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专题05 生物技术与工程
考点概览
考点01 发酵工程
考点02 植物细胞工程
考点03 动物细胞工程
考点04 胚胎工程
考点05 基因工程
发酵工程
1、（湖南省“一起考”2025 届高三二模）染料废水是一种难处理的工业废水。研究发现活性污泥中能筛
选出对蓝色的2BLN 染料（C14H9CIN2O4）废水具有高效脱色能力的菌株﹐它们通过降解具生物毒性的分
散蓝2BLN 而降低废水危害。下图表示目标菌株GN—1 的筛选和脱色实验流程。下列有关叙述正确的是（
）
A．培养基甲、乙、丙均为选择培养基，作用相同
B．培养基乙中应以2BLN 为唯一的碳源或氮源
C．向培养基乙进行接种时应采用稀释涂布平板法或平板划线法
D．所示菌落①至④中，菌落②或④的脱色能力最强
【答案】B
【知识点】培养基的类型及其应用、微生物的接种方法
【分析】微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落，这种接种方法称为平板划线法。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】A、培养基甲、乙、丙均为选择培养基，培养基甲的作用是选择和扩大培养GN—1 菌种；培养基
乙是固体培养基，作用是分离、纯化和选择菌种，培养基丙的作用是脱色实验、检验目的菌的脱色率，三
者作用不完全相同，A 错误；
B、培养基乙是选择培养基，应当以分散蓝2BLN 为唯一氮源或碳源，B 正确；
C、向培养基乙进行接种时应采用稀释涂布平板法，C 错误；
D、透明圈越大说明该菌落中的菌株降解分散蓝2BLN 的能力越强，故应该选取菌落③，D 错误。
考点01
故选B。
2、（2025 届湖南省常德市高三二模）生物学实验中常需要配制一定浓度的溶液，下列叙述错误的是（
）
A．pH=7 的缓冲液可以由0.1mol/L 的HCl 和0.1mol/L 的NaOH 等体积混合而成
B．体积分数为95%的乙醇加入无水碳酸钠可在绿叶色素提取实验中代替无水乙醇
C．精确配制的1mol/L 的
溶液和1mol/L 的葡萄糖溶液，渗透压是不相等的
D．取1ml 充分摇匀的土壤样液加入盛有9ml 无菌水的试管中，可等比稀释10 倍
【答案】A
【知识点】绿叶中色素的提取和分离实验、内环境的理化性质、其他微生物的分离与计数
【分析】1、绿叶中色素是脂溶性的，可以用无水乙醇提取色素；提取过程中加入二氧化硅的作用是充分
研磨；加入碳酸钙的目的是：保护色素在研磨中不被分解。
2、从土壤中分离微生物的一般步骤是：土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株
【详解】A、pH=7 的缓冲液是由磷酸盐组成，0.1mol/L 的HCl 和0.1mol/L 的NaOH 等体积混合只能的到
pH 约为7 的盐溶液，并不能起到缓冲作用，A 错误；
B、体积分数为95%的乙醇加入无水碳酸钠可除去乙醇中的水分，从而在绿叶色素提取实验中可以代替无
水乙醇，B 正确；
C、由于
是能解离的盐，其溶质微粒包括
和
两种，而葡萄糖是非电解质，其溶质微粒只有
一种，所以精确配制的1mol/L 的
溶液和1mol/L 的葡萄糖溶液，渗透压是不相等的，C 正确；
D、取1ml 充分摇匀的土壤样液加入盛有9ml 无菌水的试管中，总体积变为10ml，相当于等比稀释10 倍，
D 正确。
故选A。
3、（2025 届湖南省常德市高三二模）下列有关发酵工程及其应用的说法错误的是（ ）
A．选育菌种是发酵工程的前提条件，该环节很大程度上决定生产发酵的成败
B．只有发酵工程中心环节结束时才需要检测培养液中的微生物数量、产品浓度
C．通过发酵工程获得的单细胞蛋白可作为食品添加剂，也可制成微生物饲料
D．微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤
结构
【答案】B
【知识点】发酵工程的基本环节、发酵工程的应用
【分析】发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌、接种、发酵和产品的分离、提
纯等方面。
【详解】A、选育优良菌种是发酵工程的关键步骤，菌种的优劣很大程度上决定了发酵生产的成败，A 正
确；
B、在发酵工程的各个环节，包括菌种选育、发酵过程控制等，都需要检测培养液中的微生物数量、产品
浓度等参数，以确保发酵过程的顺利进行和产品质量，B 错误；
C、发酵工程获得的单细胞蛋白富含蛋白质等营养物质，可作为食品添加剂，也可制成微生物饲料，C 正
确；
D、微生物肥料通过微生物的代谢活动产生有机酸、生物活性物质等，能够增进土壤肥力，改良土壤结构，
对农业生产有重要作用，D 正确。
故选B。
4、（2025 届湖南省常德市高三二模）黄豆酱富含丰富的小分子肽和氨基酸，味道鲜美。研究人员探究了
未添加鸡胸肉的纯黄豆酱(SP)和添加了40%鸡胸肉的黄豆酱(CSP)发酵过程中蛋白质含量、蛋白酶活力、氨
基酸态氮含量的变化规律，结果如下图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．该实验的自变量为是否添加鸡胸肉，因变量为蛋白质含量、蛋白酶活力和氨基酸态氮含量
B．图1 表明，发酵过程中，CSP 组的蛋白质含量均高于SP 组，且降解速率更快
C．由图2 推测，发酵前期微生物产生了大量的蛋白酶使氨基酸态氮含量迅速增加
D．综合图1 和图2 结果，说明添加鸡胸肉有利于提高黄豆酱的品质
