文档文本内容
专题14 基因工程
6 年真题1 年模拟
考点分类
黑吉辽蒙考情
命题规律
考点01 基因工程的基本工具
2025 黑吉辽蒙（1
题）、2024 辽宁（1
题）、
2023 辽宁（1 题）、
2022 辽宁（1 题）、
2021 辽宁（1 题）
· 情境设置：以微生物发酵生产药物（香树脂醇、PHB2 蛋
白）、酶工程改造等真实科研情境为主
· 考查重点：限制酶选择、载体构建、基因表达系统优化等核
心工具的运用
· 命题趋势：工具考查融入完整工程流程，与蛋白质工程、代
谢工程交叉综合命题
考点02 基因工程的基本操作
程序（PCR 技术及其应用）
2026 黑吉辽蒙（1
题）、2024 辽宁（2
题）、
2023 辽宁（1 题）、
2022 辽宁（1 题）、
2021 辽宁（1 题）
· 情境设置：以基因工程实际应用为背景，如抗虫玉米监管、
病毒受体监控、真菌基因改造等
· 考查重点：PCR 产物鉴定、引物设计、T-DNA 转移系统、荧光
标记技术等实验操作细节
· 命题趋势：从单一PCR 技术向多技术整合考查发展，强调实
验原理与结果分析的结合
考点03 基因工程和蛋白质工
程的应用
2021 辽宁（1 题）
· 情境设置：以工业酶改造（腈水合酶耐热性提升）等蛋白质
工程典型案例为载体
· 考查重点：定点突变、结构预测与功能改造的关系，蛋白质
工程与基因工程的层级差异
· 命题趋势：该考点考查频次较低，但综合性强，未来可能强
化与人工智能辅助设计等前沿技术结合
考点1 基因工程的基本工具
1.（2025·黑吉辽蒙·高考真题）（多选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通
过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
（1）可从 中查询基因N 的编码序列，设计特定引物。如图1 所示，a 链为转录模板链，
为保证基因N 与质粒pYL 正确连接，需在引物1 和引物2 的5'端分别引入 和
限制酶识别序列。PCR 扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA 片段，构建重组质粒，
大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基本不变。
（2）进一步筛选构建的质粒，以1-4 号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1 和引物2 进行PCR 扩增，电
泳PCR 产物，结果如图2。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR 反
应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中
成功插入了基因N，理由是 。
（3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙
氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA 等。a 是诱变第240 位脯氨酸编码序列的引物（GCA 为诱变序列），
b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a 的配对模板相同。据此分析，丙氨酸
的密码子除GCA 外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
（4）进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇
合酶基因的改造方案。
【答案】（1 ）① 序列数据库 ② Xho Ⅰ ③ Xba Ⅰ ④ DNA 连接
酶 （2）① 外源DNA ② 1 ③ 目的基因N 大小为2.3kb （3）
GCC （4）香树脂醇
【分析】
PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为原料，合
成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的5'端自
3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原因是DNA 聚
合酶只能从3′端延伸DNA 链。PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
(1)小问详解：
GenBank 是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序
列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基
因N 的编码序列，设计特定引物。保证基因N 与质粒pYL 正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能
正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生
相同黏性末端的酶；分析图1 可知，质粒pYL 应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N 含有Spe
Ⅰ识别序列，故N 基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N 酶切时可以用
Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N 基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N 基因a 链为转录模
板链，才有引物1 和引物2 扩增N 基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1 序列，而编码链的5'端含有引
物2 序列，结合质粒pYL 上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2 需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端
添加Xho Ⅰ识别序列。PCR 扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA 连接酶连接DNA 片段，构建重组质粒，
大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基本不变。
(2)小问详解：
构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基本不
变，而质粒pYL 本身7.2kb，可知目的基因N 大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1 的质粒中
成功插入了基因N。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR 反应体系
是否存在污染，即检验PCR 反应中是否有外源DNA 污染。
(3)小问详解：
编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有
GCA；密码子位于mRNA 上，mRNA 上的序列与编码链序列相似，而a 是诱变第240 位脯氨酸编码序列的引物
（GCA 为诱变序列），可知a 引物延伸后的序列为编码链；b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙氨酸的引
物，其配对模板与a 的配对模板相同，分析题图bcd 序列可知c 是诱变第243 位苯丙氨酸的引物，且c 引
物延伸后的序列为编码链，根据a 引物5'-端首位GCA 为240 位，则c 引物5'-端GCC 为243 位，故据此分
析，丙氨酸的密码子除GCA 外，还有GCC。
(4)小问详解：
题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步
检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
2.（2024·辽宁·高考真题）作物在成熟期叶片枯黄，若延长绿色状态将有助于提高产量。某小麦野生型
在成熟期叶片正常枯黄（熟黄），其单基因突变纯合子ml 在成熟期叶片保持绿色的时间延长（持绿）。
回答下列问题。
（1）将ml 与野生型杂交得到F1，表型为 （填“熟黄”或“持绿”），则此突变为隐性突变
（A1基因突变为al基因）。推测A1基因控制小麦熟黄，将A1基因转入 个体中表达，观察获得
的植株表型可验证此推测。
（2）突变体m2 与ml 表型相同，是A2基因突变为a2基因的隐性纯合子，A2基因与A1基因是非等位的同源
基因，序列相同。A1、A2、a1和a2基因转录的模板链简要信息如图1。据图1 可知，与野生型基因相比，a1
基因发生了 ，a2基因发生了 ，使合成的mRNA 都提前出现了 ，翻译
出的多肽链长度变 ，导致蛋白质的空间结构改变，活性丧失。A1（A2）基因编码A 酶，图2 为
检测野生型和两个突变体叶片中A 酶的酶活性结果，其中 号株系为野生型的数据。
（3）A1和A2基因位于非同源染色体上，ml 的基因型为 ，m2 的基因型为 。若将
ml 与m2 杂交得到F1，F1自交得到F2，F2中自交后代不发生性状分离个体的比例为 。
【答案】（1）① 熟黄 ② 持绿（或m1或突变型） （2）① 碱基的替换 ② 碱
基的增添 ③ 终止密码子 ④ 短 ⑤ ① （3）① a1a1A2A2 ②
A1A1a2a2 ③ 1/2
【分析】
【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
显性突变和隐性突变判断
在完全显性关系中，杂合子体现
显性基因表型
A1 基因突变的al 基因为隐性突
变，则al相对A1 为隐性
基因突变与生物性状的关系
基因结构中碱基增添、缺失或替
换导致基因结构改变，即发生基
因突变。基因发生改变，若使对
应的mRNA 中终止子提前出现，
则基因指导的蛋白质也随着变短
由图中突变前后的基因结构进行
比较，可知a1、a2 分别发生了碱
基对的替换和增添，从而导致
mRNA 中提前出现了终止密码
非同源染色体上的非等位基因的
遗传及相关计算
等位基因和相同基因位于同源染
色体的相同位点上，同源染色体
ml和m2各发生了一对等位基因的
突变，成熟期叶片颜色受两对等
上的基因的遗传遵循分离定律；
非等位基因位于非同源染色体
上，非同源染色体上的基因的遗
传遵循自由组合定律
位基因控制，性状的遗传遵循自
由组合定律
（2）逻辑推理与论证
(1)小问详解：
若此突变为隐性突变，则m1的基因型为a1a1，野生型的基因型为A1A1，m1×野生型→A1a1，表型为野生型，
即熟黄。若要证明此推测，可将A1基因转入持绿（或m1或突变型）个体中表达，若植株表现为熟黄，则
可验证此推测。
(2)小问详解：
依据题干和图1 可知，①A2基因与A1基因是非等位的同源基因，序列相同；②突变体m2与ml表型相同，
且均为对应基因的隐性纯合子；③由于终止密码子为UAA、UAG、UGA，可知对应模板链上碱基为
ATT、ATC、ACT。与野生型基因相比较，a1发生了碱基的替代C →T，a2基因发生了碱基的增添，使添加
位点后的碱基依次后移，导致a1序列上提前出现了ACT，a2序列上出现ACT，即使合成的mRNA 都提前
出现了终止密码子，导致翻译出的多肽链长度变短，导致蛋白质的空间结构改变，活性丧失。A1（A2）基
因编码A 酶，且突变体m2与ml表型相同，可知m2与ml中A 酶的酶活性大体相同，所以据图2，可知，①
号株系为野生型数据。
(3)小问详解：
依据题干信息，A1和A2基因位于非同源染色体上，则ml的基因型为a1a1A2A2，m2的基因型为A1A1a2a2。ml
×m2→F1：A1a1A2a2，F1 →
自交F2：A1 - A2 - ：a1a1A2 - ：A1 - a2a2 ：a1a1a2a2=9:6:1，对应的表型为野生型：突变型
=9:7，后代9331 的比例中，但凡有一对基因是隐性纯合，自交后代均为持绿，所以F2中自交后代不发生
性状分离的应该占1+3+3+1，8/16=1/2。
3.（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造
β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答
下列问题：
（1）上述过程属于 工程。
（2）PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
（3）某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热
性明显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
（4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
（5）目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不
同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确
连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
（6）采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR
的模板。
【答案】（1）蛋白质 （2）③ （3）② （4）标记基因 （5）
① 筛选导入目的基因的大肠杆菌 ② 5.7 （6）逆转录
【分析】
基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合
成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和
标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入
植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显
