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6.生物技术与工程
1.(12 分)(2025·云南模拟)玉米是一种优良作物,但普通玉米缺乏动物生长发育所必需的
赖氨酸,科研工作者利用转基因技术将马铃薯中高赖氨酸蛋白基因(SBgLR)转入玉米细
胞获得高赖氨酸玉米新品种。该过程所用基因、Ti 质粒的部分结构、限制酶的识别序
列及切割位点如图所示。回答下列问题。
注:LB、RB 分别为T-DNA 的左边界、右边界。
(1)PCR 扩增SBgLR 基因时,引物的作用是
;
第二轮扩增结束时,PCR 反应体系中存在 种双链DNA。
(2)为获得能正确表达SBgLR 基因的重组质粒,应使用 两种限制酶切割图
中质粒。切割目的基因和质粒时均选用两种限制酶,这样设计的优点是
。
(3)SBgLR 基因中无上述限制酶识别序列,研究人员利用SBgLR 基因的mRNA 进行逆转
录得到了cDNA,已知mRNA 的序列为5'-UCUGUUGAAUAU…(中间序列)…
GCAUCAUCCAGG-3'。利用PCR 技术对cDNA 进行扩增,为便于将扩增后的基因和载
体连接构建重组质粒,请写出PCR 扩增时A 端和B 端所需DNA 引物的前12 个碱基序
列 、 。
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(4)研究者采用RT-PCR 技术对高赖氨酸玉米新品种转录情况进行鉴定,首先分别提取高
赖氨酸玉米新品种和野生型玉米的全部RNA 作为模板,经逆转录获得cDNA,再以
cDNA 作为模板进行PCR 扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如下图所示,1 号泳道
加入的样品是基因表达载体中SBgLR 基因的PCR 产物,则高赖氨酸玉米新品种和野生
型玉米的RT-PCR 扩增产物分别加入的是 泳道。
Marker:已知分子量的DNA 片段
2.(11 分)(2025·黑龙江模拟)诺如病毒(HuNoV)为单链RNA 病毒,是导致人急性胃肠炎的
最常见的病原体之一,其衣壳蛋白vpl 蛋白具免疫原性,且可自组装成空心的病毒样颗粒
(VLP)。科研人员利用昆虫杆状病毒表达系统制备VLP,即以杆状病毒为载体,通过特异
性感染昆虫细胞生产VLP 基因工程疫苗,部分技术路线如图1 所示。回答下列问题。
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图1
(1)为了后续实验中方便蛋白的纯化,需将vpl 基因与小段His 标签基因序列相连,形成融
合基因(图2),并与转移载体质粒连接,构建出重组转移载体。现欲通过PCR 判定融合基
因已准确连接,应选择图2 中的引物组合是 。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,
结果符合预期,通常还需进行序列测定,原因是琼脂糖凝胶电泳技术
。
图2
(2)昆虫HF 细胞能高效表达外源基因,是与载体上的 (结构)有关。从结构上看,
外源基因能和病毒DNA 拼接的原因是 。
构建重组杆状病毒要在昆虫细胞系中共转染,其原因是 。
(3)当目的基因两侧的小段序列与表达载体上某序列相同或相似时,可通过同源切割后进
行片段互换实现同源重组。将含有vpl 基因的重组转移载体质粒与携带杆状病毒基因
组的BAC 线性DNA 共转染到昆虫SF9 细胞中,通过一步转染即可实现重组杆状病毒的
高效生成。已知ORF 是病毒在昆虫细胞中复制的必备元件,△ORF 是部分片段缺失的
ORF(能在大肠杆菌中复制,不能在昆虫细胞中复制)。推测图1 所示制备过程中,SF9 细
胞中只产生重组杆状病毒的必要条件是 。(多选)
A.甲为△ORF,乙为ORF
B.BAC 线性DNA 为线状而非环状
C.BAC 线性DNA 含抗生素抗性基因
D.BAC 线性DNA 含杆状病毒基因组
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(4)为扩大疫苗产量,昆虫HF 细胞应选择 (填“贴壁”或“悬浮”)生长型细胞。
与大肠杆菌为受体细胞相比,用昆虫细胞作为受体细胞生产VLP 可更好的保留vpl 蛋白
的抗原性,其原因是
。
3.(11 分)(2025·山西吕梁二模)大豆是我国重要的油料作物和植物蛋白的主要来源,但盐
胁迫会严重影响大豆植株的生长。研究人员欲将酵母菌细胞中的耐盐基因ENA1 导入