【答案】A
【知识点】腐乳制作的原理
【分析】蚕豆瓣酱制作的原理：在多种微生物的协同作用下进行，其中起主要作用的是毛霉，毛霉等微生
物产生的蛋白酶可以将蚕豆中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可以将脂肪分解成甘油和脂肪
酸，淀粉酶将原料中的淀粉分解为葡萄糖。
【详解】A、从实验描述可知，自变量是是否添加鸡胸肉，还有图示横坐标所致的发酵时间，因变量为蛋
白质含量、蛋白酶活力和氨基酸态氮含量，A 错误；
B、图1 显示，在发酵前期，CSP 组的蛋白质含量均高于SP 组，且整个发酵时期内CSP 组的蛋白质含量下
降幅度要大，单位时间内下降更多，因而降解速率要快，B 正确；
C、图2 中发酵前期氨基酸态氮含量迅速增加，可推测是发酵前期微生物产生大量蛋白酶促进蛋白质降解
产生了更多氨基酸态氮，C 正确；
D、综合图1 和图2 结果，添加鸡胸肉在一些方面对黄豆酱的品质提升有帮助，如蛋白质降解等，说明添
加鸡胸肉有利于提高黄豆酱的品质，D 正确。
故选A。
5、（2025 届湖南省新高考教学教研联盟高三二模）发酵工程与农业、食品工业、医药工业及其他工业生
产有着密切的联系。与传统发酵技术相比，发酵工程的产品种类更加丰富，产量和质量明显提高。下列叙
述正确的是（ ）
A．通过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白
B．发酵工程与传统发酵技术最大的区别就是前者可以利用微生物来进行发酵
C．发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身
D．在发酵工程的发酵环节中，发酵条件变化会影响微生物的生长繁殖，但不会影响微生物的代谢途
径
【答案】C
【知识点】发酵工程的基本环节、发酵工程的应用
【分析】1、发酵工程生产的产品主要包括微生物的代谢产物、酶及菌体本身。产品不同，分离提纯的方
法一般不同：（1）如果产品是菌体，可采用过滤，沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；（2）如果产
品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取。
2、发酵过程中要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
【详解】A、以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液为原料，通过发酵获得了大量微生物菌体即为单
细胞蛋白，A 错误；
B、发酵工程与传统发酵技术都要利用微生物来进行发酵，B 错误；
C、发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身，C 正确；
D、在发酵工程的发酵环节中，发酵条件变化会影响微生物的生长繁殖，也会影响微生物的代谢途径，D
错误。
故选C。
植物细胞工程
1、（湖南省“一起考”2025 届高三二模）我国科学家利用植物体细胞杂交技术培育新品种耐钠盐植株的
过程（如图所示），序号代表过程或结构。下列分析正确的是（ ）
考点02
A．①过程用灭活病毒诱导原生质体甲和乙的融合
B．②过程表示脱分化，原理是植物细胞的全能性
C．③过程所用的培养基中添加了较高浓度的钠盐
D．获得的杂种植株一定能表现出双亲的优良性状
【答案】C
【知识点】植物组织培养技术综合、植物体细胞杂交技术
【分析】植物体细胞杂交，能克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出的新品种含有两种生物全部的遗传物质。
【详解】A、灭活病毒诱导细胞融合用于动物细胞融合，而甲、乙细胞属于植物细胞，故不可用灭活病毒
诱导原生质体甲和乙的融合，A 错误；
B、②过程表示脱分化，是指将高度分化的细胞经过诱导转变为未分化的状态，并未体现细胞的全能性，B
错误；
C、要筛选出耐钠盐植株，需要在含较高浓度的钠盐培养基中培养，C 正确；
D、基因的表达会相互影响，故杂种植株，不一定能同时表现出两个亲本的所有优良性状，D 错误。
故选C。
2、（2025·湖南邵阳·二模）下列相关实验叙述正确的是（ ）
A．搅拌不充分不影响
32P 标记的噬菌体侵染细菌实验中放射性物质的分布情况
B．制作酸奶时，牛奶需经过高压蒸汽灭菌后再接种乳酸菌
C．植物组织培养过程中，培养基中生长素与细胞分裂素比例较高时，有助于芽的分化
D．在探究植物细胞的失水和吸水实验中，用吸水纸引流，将清水替换成0.3g/mL 蔗糖溶液，可先后观
察到质壁分离和复原现象
【答案】A
【知识点】质壁分离及其复原实验、噬菌体侵染细菌的实验、无菌技术、植物组织培养技术综合
【分析】“观察植物细胞的质壁分离和复原”实验原理：原生质层（细胞膜、液泡膜、两层膜之间细胞
质）相当于半透膜，当外界溶液的浓度大于细胞液浓度时，细胞将失水，原生质层和细胞壁都会收缩，但
原生质层伸缩性比细胞壁大，所以原生质层就会与细胞壁分开，发生“质壁分离”。反之，当外界溶液的
浓度小于细胞液浓度时，细胞将吸水，原生质层会慢慢恢复原来状态，使细胞发生“质壁分离复原”。
【详解】A、在32P 标记的噬菌体侵染细菌实验中，32P 标记的是噬菌体的DNA，噬菌体侵染细菌时，
DNA 进入细菌内部，搅拌不充分不会影响放射性物质在细菌内的分布情况，A 正确；
B、制作酸奶时，牛奶不能经过高压蒸汽灭菌，因为高压蒸汽灭菌会杀死乳酸菌，应该采用巴氏消毒法对