微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水
平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是
否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水
平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
(1)小问详解：
根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
(2)小问详解：
PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
(3)小问详解：
根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则
所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
(4)小问详解：
作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图
示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
(5)小问详解：
目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，
这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，
则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
(6)小问详解：
转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA 为模
板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
4.（2022·辽宁·高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N 蛋白胞外段，制备相应
的单克隆抗体，增加其对N 蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N 蛋白胞外段抗原制备，流程如图1
（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 。
用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体
（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
（2）质粒在包装细胞内组装出由 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表
达并分离、纯化N 蛋白胞外段。
Ⅱ．N 蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2
（3）用N 蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用 酶处理，制
成细胞悬液，置于含有混合气体的 中培养，离心收集小鼠的B 淋巴细胞，与骨髓
瘤细胞进行融合。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96 孔板，进行
培养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N 蛋白胞外段抗体，又能大量增
殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集 ，提取单克隆抗体。
（5）利用N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成 ，实现特异性治疗。
【答案】（1）① 检测目的基因是否成功导入受体细胞 ② 双分子层中 （2）蛋白质外
壳和含N 蛋白胞外段基因的核酸 （3 ）① 胰蛋白酶或胶原蛋白 ② CO2 培养
箱 （4）① 克隆化 ② 抗原抗体杂交 ③ 细胞培养液 （5）抗体-药
物偶联物##ADC
【分析】
1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B
淋巴细胞；诱导B 细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能
产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或
小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特
异性抗体的细胞群。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
(1)小问详解：
构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基
因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即
磷脂双分子层）。
(2)小问详解：
由于目的基因为N 蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N 蛋白胞外段基因的核酸组
成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N 蛋白胞外段。
(3)小问详解：
进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有95%空
气和5%的CO2混合气体的CO2培养箱中培养。
(4)小问详解：
用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96 孔板，进行克隆化培养和抗
体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N 蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克
隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。
(5)小问详解：
利用N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治疗。
5.（2021·辽宁·高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫
颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小为
0．9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其
作为PCR 反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序
列不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入
和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，
可选用 （填“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTTTTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTGGTC↑GAC
PstI
CTGCA↓G G↑ACGTC
KpnI
GGTAC↓CC↑CATGG
BamHI
G↓GATCCCCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、
3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
（5）将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞
周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的
原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【答案】（1 ）逆转录 （2 ）① EcoRI ② PvitⅡ ③ T4DNA 连接
酶 （3）感受态 （4）3 （5）G2/M
【分析】
分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI 在质粒上有两个酶切
位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。
图4 中G1期和S 期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。
(1)小问详解：
利用RNA 获得cDNA 的过程称为逆转录。
(2)小问详解：
根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于
三种限制酶切点，但是由于KpnI 在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI 和PvitⅡ两种不同限
制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA 连接
酶连接质粒和目的基因。
(3)小问详解：
转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
(4)小问详解：
由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质
粒，如果用EcoRI 和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2
基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。
(5)小问详解：
比较图4 中G1期和S 期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S 期细胞可以进入G2期，而G2
期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2 蛋白应该作用于G2/M 期。
【点睛】
本题考察基因工程的知识，需要考生分析质粒的酶切位点，结合目的基因转入的位置进行分析，结合题干
中目的基因的大小分析电泳图。
考点2 基因工程的基本操作程序（PCR 技术及其应用）
1.（2024·辽宁·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【分析】
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的原理主要基于DNA 分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。
【详解】
A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA 分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分
离的DNA 片段大小来选择的。对于较大的DNA 片段，比如基因组DNA 或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼
脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA 片段，比如PCR 产物或酶切片段，则
需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A 正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝
胶2/3 处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B 错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA 片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，
DNA 片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段越长，迁移速率越慢，C 错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA 分子需染色后，才可在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来，D 错误。
故选A。
2.（2023·辽宁·高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达和
转运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接
过程的关键步骤是除去（ ）
A. CD163 基因中编码起始密码子的序列
B. CD163 基因中编码终止密码子的序列
C. RFP 基因中编码起始密码子的序列
D. RFP 基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【分析】
基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。
【详解】
为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因都得转录
和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163 基因转录形成的mRNA 中不能出现终止密码子，否
则红色荧光蛋白RFP 基因转录形成的mRNA 不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键
