定义】引物是
（单链DNA 或单链RNA）。用于PCR 的引物长度通
常为20-30 个核苷酸的 。
【设计原则】 ;
;
。
【作用】2 种，引物的 端分别与两条模板链
端结合，为DNA 聚合酶提供了游离的 端，使
耐高温的DNA 聚合酶能够从引物的 端开始连
接脱氧核苷酸。
b.4 种脱氧核苷酸：合成DNA 子链的原料(dNTP，包
括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP),又提供
。
c.真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要 激
活。因此，PCR 反应缓冲溶液中一般要添加
。
d.模板DNA 条母链:提供DNA 复制的模板
e.耐高温的DNA 聚合酶（ ）:催化
合成DNA 子链。
f.高温：断开氢键，打开DNA 双链。（体内进行DNA
复制时需要 断开氢键。）
条单链DNA 结合。
延伸：温度上升到 ℃左右时，溶
液中的4 种脱氧核苷酸在
的作用下合成新的
DNA 链。
扩增次数
第1 次
第2
次
第3
次
第4 次
第N 次
DNA 总数
21
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链DNA
【等长的DNA 分子数（目的基因）】
含引物A(或B)的DNA
6. 基因工程的核心——
构建基因表达载体的目的是：让目的基因在受体细胞中 存在, 并且 给下一代；使目的基
因能够 和 作用。
（1）启动子
①本质：一段有特殊序列结构的 片段
②功能：
③诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活
或抑制目的基因的表达。
④启动子具有物种和组织 性：即只有使用受体生
物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。
如：利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药物。 科学家将药用蛋白基因与
的启动子 等调控元件重组在一起，通过 的方法导入哺乳动物的 中，由这个受精
卵发育成的转基因动物在进入 期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为
或乳房生物反应器。
又如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是 。
（2）终止子：
①本质：一段有特殊序列结构的 片段
②功能：使 在所需要的地方停下来。
综上可知目的基因必须插入 和 之间。
（4）复制原点：使能完成自主 。
（2025 年四川，保证载体能在XX 细胞中能正常复制）
单酶和双酶切割比较:
单酶切：获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制
酶,目的是
。但是使用该法缺点是容易发生
，为了避免上
述情况发生，可采取的措施是
。
双酶切的优点：①防止质粒自身环化
②防止目的基因自身环化 使质粒和目的基因正确（正向）连接
③避免目的基因和质粒的随意连接
（详见：第4 页的重组质粒和反义质粒）
提升：正向连接质粒和反向连接的质粒的筛选
方法一：酶切法
例8.(2022·福建，13 节选)载体和CD14 片段的酶切位
点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用Xho Ⅰ和
Sal Ⅰ分别酶切CD14 和图中载体连接，CD14 接入载体
时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一
步用这两种限制酶对CD14 的连接方向进行鉴定，理由
是
。
例9.（2025·山东·21 节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti
质粒上的T-DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2 个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，
突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
质粒
基因表达载体
DNA连接酶
或
外源DNA
目的基因
a酶
a酶
a酶
(1)Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为
。选用图甲中的SmaI 对抗除草剂基因X 进行完全
酶切，再选择SmaI 和
对Ti 质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是
。利用DNA 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载体，转化
大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶
进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈
现一长一短2 条带，较短的条带长度近似为
bp，则一定为正向重组质粒。
方法二：PCR
例10.(高考题节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正
确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR 鉴
定。图中A 所示为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒
中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是
。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒
中扩增出了400 bp 片段，原因是
。
【能力提升】：重点难点·透析（基因表达载体的构建）
1.限制酶的选择
(1)目的基因
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，
不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图
甲不能选择限制酶 。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向