大豆体内以提高其耐盐性,如图为构建的基因表达载体的部分结构。回答下列问题。
注:LB 为T-DNA 的左侧,RB 为T-DNA 的右侧,P35S 为启动子,T35S 和Nos 均为终止子,
Bar 基因为抗草甘膦(除草剂)基因。
(1)利用PCR 方法从酵母菌基因组中扩增ENA1 基因时需根据 设
计引物,PCR 反应体系中除加入ENA1 基因、4 种脱氧核苷酸等物质外,还需加入
酶。
(2)为了检测目的基因是否正向插入,可选用图中的引物 对其进行扩增,并对扩
增产物进行电泳,若结果为 (填“获得扩增产物”或“未获得扩增产
物”),则说明ENA1 基因正向插入。
(3)将目的基因导入植物细胞常采用的方法为 ,得到转基因大豆植株后,研究人
员对转基因大豆T2~T4代进行了PCR 及电泳,实验结果如下图所示(1 kb=1 000 bp):
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图中1 组为标准对照组,2 组为加水对照组,3 组为加入野生型大豆DNA 的PCR 产物组,
则4~7 组为加入 组,已知ENA1 基因扩增条带大小为550
bp,Bar 基因扩增条带大小为441 bp,则图 表示扩增的基因为ENA1,连续三代
PCR 检测结果说明
。
(4)Bar 基因为抗草甘膦基因,大豆在生长过程常喷洒草甘膦进行除草,推测该实验在转入
ENA1 基因的同时还转入Bar 基因,目的是排除 。从分子水
平检测转基因大豆体内目的基因是否完成了表达,可采用 方法。
4.(12 分)(2025·海南海口模拟)乳腺炎是畜牧业中的常见疾病,给全球乳制品行业带来了
巨大的经济负担。研究人员利用基因编辑工具结合Cre/loxP 系统,将炎症调节序列(IRS)
靶向整合到山羊溶菌酶(LYZ)基因的启动子区域,成功培育出具有增强乳腺炎抗性的奶
山羊,其操作过程如下图,回答下列问题。
图1 山羊胎儿成纤维细胞
图2 基因编辑奶山羊培育过程图
注:①loxP 是具有特异性序列的小DNA 片段,自身不表达,也不影响其他基因表达。
②P1 为启动子;EGFP 为绿色荧光蛋白基因;PuroR 为嘌呤霉素筛选基因;T1 为终止
子;TSS 是转录起始位点。
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(1)启动子位于基因的上游,紧挨着转录起始位点,其作用是
。
(2)Cre/loxP 系统主要由Cre 酶和loxP 位点两部分组成。Cre 酶可以识别并结合到loxP
序列的特定区域,并断开特定部位两个核苷酸之间的 键,然后将切口重新连接以
敲除两个同向loxP 间的DNA 序列。从作用效果来看,Cre 酶相当于基因工程中的基本
工具中的 。
(3)从生物安全的角度分析,最终利用Cre 酶敲除外源EGFP 和PuroR 基因的意义是
。
(4)PCR 技术可从分子水平检测EGFP 和PuroR 基因是否被成功敲除。请简要的写出实
验思路:
。
(5)图2 中涉及的生物技术有 (答2 点)。
在胚胎移植前,需要对代孕母羊进行同期发情处理,其目的是
。
5.(12 分)(2025·广东二模)抗原检测技术在病毒感染筛查、病毒类型判断等多个方面均有
应用,但传统检测技术成本较高。为降低成本,需开发新型抗原检测技术。我国科研人员
以人畜共患的口蹄疫病毒FMDV 为材料,将抗FMDV 纳米抗体Nb205 和抗鸡醛化红细
胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48 的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,利用
Nb205-48 建立可用于FMDV 抗原检测的血凝方法。
(1)科研人员采用重叠延伸PCR 技术构建Nb205 和NbRBC48 融合基因,具体路线如图。
本实验中linker 为含6 个氨基酸序列的连接肽,部分PCR 引物见下表。
引物
引物序列(5'→3')
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名称
P1
CATATGGATGATGATGATGATGAG(有下划线的为Nde Ⅰ限制酶切割位点)
P2
GACCCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCAACGGTCACTTGGGT
P3
AGCTTTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC
P4