步骤是除去CD163 基因中编码终止密码子的序列，B 符合题意，ACD 不符合题意。
故选B。
3.（2022·辽宁·高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转
基因生物安全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（
）
A. 预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
【答案】B
【分析】
PCR 过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA 解旋为单链；②复性，当温度降低
到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合；③延伸，温度上升到72℃左右，溶液中
的四种脱氧核苷酸，在DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
【详解】
A、预变性是使模板DNA 充分变性，A 错误；
B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增
更加充分，B 正确；
C、延伸过程需引物参与，C 错误；
D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D 错误；
故选B。
4.（2021·辽宁·高考真题）下列有关病毒在生物学和医学领域应用的叙述，错误的是（ ）
A. 灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合
B. 用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体
C. 基因工程中常用噬菌体转化植物细胞
D. 经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防
【答案】C
【分析】
1、病毒是非细胞生物，只能寄生在活细胞中进行生命活动。病毒依据宿主细胞的种类可分为植物病毒、
动物病毒和噬菌体；根据遗传物质来分，分为DNA 病毒和RNA 病毒；病毒由核酸和蛋白质组成。
2、疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转
基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。应用转基因技术生产的疫苗，主要成分是病毒的表面
抗原蛋白，接种后能刺激机体免疫细胞产生抵抗病毒的抗体。
【详解】
A、促进动物细胞的融合除了物理方法和化学方法外，还可以采用灭活的病毒，A 正确；
B、病毒作为抗原可刺激机体发生特异性免疫，产生抗体，用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体，B 正
确；
C、基因工程中常用农杆菌转化植物细胞，农杆菌的特点是其细胞内的Ti 质粒上的T-DNA 片段能够转移至
受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上，C 错误；
D、经过灭活或减毒处理的病毒可以作为免疫学中的疫苗，用于免疫预防，D 正确。
故选C。
5.（2026·黑吉辽蒙·高考真题）平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死
率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发
“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。
注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。
（1）为提高Tps 基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因
序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是 。
实验如上图，用限制酶EcoRV 切割pPK2 质粒，然后与Tps 基因连接，用 （填“E．
coli”或“T4”）DNA 连接酶可获得更高的连接效率。
经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在 。为鉴定
重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是
和 。
A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb
C．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb
农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA 会转移并整合到平沙绿僵菌的 上。
为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR 技术进行鉴定。Tps 基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…
AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是 。
A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′ B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′
C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′ D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′
（2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。
相关指标培养
物
访
问
次
数
（次/小时）
停留时间（分
钟/小时）
2 小时感染率
（%）
LT50（天）
第7 天死亡率
（%）
平沙绿僵菌
0.9
1.1
100
5.84
62.4
工程菌
2.4
5.9
100
4.04
84.3
注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。
已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7 天死亡
率更高的原因是 。
（3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的 评价，符合标准后方可推广。
【答案】（1）① 人工合成法（化学合成法） ② T4 ③ 未插入目的基因的pPK2 空质
粒 ④ A ⑤ D ⑥ 染色体DNA ⑦ B （2）工程菌的引诱能力更
强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速
度更快，半数致死时间LT50缩短，第7 天死亡率更高 （3）安全性
(1)小问详解：
已知氨基酸序列，重新设计编码序列，目的基因通过人工合成法（化学合成法）获取。限制酶EcoRV 切割
产生平末端，T4 DNA 连接酶可以连接平末端，连接效率高于EcolDNA 连接酶，因此选T4DNA 连接酶。卡
那霉素筛选只能筛选出含有质粒的农杆菌，因此除重组质粒外，还可能存在未插入目的基因的pPK2 空质
粒。原质粒5.0kb，目的基因总长度0.7+1.1=1.8kb，重组质粒总长度为6.8kb。目的基因正向插入后：
BamHI/EcoRI 酶切得到0.7kb+6.1kb （6.8 0.7=6.1
−
）；HindIII/EcoRI 酶切得到1.1kb+5.7kb
（6.8 1.1=5.7
−
），因此正确组合是A 和D。农杆菌转化法中，T-DNA 会转移并整合到受体真菌的染色体
DNA 上。PCR 引物需要与DNA 两端的3' 端互补，子链的延伸方向为5'→3' 。转录模板链为5′
ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC 3′
−
−
，左侧引物序列为5′ ATGTC… 3′
−
−
，右侧引物与模板右侧的序列5′…
GCTCC 3′
−
反向互补，序列为5′ GGAGC… 3′
−
−
，因此选B。
(2)小问详解：
根据题干和表格数据，转入Tps 基因后工程菌引诱能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附
着量更高；而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更快，LT50更短，最终第7 天死亡率更高。
(3)小问详解：
转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。
6.（2024·辽宁·高考真题）将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒（辅助T-DNA 转移）和不含有
Vir 基因、含有T-DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，
为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3 表示引物；T-DNA-LB 表示左边界；T-DNA-RB 表示右边界；Ori 表示复制原点；KanR表示
卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%
的预冷酒精，其目的是 。
（2）本操作中获取目的基因的方法是 和 。
（3）穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其
目的可能是 。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛
选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
和 。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B. 将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【答案】（1 ）① 除去蛋白质杂质 ② 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的
DNA （2）① PCR 技术扩增 ② 人工合成 （3）① RNA 聚合酶识别并结合的
部位 ② 提高目的基因转录效率 （4 ）HygBR （5 ）① F3 ②
R2 （6）D
【分析】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
从苏云金杆菌提取DNA 时，需
加入蛋白酶
酶具有专一性
从苏云金杆菌提取DNA 时，需
加入蛋白酶，其作用是除去蛋白
质杂质
提取过程中加入体积分数为95%
的预冷酒精
DNA 在冷酒精中溶解度较低
提取过程中加入体积分数为95%
的预冷酒精，其目的是溶解蛋白
质等物质，析出不溶于酒精的
DNA
（2）逻辑推理与论证
(1)小问详解：
从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质。研磨液中的SDS 能使蛋白质变
性，因此无需担心DNA 酶水解DNA。但即使有蛋白质变性剂使蛋白质变性改变其理化性质，仍然有
可溶性、不溶性的蛋白质杂志通过沉淀、过滤等物理方式难以去除，因此为了获得较纯的DNA，保证
提取的DNA 作为PCR 模板的品质，需要加入蛋白酶。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其
目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
(2)小问详解：
本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR 技术扩增。
(3)小问详解：
穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是RNA 聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个
p35s 启动子，其目的可能是提高目的基因转录效率。
(4)小问详解：
结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基
因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)小问详解：
为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是F3
和R2。
(6)小问详解：
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来
改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技
术属于蛋白质工程，理由是用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，
将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。
ABC 不符合题意，D 符合题意。
故选D。
考点3 基因工程和蛋白质工程的应用
1.（2021·辽宁·高考真题）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。
利用蛋白质工程技术在N0的α 和β 亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。
下列有关叙述错误的是（ ）
A. N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B. 加入连接肽需要通过改造基因实现
C. 获得N1的过程需要进行转录和翻译
