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核心考点 DAY 08
姓名： 日期： 班级：
《基因工程》-1 专题
1.DNA 的粗提取和鉴定
(1)提取DNA 的原理：利用DNA 与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA,去
除
其他成分。
如：①DNA 在酒精溶液中的溶解性：DNA 不溶于 酒精 ，但某些蛋白质溶于酒精。
②DNA 在NaCI 溶液中的溶解性：DNA 在不同浓度的NaCI 溶液中的溶解度不同，它能溶于 2mol/L
的NaCl 溶液。
(2)鉴定DNA 的原理：在一定温度下( 沸水浴 加热)，DNA 遇二苯胺试剂会呈现 蓝色 。
（2025·江苏·节选）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开
展了以下研究。请回答下列问题：
研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA 提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下
表：
实验目的
简要操作步骤
释放DNA
在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA
离心后取① 上清液
，加入乙醇
② 溶解
DNA
在沉淀物中加入纯水
扩增DNA
将③ 4 种脱氧核苷酸、耐高温的
DNA
聚合酶
、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加
入PCR 管中，进行PCR
2.DNA 的电泳鉴定
（1）原理
电泳原理
DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电
场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 相反 的电极移动，这个过程就是电
泳。PCR 的产物一般通过 琼脂糖凝胶 电泳来鉴定
迁移速率
在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的 浓度 、DNA 分子的 大小 和 构象 等有关
DNA 检测
凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为300nm 的 紫外灯 灯下被检测出来
（2）步骤
注入
将扩增得到的PCR 产物与 凝胶载样缓冲液 (内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合
液缓慢注入凝胶(凝胶中含 核酸染料 )的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的
标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm,待 指示剂
前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
（3）知识延伸
DNA 标准
参照物
一种用于确定目的DNA 片段大小的标准参照物，具有特定的DNA 分子大小，一般置于第
一个点样孔中，标识样品的DNA 大小
核酸染料
和指示剂
指示剂
是一种有颜色的标记物，相当于一个较小的DNA 分子，但 （与/不与）
DNA 结合，指示剂在电泳时移动较快且 （能/不能）被肉眼观察到，用于
指示样品的迁移过程，常用指示剂包括溴酚蓝(蓝紫色)和二甲苯青(蓝色)。
核酸染料
核酸染料是一类 （能/不能）够与DNA 或RNA 分子结合，并在特定条
件下显示颜色或荧光的化学物质，用于电泳后检测核酸的 位置 。
（2024·黑吉辽）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA 分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分
离的DNA 片段大小来选择的。对于较大的DNA 片段，比如基因组DNA 或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝
胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA 片段，比如PCR 产物或酶切片段，则需要选择较高浓
度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A 正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3 处
时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B 错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA 片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA 片段的
迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段越长，迁移速率越慢，C 错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA 分子需染色后，才可在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来，D 错误。
故选A。
3.基因工程的定义：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生
物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA 分子水
平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA 技术。
（1）原理: 基因重组 。
（2）操作对象: 基因 。
（3）操作水平: DNA
分子
水平。
（4）操作环境: 生物 （体内/体外）进行。
（5）结果： 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
。
（6）优点：① 定向改造生物的性状（目的性强）
。（与诱变育种相比）
② 克服远缘杂交不亲和的障碍
等。（与杂交育种相比）
（7）不同生物的DNA 能够链接成功的原因是 DNA
都是由脱氧核苷酸组成和规则的双螺旋结构，并且遵
循碱基互补配对原则 。
4.基因工程的工具酶
（1）功能
原理
能够识别 双链
DNA
分子的 特定核苷酸 序列,并使每一条链中特定部位的 磷酸二酯键 断
开。
特点
限制酶的 识别 和 切割 具有特异性（限制性，专一性），使用不同的限制酶可以切割不同
的核苷酸序列。
类型
黏性末端（如：EcoR I）
平末端(如：Sma I)
在中轴线（图中虚线）的两侧，限制酶在切断
DNA 时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，
碱基正好互补配对，因此称这些片段为 黏性末
端
。
不产生单链的黏性末端。
应用
①限制酶一般用于切断DNA 片段，获取 目的基因 ，为目的基因连接表达载体做准备。
②由于黏性末端具有特异性，可以保证DNA 连接时具有特异性，因此在实验设计中，通常选择
切割后形成 黏性 末端的酶，而避免使用切割后形成 平 末端的酶。
思考
①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
答：原核生物中限制酶的作用是切割 （内源/外源）DNA 以保证自身安全，防止外来
病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA 分子？
答：限制酶不切割自身DNA 的原因是原核生物DNA 分子中 不存在该酶的识别序列 或 识别
序列被修饰 。
（2）特殊限制酶
同裂酶
异裂酶
同尾酶
识别 相同 序列，切割
相同 位点，产生相同
的黏性末端（但反应条
件可能不同）
识别 相同 序列，但切割
不同 位点。
识别 不同 序列，产生 相同 的黏性末端。
Sph I
Bbu I
Sma I
Xma I
异端同尾酶
异长同尾酶
Bam I
Bgl II
Sau 3A I
【教材深挖】
选择性必修
3P
74 ，拓展应用，
1
1.有2 个不同来源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶SpeI 进行切割，B 片段分别用限制酶Hind Ⅲ、
XbaI、EcoR V 和Xho I 进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1) 哪种限制酶切割B 片段产生的DNA
片段能与限制酶SpeI 切割A 片段产生
的
DNA 片段相连接?为什么?
Xho
I
Xho
I 和
Spe
I 切割
DNA
产生相同的黏性末
端
(2) 不同的限制酶切割可能产生相同的
黏性末端，这在基因工程操作中有什
么意义?