牛奶进行消毒，然后再接种乳酸菌，B 错误；
C、植物组织培养过程中，培养基中生长素与细胞分裂素比例较高时，有助于根的分化，而不是芽的分化，
C 错误；
D、在探究植物细胞的失水和吸水实验中，用吸水纸引流，将清水替换成0.3g/mL 蔗糖溶液，可观察到质
壁分离现象，再将蔗糖溶液替换为清水才能观察到复原现象，D 错误。
故选A。
3、（2025·湖南永州·二模）花椰菜（2n=18）种植时容易遭受病菌侵害形成病斑，紫罗兰（2n=14）具有
一定的抗病性。科研人员利用植物体细胞杂交技术培育具有抗病性状的花椰菜新品种如图所示。下列有关
叙述错误的是（ ）
A．图中培育杂种植株时①过程使用了纤维素酶和果胶酶
B．杂种细胞培育成的愈伤组织的代谢类型是异养需氧型
C．培育出的抗病花椰菜是四倍体，将病菌悬浮液均匀喷施于叶片上可筛选抗病性强的杂种植株
D．上述过程中包含着有丝分裂，细胞分化和减数分裂等过程
【答案】D
【知识点】染色体数目的变异、植物组织培养技术综合、植物体细胞杂交技术、植物细胞工程的实际应用
【分析】据图分析，①是去除细胞壁，②是原生质体融合。
【详解】A、植物体细胞杂交技术将两个物种的细胞融合成杂种细胞后培养成完整植株，①过程是去掉细
胞壁的过程，使用了纤维素酶和果胶酶，A 正确；
B、杂种细胞脱分化形成的愈伤组织中，细胞没有分化，不能进行光合作用，其代谢类型是异养需氧型，B
正确；
C、培育出的抗病性状的花椰菜新品种同时含有花椰菜和紫罗兰的遗传物质，是四倍体植物，可通过将病
菌悬浮液均匀喷施于杂种植株叶片上，一段时间后,测定病斑面积占叶片总面积的百分比，来筛选出抗病性
强的杂种植株，C 正确；
D、上述过程中包含有丝分裂和细胞分化等过程，但没有形成生殖细胞，所以没有减数分裂过程，D 错误。
故选D。
动物细胞工程
考点03
1、（2025·湖南永州·二模）下列关于动物细胞工程和胚胎工程的说法正确的是（ ）
A．传代培养时，贴壁细胞会因接触抑制而停止分裂，需用胰蛋白酶处理，再经离心收集
B．动物细胞培养所需气体中的
的作用和医用氧气中添加的
的作用一致
C．体外受精时，采集的卵母细胞能与采集后获能的精子结合形成受精卵
D．胚胎移植的实质是早期胚胎在不同生理环境下空间位置的转移
【答案】A
【知识点】动物细胞培养技术、动物的体外受精、胚胎移植技术
【分析】1、动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋
白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重
新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养；
2、哺乳动物的体外受精技术主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。采集到的卵母细胞和
精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理，然后才能用于体外受精。一般情况下，可以将获能的精子
和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精。
【详解】A、贴壁生长的细胞进行传代培养时，需要用胰蛋白酶将其分离成若干游离的细胞再离心收集，
A 正确；
B、动物细胞培养所需气体中CO2 的作用是维持pH，医用氧气中添加CO2 的作用是刺激呼吸中枢，以增
加呼吸频率，B 错误；
C、体外受精时，采集的卵母细胞要培养到MⅡ期才能与获能的精子结合形成受精卵，C 错误；
D、胚胎移植将供体胚胎移植到受体内，实质上是早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移，D 错误。
故选A。
胚胎工程
1、（2025·湖南邵阳·二模）印度沙漠猫是一种珍稀猫科动物，通过胚胎工程技术，可以让家猫代孕而繁
育，主要步骤如下图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．A 处理常用的方法是注射外源促性腺激素
B．B 处理中使用的获能液常见的有效成分有肝素、Ca2+
考点04
C．步骤甲、乙分别是体外受精、胚胎分割
D．进行胚胎分割时，需将原肠胚的内细胞团均等分割
【答案】A
【知识点】动物的体外受精、胚胎移植技术、胚胎分割技术
【分析】分析题图：步骤甲为受精作用，步骤乙为胚胎移植，其中诱导超数排卵用的是促性腺激素，早期
胚胎培养的培养液成分，除了一些无机盐和有机盐类外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸以及血
清等。
【详解】A、诱导超数排卵常用的方法是注射外源促性腺激素，A 正确；
B、B 处理中使用的获能液常见的有效成分有肝素、Ca2+载体，而不是Ca2+，B 错误；
C、步骤甲、乙分别是体外受精、胚胎移植，C 错误；
D、进行胚胎分割时，需将囊胚的内细胞团均等分割，D 错误。
故选A。
2、（2025 届湖南省新高考教学教研联盟高三二模）基因印记是指受精卵形成过程中，来源于父亲或者来
源于母亲的等位基因被修饰后，该印记导致下一代仅仅表达父源或者母源等位基因。这种修饰常为DNA
甲基化修饰等，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。
(1)研究发现某种小鼠有体型正常（N）和体型矮小（n）两种类型，N 基因可根据亲代的不同而有不同的表
达，表现出“基因印记”现象，如图为相关实验。