D. 检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
【答案】D
【分析】
1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，
对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上
只能生产自然界已存在的蛋白质）。
2、蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。
3、蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。基本
途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核
苷酸序列（基因）。
【详解】
A、在N0的α 和β 亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），则N1与N0氨基酸
序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A 正确；
B、蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B 正确；
C、N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C 正确；
D、酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D 错误。
故选D。
1.（2026·内蒙古呼和浩特·一模）T4 噬菌体基因编码的T4DNA 连接酶，可连接具有黏性末端和平末端的
DNA 分子，下列有关T4DNA 连接酶的叙述正确的是（ ）
A. 组成元素为C、H、O、N、P
B. 在T4 噬菌体的核糖体上合成
C. 能连接黏性末端和平末端，不具有专一性
D. 可降低DNA 分子间形成磷酸二酯键所需的活化能
【答案】D
【详解】
A、T4DNA 连接酶的本质为蛋白质，蛋白质的基本组成元素是C、H、O、N，多数不含P 元素，A 错误；
B、T4 噬菌体属于病毒，无细胞结构，不含有核糖体，B 错误；
C、酶的专一性指一种酶可催化一种或一类化学反应，T4DNA 连接酶只能催化DNA 片段间磷酸二酯键的形成，
虽然可连接两类末端，仍具有专一性，C 错误；
D、酶的作用机理是降低化学反应所需的活化能，DNA 连接酶的功能是催化DNA 片段间形成磷酸二酯键，因
此可降低该反应的活化能，D 正确。
2.（2026·辽宁辽阳·一模）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A. 利用酒精初步分离DNA 与蛋白质的原理是DNA 溶于酒精
B. 预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA 水解
C. DNA 粗提取时，通过离心研磨液可以加速DNA 的沉淀
D. 将DNA 丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴加热出现蓝色
【答案】B
【详解】
A、DNA 不溶于酒精，蛋白质等杂质可溶于酒精，该原理可用于初步分离DNA 与蛋白质，A 错误；
B、预冷的酒精溶液具有两个功能：第一，能抑制核酸水解酶活性，防止 DNA 水解；第二， DNA 不溶于
酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，因此利用酒精溶液可以将 DNA 析出，B 正确；
C、粗提取DNA 时，离心研磨液的作用是去除细胞碎片等不溶性杂质，DNA 溶解于上清液中，并非加速DNA
沉淀，C 错误；
D、DNA 与二苯胺试剂反应需要DNA 处于溶解状态，应先将DNA 丝状物溶解在2mol/L 的NaCl 溶液中，再加
入二苯胺试剂沸水浴，直接加入DNA 丝状物无法充分反应，不会出现蓝色，D 错误。
3.（2026·黑龙江齐齐哈尔·一模）冠瘿是植物被农杆菌感染后根部长出的肿瘤（如图1 所示），冠瘿的
形成与天然农杆菌的Ti 质粒（如图2 所示）有关，其中Vir 基因编码的产物可激活T-DNA 转移。下列相关
叙述正确的是（ ）
A. 长出冠瘿的植物根部某些植物激素水平较高
B. T-DNA 区域的基因可在植物细胞的细胞质基质中复制、转录、翻译
C. 若用Ti 质粒作为基因的载体，可将目的基因插入Vir 基因的内部
D. 若利用农杆菌进行基因工程转化，需将其Ti 质粒上的所有基因去掉
【答案】A
【详解】
A、冠瘿是植物被农杆菌感染后根部长出的肿瘤，冠瘿的形成与天然农杆菌的Ti 质粒，该质粒可将T-DNA
转移到受体细胞的染色体DNA 上，T-DNA 中含有生长素合成酶基因和细胞分裂素合成酶基因，这些基因表
达会使植物细胞中生长素和细胞分裂素含量升高，而生长素和细胞分裂素能促进植物组织异常增殖形成肿
瘤（冠瘿） ，因而推测，长出冠瘿的植物根部某些植物激素水平较高，A 正确；
B、T-DNA 区域的基因会转移到受体细胞的染色体DNA 上，因而在植物细胞的细胞核中复制、转录，但翻译
过程发生在细胞质基质中的核糖体上，B 错误；
C、Vir 基因编码的产物可激活T DNA
−
转移，若将目的基因插入Vir 基因内部，会破坏Vir 基因的结构，使
其不能编码激活T DNA
−
转移的产物，导致T DNA
−
无法转移，所以目的基因不能插入Vir 基因内部，而应插
入T DNA
−
区域 ，C 错误；
D、若利用农杆菌进行基因工程转化，不需要将其Ti 质粒上的所有基因去掉，只需要去除Ti 质粒上的T -
DNA 区域中的致瘤基因（生长素合成酶基因和细胞分裂素合成酶基因等），保留T - DNA 的边界序列以及
Vir 基因等必要元件，以便将目的基因插入T - DNA 区域并借助Vir 基因激活T - DNA 转移，D 错误。
4.（2026·黑龙江齐齐哈尔·二模）为鉴定目的基因是否正确插入质粒中，某同学准备设计引物进行PCR
鉴定，如图所示为a、b、c3 种引物在正确重组质粒中的相应位置，Tet
R为四环素抗性基因。下列说法错误
的是
A. 可选择引物a 和c 进行扩增，来判断目的基因是否插入到质粒中
B. 可选择引物b 和c 进行扩增，来判断目的基因是否正确插入质粒中
C. 选择引物a 和b 进行扩增，若扩增产物约为650 bp，说明基因反向插入质粒中
D. 将质粒导入大肠杆菌后，若表现出四环素抗性，说明导入的质粒含有目的基因
【答案】D
【详解】
A、选择引物a 和c 进行扩增，若扩增产物约为750bp，说明目的基因插入质粒中，A 正确；
B、选择引物b 和c 进行扩增，若扩增产物约为600bp，说明目的基因正确插入到质粒中，B 正确；
C、选择引物a 和b 进行扩增，若目的基因反向插入质粒中，扩增产物约为650bp，C 正确；
D、将质粒导入大肠杆菌后，若表现出四环素抗性，说明大肠杆菌含有质粒，但无法确定是空载质粒，还
是含有目的基因的重组质粒，D 错误。
5.（2026·内蒙古包头·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（ ）
A. PCR 扩增DNA 片段时DNA 双链的解聚原理与细胞内相同
B. 耐高温的DNA 聚合酶可直接在模板链的3′端从头合成子链
C. 电泳可鉴定不同长度的DNA 分子是因为它们在凝胶中的迁移速率不同
D. 染色后的凝胶条带的位置可以反映DNA 分子碱基序列的组成
【答案】C
【详解】
A、细胞内DNA 双链解聚依赖解旋酶断裂氢键，PCR 扩增时DNA 双链解聚依赖高温使氢键断裂，二者原理不
同，A 错误；
B、耐高温的DNA 聚合酶不能从头合成子链，只能从引物的3′端开始延伸子链，反应体系中需要加入引物
才能启动子链合成，B 错误；
C、DNA 分子带负电，在电场作用下向正极迁移，不同长度的DNA 分子在凝胶中的迁移速率不同（分子量越
小迁移速率越快），因此可通过电泳分离鉴定不同长度的DNA 分子，C 正确；
D、染色后的凝胶条带的位置仅反映DNA 分子的分子量（长度）大小，无法反映DNA 分子的碱基序列组成，
D 错误。
6.（2026·辽宁锦州·一模）二化螟和田间杂草极大影响了稻米的产量和品质，科学家利用转基因技术将
抗虫（cry1C）基因和抗草甘膦（EPSPS）基因成功转入水稻细胞中，并利用Cre/loxP 重组酶系统特异性
删除种子胚乳中的外源基因，获得了胚乳中无外源基因的抗虫、抗除草剂转基因水稻。转基因水稻的部分
培育过程如图1 所示。
Cre/loxP 重组酶系统由Cre 重组酶和loxP 位点组成，多基因串联体左侧loxP 位点的部分序列如图2 所示。
当DNA 分子中存在两个相同的loxP 序列且同向时，Cre 重组酶能特异性识别并删除两个位点间的DNA 序列。
注：LB、RB：多基因串联体左右边界序列，Kanr：卡那霉素抗性基因，PstI、SacI、EcoRI：限制性核酸内
切酶
（1）启动子与起始密码子发挥作用的阶段分别在基因表达的 阶段、 阶段。
（2）结合图2 信息，为删除两个loxP 位点间的DNA 序列，多基因串联体右侧loxP 位点间隔区的编码链序
列为5’- -3’。
（3）人类食用的精米主要是由水稻种子的胚乳加工制成，二化螟主要通过钻蛀叶鞘、叶心、茎秆等绿色
组织而危害水稻。结合题干信息，为实现水稻中外源基因的精准表达与特异性删除，启动子1、2、3 分别
为 、 、 。（编号选填）。
①胚乳特异性启动子②绿色组织特异性启动子③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性）
（4）为使多基因串联体与质粒PC1300Z 高效连接，需在其两侧添加 的识别序列。
（5）转基因水稻To 培育过程中，过程III 中诱导生根时，培养基中要适当增加 的
浓度。
（6）为评估外源基因的敲除是否具有组织特异性，科研人员分别提取转基因水稻各组织细胞的总RNA，通
过RT - PCR（是以mRNA 为模板进行的特殊PCR）和凝胶电泳检测各细胞中不同基因的表达情况。结果如表
所示，“+”表示“表达”，“-”表示“不表达”。表格结果中分别符合目标水稻的根细胞及胚乳细胞的
是 。（编号选填）
编号
cry1C 基因
EPSPS 基因
①
-
+
②
+
-
③
+
+
④
-
-
【答案】（1）① 转录 ② 翻译 （2）ATGTATGC （3）① ① ②
② ③ ③ （4 ）SacI 的识别序列、PstI 的识别序列 （5 ）生长
素 （6）①④
(1)小问详解：
启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，进而驱动转录过程，起始密码子是翻译的起点，即二者分别在基
因表达的转录阶段、翻译阶段起作用。
(2)小问详解：
Cre/loxP 重组酶系统由Cre 重组酶和loxP 位点组成，多基因串联体左侧loxP 位点的部分序列如图2 所示。
当DNA 分子中存在两个相同的loxP 序列且同向时，Cre 重组酶能特异性识别并删除两个位点间的DNA 序列。
题目要求删除两个loxP 位点间的DNA 序列，说明两个loxP 方向相同。左侧loxP 的间隔区模板链为5'-
GCATACAT-3'，所以右侧loxP 位点间隔区的编码链序列为5'-ATGTATGC-3'。
(3)小问详解：
启动子1 对应Cre 酶基因，要在胚乳中切除外源基因，避免人类食用的潜在危害，应为胚乳特异性启动子。
二化螟主要通过钻蛀叶鞘、叶心、茎秆等绿色组织而危害水稻，启动子2 对应抗虫基因，应为绿色组织特
异性启动子；启动子3 对应抗草甘膦（EPSPS）基因，应为组成型启动子（在所有组织中都能保持活性），
使所有组织抗草甘膦。
(4)小问详解：
质粒PC1300Z 上有SacI、PstI 的酶切位点，而EcoRI 位点可能破坏质粒关键结构/标记基因，因此多基因
串联体两侧需添加SacI 和PstI 的识别序列，才能与酶切后的质粒高效连接。
(5)小问详解：
转基因水稻To 培育过程中，过程III 中诱导生根时，培养基中要适当增加生长素的浓度，因为生长素能促
进生根。
(6)小问详解：
题干要求实现胚乳中删除外源基因，绿色组织（根/茎/叶）保留并表达外源基因。根细胞：cry1C 不表达，
EPSPS 表达，对应表格中①（-、+）；胚乳细胞：Cre 重组酶切除外源基因，两个基因均不表达，对应表
格中④（-、-）。因此符合目标水稻的根细胞及胚乳细胞的是①④。
7.（2026·黑龙江哈尔滨·一模）（多选）CRISPR/Cas12a 系统是由crRNA 和Cas12a（Cpf1）蛋白形成的
复合体。crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA 序列，引导Cas12a 蛋白到相应位置剪切DNA。低温适应性
的荧光假单胞菌可引发乳制品腐败变质。科研人员结合PCR 扩增技术与CRISPR/Cas12a 系统建立一种荧光
检测方法，用于乳制品中荧光假单胞菌的快速检测。图1 是CRISPR/Cas12a 系统的工作原理示意图。回答
下列问题。
（1）据题意推测，CRISPR/Cas12a 系统的功能类似于______（多选）。
A. 解旋酶
B. DNA 连接酶
C. DNA 聚合酶
D. 限制性内切核酸酶
（2）在CRISPR/Cas12a 系统中，crRNA 序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含
种核苷酸。PCR 每次循环一般分三步，其中 需要降温，该过程的目的是
。
（3）研究人员设计了针对荧光假单胞菌aprX 基因序列的7 对PCR 引物并进行筛选，电泳结果如图2
（A），引物对 能产生特异性扩增条带。使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物，DNA 分子的迁
移速率与 有关。对初筛中表现良好的引物对，使用包括荧光假单胞菌在内的3 种不同细菌的
DNA 进行PCR 扩增，验证其特异性，结果如图2（B）所示。请结合两张电泳图，确定本实验应选择
作
为
荧
光
假
单
胞
菌
PCR
扩
增
引
物
，
给
出
选
择
的
理
由
。
注：M-DNA 分子量标准（Marker）；Blank-空白组（不加荧光假单胞菌基因组）；1-单独的荧光假单胞
菌基因组。图2（A）：2-8 依次对应7 对引物：F1R1 至F7R7。图2（B）：2-金黄色葡萄球菌；3-大肠