答：同尾酶使构建载体时，切割位点的
选
择范围 （缩小
/ 扩大
）。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载
体，如果目的基因的核苷酸
序列中恰好没有该限制酶的识别序列，这时可以考虑用合适的
同尾
酶（目的基因的核苷酸序列中
不能有该酶的识别序列）来获取目的基因。
例1.某线性DNA 分子含有3000 个碱基对(bp)，先用限制酶a 切割，再把得到的产物用限制酶b 切
割，得到的DNA 片段大小如表所示。限制酶a 和b 的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正
确的是( )
A.在该DNA 分子中，a 酶与b 酶的识别序列分别有3 个和2 个
B.a 酶与b 酶切出的黏性末端不能相互连接
C.a 酶与b 酶切断的化学键不相同
D.用这两种酶和DNA 连接酶对该DNA 分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， 序
列会明显增多
【解析】 A.在该线性DNA 分子中，a 酶与b 酶的识别序列分别有2 个和2 个，D.由图可知，经a 酶
和b 酶切割出的DNA 片段，具有相同的黏性末端，可形成重组DNA 分子，重组后的DNA 分子没有这两
种酶的识别序列，所以两种限制酶都不能识别重组DNA 分子，不能将其切割成片段，D 正确。
(2)DNA 连接酶（连接两个DNA 片段）
E.coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶都能连接
（黏性末端/平末端/黏性末端和平末端）。但E.coli DNA 连接酶连接双链DNA 片段的
平末端效率远比T4 DNA 连接酶的效率 （低/高）。
例3.说出下列过程参与的酶（写在箭头下面）
例4.下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的（ D ）
① ② ③ ④
A.1 种 B.2 种 C.3 种 D.4 种
图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？ ①③ 、 ②④ 。
方法：将某一个黏性末端旋转 180
度。
提升：理解重组质粒和反义质粒
（3）运载体：
①基因在细胞中的稳定复制需要有 复制原点 ，基因的表达则需要 启动子 和 终止子 ，在研究中一
般通过各种载体，提供不同的结构，从而促进基因的复制和表达，其中最常用的是 质粒 ，其他运载
体有 噬菌体、动植物病毒 （病毒具有特异性）
②质粒
定义
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞 拟核 DNA 之外，并
具有自我复制能力的环状 （单链/双链）DNA 分子
原理
将目的基因插人质粒中，并导入 受体
细胞，可以在受体细胞内稳定 遗传
和 表达
来源
来自细菌或酵母菌，天然质粒 （需要/不需要）人工改造
种类
根据功能可以将质粒分为克隆载体和表达载体两种常用载体 。此外，有些载体还能起
到基因编辑、 基因敲除的功能，这里我们学习最常用的表达载体。
标记基
因的
类型
标记基因是质粒上目的基因之外的另外一个基因，可以控制一些易于筛选和检测的性状，
便于重组DNA 分子的筛选。基因工程中常用的标记基因有四种，分别是抗生素抗性基因、荧
光基因、营养物质合成基因、LacZ 基因。
抗性
基因
将抗生素抗性基因的载体导人 （敏感型/抗性型）的宿主细胞中，并在培养基中
添加抗生素或除草剂，抗性基因在受体细胞内表达，表达产物使受体细胞对该抗生素产生抗
性可以淘汰转化失败的细胞，筛选出转化成功的细胞。在题目中最常出现的抗性基因有氨苄
青霉素抗性基因(AmpR)、 四环素抗性基因(TetR)及卡那霉素抗性基因(KanR)等
影印法：例5.某一质粒载体如图所示，外源DNA 插入到Ampr 或Tetr 中会导致相应的基因失活
（Ampr 衣示氨苄青霉素抗性基因，Tetr 表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH l
酶切后，与用BamH I 酶切获得的目的基因混合，加入DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混
合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三
种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆
菌。
(1）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，
在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅
含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是
二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养
基上均不能生长
(2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，
在上述四种大肠杆菌细胞中，含有质粒载体和
含有插入了目的基因的重组质粒
的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含氨苄青霉素抗
性基因，在该培养基上均能生长
。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使
用含 四环素
培养基。图中 1 、
2 、
3 、
6 、
9 （菌落号数）就是插入了目的基因的重组质粒的
大肠杆菌。
荧光 基
因
荧光基因可以表达出荧光蛋白，荧光蛋白可被激
发出荧光，从而被观察到。将荧光基因作为标记基因
转入各类细胞中，都可以通过荧光检测转入是否成
功。
未被转化的大肠杆菌；
结构
功能
复制原点
复制起始位点，使目的基因稳定遗传
启动子和终止子促进目的基因的表达
标记基因
将含有目的基因的重组质粒筛选出来
多个酶切位点
方便对基因进行插入或其他操作
例6. （2021 年6 月浙江选考试题）采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白
（EGFP）基因定点插入到受精卵的Y 染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型
雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ B ）
A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B．基因编辑处理的受精卵在体外培养至2 细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可
获得表达EGFP 的小鼠
C．分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP 的即为雄性小鼠胚胎
【解析】：在桑椹胚或囊胚进行胚胎移植。
例7.（2023 年6 月浙江选考试题,T19）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）
基因整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合
子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生
小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。下列叙
述正确的是（ ）
A.Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B.翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C.2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D.若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合
【解析】 分析题图甲可知，启动子在左侧，GFP 基因整合在Gata3 基因的右侧，启动子启
动转录后，可以使GFP 基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；因
启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA 从左向右为├ 5′→3′┤ ，刚好是翻译的
方向，
所以翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；整合GFP 基因后，核酸片段变