①基因组印记中的DNA 甲基化修饰、组蛋白修饰等，使得基因表达和表型变化可遗传，这种现象属于
。
②由实验结果可知，F2个体不被表达的N 基因可能来自其亲本F1中的 。
F
③
2中体型正常的雌雄鼠自由交配，后代体型正常的概率为 。
(2)进一步研究发现，小鼠个体在生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印记将全部被消除，精子和卵子形
成时产生新的甲基化模式。此模式导致只有同时具有精子和卵细胞的细胞核的胚胎才能正常发育，具有两
套母本基因组或两套父本基因组的“受精卵”不能正常发育成小鼠。某研究团队通过改变小鼠生殖细胞的
“基因印记”使其“变性”，然后将一个极体注入修饰后的次级卵母细胞（类似受精作用），最终创造出
“孤雌生殖”的小鼠。实验过程如下图所示。
①图中囊胚进一步发育会出现 现象，否则胚胎无法继续发育；将极体注入修饰后的次级卵母细胞
并融合，类似受精作用，该操作能成功创造孤雌小鼠，依赖的原理是 。
②从打破基因印记对孤雌生殖的阻碍这个角度看，这些操作的目的是去除或改变阻碍孤雌生殖的基因印记，
模拟 过程中基因表达所需的甲基化状态。
③有人认为“孤雌小鼠”诞生过程没有精子参与，其核基因型与提供卵母细胞的雌鼠相同。请结合图中信
息，分析该观点错误的原因： 。
【答案】(1) 表观遗传 母本 3/4
(2) 透明带破裂/孵化 动物体细胞的细胞核具有全能性 受精 孤雌小鼠的核基因除了来
自卵母细胞，还来自注入的第二极体，核基因型与提供卵母细胞的雌鼠不完全相同
【知识点】基因分离定律的实质和应用、克隆、胚胎发育、表观遗传
【分析】表观遗传是指DNA 序列不发生变化，但基因的表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变
化而表现型却发生了改变，如DNA 的甲基化，甲基化的基因不能与RNA 聚合酶结合，故无法进行转录产
生mRNA，也就无法进行翻译，最终无法合成相应蛋白，从而抑制了基因的表达。
【详解】（1）①基因组印记中的DNA 甲基化修饰、组蛋白修饰等，使得基因表达和表型变化可遗传，这
种现象属于表观遗传。
②从实验情况可知亲代雄性NN 与雌性nn 杂交，子一代均为正常体型，所以从父本传递下来的N 基因不被
印记，即F2 个体不被表达的N 基因可能来自其亲本F1 中的母本。
③选取F2 中体型正常的雌雄鼠自由交配，则选取的基因型为1/2NN 和1/2Nn，产生雄配子比例为
N:n=3:1，雌配子比例为N：n=3：1，随机交配的结果见下表。
雌配
子雄配子
3/4N
1/4n
3/4N
9/16NN（体型正常）
3/16Nn（体型正常）
1/4n
3/16Nn（体型矮小）
1/16nn（体型矮小）
注：父本传递下来的基因不被印记，正常表达
所以表型正常的比例为9/16+3/16=3/4。
（2）①图中囊胚进一步发育，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，即出现孵化现象，否则胚胎无
法继续发育；将极体注入修饰后的次级卵母细胞并融合，类似受精作用，该操作能成功创造孤雌小鼠，其
依赖的生物学原理是动物体细胞的细胞核具有全能性。
②从打破基因印记对孤雌生殖的阻碍这个角度看，这些操作的目的是去除或改变阻碍孤雌生殖的基因印记，
其模拟的是受精作用过程中，基因表达所需的甲基化状态。
③据图可知，孤雌生殖的小鼠的核基因来自次级卵母细胞和第二极体，所以核基因型与提供卵母细胞的雌
鼠不完全相同。
基因工程
1、（2025·湖南永州·二模）下列有关生物学实验的叙述正确的是（ ）
A．DNA 的粗提取与鉴定实验，在常温下DNA 遇二苯胺试剂呈现蓝色
B．拜尔实验证明尖端产生的生长素在其下部分布不均匀造成胚芽鞘弯曲生长
C．
32P 标记的T2 噬菌体侵染
35S 标记的大肠杆菌后，子代噬菌体的蛋白质外壳均会被标记
D．电泳鉴定PCR 产物时，将电泳缓冲液加入电泳槽要没过凝胶1cm
【答案】C
【知识点】噬菌体侵染细菌的实验、生长素的发现过程、PCR 扩增的原理与过程、DNA 的粗提取及鉴定
的方法
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精溶
液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
（2）DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、在一定温度（沸水浴）条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色，A 错误；
B、拜尔实验证明尖端产生的影响在其下部分布不均匀造成胚芽鞘弯曲生长，当时未能确定这种影响是生
长素，B 错误；
C、32P 标记的T2 噬菌体侵染35S 标记的大肠杆菌后，以宿主细胞大肠杆菌的物质为原材料和从子代噬菌
体的蛋白质外壳，因此子代噬菌体的蛋白质外壳会被35S 标记，C 正确；
D、将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液需要没过凝胶1mm，D 错误。
故选C。
2、（2025 届湖南省新高考教学教研联盟高三二模）FSHD 是由于DUX4 基因突变产生对骨骼肌有毒的
DUX4 蛋白而导致的神经肌肉疾病，研究者尝试将如下表达载体导入患病组织，从而达到抑制DUX4 基因
表达的目的。下列说法正确的是（ ）
A．利用PCR 技术获取目的基因，需要DNA 聚合酶和DNA 连接酶