杆菌。
（4）为检测模拟荧光假单胞菌污染的巴氏杀菌乳样品，研究人员对已建立的PCR 和CRISPR/Cas12a 荧光
检测技术的性能进行可靠性评估。可采用 法对相同样品进行计数检测。
【答案】（1）AD （2）① 8##八 ② 复性 ③ 使两种引物通过碱基互补配对与
两条单链DNA 结合 （3）① F2R2、F4R4、F7R7 ② 凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构
象、DNA 电泳速度，电泳缓冲液浓度，电压（答对一点即可） ③ F2R2 ④ 从图2（A）
可知：具有有效扩增能力；扩增效率高（F2R2 引物对的扩增条带信号宽度明显高于F4R4 和F7R7）；产物
大小与预期目标片段相符（F2R2 扩增产物约为250bp）。从图2（B）可知：特异性强 （4）稀
释涂布平板##涂布平板
(1)小问详解：
CRISPR/Cas12a 系统能在crRNA 引导下剪切DNA 特定位置，其功能类似于限制性内切核酸酶（剪切DNA）和
DNA 解旋酶（解开双链便于识别和切割），因此选AD。
(2)小问详解：
crRNA 是RNA，由4 种核糖核苷酸组成；目的基因是DNA，由4 种脱氧核糖核苷酸组成。两者在结合区域通
过碱基互补配对结合，因此该区域最多含8 种核苷酸。PCR 每次循环一般分三步：变性（高温）、复性
（降温）、延伸（中温），其中复性需要降温。复性降温的目的是使两种引物与模板DNA 单链通过碱基互
补配对特异性结合。
(3)小问详解：
根据题干说明，图 2 (A) 中泳道2-8 依次对应引物对F1R1 至F7R7，PCR 特异性扩增要求仅出现一条清晰
的目标条带，泳道2（F1R1）出现两条杂带为非特异性扩增，泳道4、6、7 无明显条带为扩增失败，只有
泳道3、5、8（对应 F2R2、F4R4、F7R7）各有一条清晰的特异性条带，因此这三对引物能产生特异性扩增
条带。琼脂糖凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象、电泳缓冲液浓度、
电压等有关，通常分子越小迁移越快。结合图 2（A）扩增结果可知，F2R2 具有有效扩增能力，且扩增条
带信号宽度明显高于F4R4 和F7R7，扩增效率更高，其扩增产物大小约为250bp，与预期目标片段相符；结
合图 2（B）特异性检测结果可知，F2R2 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等非目标菌无扩增条带，特异性强。
因此本实验应选择F2R2 作为荧光假单胞菌PCR 扩增引物。
(4)小问详解：
为对模拟污染的巴氏杀菌乳样品中的荧光假单胞菌进行计数检测，可采用稀释涂布平板法（或涂布平板
法）进行计数，该方法能统计样品中的活菌数量。
8.（2026·内蒙古呼和浩特·一模）腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA 缺陷型非包膜病毒，是临床基因
治疗广泛使用的载体。Otof 基因（6kb）编码R 蛋白，突变可导致常见先天性耳聋。中外科研人员利用AAV
双载体系统递送人源正常Otof 基因，通过基因工程技术治疗先天性耳聋取得显著疗效。请分析回答：
（1）体外可利用 技术扩增Otof 基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺
点是感染率和成活率低。
（2）Otof 基因和AAV 基因组如图1、图2 所示，单个AAV 能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为
可选择的酶切位点，则图1 需要将Otof 基因拆分为大小分别为 的5′-Otof 和Otof-3′
片段，分别装入AAV 载体形成AAV 重组载体1 和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载
体中需包括启动子和 等序列。
（3）重组载体1 和2 共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2 表达Cre 酶切割重组载体1 和
2 中的lox 位点，产生黏性末端，实现两段DNA 精准对接。若重组载体1 中lox 序列如图4，则重组载体2
的lox 序列可否为图5 所示序列，请说明理由 。
（4）为了使R 蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1 应选择 （填器官名称）部细胞
中特异性表达基因的启动子。为减少Cre 酶对受体细胞的其他影响，重组载体2 的启动子应选择
（填“强”或者“弱）启动子。
（5）若要从个体水平检测Otof 基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof
基因敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV 双载体，对 （答出一种即可）进行检测，以确
定Otof 基因在受体细胞中重组并表达。
【答案】（1 ）PCR （2 ）① 3.5kb 和2.5kb （顺序可以互换） ② 终止
子 （3）否，因为经Cre 酶切后5’-Otof 的片段与含3’-Otof 片段的黏性末端没有碱基互补配
对，无法连接（能够与含5’-Otof 片段黏性末端连接的不是含3’-Otof 的片段；能够与含3’-Otof 片段
黏性末端连接的不是含5’-Otof 的片段） （4）① 耳 ② 弱 （5）听觉功
能（听力）
(1)小问详解：
体外可利用PCR 技术扩增Otof 基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺点是感染率和成活率
低，因而需要改进相应的方法。
(2)小问详解：
Otof 基因和AAV 基因组如图1、图2 所示，单个AAV 能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为可选择
的酶切位点，则图1 需要将Otof 基因拆分为大小分别为3.5kb 和2.5kb 的5′-Otof 和Otof-3′片段，分
别装入AAV 载体形成AAV 重组载体1 和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载体中需包
括启动子和终止子等序列，保证目的基因的顺利表达。
(3)小问详解：
重组载体1 和2 共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2 表达Cre 酶切割重组载体1 和2 中
的lox 位点，产生黏性末端，实现两段DNA 精准对接。若重组载体1 中lox 序列如图4，则重组载体2 的
lox 序列不能为图5 所示序列，因为经Cre 酶切后<5’-Otof 的片段与含3’-Otof 片段的黏性末端没有碱
基互补配对，无法连接。
(4)小问详解：
为了使R 蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1 应选择耳部细胞中特异性表达基因的启动子，该操作
可以保证目的基因在特定部位的表达。为减少Cre 酶对受体细胞的其他影响，重组载体2 的启动子应选择
弱启动子，避免对受体细胞其他部位的基因产生切割。
(5)小问详解：
若要从个体水平检测Otof 基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof 基因
敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV 双载体，对听觉功能（听力）进行检测，进而检测Otof 基因在受体细
胞中是否进行重组并表达。
9.（2026·辽宁辽阳·一模）通过研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成可
以更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1 基因，通过基因工程将Ers1 基因
反向连接在启动子后，筛选转入反义Ers1 基因的草莓，达到延长储藏期的效果。回答下列问题：
（1）使用相关技术获得DNA 后，需要通过PCR 技术进行扩增Ers1 基因（如图）。为使目的基因与质粒连
接，在设计PCR 引物扩增Ers1 基因时需添加限制酶XhoI（识别序列为5′－CTCGAG－3′）的识别序列。
已知Ers1 基因左端①处的碱基序列为－TTCCAATTTTAA－，则其中一种引物设计的序列是5′－
－3′。PCR 技术扩增出Ers1 基因，该技术的原理为 。在PCR 反应体系中因参与反应不断消
耗而浓度下降的组分有 （答出两点即可）。
（2）采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物时，在凝胶中DNA 分子的迁移速率与DNA 分子大小呈
（填“正相关”或“负相关”），此外DNA 分子的迁移速率还与 （答两点）等有关。
（3）应将Ers1 基因反向连接到质粒的 之间。将筛选得到的反向连接质粒与Ca²⁺处理过的农
杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成转化实验。农杆菌转化后的植物组织，应在添加了
的固体培养基上培养筛选。
（4）转入反义Ers1 基因的草莓，乙烯受体的合成受阻，可达到延长储藏期的效果，其原因是
。
【答案】（1 ）① CTCGAGTTCCAATTTTAA ② DNA 半保留复制 ③ 引物和脱氧核苷
酸 （2）① 负相关 ② DNA 分子构象、凝胶浓度 （3）① 启动子和潮霉素抗
性基因 ② 潮霉素 （4）Ers1 基因的转录产物与反义Ers1 基因转录的产物碱基互补配
对，使得翻译过程受阻
【分析】
1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受
体细胞；目的基因的检测与表达。
2、基因工程的工具：限制酶、DNA 连接酶和载体。
(1)小问详解：
限制酶 XhoⅠ 识别序列为5'-CTCGAG-3'，需将其添加在Ers1 基因左端序列TTCCAATTTTAA-的 5' 端，故
引物序列为：5′－CTCGAGTTCCAATTTTAA－3′。PCR 技术的原理是DNA 半保留复制，通过高温变性、低温
退火、适温延伸的循环，在体外快速扩增特定 DNA 片段。反应中不断被消耗的组分有：引物（与模板结
合并延伸，循环中逐渐被消耗）、脱氧核苷酸（作为合成新 DNA 链的原料）、Taq 酶（虽耐高温但多次
循环后活性下降，浓度相对降低）。
(2)小问详解：
在凝胶中，DNA 分子大小与迁移速率呈负相关—— 分子越大，迁移阻力越大，速率越慢；分子越小，迁
移速率越快。除分子大小外，还与DNA 分子构象（如超螺旋、线性、开环，迁移速率不同）、凝胶浓度
（浓度越高，孔径越小，阻力越大，迁移越慢）、电场强度（电压越高，迁移越快）、缓冲液离子强度等
有关。
(3)小问详解：
需将反义Ers1 基因反向连接到质粒的启动子和终止子之间（图中为启动子与潮霉素抗性基因之间，潮霉
素抗性基因下面有终止子结构），保证目的基因能被正常转录。质粒含潮霉素抗性基因，故植物组织应在
添加了潮霉素的固体培养基上培养，筛选出成功导入重组质粒的细胞。
(4)小问详解：
由题意可知，通过基因工程将Ersl 基因反向连接在启动子后，筛选转入反义Ersl 基因的草莓，达到延长
储藏期的效果，说明得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻，其原因是反义Ers1 基因的转录产物与Ersl
基因的转录产物碱基互补配对，使得翻译过程受阻。
10.（2026·黑龙江齐齐哈尔·一模）利用Golden Gate 构建基因表达载体的原理是利用TypeⅡs 型限制酶
（如BsaⅠ）的酶切位点在识别序列之外的特性，使重组DNA 分子上不会留下使用的酶切位点，这样就可
以在同一反应体系中进行酶切和片段连接，且可以通过设计自定义序列（NNNNN）同时进行多片段的有序
连接。镉是水体污染中常见的重金属元素，为治理水体中的镉污染，研究人员将镉离子结合蛋白基因
CADR、黄色荧光蛋白基因YFP 利用Golden Gate 法融合并接入质粒，转入莱茵衣藻细胞后利用含镉培养液
进行培养。质粒构建过程如图所示（RFP 表示红色荧光蛋白基因），请回答下列问题。
（1）重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有 （写出一项）。利用BsaⅠ
切割时DNA 分子的 键发生断裂，形成黏性末端；理论上利用BsaⅠ切割后最多可以产生
种黏性末端。若要在同一反应体系中完成载体构建，除BsaⅠ酶外，还需要在反应体系中加入
。
（2）为保证目的基因与载体正确连接且重组质粒上不保留酶切位点，研究人员需要设计不同的BsaⅠ切
割位点，若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'-CCATGGAGACC-3'，则CADR 基因左侧切割后
形成的黏性末端序列为5'- -3'（写出同一单链碱基）。
（3）构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶作用底物的是 。
（4）为筛选构建成功的重组载体，用酶切并连接处理后的DNA 分子转化靶细胞，培养一段时间后在荧光
显
微
镜
下
观
察
，
观
察
到
部
分
发
红
色
荧
光
的
细
胞
，
原
因
是
。若通过培养，观察到某细胞株系发出黄色荧光， （填“能”或“不能”）确定该株系适合
用于镉污染治理。
【答案】（1）① 标记基因 ② 磷酸二酯 ③ 256 ④ DNA 连接酶 （2）
5'-CCAT-3' （3）D （4）① 未插入CADR/YFP 的目的基因的空载体，RFP 基因正常表
达 ② 能
【分析】
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新
的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 分子水平进行设计和施工的，因此又
叫重组DNA 技术。
(1)小问详解：
重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有标记基因、复制原点。BsaⅠ属于限制酶切割