连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质
粒，如图甲可选择 和 两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，
如图乙)。
(2)质粒 (3)Ti 质粒的T－DNA 片段
T-DNA 上也要有标记基因，筛选
。
例11.(2024·湖南，21 节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种
技术研究。研究人员从野生百合中获得
一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基
因及其上游的启动子pL 和下游的终止子
结构如图a。图b 是一种Ti 质粒的结构
示意图，其中基因gus 编码GUS 酶，GUS
酶活性可反映启动子活性。
(1)研究病原微生物对L 的启动子pL 活性
的影响。从图a 所示结构中获取pL，首
先选用_________________酶切，将其与
相同限制酶酶切的Ti 质粒连接，再导入
烟草。
例12.（2025·黑吉辽蒙·节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表
达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询
基因N 的编码序列，设计
特定引物。如图1 所示，a
链为转录模板链，为保证
基因N 与质粒pYL 正确连
接，需在引物1 和引物2
的5'端分别引入
和 限制酶识别序
列。PCR 扩增基因N，特异
性酶切后，利用
连接DNA 片段，构建重组
质粒，大小约9.5kb（kb
为千碱基对），假设构建
重组质粒前后，质粒pYL
对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质
粒，以1-4 号菌株中提取
的质粒为模板，使用引物
1 和引物2 进行PCR 扩增，电泳PCR 产物，结果如图2。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板
DNA，目的是检验PCR 反应中是否有
的污染。初步判断实验组 （从“1-4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。
例13.（2025·陕晋青宁·节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科
研人员发现，野生马铃薯中S 基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能
力。回答下列问题。
(2)图中标识了载体和S 基因中限制酶的切割位点。为将S 基因正确插入载体，PCR 扩增S 基因时需在引物的
（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-
-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是
，PCR 扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化
和连接，获得含S 基因的表达载体并导入农杆菌。
2.注意教材上的两句话
（1）P72，在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。
（2）P82，基因表达载体的构建的方法也不是千篇一律的。
例13.（2025·周测8）Mse Ⅰ（GAAT↓TAATTC）、Pst Ⅰ（C↓TGCAG）、EcoR Ⅰ（G↓AATTC）三种限
制酶的识别序列及切割位点,下图1、图2 中箭头表示相关限制酶的酶切点。 若要用上图质粒和外源
DNA 构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中
需要使用的酶是（ ）
A. 限制酶Pst Ⅰ、DNA 连接酶、DNA
聚合酶
B. 限制酶EcoR Ⅰ、DNA 连接酶、DNA
聚合酶
C. 限制酶EcoR Ⅰ、限制酶Pst Ⅰ、
DNA 聚合酶
D. 限制酶Pst Ⅰ、限制酶EcoR Ⅰ、
DNA 连接酶
例14.（2025·周测8）研究人员利用Ti 质粒构建p—H5/H3 共表达重组质粒（如下图)。设计思路
是：获得H5 基因和H3 基因，先将H5 基因整合到含
卡那霉素抗性基因的T-DNA(仅含有 Nhe Ⅰ和
Xho Ⅰ酶切位点）上，再将H3 基因插入，获得重组
质粒。为达到实验目的，需在H5 基因两端分别引
入___________和_________________酶切位点。通常酶切位点的引入方法是在PCR 过程中，通过设计
使其出现在_______中，进而出现在H5 基因中。
3.启动子
（1）启动子具有物种和组织特异性(选择性必修3P90)。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能
比较有利于基因的表达。
（2）诱导型启动子（选择性必修3P80）
例15.（2024 年河北卷，T22）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关
基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN 疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
7. 将目的基因导入受体细胞
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持 和 的过程。实质是
(变异类型)
导入至植物细胞
花粉管通道法
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA 溶液滴
加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
农杆菌转化法
1. 农杆菌特点：易感染 叶植物和 植物，对大多数
叶植物没有感染能力（人工添加 化合物可以解决）。
2. 原理：农杆菌细胞内含Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将
Ti 质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该