B．利用图中质粒和DUX4 基因构建表达载体时，应选择的限制酶为BamHⅠ和HindⅢ
C．可采用农杆菌转化法将基因表达载体导入患病组织
D．获取受体细胞的mRNA 经逆转录获得DNA 后，利用DUX4 基因序列制备的引物进行PCR 可检测
考点05
表达载体是否构建成功
【答案】B
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、利用PCR 技术获取目的基因，需要DNA 聚合酶，不需要DNA 连接酶，A 错误；
B、DUX4 的反义基因与DUX4 基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同，因此DUX4 的反义基因的模
板链为DUX4 基因的编码链，子链延伸的方向是5'→3'，因此DUX4 基因右侧连接启动子，左侧连接终止
子，构建DUX4 反义基因表达载体，选用的限制酶为HindⅢ和BamHⅠ，B 正确；
C、当受体细胞为动物时应选用显微注射法，C 错误；
D、由于DUX4 的反义基因与DUX4 基因的碱基序列相同，两者转录的模板不同，但形成的mRNA 序列互
补，经逆转录获得的双链DNA 相同，因此不能检测表达载体是否构建成功，D 错误。
故选B。
3、（湖南省“一起考”2025 届高三二模）重叠延伸PCR 技术是采用具有互补末端的引物，使PCR 产物
形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，
可通过定点诱变在体外改造DNA 分子（图中黑色正方形代表替换的碱基），并将改造后的目的基因导入
质粒构建目的基因表达载体。回答下列问题：
(1)上图所示的重叠延伸PCR 技术中，PCR1 的引物是 。PCR4 可获得大量定点诱变目的基因，此时的
引物为 。PCR3 时模板DNA 不能选择DNA 分子③的原因是 。
(2)为使重叠延伸PCR 技术改造后的目的基因（该基因序列不含图中限制酶的识别序列）能与载体正确连
接，PCR4 时，最好分别在基因转录的非模板链和模板链的 （填“5'”或“3'”）端和 （填“5'”或
“3'”）端的引物上添加限制酶 和 酶切位点。
(3)将目的基因，质粒及大肠杆菌混合，温育一段时间后涂在含四环素的平板上培养，一段时间后平板上长
出菌落。这些菌落的菌体内不一定含有目的基因，理由是 。
【答案】(1) 引物A、引物C 引物C、引物D 子链的延伸方向只能从5'端→3'端，以DNA 分
子③作模板时子链不能延伸
(2) 3' 5' EcoRI KpnⅠ
(3)含有空白质粒的大肠杆菌也能在该培养基上生长
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、DNA 重组技术的基本工具、目的基因的检测与鉴定
【分析】PCR 原理：在DNA 复制中，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以四种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物的作用下，DNA 聚合酶从引物3’端开始延伸DNA 链。
【详解】（1）由于DNA 合成的方向是从子链的5'端到3'端，根据PCR1 的产物，可知引物是引物A、引
物C，根据PCR2 的产物，PCR2 的引物为引物B、引物D，将DNA 分子②④混合后退火可得到③⑤，
PCR3 获得DNA⑥，DNA⑥分子的3'端与引物D 互补配对，5'端与引物C 互补配对，所以PCR4 的引物为
引物C、引物D；PCR3 为了获得重叠链，模板DNA 不能选择DNA 分子③的原因是子链的延伸方向只能
从5'端→3'端，以DNA 分子③作模板时子链不能延伸。
（2）为使重叠延伸PCR 技术改造后的目的基因能与载体正确连接，PCR4 时，应在基因上、下游引物的
5'端分别添加限制酶，均对应DNA 两条链的3'端。目的基因应插在启动子和终止子之间，由于PstⅠ靠近终
止子，所以应在引物的5'端分别添加限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ，分别对应非模板链和模板链的3'端。
（3）目的基因、质粒及大肠杆菌混合，可能有一些质粒与目的基因成功连接，可能也有些质粒没有与目
的基因连接，即空质粒，这些质粒若成功导入大肠杆菌，由于质粒上有四环素抗性基因，所以都能在含四
环素的平板上长出菌落，所以这些菌落不一定含有目的基因。
4、（2025 届湖南省常德市高三二模）金黄色葡萄球菌(Sa)可引起败血症、细菌性肺炎等疾病。不规范使
用抗生素易出现多重抗药性Sa，推测Sa 产生头孢霉素抗性与其质粒上的R 基因有关。为验证该推测，以
下图中R 基因的上、下游片段和质粒1 构建质粒2，然后通过同源重组(质粒2 中的上、下游片段分别与Sa
基因组中R 基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除Sa 的R 基因。回答下列问题：
注1：1kb=1000 碱基对；
2：Y 是可被脱水四环素(不作为抗生素起作用)诱导表达的Sa 致死基因。
(1)利用PCR 技术扩增出较多的R 基因及其上下游序列，应在引物的 (填“3'端”或“5'端”)添
加相应的限制酶识别序列。若要扩增出较多DNA 单链序列，在添加引物时需做怎样的处理？ 。
(2)质粒2 的构建过程中需选择 (填限制酶)对PCR 扩增产物进行酶切。