长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3−GFP 基因纯合子，4 号个体只有小片段，是野生
型，C 错误；用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，杂合子和Gata3−GFP 基因纯合子均能扩增出
条带，仅有Gata3 基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D 错误。
营养物
质合成
基因
用营养缺陷型的微生物作为转基因的
宿主（受体细胞） 时，可以使用营养物质合成基因作为标记基因，例如，与野生型相比，亮
氨酸合成缺陷型酵母菌在 (含/不含）亮氨酸的培养基中不能生存，将亮氨酸合成基因
作为标记基因导入亮氨酸合成缺陷型酵母菌，在不含亮氨酸的培养基上转入成功的酵母菌可以
形成菌落，转入失败的酵母菌不能生存。
没有找到病毒作为运载体的题目，以缺陷型细菌的筛选为例了解一下营养合成缺陷基因。
例7. 菌种M 和茵种N 在发酵工程应用上具有不同的优越性，为了获得具有它们共同优良性状
的融合菌，进行了下图所示的实验。已知菌种M 为组氨酸依赖(组氨酸合成相关基因突变为
B-),菌种N 为色氨酸依赖(色氨酸合成相关基因突变为A-),下列分析错误的是( )
A.菌种M 和N 可通过人工诱变和选择性培养选获得
B.用PEG 诱导融合之前需要去除菌种M 和N 的细胞壁
C.在培养基X 中添加组氨酸和色氨酸以筛选出杂种融合菌
D.从培养基X 中分离出的杂种融合菌P 对两种氨基酸均不依赖
【解析】：融合的细胞A+A-B+B-可以在缺少色氨酸和组氨酸的培养基上生长
LacZ 基
因（显
色
法），
常用蓝
白斑筛
选法
LacZ 基
因（显
色
法），
常用蓝
白斑筛
选法
图示中,菌落1、2、5、6 呈蓝
色，是导入 质粒 的受体菌。
【教材深挖】选择性必修
3P
98，复习与提高，
1
例8.1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基
因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保
存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ
基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如
下图所示。回答问题：
【我们假设：在②步中使用单酶切】
（1）在②步中，应怎样选择限制酶？
答：第一，应选择用 （
相同
/ 不同）的限制酶
或切割能产生 （
相同
/ 不同）末端的限制酶切
割质粒和含有目的基因的
DNA
片段；
第二，注意限制酶的切割位点 （能
/ 不
能
）位于目的基因的内部，以防破坏目的基因
, 限制
酶也不能破坏质粒的
启动子
、 终止子 、 标记基
因 、复制原点等结构。
（2）在第③步中，为了使质粒DNA 与目的基因能
连接，还需要在混合物中加入哪种物质?
DNA
连接酶
（3）选用含有AmpR 和LacZ 基因的质粒进行实验
有哪些优势?
答：该质粒便于进行
双重
筛选。标记基因
AmpR
基
因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有
导入了
质粒
的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培
养基上生长。而由于
LacZ
基因的效应，这些生长的
菌落可能出现两种颜色：含有空质粒
( 没有连接目的
基因的质粒
) 的大肠杆菌菌落呈
蓝
色；含有重组质
粒的大肠杆菌菌落呈
白
色
。
（4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什!么颜色?为什么?
答：有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因插入
目的基因
了
LacZ
基因的结构，
使其不能正常表达成
β-
半乳糖苷酶，底物
X-gal
也就不会被分解。
附：我们可以看到单酶切会产生目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒的反向连
接，为克服该缺点，保证目的基因和质粒的正确（正向）连接，采取的方法是 用两种不同的
限制酶（产生不同的末端）同时切割含目的基因的
DNA
片段和质粒
。
③病毒载体：动物细胞不含质粒，如果要向动物细胞导人外源基因，通常需要用到DNA 病毒或RNA 病
毒。病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，因此它是功能强大的基因转移载
体。如腺病毒载体、慢病毒载体等，但目前对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟。除质粒外，噬菌
体载体也是常用工具之一。
图示中,菌落1、2、5、6 呈
黑色，是 未转化 的受体
菌。
图示中,菌落3 呈蓝色，是
导入 λ
DNA
载体
的受体
菌。
慢病毒是一种RNA 逆转录病毒，可以将目的基因导入宿主细胞基因组DNA 上，从而实现稳定的遗
传
腺病毒是一种DNA 病毒。它通过内吞进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色
体外， 不整合进入宿主细胞基因组中。可以利用其DNA 进行转基因、基因编辑、基因沉默等操
作
λ 噬菌体是一种温和噬菌体，可以将基因整合到宿主细胞基因组DNA 上，经过改造的 λ 噬 菌 体
可 以 不 裂解宿主细胞，从而作为基因载体
没有找到病毒作为运载体的题目，以噬菌体的筛选为例了解一下双层平板法。
例8.双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。
具体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量是2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量是1%
的培养基熔化并冷却至45-48℃,然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立
即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而
使宿主细胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。通常一个噬菌斑来自原液中的一个噬菌体，根据噬菌斑
的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列叙述正确的是( B )
A.牛肉膏蛋白胨培养基可作为选择
培养基选择出噬菌体的宿主细胞
B.加入混合液后，使用灭菌后的涂
布器将混合液均匀地涂布在培养基表面
C.上层培养基中琼脂浓度较高，因
此形成的噬菌斑较大，更有利于计数
D.双层平板法获得的噬菌斑不易
发生上下重叠现象
【解析】：B 项与题干矛盾。
底层平板起到支撑上层平板，是上层平板保持平整，是菌落更清晰。
5. 目的基因的筛选与获取
（1）真核生物、原核生物基因的结构和表达
（2）目的基因的筛选与获取
随着 测序 技术的发展，以及 序列数据库 （如GenBank）、 序列比对工具 （如BLAST）等的应
用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
①
从基
基因组
文库的构
因文
库中
直接
获取
建
部分基因
文库（如
cDNA 文
库）构建
②
人工
合成
前提：基
因比较
（大/小
）、核苷
酸序列
（未
知/已
知）
方法：通
过 DNA
合
成仪 用
化学方法
直接合成
目的基因
逆转
录法
即以 总
mRNA
作为模板，在 逆转录 酶的作用下合成 cDNA
，若要运用该
方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的 胰岛
B 细胞中提取到胰岛素的
mRNA 进行逆转录获取胰岛素基因；原因是 胰岛素基因只会在胰岛
B 细胞
中表达，其他细胞不表达 。上述方法获得的胰岛素基因（cDNA）在基因
结构的特点是 只包含了编码区的外显子序列，没有非编码区和内含子 。
化学
合成
法(蛋
白质
工程)
P94
A.蛋白质工程运用化学合成法合成目的基因的基本途径是
预期的蛋白质功能 → 设计预期的蛋白质结构 →
推测应有的氨基酸序列 → 找到对应的脱氧核苷酸序列 。
B. 化学法合成的目的基因 （含/不含）内含子、启动子和终止子？
参与翻译的
mRNA
序列是由编码序列转录而来的
。
C.若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可
能有 （一种/多种）；理由是 遗传密码具有简并（一种氨基酸可
由多个密码子编码）。