细胞的 上。
3. 过程：
①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是
将 拼接到 上，第二次
拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T−DNA 拼接到受体细胞
的染色体DNA 上；//第一次导入是导入 ，第二次
导入（非人工操作）是将含目的基因的T−DNA 导入
。
②导入的目的基因可能存在于细胞质中（具体位置是
、 ），也可能整合到染色体DNA 上。存在于
染色体DNA 上的目的基因有可能通过 传播进入杂草或
其他作物中，造成“基因污染”。
③T-DNA 上也要有标记基因，筛选导入成功的受体细胞。
④植物的受体细胞是 或 。
导入至动物细胞
法
1. 受体细胞 。
2. 过程：构建基因表达载体并提纯→利用显微注射法将基因表达
载体注入动物的受精卵中→ →
（移植到同期发情的母畜子宫内）→获得具有新性状的动物（也
叫
）
膀胱生物反应器：利用转基因的动物的尿液来获得目的蛋白，一般采用工
程化膀胱上皮细胞生产特定的蛋白并分泌进入尿液；膀胱生物反应器具有
一定的优点：如尿液产量大、收集方便；膀胱生物反应器 （无/有）
周期和性别的限制, 在任何时期, 雌雄动物均可通过尿液收集目的蛋白；从
尿中提取蛋白更容易, 因为尿液中含有的蛋白种类及其他杂质相对较少易
于纯化。
导入至微生物
细胞
法
（感受态细胞
法）
1. 常用菌: 。
2. 微生物作为受体细胞的原因是
。
3. 过程：Ca2+处理细胞→ →表达载体与感受态细胞
混合→感受态细胞吸收DNA
8. 目的基因的检测与鉴定
类型
检测内容
方法
水平检测
受体细胞的染
色体DNA 上是
否插入了
;
目的基因是否
转录出
。
、分子杂交等技术。
1. PCR 技术检测
（1）受体细胞的染色体DNA 上是否插入了目的基因：
例如：检测棉花的染色体DNA 上是否插入了Bt 基因或检测Bt 基
因。
提取棉花细胞 →Bt 基因的特异性引物进行PCR 扩增
→对扩增产物进行检测（如：琼脂糖凝胶电泳检测）
（2）PCR 技术检测受体细胞的目的基因是否转录出了mRNA。
方法：提取转基因生物的 ，在 酶作用下合成
，再用与目的基因特异性结合的引物进行PCR 扩增，检测是否有
扩增产物。
2. 分子杂交技术
探针：是一种带有放射性同位素、荧光染料或其他化学物质标记
的 （单/双）链核酸序列，可以是DNA 或RNA，用来检测样
品中的特定核酸序列。探针能够通过分子杂交的方式与目标序列
结合，从而实现对目标序列的检测。
受体细胞的目
的基因是否翻
译成
1. 方法：
2. 原理：
3. 过程：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体与提取的蛋
白质进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则说明目的基因已成功
翻译。
变性→复性
延伸
延伸
生物
学水平的鉴定
鉴定生物是否
具有该蛋白质
赋予的某种特
性以及具有该
特性的程度
（活性鉴定）
①抗虫：做抗虫接种实验（饲喂害虫），观察 （害虫/植
物体）的生存状况。
②抗病：做病原体接种实验，观察 （病原体/植物体）的
生存状况。
③抗盐：将转基因植物移栽到 ，观察其生
长状况。
④抗寒：将转基因植物移栽到 环境中，观察其生
长状况。
（2025·黑吉辽蒙·节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香
树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方
案。
（2025·山东·节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti 质粒上
的T-DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2 个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体
种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，
（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
9.蛋白质工程
（1）为什么要通过基因改造或基因合成来完成蛋白质工程，而不是直接对蛋白质进行改造？
①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大。
②蛋白质是由基因编码的，改造了基因，可以间接改造蛋白质。
③基因可以遗传，蛋白质无法遗传。
（2）定义：是以 作为基础，通过
对现有的蛋白质进行改造，或制造一种 ，以满足人类的生产和生活需要。
（3）蛋白质工程和基因工程的比较
基因工程
蛋白质工程
操作环境
生物体外
生物 （体内/体外）
操作核心
基因
操作起点
目的基因
基本过程
目的基因的筛选与获取→基因表达
载体的构建→将目的基因导入受体
细胞→目的基因的检测与鉴定
结果
生产自然界已存在的蛋白质
改造天然蛋白质或创造出自然界 （不存
在/存在）的蛋白质
联系
蛋白质工程最终还是要回到基因工程上来，因为蛋白质的合成由基因控制，所以说蛋白
质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第 代基因工程
（2025·河南·节选）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分
子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶
寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌
种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
(1) 已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而
提升蛋白质的耐热性。为提高CG 的耐热性，研究人员分
析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大
表明该位点对酶的功能越关键），如图2 所示。根据分析
结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，
原因是
。