DNA 分子，断裂DNA 分子磷酸二酯键。由于BsaⅠ黏性末端含有4 个随机碱基（NNNN），每种位置有4 种可
能，故最多能产生44=256 种黏性末端。表达载体的构建需要使用DNA 连接酶、限制酶等工具酶。
(2)小问详解：
若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'-CCATGGAGACC-3'，BsaⅠ切割产生的黏性末端是3'-
GGTA-5'，则CADR 基因左侧切割后形成的黏性末端序列为5'-CCAT-3'。
(3)小问详解：
脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH 位于3'端，ABC 脱氧核苷酸两端的基团有误，DNA 连接酶是连接两
个相同的DNA 片段，即催化一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH 与另一脱氧核苷酸链的5'端的磷酸基团形成磷
酸二酯键，故选D。
(4)小问详解：
部分细胞仅导入未插入CADR/YFP 的目的基因的空载体，RFP 基因正常表达，但CADR 和YFP 未插入，故仅
发红色荧光。若观察到黄色荧光，即CADR 与YFP 均正确插入并转录翻译，说明该体系具备镉抗性及报告功
能，能用于镉污染治理。
11.（2026·吉林·一模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高
温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了耐热性强的淀粉
酶AmyS2 基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1 所示。回答下列问题。
（1）科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27 位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶
（AmyS2），其研究基本思路如下：预期AmyS2 功能→设计目标蛋白的结构→ →找到并
改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）→将获得的基因导入芽孢杆菌生产AmyS2，要替换蛋白质基因中相
对应的碱基可以采用 法。
（2）根据图2 分析，利用PCR 技术扩增AmyS2 基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的
。若将1 个基因扩增4 次，共需要引物 个。
（3）将AmyS2 基因与原始质粒A 构建成质粒B，应选择的限制酶是 ；将质粒B 与信号肽
基因构建成质粒C，应选择的限制酶是 。
（4）信号肽是一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链。据此推测，与质粒B 相比，在工业生产中
使用导入质粒C 的工程菌生产α-淀粉酶的优势是 ，从发酵液中可采取适当的
措施来获得产品。
【答案】（1 ）① 氨基酸序列 ② 定点突变 （2 ）① 乙、丙 ②
30 （3）① NdeI 和EcoRI ② MluI 和Eco52I （4）① 更容易从培养液中获取
并提纯目标蛋白质 ② 纯化
【分析】
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造
现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出
来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。
(1)小问详解：
蛋白质工程通常是根据人们对蛋白质功能的特殊要求，对蛋白质的结构进行分子设计，最终通过基因完成，
故基本流程是：预期蛋白质功能→蛋白质分子结构设计→推测氨基酸序列多肽链→据核苷酸序列推出脱氧
核苷酸序列→DNA 合成。本实验利用蛋白质工程对淀粉酶（AmyS2）进行了如下改造：预期AmyS2 的功能→
设计AmyS2 的结构→设计AmyS2 的氨基酸序列→人工合成AmyS2 基因的脱氧核苷酸序列→将获得的AmyS2
基因导入芽孢杆菌生产AmyS2；要替换蛋白质基因中特定碱基，通常采用 定点突变技术，该方法允许在已
知DNA 序列的特定位点引入精确的碱基替换，从而实现对编码氨基酸序列的定向改造。
(2)小问详解：
PCR 扩增目的基因时，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸子链。据图分析可知，扩增AmyS2 基因时，应选择
引物乙、丙。若扩增4 次，会产生16 个DNA，32 条链，其中2 条链是原来的母链不需要引物，所以需要30
个引物。
(3)小问详解：
目的基因上只有BamHI、NdeI 和EcoRI 识别序列，若用BamHI 进行切割，会破坏AmyS2 基因，因此选择
NdeI 和EcoRI 进行切割。根据质粒C 的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B 与信号肽基因构
建成质粒C，应选择的限制酶是MluI 和Eco52I。
(4)小问详解：
信号肽是一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链，在工业生产中，使用导入质粒C 的工程菌生产
α-淀粉酶时，更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质；从发酵液中可采取适当的分离纯化的措施来获
得产品，如吸附法获得产品。
12.（2026·辽宁·二模）在植物基因工程研究中，准确鉴定启动子的时空表达特性至关重要。研究人员
构建了RFP/GFP 双荧光载体，过程如下：
注：Hind Ⅲ、Pst Ⅰ、Xba Ⅰ、Sac Ⅰ、EcoR Ⅰ为限制酶切位点，切口都位于其中轴线的两侧；CaMV
35S 为组成型启动子，在大多数组织和细胞中都能高效表达；GFP 为绿色荧光蛋白基因；RFP 为红色荧光蛋
白基因；Nos 为终止子。
（1）构建双荧光载体的过程中，去除载体1 中Xba Ⅰ和Sac Ⅰ位点，目的是 。T4
DNA 聚合酶具有 （填“5′→3′”或“3′→5′”）聚合酶活性，将限制酶切割
产生的黏性末端补平为平末端，操作步骤一、二中选用的限制酶为：① ②
；操作步骤三中优选用 （填“E.coli”或“T4”）DNA 连接酶进行连接反应。
（2）研究人员欲利用RFP/GFP 双荧光载体验证番茄E8 启动子是果实特异性启动子，利用PCR 技术扩增E8
启动子片段时，为便于其与RFP/GFP 双荧光载体正确连接，应在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列
（如图），其中对引物Ⅰ应添加 识别序列，进行PCR 时复性温度过高，可能导
致 。
（3）将得到的E8 启动子与双荧光载体连接得到E8-RFP/GFP 载体，导入相应受体细胞，实验方案如下：
组别
载体
受体材料
预期结果
A
RFP/GFP 双荧光载体
果实细胞
绿色荧光+，红色荧光+
B
E8-RFP/GFP 载体
果实细胞
？
C
E8-RFP/GFP 载体
叶肉细胞
？
①设置A 组实验的具体作用是 。
②完善上表中的预期结果（用“+”表示有荧光，“-”表示无荧光）
（4）在植物基因工程中，RFP/GFP 双荧光载体除用于研究启动子时空表达的特异性，还有多项潜在应用
价值，下列三项有关应用正确的是________。
A. 通过比较RFP 与GFP 的荧光强度比值，定量分析启动子的驱动活性
B. 可用目的基因置换载体中RFP，通过红色荧光对目的蛋白进行定位
C. 通过启动子研究基因表达的时空模式，可揭示植物发育的调控机制
【答案】（1 ）① 防止后续构建过程中GFP 基因被意外切割 ② 5'→3' ③ Hind
Ⅲ ④ EcoR Ⅰ ⑤ T4 （2）① Xba Ⅰ ② 引物无法与模板结合，PCR
扩增效率降低或失败 （3）① 绿色荧光+，红色荧光+ ② 绿色荧光+，红色荧
光- ③ 作为阳性对照，证明载体系统和检测方法的有效性；证明RFP 基因本身可以正常表
达 （4）AC
(1)小问详解：
利用载体1 和载体2 构建RFP/GFP 双荧光载体时，去除载体1 中XbaⅠ和SacⅠ位点是为了防止后续构建
过程中GFP 基因被意外切割，以保持GFP 表达体系的完整性，在后续应用中能够表达绿色荧光蛋白，使其
作为阳性对照。利用PstⅠ酶切后，载体1 呈链状且两端露出黏性末端，利用T4DNA 聚合酶将游离的脱氧
核糖核苷酸连在与黏性末端互补的子链上，从而补齐成为平末端，因此T4DNA 聚合酶具有5′→3′聚合酶
活性。在利用HindⅢ酶切后，载体1（链状）一端为平末端，一端为HindⅢ酶切后的黏性末端；同理对
载体2，先用EcoRI 切割、再用T4DNA 聚合酶补齐、最后用HindⅢ酶，可使RFP 表达体系一端为平末端，
一端为HindⅢ酶切后的黏性末端，由于T4 DNA 连接酶连接平末端的效率较高，因此在步骤三中被选用。
(2)小问详解：
欲利用RFP/GFP 双荧光载体验证番茄E8 启动子是果实特异性启动子，需用E8 启动子替换RFP 上游的CaMV
35S 启动子，为保证正确连接，需要用到双酶切法，结合（2）中的图示，应在引物Ⅰ的5′端添加XbaⅠ
识别序列。复性时，引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，若温度过高，引物无法与模板结合，
PCR 扩增效率降低或失败。
(3)小问详解：
CaMV 35S 为组成型启动子，在大多数组织和细胞中都能高效表达，A 组作为阳性对照，可以通过检测细胞
在相应条件下产生的荧光判断载体系统的有效性，亦可证明RFP 基因本身可以正常表达。因为E8 启动子是
果实特异性启动子，在果实细胞中能够同时启动RFP 和GFP 基因的表达，因此B 组预期结果为绿色荧光+、
红色荧光+；在叶肉细胞中，E8 启动子无法启动RFP 基因表达，但GFP 基因的表达由CaMV 35S 启动子驱动，
因此C 组预期结果为绿色荧光+、红色荧光-。
(4)小问详解：
A、置换RFP 上游的CaMV 35S 启动子，通过RFP 与GFP 的荧光强度比值，定量分析启动子的驱动活性，A 正
确；
B、用目的基因置换载体中RFP，此时红色荧光消失，无法通过红色荧光对目的蛋白进行定位，B 错误；
C、通过启动子研究基因表达的时空模式，可揭示植物发育的调控机制，因为不同启动子驱动基因在特定
时间、特定组织中表达，有助于解析发育过程中的分子调控网络，C 正确。
13.（2026·黑龙江哈尔滨·二模）T4 溶菌酶可溶解细菌的细胞壁，干扰细菌正常的生理代谢，常被用于
医药、食品、农业等领域。但其在较高温度下容易失去活性，科学家利用PCR 定点突变技术改造T4 溶菌酶
基因的结构，使表达的溶菌酶第3 位的异亮氨酸变为半胱氨酸，从而提高热稳定性。回答下列问题。
（1）图1 中拟突变位点①②对应的碱基分别是 。在图2 所示的基因改造方案中应对引物
（填“1”或“2”）替换碱基。
（2）扩增改造后的T4 溶菌酶基因时，PCR 仪中需要添加模板、4 种脱氧核苷酸、引物、 和缓
冲液。缓冲液中一般加入Mg2+，原因是 。
（3）分析图2 和图3，为保证改造后的T4 溶菌酶基因正确插入质粒中，应在引物1 的 （填
“3 端”或“5’端”）加上 酶的识别序列。
（4）科学家将构建的基因表达载体采用 法导入植物叶片，以获得抗细菌植物。
利用GUS 基因初步检测T4 溶菌酶基因是否导入成功。具体操作步骤如下：首先将植物叶片放在酒精中，然
后用洗涤缓冲液冲洗，最后用X-GLuc 溶液浸没植物叶片，一段时间后选取出现
现象的叶片进行下一步的检测和鉴定。这一方法在检测T4 溶菌酶基因是否导入植物细胞中的优势是
。后续鉴定转T4 溶菌酶基因植物能否在较高温度下抗细菌的实验思路是 。
（5）科学家将该抗细菌基因导入水稻，培育出抗细菌性条斑病的转基因水稻品种。请从环境保护角度，
分析该研究成果的实际应用价值有 （答出一点）。
【答案】（1）① A 和C ② 2 （2）① 耐高温的DNA 聚合酶 ② 激活DNA 聚合
酶 （3 ）① 5' ② SpeI （4 ）① 农杆菌转化 ② 蓝色沉
淀 ③ GUS 作为报告基因，检测灵敏、直观，通过蓝色沉淀可快速初步筛选转化成功的组织，无需
复杂设备，适合大规模筛选 ④ 在较高温环境条件下向转基因植物接种细菌 （5）减少
化学农药的施用，降低农药对土壤、水源的污染，保护农田生态系统；减少对非靶标生物的伤害，维护生
物多样性，促进农业可持续发展
(1)小问详解：
半胱氨酸的密码子是UGU，密码子与DNA 模板链碱基互补配对，可推得DNA 模板链对应序列为ACA，因此拟
突变位点①为A、②为C；根据引物结合的位置（结合在模板链的3'端）可知，b 链（转录模板链）右侧为
3'端即基因的上游，而定点突变的是第3 位氨基酸，所以应该是与上游配对结合的引物2 替换突变碱基。
(2)小问详解：
PCR 扩增的反应体系需要模板、4 种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA 聚合酶（Taq 酶）和缓冲液；Mg2+是
Taq 酶的激活剂，激活Taq 酶的活性，因此缓冲液中需要添加Mg2+。
(3)小问详解：
DNA 合成时引物从3′端开始延伸，额外的限制酶识别序列需要添加在不影响延伸的5′端；结合质粒图谱，
目的基因需要插入启动子下游，启动子后第一个酶切位点（上游）是NcoⅠ第二个酶切位点（下游）是
SpeI，因此引物1（下游引物）的5′端需要加上SpeI 的识别序列。
(4)小问详解：
将重组的基因表达载体导入植物叶片常用农杆菌转化法；GUS 基因的表达产物能水解X-GLuc 产生蓝色沉淀，
因此导入成功的叶片会出现蓝色沉淀；该检测方法的优势是GUS 作为报告基因，检测灵敏、直观，通过蓝
色沉淀可快速初步筛选转化成功的组织，无需复杂设备，适合大规模筛选；功能鉴定实验需要在较高温度
条件，接种细菌后观察植株的发病情况即可验证。
(5)小问详解：
从环境保护角度，转基因抗细菌水稻可以减少防治病害的化学农药用量，降低农药造成的环境污染，保护
生态环境；减少对非靶标生物的伤害，维护生物多样性，促进农业可持续发展。
14.（2026·黑龙江齐齐哈尔·二模）利用工程菌表达重组蛋白时，蛋白质常以未折叠和无活性的包涵体