D.化学合成法 （能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物
产生新的性状以满足人类的要求
③
利用
PCR
获取
和扩
增目
的基
因
A. RCR 概念：PCR 是 聚合酶链式反应 的缩写，是一
项根据 DNA
半保留复制
的原理，在 体外 提供参与
DNA 复制的 各种组分 与 反应条件 ，对 目的基因的
核苷酸序列 进行 大量复制 的技术。
B. 条件: 前提条件： 已知目的基因的核苷酸序列
。
一定的缓冲溶液(含 Mg
2+ )、DNA 模板、 2 种引物、4
种 脱氧核苷酸 （或dNTP）、 耐高温 的DNA 聚合
酶、控制温度使DNA 复制在 体外 反复进行
a.引物：
【定义】引物是 一小段能与
DNA
母链的一小段碱
基序列互补配对的短单链核酸 （单链DNA 或单链
RNA）。用于PCR 的引物长度通常为20-30 个核苷
酸的 DNA
。
【设计原则】 引物自身不能环化 ;
两种引物之间不能互补配对 ;
引物长度不宜过短，防止引物随机结
合
, 产生非特异性条带，不可过长，导致扩增效率低
。
C. 过程：P78
变性：温度上升到 90
℃以上，双链
DNA 解聚为 单链
复性：当温度下降到 50
℃左右时，
2
种引物通过碱基互补配对
与 两
条单链DNA 结合。
延伸：温度上升到 72
℃左右
时，溶液中的4 种脱氧核苷酸
在 耐高温的
DNA
聚合酶
的作
用下合成新的DNA 链。
基因组文库
cDNA 文库
文库大小
大
小
基因中启动子
有
无
基因中内含子
有
无
基因多少
全部
部分
物种间的基因交流
部分可以
可以
【作用】2 种，引物的 5 ′
端分别与两条模板链 3 ′
端结合，为DNA 聚合酶提供了游离的 3 ′ 端，使耐
高温的DNA 聚合酶能够从引物的 3 ′ 端开始连接脱
氧核苷酸。
b.4 种脱氧核苷酸：合成DNA 子链的原料(dNTP，包
括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP),又提供 能量 。
c.真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要 Mg
2+ 激活。
因此，PCR 反应缓冲溶液中一般要添加 Mg
2+ 。
d.模板DNA 两 条母链:提供DNA 复制的模板
e.耐高温的DNA 聚合酶（ Taq
酶
）:催化合成DNA
子链。
f.高温：断开氢键，打开DNA 双链。（体内进行DNA
复制时需要 解旋酶 断开氢键。）
扩增次数
第1 次
第2
次
第3
次
第4 次
第N 次
DNA 总数
21
22
23
24
2n
长链-中长链DNA
2
2
2
2
2
中长链-短链DNA
0
2
4
6
2(n-1)
短链-短链DNA
【等长的DNA 分子数（目的基因）】
0
0
2
8
2n-2n
含引物A(或B)的DNA
1
3
7
15
2n-1
6. 基因工程的核心—— 基因表达载体的构建
构建基因表达载体的目的是：让目的基因在受体细胞中 稳定 存在, 并且 遗传 给下一代；使目的基
因能够 表达 和 发挥作用 作用。
（1）启动子
①本质：一段有特殊序列结构的 DNA
片段
②功能：RNA
聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
出
mRNA
。
③诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活
或抑制目的基因的表达。
④启动子具有物种和组织 特异 性：即只有使用受体生
物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。
如：利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药
物。 科学家将药用蛋白基因与 乳腺细胞中特异表达的基
因 的启动子 等调控元件重组在一起，通过 显微注射 的方法导入哺乳动物的 受精卵 中，由这个受
精卵发育成的转基因动物在进入 泌乳 期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为 乳腺生
物反应器 或乳房生物反应器。
又如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是 水稻胚乳细胞中特异表达的基因
的启动子 。
（2）终止子：
①本质：一段有特殊序列结构的 DNA
片段
②功能：使 转录 在所需要的地方停下来。
综上可知目的基因必须插入 启动子 和 终止子 之间。
（4）复制原点：使能完成自主 复制 。
（2025 年四川，保证载体能在XX 细胞中能正常复制）
单酶和双酶切割比较:
单酶切：获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制
酶,目的是 为了产生相同的黏性末端，便于连接 。但是使用
该法缺点是容易发生 目的基因、质粒的自身环化以及目的基
因与质粒随意连接 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施
是 分别使用两种限制酶去切割目的基因和质粒。
双酶切的优点：①防止质粒自身环化
②防止目的基因自身环化 使质粒
和目的基因正确（正向）连接
③避免目的基因和质粒的随意连接
（详见：第4 页的重组质粒和反义质粒）
提升：正向连接质粒和反向连接的质粒的筛选
方法一：酶切法
例8.(2022·福建，13 节选)载体和CD14 片段的酶切位
点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用Xho Ⅰ和
Sal Ⅰ分别酶切CD14 和图中载体连接，CD14 接入载体
时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一
步用这两种限制酶对CD14 的连接方向进行鉴定，理由
是 正向连接的重组
DNA
有这两种酶切位点
( 限制酶的识
别序列
) ；而反向连接的重组
DNA
会形成新的序列，没
有这两种酶的酶切位点
( 没有限制酶的识别序列
) 。
例9.（2025·山东·21 节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti
质粒上的T-DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2 个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，
突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1) Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为
。选用图甲中的SmaI 对抗除草剂基因X 进行完
全酶切，再选择SmaI 和
对Ti 质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是
。利用DNA 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载体，转化
大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶
进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈
现一长一短2 条带，较短的条带长度近似为
bp，则一定为正向重组质粒。
【答案】(1) 复制原点 Xba I DNA 聚合酶 Sma I 和Spe I 550bp
【详解】（1）DNA 复制的起点是复制原点，因此Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根
据Sma I 限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用Sma I 酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入
也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗
除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamH I，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择Xba I
和Sma I 进行酶切，Xba I 酶切会形成黏性末端，需要用DNA 聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补
平（可使重组质粒最小，同时Pst I 酶切后产生的黏性末端无法用DNA 聚合酶抹平，因为DNA 聚合酶只能从3'延伸
质粒
基因表达载体
DNA连接酶
或
外源DNA
目的基因
a酶
a酶
a酶