(3)用质粒2 转化临床分离获得具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感且含质粒2 的Sa，涂布在含有氯霉素的平
板上，经培养获得含质粒2 的Sa 单菌落，再经多次传代增加同源重组敲除R 基因的概率，随后稀释涂布在
含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2 的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接
种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基因可能被敲除。
(4)以上述获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，电泳检测结果如图，表明R 基因
已被敲除的是 。
【答案】(1) 5'端 一种引物的比例显著多于另一种引物
(2)SacⅡ和EcoRⅠ
(3) 脱水四环素 头孢霉素
(4)D
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定
【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、
启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不
一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物
细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因
的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子
杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗
原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）在PCR 技术中，DNA 聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA 链，所以应在引物的5'端添
加相应的限制酶识别序列，这样在后续对PCR 产物进行酶切时，就可以将带有目的基因（R 基因及其上下
游序列）的片段切下来用于构建质粒等操作；若要扩增出较多DNA 单链序列，可在添加引物时，需要扩
大两种引物的相对比例，一种引物是另一种引物的50 至100 倍，这样就能在较少的双链DNA 分子的基础
上扩增出较多的单链DNA；
（2）由图可知，质粒2 上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1 上只有SacⅡ酶切位点，
R 基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ，EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1 和4 进
行PCR 扩增可得到整个R 基因，以及上下游片段（或采用引物1 和3 以及引物2 和4 分别进行PCR 扩增），
用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR 产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII 酶切质粒1 所得大片段连接，
获得质粒2；
（3）因为Y 是可被脱水四环素诱导表达的Sa 致死基因，用质粒2 转化临床分离获得的Sa 后，要筛选并获
得不再含有质粒2 的菌落，就需要将菌液稀释涂布在含有脱水四环素的平板上，含有质粒2 的菌体会因为
脱水四环素诱导Y 基因表达而死亡，从而筛选出不含质粒2 的菌落；为了验证R 基因是否被敲除，由于推
测Sa 产生头孢霉素抗性与其质粒上的R 基因有关，所以从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含
头孢霉素的平板上，若无法增殖，说明其可能失去了R 基因，从而失去了头孢霉素抗性；
（4）从电泳检测结果来看，D 组引物组合扩增出的条带大小(1.9kb)与预期的R 基因(0.7+2.2+1.2=3.1kb)大
小明显不一致，说明R 基因(2.2kb)已被敲除。
5、（2025·湖南邵阳·二模）在农作物的初级生产力中，有90%-95%来自于光合作用的有机物生产，但C3
植物的实际光能转化效率仅为1%，C4植物可以达到2%左右，同时对水的利用效率也比C3植物高。
Rubisco 酶在C3和C4植物中均存在，能催化C5与CO2反应形成C3；当CO2浓度较低时，Rubisco 酶也能催
化C5与O2反应形成C2等化合物(此过程称为光呼吸)。因此，将C3植物改造成C4植物(C4工程)，有望解决
当今粮食短缺的问题；下图是C4途径的示意图，据图回答以下问题；
(1)和C3植物相比，C4植物在叶片器官和细胞结构上有诸多不同：C4植物的维管束鞘细胞外侧紧密连着一
圈叶肉细胞，组成花环(Kranz)结构，多数C4植物的光合作用是通过两种细胞共同实现，这两种细胞间分布
有较多的胞间连丝，有利于细胞间的 。在进行光合作用时，C4植物固定CO2的具体场所有
。
(2)除Rubisco 酶外，C4植物还具有由 酶催化的CO2固定过程，该酶对CO2的亲和力比Rubisco
酶更高，可进行CO2浓缩，减少光呼吸对有机物的消耗。
(3)在低浓度CO2条件下，可诱导黑藻中该酶基因的表达，将黑藻由C3型转变为C4型，从分子水平验证该