形式积累。研究人员将乳糖酶基因LacZ(3075 bp)构建至自剪切型表达载体pTWIN1(注：CBD、Ssp DnaB 与
LacZm 形成融合基因CSL，其中CBD 编码的标签蛋白具有几丁质结合活性。Ssp DnaB 编码内含肽，具有自
我切割能力，能在特定条件下将自身与目标蛋白切割开)，其构建过程如图所示。构建完成后，将重组质
粒转入大肠杆菌，经诱导表达、纯化，制备无标签乳糖酶。回答下列问题。
（1）启动子位于基因的上游，是 识别和结合的部位，图中将基因表达载体导入
大肠杆菌的方法是用 处理大肠杆菌细胞，使其处于一种
的生理状态。
（2）研究人员首先对乳糖酶基因(LacZ)进行了扩增，为保证LacZ 基因能与质粒pUC18 正确连接，设计引
物时需要在图中LacZ 基因左右两侧引物的5＇端分别添加 的识别序列。原LacZ
基因中含有一个Bam H Ⅰ切割位点序列GGATCC，通过引物设计将其替换为GAGTCC，获得了基因LacZm，
其编码的氨基酸与LacZ 相同，原因是 。
（3）将基因LacZm 用限制酶酶切后与克隆载体pUC18 进行重组，进而构建至表达载体pTWIN1 中，从而获
得原核表达重组质粒pTWIN1-LacZm。对重组质粒pTWIN1-LacZm 进行双酶切，然后电泳，得到的结果如图
所示(泳道1 为分子量Marker，泳道2 为pTWIN1-LacZm 酶切产物，泳道3 为未酶切的pTWIN1-LacZm)。电
泳图中代表LacZm 基因的条带是 (填“a”“b”或“c”)。未酶切重组质粒分子
量大于其酶切产物，然而电泳图谱显示结果却相反，其原因是 。
（4）将重组质粒pTWIN1-LacZm 导入大肠杆菌，经诱导表达后，破碎细胞、离心、收集上清，制得粗酶液。
然后利用几丁质亲和吸附柱对粗酶液进行纯化，纯化后乳糖酶位于吸附柱；加入裂解液，在特定条件下诱
导融合蛋白进行自剪切，目的是 。
【答案】（1）① RNA 聚合酶 ② Ca2+ ③ 能吸收周围环境中 DNA 分子 （2）①
EcoRⅠ和BamHⅠ ② 密码子具有简并性 （3）① b ② 环状质粒在琼脂糖凝胶
中的迁移速率较快 （4）将融合标签从重组蛋白中切除，获得纯净的乳糖酶（去除融合蛋白中
的CBD 和SspDnaB 编码的部分，获得纯净的乳糖酶）
(1)小问详解：
启动子是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的上游，是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转
录出 mRNA。将基因表达载体导入大肠杆菌等微生物细胞常用的方法是用Ca2+（或CaCl2）处理大肠杆菌细
胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态。
(2)小问详解：
要将基因 LacZ 与质粒 pUC18 正确连接，需要用限制酶切割，根据图中质粒 pUC18 上的酶切位点
（BamHⅠ和 EcoRⅠ），质粒 pUC18 中EcoR Ⅰ的酶切位点位于BamH Ⅰ酶切位点的上游，为保证LacZ 基
因能与质粒 pUC18 正确连接，设计引物时需要在图中LacZ 基因左右两侧引物的5′端分别添加EcoR Ⅰ和
BamH Ⅰ的识别序列。原 LacZ 基因中含有一个 BamHⅠ切割位点序列 GGATCC，通过引物设计将其替换为
GAGTCC，由于密码子的简并性，即一种氨基酸可能由多种密码子编码，所以替换后编码的氨基酸与 LacZ
相同。
(3)小问详解：
观察电泳图，已知LacZm 基因长度为3075bp，根据分子Marker 以及各泳道条带位置，b 条带对应的分子量
在3000 左右，符合LacZm 基因的大小，所以代表LacZm 基因的条带是b。在琼脂糖凝胶电泳中，DNA 分子
的迁移速率与分子的构象等有关，未酶切的重组质粒通常以紧密的环状构象存在，这种构象在凝胶中的迁
移速率较快，所以会出现未酶切重组质粒分子量虽大于其酶切产物，但在电泳图谱中迁移速率更快。
(4)小问详解：
构建的重组蛋白是带有融合标签（CBD 和SspDnaB 编码的部分）的乳糖酶融合蛋白，利用几丁质亲和吸附
柱对粗酶液进行纯化后，乳糖酶位于吸附柱上，加入裂解液，在特定条件下诱导融合蛋白进行自剪切，将
融合标签从重组蛋白中切除，去除融合蛋白中的CBD 和SspDnaB 编码的部分，从而获得纯净的、无标签的
乳糖酶。
15.（2026·辽宁沈阳·二模）培育转VEGF 基因的山羊，有利于提高羊绒产量。但转基因动物含有标记基
因可能造成安全性问题。研究者利用Cre/LoxP 系统删除标记基因。回答下列问题。
（1）基因表达载体除了含有标记基因外，还应有 （写出两点）等，其中标记基因的作用是
。
（2）如图1 所示，Cre 酶能切割特定位点形成黏性末端。结合图1 和图2 分析，Cre 酶能将 （填
“①”或“②”）中的目标片段删除，并且其余片段末端可以连接形成一个DNA 分子。
（3）为保证转化后可删除标记基因并构建P1，图3 中引物a 和b 应添加的LoxP 序列分别为5’-
-3’、5’- -3’（写出已知的8 个碱基），同时限制酶识别序列需添加在LoxP 序列的 端。
用BglⅡ和HindⅢ处理P1并对产物进行电泳鉴定，结果长度为 ，说明P1构建成功。
（4）将P1导入山羊皮肤成纤维细胞，经检测VEGF 已成功表达。此时还需要 的作用将标记基因删
除。利用荧光显微镜观察，结果为 ，说明已成功删除标记基因。
【答案】（1 ）① 启动子、目的基因、终止子、复制原点 ② 便于重组DNA 分子的筛
选 （2 ）② （3 ）① GCATACAT ② ATGTATGC ③ 5’ ④
3600bp 和4100bp （4）① Cre 酶 ② 无（红色）荧光
(1)小问详解：
基因表达载体的核心组成包括： 启动子：RNA 聚合酶的结合位点，启动目的基因的转录； 目的基
因：需要表达的外源基因（本题中为 VEGF 基因）； 终止子：终止转录的 DNA 序列； 复制原点：载体
在受体细胞中复制的起点； 标记基因：如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等，作用是筛选出成功导入重
组载体的受体细胞（未导入载体的细胞无法在选择培养基上存活，或无荧光信号）。
(2)小问详解：
结合图 1 和图 2 分析： 图 1 显示：Cre 酶识别 LoxP 序列，在5'-GCATACAT...-3'和3'-
CGTATGTA...-5'之间剪切，产生黏性末端； 图 2 中，②的两个 LoxP 序列方向一致，Cre 酶剪切后，两
个 LoxP 之间的目标片段被删除，剩余的黏性末端可以互补连接，形成完整的 DNA 分子； ①的 LoxP 序
列方向相反，Cre 酶剪切后会导致片段倒位，而非删除。因此 Cre 酶能将②中的目标片段删除。
(3)小问详解：
根据图 1，LoxP 序列的已知 8 个碱基为5'-GCATACAT-3'（正链），其互补链为3'-CGTATGTA-5'（即5'-
ATGTATGC-3'）。引物 a 和 b 需要添加 LoxP 序列，因此引物 a 添加5'-GCATACAT-3'，引物 b 添加
5'-ATGTATGC-3'。限制酶需要识别并切割 DNA，因此其识别序列必须添加在 LoxP 序列的5' 端，才能保
证后续酶切操作正常进行。图 3 中，P₁ 载体总长度为 7700bp，VEGF 基因长度为 5600bp。 用
HindⅢ单酶切：载体被切成 1 个片段，长度为 7700bp； 用BglⅡ 和 HindⅢ双酶切：载体被切成 2 个
片段： 含 VEGF 的片段：7700bp - 4100bp = 3600bp, 含 LoxP、DsRed、KanR的片段：4100bp（图中标
注）因此电泳结果出现3600bp 和 4100bp 两个条带，说明 P₁ 构建成功。
(4)小问详解：
本题利用Cre/LoxP 系统删除标记基因，因此需要Cre 酶识别 LoxP 序列，剪切并删除两个 LoxP 之间的
标记基因（DsRed 红色荧光基因、KanR卡那霉素抗性基因）。标记基因包含DsRed 红色荧光基因，若标记
基因被成功删除，细胞将不再表达红色荧光蛋白。因此用荧光显微镜观察，结果为无（红色）荧光，说明
标记基因已成功删除。
16.（2026·辽宁沈阳·二模）野生型家蚕卵呈黑褐色，产红色卵的突变体由5 号染色体上单基因隐性突
变形成。不考虑性染色体同源区段。回答下列问题。
（1）选取一对经诱变处理的黑褐色卵家蚕杂交，F1中出现约1/4 的暗红色卵（雌雄比例相等），且在胚胎
末期全部死亡。由此可知：控制暗红色卵的基因是位于 （填“常”或“性”）染色体上
（填“显性”或“隐性”）基因。
（2）为探究暗红色卵基因和红色卵基因是否为等位基因，研究者选择F1全部个体与红色卵突变体进行杂
交得到F2，统计F2表型及比例为 ，说明两个基因互为等位基因，且红色卵对暗红色卵为显性。
据此分析，上述家蚕成体中相关基因型共有 种。
（3）进一步分析确定：暗红色卵基因无致死效应。研究者推测：致死表型是由同样位于5 号染色体上的
基因D 突变为d 所致。为验证此推测，利用基因工程将A 基因和B 基因分别导入暗红色卵品系，获得甲、
乙品系。每个品系个体的细胞中仅插入一个目的基因，且基因A、B、D 均独立遗传。
品系
插入的目的基因
目的基因的产物
备注
甲品系
A 基因
转录产物sgRNA
当一个细胞中同时含有
A 和B 时，sgRNA 可引
导Cas9 蛋白在基因D 的
特定位点进行切割，进
而实现将基因D 编辑为
基因d。
乙品系
B 基因
表达Cas9 蛋白
①将甲品系与乙品系杂交得到F1，在早期胚胎阶段，仅选出同时含基因A 和B 的胚胎继续培育，这些胚胎
均成活并发育为成体，测序可知，这些成体中基因D 被编辑为d 的个体占80%，那么，所培育的成体中
Dd 的个体占 。
②将上述选育的成体随机交配得到F2，其中不同时含基因A 和B 的个体占 ，在该类型个体中，
若仅考虑相同基因型的雌雄个体交配，理论上子代出现约1/4 致死的交配组合占 ，上述推测成
立。
【答案】（1 ）① 常 ② 隐性 （2 ）① 黑∶红=2∶1 ② 5##
五 （3）① 4/5#P% ② 7/16 ③ 4/7
(1)小问详解：
分析题意，一对黑褐色卵家蚕杂交，F₁ 中暗红色卵占1/4，且雌雄比例相等，全部胚胎死亡，若基因在性
染色体上，性状会和性别关联，雌雄比例不会相等，因此控制暗红色卵的基因位于常染色体；亲本都为黑
褐色，子代出现新性状暗红色卵，符合“无中生有为隐性”，因此暗红色卵是隐性基因控制。
(2)小问详解：
设等位基因显隐性关系：黑褐（野生型）R > 红色卵r 红 > 暗红色卵r 暗，若二者为等位基因，原F₁ 中
暗红色卵（r 暗r 暗）全部致死，成活的F₁ 黑褐色个体基因型及比例为RR:Rr 暗=1:2，让F₁ 和红色卵突变体
（r 红r 红）杂交，RR×r 红r 红 → 全为Rr 红（黑褐色），占比1/3×1=1/3，Rr 暗×r 红r 红 → Rr 红（黑
褐）: r 红r 暗（红）=1:1，占比:黑褐2/3×1/2=1/3，红色2/3×1/2=1/3，总表型比例黑褐色:红色卵
=(1/3+1/3):1/3=2:1；三个等位基因R、r 红、r 暗，其中r 暗r 暗纯合致死，无法存活为成体，成活的基因型
为：RR、Rr 红、Rr 暗、r 红r 红、r 红r 暗，共5 种。
(3)小问详解：
①利用基因工程将A 基因和B 基因分别导入暗红色卵品系，每个品系个体的细胞中仅插入一个目的基因，
获得甲、乙品系。将甲品系与乙品系杂交得到F1，在早期胚胎阶段，当一个细胞中同时含有A 和B 时，
sgRNA 可引导Cas9 蛋白在基因D 的特定位点进行切割，进而实现将基因D 编辑为基因d。dd 纯合致死，仅
选出同时含基因A 和B 的胚胎继续培育，这些胚胎均成活并发育为成体，测序可知，这些成体中基因D 被
编辑为d 的个体占80%，那么，所培育的成体中Dd 的个体占80%=4/5。
②选育的成体都同时含A、B，基因型为AaBb（A 为插入，a 未插入，B 同理，独立遗传），随机交配后，
后代同时含A、B 的为A_B_，占3/4×3/4=9/16，因此不同时含A、B 的比例为1-9/16=7/16；亲本F₁ 成体D
基因型为1/5DD、4/5Dd，随机交配后，d 配子频率2/5，D 配子频率3/5，后代DD:Dd:dd=9:12:4，dd 致死，
因此成活个体中DD:Dd=9:12=3:4，即成活个体中Dd 占4/7，只有相同基因型Dd 自交，子代才会出现1/4
的dd 致死，因此该交配组合占4/7。
17.（2026·吉林长春·二模）肿瘤的生长和转移具有血管依赖性，阻断血管生成是遏制肿瘤的有效策略。
KDR 基因编码的蛋白是肿瘤血管内皮细胞表面的关键受体。病毒的胸苷激酶基因（tk）编码的酶能将无毒
性的前体药物更昔洛韦（GCV）转化为毒性物质，导致细胞死亡。为特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞，科研
人员拟构建由KDR 基因启动子驱动tk 表达的重组质粒（KDR-tk），并检测其杀伤效果，部分过程如图。回
答下列问题。
限制酶
识别序列和切割位点
Nhe Ⅰ
5′-G↓CTAGC-3′
Mfe Ⅰ
5′-C↓AATTG-3′
Age Ⅰ
5′-A↓CCGGT-3′
EcoR Ⅰ
5′-G↓AATTC-3′
Xba Ⅰ
5′-T↓CTAGA-3′
Hind Ⅲ
5′-A↓AGCTT-3′
（1）启动子是 识别和结合的部位，因此无启动子的tk 无法表达。为达到使用GCV 特异性
杀伤肿瘤血管内皮细胞的目的，科研人员从众多启动子中选择了KDR 基因启动子序列构建载体，推测是
由于KDR 基因 。
（2）向①②两个PCR 反应体系中提供的组分不同的有 。将反应体系放入PCR 仪中进行反
应，每次循环按序可以分为变性、 、延伸三步。
（3 ）图中KDR 基因启动子的a 链与所在基因的模板链为同一条链，已知b 链序列为5′-
GAGCATTAAAACTGAA……CGTAGAGTCTGCGCAG-3′ ，则过程①构建的一对引物序列为
。
5′-GCATTAAAACTGAAGTGAAGTG-3′
①
5′-GCTAGCGAGCATTAAAACTGAA-3′
②
5′-GGTACCCTGCGCAGACTCTACG-3′
③
5′-ACCGGTCTGCGCAGACTCTACG-3′
④
（4 ）为保证正确连接，过程④最好选择用限制酶 处理质粒，选用限制酶