子链）。利用DNA 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载
体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA 片段上含有一个SmaI 酶切位点和一个Spe I 酶切位点，可以选择用Sma I 和Spe
I 进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2
条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。
方法二：PCR
例10.(高考题节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正
确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR 鉴
定。图中A 所示为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒
中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是 乙和
丙 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质
粒中扩增出了400 bp 片段，原因是 目的基因反向连接
。
【解析】如图A 所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产
生350 bp 片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450 bp 片
段。根据图B 进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp 片段。
【能力提升】：重点难点·透析（基因表达载体的构建）
1.限制酶的选择
(1)目的基因
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，
不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图
甲不能选择限制酶 Sma
I 。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向
连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质
粒，如图甲可选择 Pst
I 和 Eco
R I 两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如
图乙)。
(2)质粒 (3)Ti 质粒的T－DNA 片段
T-DNA 上也要有标记基因，筛选 将
T-DNA
片段整
合到宿主细胞染色体
DNA
上的受体细胞筛选出来
。
例11.(2024·湖南，21 节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种
技术研究。研究人员从野生百合中获得
一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基
因及其上游的启动子pL 和下游的终止子
结构如图a。图b 是一种Ti 质粒的结构
示意图，其中基因gus 编码GUS 酶，GUS
酶活性可反映启动子活性。
(1)研究病原微生物对L 的启动子pL 活性
的影响。从图a 所示结构中获取pL，首
先选用_________________酶切，将其与
相同限制酶酶切的Ti 质粒连接，再导入
烟草。
【答案】Hind Ⅲ、BamH Ⅰ
【解析】根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL 并连接到质粒上，可选
用限制酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ进行酶切，以替换Ti 质粒中的启动子，从而达到根据GUS 酶活性反映启
动子活性的目的。
例12.（2025·黑吉辽蒙·节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表
达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询
基因N 的编码序列，设计
特定引物。如图1 所示，a
链为转录模板链，为保证
基因N 与质粒pYL 正确连
接，需在引物1 和引物2
的5'端分别引入
和 限制酶识别序
列。PCR 扩增基因N，特异
性酶切后，利用
连接DNA 片段，构建重组
质粒，大小约9.5kb（kb
为千碱基对），假设构建
重组质粒前后，质粒pYL
对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质
粒，以1-4 号菌株中提取
的质粒为模板，使用引物
1 和引物2 进行PCR 扩增，电泳PCR 产物，结果如图2。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板
DNA，目的是检验PCR 反应中是否有
的污染。初步判断实验组 （从“1-4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。
【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶
(2) 外源DNA 1 目的基因N 大小为2.3kb
【详解】（1）GenBank 是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发
布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据
库中查询基因N 的编码序列，设计特定引物。保证基因N 与质粒pYL 正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因
能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏
性末端的酶；分析图1 可知，质粒pYL 应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N 含有Spe Ⅰ识别序列，故N
基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N 酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N 基因
两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N 基因a 链为转录模板链，才有引物1 和引物2 扩增N 基因，则
扩增后模板链的5'端含有引物1 序列，而编码链的5'端含有引物2 序列，结合质粒pYL 上的启动子和终止子方向，
可知应该在引物2 需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR 扩增基因N，特异性酶切后，利用
DNA 连接酶连接DNA 片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对
应部分大小基本不变。
（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基本不
变，而质粒pYL 本身7.2kb，可知目的基因N 大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1 的质粒中成功插入
了基因N。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR 反应体系是否存在污染，即
检验PCR 反应中是否有外源DNA 污染。
例13.（2025·陕晋青宁·节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科
研人员发现，野生马铃薯中S 基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能
力。回答下列问题。
(2)图中标识了载体和S 基因中限制酶的切割位点。为将S 基因正确插入载体，PCR 扩增S 基因时需在引物的
（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-
-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是
，PCR 扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化
和连接，获得含S 基因的表达载体并导入农杆菌。
【答案】(2) 5'端 AGATCT BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ
【详解】（2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。
结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I 和Xba I 的识别序列，而S 基因内部含有Xba I、
Nde I 和BamH I 的识别序列，要用BamH I、EcoR I 或Xba I 切割载体，又不能用Xba I、Nde I 或BamH I 切割S 基
因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I 切割载体，用BamH I 的同尾酶Bgl
Ⅱ和EcoR I 切割S 基因，故PCR 扩增S 基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。
2.注意教材上的两句话
（1）P72，在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。
（2）P82，基因表达载体的构建的方法也不是千篇一律的。
例13.（2025·周测8）Mse Ⅰ（GAAT↓TAATTC）、Pst Ⅰ（C↓TGCAG）、EcoR Ⅰ（G↓AATTC）三种限
制酶的识别序列及切割位点,下图1、图2 中箭头表示相关限制酶的酶切点。 若要用上图质粒和外源
DNA 构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中
需要使用的酶是（ ）
A. 限制酶Pst Ⅰ、DNA 连接酶、DNA
聚合酶
B. 限制酶EcoR Ⅰ、DNA 连接酶、DNA
聚合酶
C. 限制酶EcoR Ⅰ、限制酶Pst Ⅰ、
DNA 聚合酶
D. 限制酶Pst Ⅰ、限制酶EcoR Ⅰ、
DNA 连接酶
【详解】
例14.（2025·周测8）研究人员利用Ti 质粒构建p—H5/H3 共表达重组质粒（如下图)。设计思路
是：获得H5 基因和H3 基因，先将H5 基因整合到含卡那霉素抗性基因的T-DNA(仅含有 Nhe Ⅰ和
Xho Ⅰ酶切位点）上，再将H3 基因插入，获得重组质粒。为达到实验目的，需在H5 基因两端分别引
入___________和_________________酶切位点。通常酶切位点的引入方法是在PCR 过程中，通过设计
使其出现在_______中，进而出现在H5 基因中。
【详解】
3.启动子
（1）启动子具有物种和组织特异性(选择性必修3P90)。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能
比较有利于基因的表达。
（2）诱导型启动子（选择性必修3P80）
例15.（2024 年河北卷，T22）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关
基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN 疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1 所示。其中GtP 为启动子，若使r2HN 仅在水
稻胚乳表达，GtP 应为 启动子。Nos 为终止子，其作用为
。r2HN 基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对
r2HN 基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
【答案】水稻胚乳中特异性表达的基因的 使转录终止 Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ
【解析】利用水稻细胞培育能表达r2HN 的水稻胚乳细胞生物反应器，在胚乳中特异性表达的基因的启动子在水稻
胚乳细胞中更容易被RNA 聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos 为终止子，终止子可以终止转录。Kpn Ⅰ破坏了启动
子序列，Sac Ⅰ位于终止子序列，均不能选用，且r2HN 基因内部不含载体的限制酶识别位点，则为了将目的基因
插入载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ对r2HN 基因与载体进行酶切，用于表达载体
的构建。
例16.（2024 年广东五校联考）利用细菌靶向给药在肿瘤治疗领域受到广泛关注。科研人员改造大肠
杆菌，制造出能定点、可控表达治疗性抗体的工程菌。回答下列问题：
(1) 聚焦超声能使肿瘤部位的温度从37℃提升
至42℃，可作为工程菌的“温度开关”。研究
人员筛选出3 种转录抑制蛋白，37℃时，转录
抑制蛋白与诱导型启动子结合，抑制下游绿色
荧光蛋白（GFP）基因的转录；42℃时，转录抑
制蛋白空间结构改变，不再与诱导型启动子结
合。
①研究人员构建了下
图所示表达载体，以
筛选最佳感温元件。
除图中所含元件外，
表达载体还必须具
有
和氨苄青霉素抗性基
因、限制酶酶切位点
等元件。长时间培养
时在培养液中加入氨苄青霉素，其作用是
。（写出两点即可）
②检测导入不同转录抑制蛋白基因的大肠杆菌在不同温度下的荧光强度，结果如下图所示。最终选
择转录抑制蛋白 （填“A”或“B”或“C”）来构建工程菌，理由是
。
(2)上述表达载体仅在42℃时表达，而肿瘤治疗需要长期进行。科研人员继续对表达载体进行如下图
所示改造，整合酶可将P7 序列进行一次永久性翻转。请预测以下培养条件下改造后的工程菌菌落的
颜色：Ⅰ.37℃培养 ；Ⅱ.42℃培养 ；Ⅲ. 42℃处理1h 后，37℃培养
。（填“无色”或“绿色”）
(2) 为得到可用于肿瘤治疗的工程菌，需进一步改造上述工程菌。请选择下图中 X、Y、Z 三个位点
中的一个作为治疗性抗
体编码基因的插入位点
。
【答案】（1）终止子和复制原点 防止杂菌污染、将含有目的基因的受体细胞筛选出来 37℃时荧光强度低，
安全性高；42℃荧光提高倍数最大，灵敏度高 （2）无色 绿色 绿色 （3）X
【详解】（1）①质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，而表达载体没有进入的细菌没有，长时间培养时在培养液中加
入氨苄青霉素，其作用是去除丢失质粒的细菌，抑制杂菌生长。②由图可知，37℃下荧光强度很低，安全性高，
42℃下荧光强度提高倍数最大，灵敏度高，所以最终选择转录抑制蛋白C 来构建工程菌。（2）Ⅰ. 在37°C 培养
时，转录抑制蛋白与诱导型启动子结合，抑制整合酶基因表达，P7 序列不能翻转，下游绿色荧光蛋白（GFP）基因
无法转录表达，所以工程菌菌落无色。
Ⅱ. 在42°C 培养时，转录抑制蛋白空间结构改变，不再与诱导型启动子结合，整合酶基因表达，使P7 序列翻
转，GFP 基因可以转录表达，工程菌菌落为绿色。Ⅲ. 在42°C 处理1h 后，P7 序列被整合酶永久性翻转，之后在
37°C 培养时，由于P7 序列翻转后的结构变化，使得GFP 基因可以持续表达，工程菌菌落为绿色。
（3）将治疗性抗体编码基因插入X 位点，可实现机体正常部位不表达，仅当肿瘤部位升温至42℃后，才激活并持
续表达，实现长期、定点的肿瘤治疗，所以择图5 中X 位点作为治疗性抗体编码基因的插入位点。
例17.（2025·广东）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了
通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设
计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2 为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA 短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在
添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR 及 检测，筛选获得重组菌株W1。
(2)将W1 在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测
液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原是
。
(3)研究者选用启动子PX、X 基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大
肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2 的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为
。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A 活性弱，且莽草酸会
被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽
草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：
。
【答案】(1)荧光
(2) 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro 在生长稳定期
停止基因转录，且带有SsrA 短肽的mKate2 被降解
(3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定
(4)先敲除野生菌株中的酶B 基因，再将质粒①中的mKate2 基因替换为酶B 基因，将质粒②中的mKate2 基因替换为
酶A 基因，并将两种质粒导入野生菌株中
【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可
利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到
细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的
荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGro 在生长
稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA 短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA 短肽的蛋白质可被大肠杆菌内
源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
（3）在重组菌株W2 中，启动子PX 被阻遏蛋白X 阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2 基因的
表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X 停止表达并被降解，对PX 启动子的阻遏作用降低，mKate2 基因开始
表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期无荧
光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 。
（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生
型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B 基因；然后将
质粒①中的mKate2 基因替换为酶B 基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进
入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2 基因替换为酶A 基因，利用其调控机
制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。
4 .Ti 质粒
例18.(2023·海南，20 节选)我国开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽，简称CDB 法)。图1
与图2 分别是利用常规转化法和CDB 法在某植物中递
送基因的示意图。则：
(1)图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外
源基因递送到植物细胞中的原因是
。
(3) 已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构
建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体
(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2 中的CDB 法
将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转
化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段
的方法是
，
图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发
挥作用的方法是
，
依据是
。
【答案】(1)农杆菌细胞内含有Ti 质粒，Ti 质粒中的T－DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染
色体DNA 整合到一起
(2)检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS 缺失会导致植株白化，白化苗的
出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除
例19.（CS 周练18，6）A 蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科
研团队利用无缝克隆技术将A 蛋白结合蛋白基因（P 基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS 基因）融合，
构建A 蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。农杆菌的Ti 质粒的T-DNA 上含有抗
甘草磷除草剂基因，相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。
（1）利用双酶切法将融合基因插入Ti 质粒，选用的限制酶为
。
（2）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选
分别是
。
【答案】(1)Bcl I 和Sma I (2)先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆
菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞
【解析】（2）利用双酶切法将融合基因插入Ti 质粒的T-DNA 区，如果使用BamHI，会降Ti 质粒上的复制原点切
掉，剩下的部分在启动子和终止子之间没有限制酶的切割位点，故选择BclI 和SmaI。根据融合基因的放大图可
知，扩增时以DNA 的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1 和F2 应选用下列引物组合为3'端序列可以与
④5'-…TCTGTTGAAT-3'配对，5'端序列的互补链可以与①5'-…CTTGGATGAT-3'配对，因此选用的引物组合为
①④。（3）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是
先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出
导入融合基因的拟南芥细胞。
例20.（2025·陕晋青宁·节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科
研人员发现，野生马铃薯中S 基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能
力。回答下列问题。
(3)用携带S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA 进入愈伤组织细胞，将S 基因整合到
，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能
力显著增强的马铃薯植株。
【答案】(3) 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化
【解析】（3）T-DNA 属于可转移DNA，用携带S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA
进入愈伤组织细胞，将S 基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1 位于T-DNA 外部，用于筛选
含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2 位于T-DNA 内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形
成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
7. 将目的基因导入受体细胞
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持 稳定 和 表达 的过程。实质是 基因重组
(变异类型)