结论，可采用的技术有 。诱导成功后黑藻不依赖“花环”(Kranz)结构，仅在叶肉细胞中进行
C4途径，为C4工程提供了新的研究方向，因为 。
(4)C4途径的出现是对C3途径重要补充而非代替，从进化角度分析C4植物出现的原因，可能是___________。
A．作为低CO2情况下植物采取的一种光合策略
B．适应盐渍化、高温以及干旱环境
C．减弱Rubisco 酶催化的光呼吸，提高光合速率
D．工业革命以来，全球CO2升高，会抑制C3植物进化为C4植物
【答案】(1) 物质交换、信息交流 叶肉细胞细胞质基质、维管束鞘细胞的叶绿体基质
(2)PEP 羧化
(3) PCR 技术（DNA 分子杂交技术或抗体—抗原杂交技术） 有望在细胞结构（酶）而非器官结
构（叶片的Krans 结构）层面，将C3 植物改造为C4 植物
(4)ABC
【知识点】光反应、暗（碳）反应的物质变化和能量变化、影响光合作用的因素、基因工程在农牧业、制
药及环境等方面的应用、光合作用的实质和意义
【分析】光呼吸是所有进行光合作用的细胞在光照和高氧低二氧化碳情况下发生的一个生化过程。它是光
合作用一个损耗能量的副反应。绿色植物在照光条件下的呼吸作用。特点是呼吸基质在被分解转化过程中
虽也放出CO2，但不能转换成能量ATP，而使光合产物被白白地耗费掉。在黑暗条件下，呼吸过程能不断
转换形成ATP，并把自由能释放出来，以供根系的吸收功能、有机物质的合成与运转功能以及各种物质代
谢反应等等功能的需要，从而促进生命活动的顺利进行。
【详解】（1）C4 植物的叶肉细胞和维管束鞘细胞间通过胞间连丝频繁进行物质交换（如C4 化合物的转
移），确保CO2 高效传递至维管束鞘细胞参与卡尔文循环，此外，植物细胞还能通过胞间连丝进行信息交
流。根据图示信息可知，C4 植物固定CO2 的场所分两步； 在叶肉细胞的细胞质基质中，PEP 羧化酶
催化CO2 与PEP 生成C4 酸；在维管束鞘细胞的叶绿体基质中，C4 酸分解释放CO2 供Rubisco 酶用于卡尔
文循环。
（2）C4 植物特有的PEP 羧化酶（PEPC）对CO2 的亲和力远高于Rubisco 酶，可在低CO2 条件下高效催
化的CO2 固定过程，形成C4 化合物以浓缩CO2，减少光呼吸消耗。
（3）从分子水平验证黑藻C4 途径相关基因（如PEPC 基因）的表达，可通过： PCR 技术检测mRNA 水
平，或者抗体—抗原杂交技术检测PEPC 蛋白的表达量。黑藻的C4 途径仅在叶肉细胞完成，突破了传统
C4 植物依赖叶肉-维管束鞘细胞分工的限制，有望在细胞结构（酶）而非器官结构（叶片的Krans 结构）
层面，将C3 植物改造为C4 植物。
（4）A、根据题意信息可知，C4 植物特有的PEP 羧化酶可在低CO2 条件下高效催化的CO2 固定过程，所
以C4 途径是植物对低CO2 等恶劣环境的适应策略，A 正确；
B、C4 植物的进化与干旱、高温等环境压力直接相关，其光合机制是对这些胁迫的适应性进化结果，B 正
确；
C、C4 途径是通过CO2 浓缩机制减少光呼吸，提高水分利用效率和光合速率，C 正确；
D、工业革命后CO2 升高可能会抑制C4 植物的竞争优势，并不能得出会抑制C3 植物进化为C4 植物，D
错误。
故选ABC。
6、（2025·湖南邵阳·二模）传统的乙醇发酵利用高粱、甘蔗等粮食进行生产，对粮食消耗巨大。高粱等
植物的秸秆中含有丰富的半纤维素(主要水解产物是木糖)。木糖在XYR 酶、XDH 酶的催化下转化成为木
酮糖，木酮糖在XK 酶作用下进一步代谢成为乙醇。酿酒酵母是乙醇发酵的重要菌种，但因其缺乏XYR 基
因和XDH 基因而无法直接利用木糖。研究人员通过基因工程将XYR 基因和XDH 基因导入野生型的酿酒
酵母中，在酵母细胞内建立了完整的木糖代谢的通路。
注：增强子是一种可促进基因转录的一小段特殊DNA 序列；LEU2 基因是亮氨酸合成基因，URA3 基因是
尿嘧啶合成基因。
(1)酿酒酵母菌种的性能是决定产品质量的重要因素，性状优良的酵母菌菌种可以从自然界中筛选，也可以
通过 或 获得；经主发酵阶段产生的啤酒要在低温、密闭的环境下储存一段时间经
过 阶段才适合饮用，在实验室培养酿酒酵母时，培养皿等玻璃器皿用 灭菌。
(2)为提高乙醇的产量，研究人员采用PCR 融合技术，将增强子序列拼接到XK 基因上游，需要在引物2、
3 的 (填“3'”或“5'”)端引入与另一个基因相应末端互补的序列，形成重叠区域。虚线框中的过
程不需要加入引物，原因是 。
(3)载体质粒中LEU2 基因和URA3 基因可作为 筛选目的菌。由此研究人员将重组质粒a 和b 导
入到 酿酒酵母中，并在 培养基上进行培养，以获得工程菌a．
(4)在同等适宜条件下分别将工程菌a 和工程菌b 进行发酵实验，发现工程菌a 的乙醇产量是工程菌b 的1.5
倍，试分析工程菌a 提高了乙醇产量的原因 。
【答案】(1) 诱变育种 基因工程育种 后发酵 干热
(2) 5' 在TaqDNA 聚合酶催化下可分别以这两条链为引物进行延伸
(3) 标记基因 亮氨酸和尿嘧啶缺陷型 以木糖为唯一碳源、缺少亮氨酸和尿嘧啶
(4)工程菌a 与工程菌b 相比，导入了增强子与XK 重组基因，使细胞超表达XK 酶，提高了木酮糖转变为
乙醇的效率
【知识点】果酒和果醋的制作原理、PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定；
2、PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为原