处理KDR 基因启动子-tk，此过程还需用DNA 连接酶，其催化连接的化学键是 。获得的
KDR-tk 重组质粒，经检测鉴定后导入大肠杆菌体内。
（5）研究人员提取大肠杆菌中的重组质粒，将其导入HUVEC 细胞（常用作体外模拟肿瘤的血管内皮细胞
系），一段时间后，在转化成功细胞的培养液中加入 进行培养，于不同时间检测细胞存活
率，证明实验成功的实验结果是 。
【答案】（1）① RNA 聚合酶 ② 在肿瘤血管内皮细胞中高表达，在正常血管内皮细胞和其他细胞
中低表达/ 在肿瘤血管内皮细胞中选择性表达 （2 ）① 模板和引物 ② 复
性 （3）②④ （4）① Xba Ⅰ、Mfe Ⅰ ② Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ ③ 磷
酸二酯键 （5）① 更昔洛韦（GCV） ② HUVEC 细胞存活率下降
(1)小问详解：
启动子是RNA 聚合酶识别和结合的位点，启动下游基因的转录；实验需要特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞，
而KDR 基因仅在肿瘤血管内皮细胞中特异性表达（在肿瘤血管内皮细胞中高表达，在正常血管内皮细胞和
其他细胞中低表达），其启动子才能驱动tk 基因仅在目标细胞中表达，因此选择KDR 基因启动子。
(2)小问详解：
PCR 是一项体外扩增DNA 的技术，①扩增KDR 基因启动子，②扩增tk 基因，两个PCR 体系的模板DNA、引
物（与模板链碱基互补配对）均不同；PCR 的每一次循环依次分为变性、复性、延伸三步。
(3)小问详解：
已知b 链序列为5′ GAGCATTAAAACTGAA……CGTAGAGTCTGCGCAG 3′
−
−
，PCR 引物需要在5'端引入酶切位点，
KDR 启动子左端需要引入NheⅠ位点，NheⅠ识别序列为5′ GCTAGC 3′
−
−
，上游引物序列需要匹配b 链
5'端序列并加上该识别序列，对应②；KDR 启动子右端需要引入AgeⅠ位点，AgeⅠ识别序列为5′
ACCGGT 3′
−
−
，下游引物与b 链3'端反向互补，加上识别序列后对应④，因此引物为②和④。
(4)小问详解：
分析题图，NheⅠ切割序列为5′ G↓CTAGC 3′
−
−
，切割后产生粘性末端5′ CTAG 3′
−
−
；XbaⅠ切割序列
为5′ T↓CTAGA 3′
−
−
，切割后产生的粘性末端同样是5′ CTAG 3′
−
−
，二者粘性末端互补，可互相连接，
EcoRⅠ切割序列为5′ G↓AATTC 3′
−
−
，切割后产生粘性末端5′ AATT 3′
−
−
，MfeⅠ切割序列为5′
C↓AATTG 3′
−
−
，切割后产生的粘性末端同样是5′ AATT 3′
−
−
，二者粘性末端互补，可互相连接， 质
粒上本身带有XbaⅠ和MfeⅠ两个酶切位点，用XbaⅠ和MfeⅠ双酶切质粒后，质粒产生两个不同的粘性
末端，可避免质粒自身环化，保证后续连接方向正确。 融合后的KDR 基因启动子tk 片段，左端保留KDR
启动子的NheⅠ酶切位点，右端保留tk 基因的EcoRⅠ酶切位点，因此NheⅠ和EcoRⅠ双酶切处理目的基
因，得到的两个粘性末端正好可以和双酶切后的质粒粘性末端互补配对，实现目的基因的定向正确连接；
DNA 连接酶催化连接的化学键是磷酸二酯键。
(5)小问详解：
tk 基因表达的酶可将无毒的更昔洛韦（GCV）转化为毒性物质杀死细胞，因此需要向培养液中加入更昔洛
韦（GCV）；若实验成功，tk 基因仅在转化成功的肿瘤血管内皮细胞中表达，因此观察到的结果是转化成
功的HUVEC 细胞存活率显著降低。
18.（2026·内蒙古·二模）为实现水稻产量提升，科研人员尝试将动物来源的肥胖基因FTO 的cDNA 导入
水稻细胞，构建含FTO 基因的T-DNA 序列（结构如图所示）。科研人员以水稻愈伤组织为受体，采用农杆
菌转化法将该T-DNA 转入水稻细胞，经植物组织培养技术获得转基因水稻植株，进而探究FTO 基因对水稻
产量的影响。回答下列问题：
（1）选择水稻启动子驱动FTO 基因表达的优势是 。农杆菌转化法中，农杆菌介导转化的
原理是 。水稻愈伤组织发育为完整转基因植株过程的理论基础是 。
（2）对转化后的水稻愈伤组织进行培养时，需在培养基中添加潮霉素，该操作的目的是 。
Flag 是一种常用于蛋白质纯化和检测的短肽标签，其与FTO 基因串联后，会表达出“FTO 蛋白+Flag 标
签”的融合蛋白，该设置的目的是 。
（3）为验证FTO 基因的表达能提升水稻产量，科研人员设置三组实验：甲组为非转基因野生型水稻，乙
组为转入空载体（仅不含FTO 基因）的水稻，丙组为转入上述重组载体的转基因水稻。将三组水稻置于相
同且适宜的环境中培养，收获后统计有效穗数、每穗粒数、千粒重。
①设置乙组实验的目的是 ；
②若实验结果为 ，则可证明FTO 基因的表达能提升水稻产量。
（4）若将该转基因水稻投入生产，还需进行田间多代种植实验，目的是 ，从生物安全角
度分析，还需评估 。
【答案】（1）① 水稻启动子能被水稻的RNA 聚合酶识别，驱动FTO 基因在水稻细胞中特异性稳定表
达 ② 农杆菌Ti 质粒上的T-DNA 可转移并整合到受体细胞的染色体DNA 上 ③ 植物细胞的
全能性 （2）① 筛选出成功导入目的基因（FTO 基因）的愈伤组织 ② 便于检测FTO 基
因是否成功表达，以及对FTO 蛋白进行纯化 （3）① 排除空载体（T-DNA 插入本身）对实验结
果的干扰，保证实验结果是由FTO 基因表达引起的 ② 丙组的有效穗数、每穗粒数、千粒重均显
著高于甲组和乙组，甲组和乙组的相关指标无明显差异 （4）① 筛选出能稳定遗传的转基因水
稻植株，确认其产量性状的遗传稳定性 ② 转基因水稻的食用安全性和对生态环境的安全性（生
物安全风险）
(1) 小问详解：
启动子是RNA 聚合酶识别结合的位点，使用水稻自身的启动子，能被水稻的RNA 聚合酶识别，驱动FTO 基
因在水稻细胞中特异性稳定表达；农杆菌转化法中，农杆菌Ti 质粒上的T-DNA 可转移并整合到受体细胞的
染色体DNA 上，使目的基因稳定遗传；植物组织培养获得完整植株的理论基础是植物细胞的全能性。
(2)小问详解：
潮霉素抗性基因是标记基因，培养基添加潮霉素可淘汰未导入FTO 基因的愈伤组织，筛选出获得目的基因
的愈伤组织；Flag 标签用于蛋白质的纯化和检测，融合表达后可通过检测标签间接检测FTO，方便目的基
因表达的检测和蛋白纯化。
(3)小问详解：
实验中设置转入空载体的乙组，是为了排除空载体（T-DNA 插入本身）对实验结果的干扰，保证实验结果
是由FTO 基因表达引起的；若FTO 表达提升产量，则结果为转入FTO 的丙组的有效穗数、每穗粒数、千粒
重均显著高于甲组和乙组，而未转入FTO 基因的甲组、乙组产量无明显差异。
(4)小问详解：
转基因植株初始多为杂合子，多代种植可以筛选出能稳定遗传的转基因水稻植株，确认其产量性状的遗传
稳定性；投入生产前，从生物安全角度，需要评估转基因水稻的食用安全性（对人体健康的影响）和生态
安全性（对环境、生物多样性的潜在风险）。
19.（2026·辽宁锦州·二模）枯草芽孢杆菌在营养不足、环境恶劣等条件下会形成抗逆性强的芽孢，环
境适宜时，芽孢恢复活性。我国科学家通过将芽孢包埋在可降解塑料PCL 中，制备出能在特定条件下加速
降解的“活塑料”（制备原理如图1），以期用于食品、日用品等包装。
（1）为获得用于制备“活塑料”的芽孢，需先在培养基中培养枯草芽孢杆菌。培养基中应提供
（答出两种）以及水和无机盐等营养物质，全程保证 操作。
（2）研究者构建图2 所示的基因表达载体转入枯草芽孢杆菌，获得只有在木糖存在时才能大量表达并分
泌脂肪酶（塑料降解酶）的工程菌。请从以下选项中选择合适的启动子和基因，将所选序号填入相应位置
。
启动子：①芽孢杆菌内源启动子②T7 启动子（只被T7RNA 聚合酶识别）③木糖诱导型启动子
基因：
A．脂肪酶基因 B．脂肪酶基因+分泌信号肽基因
C．T7RNA 聚合酶基因 D．木糖合成酶基因
（注：分泌信号肽能引导蛋白质分泌到细胞外）
（3）研究者将上述表达载体转入用 处理过的枯草芽孢杆菌中，筛选得到转化
成功的工程菌。再利用重金属刺激工程菌形成工程芽孢，进一步制备出活塑料。
（4）活塑料能实现“在日常使用时不降解、需要回收时启动降解”的目标。活塑料使用完回收后快速降
解所需的条件是 。
（5）为保证该技术在实际应用中的安全性，在选取工程菌株时，还需要考虑的是____________。
A. 对人体和动植物无致病性
B. 在完成降解任务后种群会自然衰退
C. 在自然环境中具备较强的生存和扩散能力
D. 所携带的外源基因不易转移至自然环境
【答案】（1）① 碳源、氮源 ② 无菌 （2）启动子 Ⅰ：③（木糖诱导型启动子），
基因Ⅱ：C（T7RNA 聚合酶基因）；启动子Ⅲ：②（T7 启动子），基因Ⅳ：B（脂肪酶基因+分泌信号肽基
因） （3）CaCl2（或Ca²⁺） （4）添加木糖；提供适宜环境条件 （5）ABD
(1)小问详解：
微生物的培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。为获得用于制备“活塑料”的芽孢，需先在培养基
中培养枯草芽孢杆菌，所以培养基中应提供碳源、氮源以及水和无机盐等营养物质。在微生物培养过程中，
为防止杂菌污染，全程要保证无菌操作。
(2)小问详解：
要实现 “木糖存在才大量表达”，必须用木糖诱导型启动子（③） 来控制脂肪酶的表达。同时，脂肪酶
需要分泌到胞外，因此对应的基因必须是脂肪酶基因+分泌信号肽基因（B）。T7 启动子（②）只能被 T7
RNA 聚合酶识别，因此需要一个 “开关” 来控制 T7 RNA 聚合酶的表达。用木糖诱导型启动子（③）控
制T7 RNA 聚合酶基因（C）：木糖存在时，启动子③激活，表达 T7 RNA 聚合酶；用T7 启动子（②）控
制脂肪酶 + 分泌信号肽基因（B）：T7RNA 聚合酶大量表达后，会特异性识别T7 启动子，启动下游脂肪酶
基因的高强度转录，实现 “大量表达” 的效果。因此启动子Ⅰ（③木糖诱导型启动子）→基因Ⅱ（C T7
RNA 聚合酶基因）、启动子Ⅲ（②T7 启动子）→基因Ⅳ（B 脂肪酶基因+分泌信号肽基因）。
(3)小问详解：
将基因表达载体导入微生物细胞时，常用CaCl2（Ca²⁺）处理枯草芽孢杆菌，使其成为感受态细胞，便于吸
收外源DNA。
(4)小问详解：
由于该“活塑料”是将芽孢包埋在可降解塑料PCL 中，制备出能在特定条件下加速降解的塑料，所以该塑
料使用后回收后快速降解所需的条件是：添加木糖（作为诱导剂，激活木糖诱导型启动子，启动脂肪酶基
因表达）；提供适宜环境条件（包括水分、温度、pH、营养物质等，促使芽孢萌发为活性工程菌，进而分
泌脂肪酶降解PCL）。
(5)小问详解：
A、为保证技术在实际应用中的安全性，工程菌株需对人体和动植物无致病性，这样可以避免对生物造成
危害，A 正确；
B、工程菌株在完成降解任务后种群会自然衰退，能防止其在环境中过度繁殖带来不良影响，保障安全性，
B 正确；
C、工程菌株在自然环境中不应具备较强的生存和扩散能力，否则可能会扩散到不该去的环境中造成生态
问题，C 错误；
D、所携带的外源基因不易转移至自然环境，可防止基因污染等安全隐患，D 正确。
20.（2026·内蒙古包头·二模）人体肠道发炎时会异常合成硝酸盐，因此硝酸盐被视作肠炎标志物。为
及时精确诊断肠炎，研究人员将重组质粒导入大肠杆菌，构建了能够感知硝酸盐并通过荧光报告肠炎的工
程菌。该质粒的部分结构如图1 所示。回答下列问题。
（1）将重组质粒导入感受态细胞后，在培养基中需添加 和 ，通过监
测荧光蛋白含量，以筛选出符合要求的菌株。
（2）用混有工程菌的饲料饲喂健康和患有肠炎的小鼠，监测腹部的荧光情况。结果发现，健康小鼠的腹
部也检测到少量荧光。研究人员对比了实验前后健康小鼠的炎症指标，发现两者无显著差异，从而排除了
导致此现象的可能性。
（3）进一步研究发现，上述结果是由于大肠杆菌的启动子在没有诱导物时也会少量启动荧光蛋白基因的
表达导致。研究人员引入“开关—触发”调控系统（图2、3），以抑制非炎症状态下荧光蛋白基因的表达。
该系统由开关RNA 和触发RNA 构成，其中开关RNA 与荧光蛋白mRNA 相连接。
据图2，3 可知，当不存在触发RNA 时，开关RNA 会形成发夹结构，使得核糖体结合位点被遮挡，从而抑制
荧光蛋白基因表达的 过程；当存在触发RNA 时，它可以与开关RNA 的踏板区域通过
的方式结合，解开其发夹结构，使得荧光蛋白基因启动表达。
（4）一个启动子一般只驱动产生一种mRNA。为实现荧光蛋白基因只在炎症状态下表达，根据上述原理，
修改了重组质粒（图4），用以构建新的工程菌。在图4 给定的4 个元件中，选择恰当的元件并以正确的
顺序补充在方框中 。
【答案】（1）① 硝酸盐 ② 抗生素 （2）工程菌导致小鼠肠道出现炎症产生硝酸
盐 （3）① 翻译 ② 碱基互补配对 （4）C→B→D
(1)小问详解：
将重组质粒导入感受态细胞后，在培养基中需添加硝酸盐和抗生素，通过监测荧光蛋白含量，以筛选出符
合要求的菌株，因为荧光蛋白的表达受P 启动子调控，而该启动子受硝酸盐的诱导，且重组质粒中带有抗
生素抗性基因。
(2)小问详解：
用混有工程菌的饲料饲喂健康和患有肠炎的小鼠，监测腹部的荧光情况。则可能是饲喂的工程菌引发健康
小鼠肠道发炎，进而合成了硝酸盐诱导荧光表达。而研究人员对比了实验前后健康小鼠的炎症指标，发现
两者无显著差异，因而可排除工程菌导致小鼠肠道出现炎症产生硝酸盐的可能。
(3)小问详解：
据图2，3 可知，当不存在触发RNA 时，开关RNA 会形成发夹结构，使得核糖体结合位点被遮挡，从而抑制
荧光蛋白基因表达的翻译过程；当存在触发RNA 时，它可以与开关RNA 的踏板区域通过碱基互补配对的方
式结合，解开其发夹结构，使得荧光蛋白基因启动表达，进而实现开关RNA 的调节作用。
(4)小问详解：
一个启动子一般只驱动产生一种mRNA。要求荧光蛋白仅在炎症（存在硝酸盐）时表达，因此触发RNA 也需
要仅在硝酸盐存在时合成，又一个启动子仅驱动一个mRNA，而原有P 启动子已经驱动开关区域+荧光蛋白
基因的转录(其后需要添加终止子)，因此需要额外添加硝酸盐诱导型P 启动子（B），再连接触发区域DNA
序列（D），这样可保证只有炎症存在时，P 启动子激活转录出触发RNA，进而开启荧光蛋白的翻译，即图
示空白处需要填上C→B→D。故为实现荧光蛋白基因只在炎症状态下表达，则需要修改的重组质粒如下：
。