导入至植物细胞
花粉管通道法
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA 溶液滴
加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
农杆菌转化法
1. 农杆菌特点：易感染 单子叶 叶植物和 裸子 植物，对大多数
叶植物没有感染能力（人工添加 酚类 化合物可以解决）。
2. 原理：农杆菌细胞内含Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将
Ti 质粒上的 T-DNA
转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细
胞的 染色体
DNA
上。
3. 过程：
①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是
将 目的基因 拼接到 Ti
质粒的
T − DNA
上，第二次拼接（非人
工操作）是指插入目的基因的T−DNA 拼接到受体细胞的染色体
DNA 上；//第一次导入是导入 农杆菌 ，第二次导入（非人工操
作）是将含目的基因的T−DNA 导入 受体细胞 。
②导入的目的基因可能存在于细胞质中（具体位置是 线粒体 、
叶绿体 ），也可能整合到染色体DNA 上。存在于染色体DNA 上
的目的基因有可能通过 花粉 传播进入杂草或其他作物中，造成
“基因污染”。
③T-DNA 上也要有标记基因，筛选导入成功的受体细胞。
④植物的受体细胞是 受精卵 或 体细胞 。
导入至动物细胞
显微注射 法
1. 受体细胞 受精卵 。
过程：构建基因表达载体并提纯→利用显微注射法将基因表达载
体注入动物的受精卵中→ 早期胚胎培养 → 胚胎移植（移植到
同期发情的母畜子宫内）→获得具有新性状的动物（也叫 生物
反应器 ）
膀胱生物反应器：利用转基因的动物的尿液来获得目的蛋白，一般采用工
程化膀胱上皮细胞生产特定的蛋白并分泌进入尿液；膀胱生物反应器具有
一定的优点：如尿液产量大、收集方便；膀胱生物反应器 （无/有）
周期和性别的限制, 在任何时期, 雌雄动物均可通过尿液收集目的蛋白；从
尿中提取蛋白更容易, 因为尿液中含有的蛋白种类及其他杂质相对较少易
于纯化。
导入至微生物
细胞
Ca
2+ 处理
法
（感受态细胞
法）
1. 常用菌: 大肠杆菌 。
微生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质
相对少 。
2. 过程：Ca2+处理细胞→ 感受态细胞 →表达载体与感受态细胞
混合→感受态细胞吸收DNA
8. 目的基因的检测与鉴定
类型
检测内容
方法
分子 水平检
测
受体细胞的染
色体DNA 上是
否插入了 目的
基因 ;
目的基因是否
转录出 mRNA
分子杂交 、分子杂交等技术。
1. PCR 技术检测
（1）受体细胞的染色体DNA 上是否插入了目的基因：
例如：检测棉花的染色体DNA 上是否插入了Bt 基因或检测Bt 基
因。
提取棉花细胞 染色体
DNA
→Bt 基因的特异性引物进行PCR 扩增
。
→对扩增产物进行检测（如：琼脂糖凝胶电泳检测）
（2）PCR 技术检测受体细胞的目的基因是否转录出了mRNA。
方法：提取转基因生物的 总
mRNA
，在 逆转录 酶作用下合成
cDNA
，再用与目的基因特异性结合的引物进行PCR 扩增，检测是
否有扩增产物。
2. 分子杂交技术
探针：是一种带有放射性同位素、荧光染料或其他化学物质标记
的 （单/双）链核酸序列，可以是DNA 或RNA，用来检测样
品中的特定核酸序列。探针能够通过分子杂交的方式与目标序列
结合，从而实现对目标序列的检测。
受体细胞的目
的基因是否翻
译成 蛋白质
1. 方法： 抗原
- 抗体杂交
2. 原理： 抗体与抗原的结合具有特异性
3. 过程：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体与提取的蛋
白质进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则说明目的基因已成功
翻译。
个体 生物学
水平的鉴定
鉴定生物是否
具有该蛋白质
赋予的某种特
性以及具有该
特性的程度
（活性鉴定）
①抗虫：做抗虫接种实验（饲喂害虫），观察 （害虫/植
物体）的生存状况。
②抗病：做病原体接种实验，观察 （病原体/植物体）的
生存状况。
③抗盐：将转基因植物移栽到 含有较高盐的土壤中 ，观察其生
长状况。
④抗寒：将转基因植物移栽到 低温（寒冷） 环境中，观察其生
长状况。
（2025·黑吉辽蒙·节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香
树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 香树脂醇
含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方
案。
（2025·山东·节选）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti 质粒上
的T-DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2 个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体
种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
（3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，
（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【解析】突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。
9.蛋白质工程
（1）为什么要通过基因改造或基因合成来完成蛋白质工程，而不是直接对蛋白质进行改造？
①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大。
②蛋白质是由基因编码的，改造了基因，可以间接改造蛋白质。
③基因可以遗传，蛋白质无法遗传。
（2）定义：是以 蛋白质分子的结构规律与生物功能的关系 作为基础，通过 基因改造或合成基因 对
现有的蛋白质进行改造，或制造一种 新的蛋白质 ，以满足人类的生产和生活需要。
（3）蛋白质工程和基因工程的比较
基因工程
蛋白质工程
操作环境
生物体外
生物 （体内/体外）
操作核心
基因
基因
操作起点
目的基因
蛋白质预期功能
基本过程
目的基因的筛选与获取→基因表达
载体的构建→将目的基因导入受体
细胞→目的基因的检测与鉴定
预期蛋白质的功能→设计预期蛋白质结构→推测应
有氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列
→获得所需要的蛋白质
结果
生产自然界已存在的蛋白质
改造天然蛋白质或创造出自然界 （不存
在/存在）的蛋白质
联系
蛋白质工程最终还是要回到基因工程上来，因为蛋白质的合成由基因控制，所以说蛋白
质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第 二 代基因工程
（2025·河南·节选）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分
子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶
寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌
种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
(1) 已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而
提升蛋白质的耐热性。为提高CG 的耐热性，研究人员分
析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大
表明该位点对酶的功能越关键），如图2 所示。根据分析
结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，
原因是
。
【答案】(4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功
能的影响较小
【详解】（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44 位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易
形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