料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的
5'端向3'端延伸的。
【详解】（1）性状优良的酵母菌菌种可以通过诱变育种（人工诱变使酵母菌发生基因突变，从而筛选出
优良性状的菌种）或基因工程育种（按照人们的意愿，将特定基因导入酵母菌中，获得具有优良性状的菌
种）获得。经主发酵阶段产生的啤酒要在低温、密闭的环境下储存一段时间经过后发酵阶段才适合饮用。
后发酵阶段可以使啤酒的风味更加成熟，品质更加稳定；在实验室培养酿酒酵母时，培养皿等玻璃器皿用
干热灭菌法灭菌。干热灭菌法适用于耐高温且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等；
（2）在PCR 技术中，DNA 聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA 链，所以要将增强子序列拼接到XK
基因上游，需要在引物2、3 的5'端引入与另一个基因相应末端互补的序列，形成重叠区域；虚线框中的过
程是以PCR 产物为模板进行的DNA 合成，因为在TaqDNA 聚合酶催化下可分别以这两条链为引物进行延
伸，所以不需要加入引物；
（3）载体质粒中LEU2 基因和URA3 基因可作为标记基因筛选目的菌。标记基因的作用是便于将含有目的
基因的受体细胞筛选出来；研究人员将重组质粒a 和b 导入到亮氨酸和尿嘧啶缺陷型酿酒酵母中。因为重
组质粒a 和b 中分别含有LEU2 基因和URA3 基因，导入后可以使缺陷型酵母能够合成亮氨酸和尿嘧啶，
从而在特定培养基上生长；在以木糖为唯一碳源、缺少亮氨酸和尿嘧啶的培养基上进行培养，只有导入了
重组质粒的酵母细胞（工程菌a）才能生长，从而获得工程菌a；
（4）工程菌a 同时导入了增强子与XK 重组基因，增强子可促进XK 基因的转录，使XK 酶的合成量增加，
提高了木酮糖转变为乙醇的效率，从而提高了乙醇产量；而工程菌b 没有增强子序列，XK 基因转录水平
相对较低，XK 酶量少，乙醇产量相对较低。
7、（2025·湖南永州·二模）第三代杂交水稻育种技术是以基因工程雄性不育系为遗传工具，将任意雄性
可育水稻品种转化为雄性不育水稻，从而实现任意两个品种水稻的杂交。获取任意雄性不育水稻的技术路
线如下：①提取并测序所有水稻品种都有的显性雄性可育基因A；②比较可育基因A 与某隐性天然雄性不
育基因a 的碱基序列，找到其不同点并设为拟突变位点；③利用PCR 定点突变技术将雄性可育基因A 突变
为雄性不育基因a（过程如图1）；④将雄性不育基因a 导入水稻细胞并培育出水稻植株（过程如图2）；
⑤利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统敲除转基因水稻原有的雄性可育基因A。请回答下列问题：
(1)图1 中引物2 与引物3 （填“相同”或“互补”），合成的DNA 分子经混合、变性、杂交后选取
通过引物2 和引物3 延伸形成的两条链杂交在一起的片段，在后续的PCR 过程中，这两条链互为 。
可育基因A 与不育基因a 之间的差异可能不止一处，若它们之间的差异有三处，则共计需要设计 种
引物。最后利用引物 进行PCR 扩增得到大量含有突变位点的DNA 片段。
(2)图2 中选用的质粒有两个标记基因，分别是抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因，其好处是： 。
在构建重组质粒时最好选用限制酶 切割目的基因，用这样的限制酶切割目的基因和质粒的优点是
。
【答案】(1) 互补 模板和引物 8 1、4
(2) 可通过检测农杆菌是否抗氨苄青霉素来检测质粒是否导入，可通过检测农杆菌是否抗四环素来检
测目的基因是否导入 HindⅢ和Sal I 可以防止目的基因自连和质粒自连；防止目的基因与质粒反
向连接
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定
【分析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。原理：DNA 复
制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。过程：①高温变性：DNA 解旋过程；
②低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋
酶，高温条件下氢键可自动解开。
【详解】（1）图1 中引物2 与引物3 是分别与DNA 两条互补的模板链中拟突变点处的一段碱基序列互补
(突起处代表与模板链不能互补的突变位点)。故引物2 与引物3 是互补关系。分别经过引物1、2 和引物
3、4 合成的 DNA 分子经混合。变性、杂交后选取通过引物2 和引物3 延伸形成的两条链杂交在一起的片
段，在后续的PCR 过程中，这两条链既作为PCR 的模板，又作为PCR 的引物。可育基因A 与不育基因a
之间的差异若有三处，设计引物时入基因的两端要各设计一种引物，每处差异处要设计两种互补的引物，
设计引物总数有8 种。最后利用引物1 和4 进行PCR 扩增得到大量含有突变位点的DNA 片段。
（2）据图2，可用限制酶HindⅢ和Sal Ⅰ同时切割目的基因和质粒(双酶切)，可以防止目的基因自连和质
粒自连，也可防止目的基因与质粒反向连接。若目的基因和质粒正确连接了，则重组质粒中含抗氨苄青霉
素基因，不含抗四环素基因，可通过分别检测农杆菌是否抗氨苄青霉素来检测质粒是否导入，是否抗四环
素来检测目的基因是否导入。