GCGGCCGCTGAGGAGACGGT(有下划线的为Not Ⅰ限制酶切割位点)
①两个不同的基因得以融合的结构基础是 。
②重叠延伸PCR 技术是先分别PCR 获得目的链1 和目的链2,然后使用引物 进
行PCR 获得融合基因。引物P2 中决定linker 的碱基序列是5'- -3'。
③在构建基因表达载体时,需用限制酶 对质粒和Nb205-linker-NbRBC48 融合基
因进行酶切。
(2)科研人员将重组质粒导入大肠杆菌表达并纯化获得双特异纳米抗体Nb205-48,并对
融合双抗的敏感性进行了检测,结果见图。结果表明
,说明融
合双抗构建成功。
(3)在对融合双抗Nb205-48 进行推广前,还需进行的研究有
。
6.(10 分)(2025·云南玉溪模拟)百合极易受到尖孢镰刀菌引起的枯萎病的影响。研究人员
发现野生百合品种——岷江百合含有一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L 使其对尖孢镰
刀菌展现出强大的抗性,该基因及其上游的启动子pL 和下游的终止子结构如图甲所示。
图乙是一种Ti 质粒的结构示意图,其中基因gus 编码的GUS 酶活性可反映启动子活性。
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图甲
图乙
(1)图乙中启动子与复制原点的化学本质 (填“相同”或“不同”)。
(2)为研究不同病原微生物对基因L 的启动子pL 活性的影响,科研人员利用转基因植物
对其进行功能鉴定。
①从图甲所示结构中选用 酶切获取 ,再将其与图乙含有gus 基因的Ti
质粒重组构建 转入农杆菌细胞中。
②将预培养的新鲜植物叶片与适宜浓度的已成功转化的农杆菌共培养可达到转化目的,
原因是
。
③利用不同病原微生物侵染转基因成功的植物细胞,检测 ,比较出pL 的活性。
(3)研究人员还发现某种抗病性弱的栽培百合中也有基因L,但其上游的启动子与岷江百
合不同。若要提高该百合中基因L 的表达量,培育具有高抗病能力的百合新品种,请结合
题干信息简要写出实验思路:
。
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参考答案
1.答案 (1)使DNA 聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 4
(2)Mun Ⅰ和Xma Ⅰ 避免目的基因和质粒的反向连接;防止目的基因和质粒的自身环
化
(3)5'-CAATTGTCTGTT-3' 5'-CCCGGGCCTGGA-3'
(4)3、2
解析 (1)PCR 扩增目的基因时,引物的作用是使DNA 聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧
核苷酸。PCR 扩增利用的是DNA 半保留复制的特点,因此第二轮扩增结束时,PCR 反应
体系中存在4 种双链DNA。
(2)不能选择EcoR Ⅰ酶切割质粒,因为该酶的识别序列在启动子中;也不能选择Nhe Ⅰ酶
切割质粒,因为该酶的识别序列在质粒上有两个部位,因此需选择Mun Ⅰ、Xma Ⅰ切割
质粒。切割目的基因和质粒时均选用了两种限制酶,这样操作的优点是一方面可以避免
目的基因和质粒的反向连接,另一方面还可防止目的基因和质粒的自身环化。
(3)已知mRNA 的序列为5'-UCUGUUGAAUAU…(中间序列)…GCAUCAUCCAGG-3',
逆转录得到cDNA 序列为5'-CCTGGATGATGC…(中间序列)…ATATTCAACAGA-3',利
用PCR 技术对cDNA 进行扩增,PCR 过程需要两种引物,能分别与目的基因两条链的
3'端通过碱基互补配对结合,并在A 端、B 端分别加入Mun Ⅰ、Xma Ⅰ识别序列,故PCR
扩增时所需引物的前12 个碱基序列为5'-CAATTGTCTGTT-3'、5'-
CCCGGGCCTGGA-3'。
(4)结合题意并分析电泳结果可知,1 号泳道加入的样品是基因表达载体中SBgLR 基因的
PCR 产物,比较可得3 号泳道为高赖氨酸玉米新品种的RT-PCR 扩增产物,野生型玉米中
不含SBgLR 基因,因此在电泳过程中未显示条带,对应2 号泳道。
2.答案 (1)(引物)1 和3 仅能检测DNA 分子的大小,无法确定其碱基序列
(2)启动子 都有规则的双螺旋结构 病毒只能寄生在活细胞中
(3)AD
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(4)悬浮 昆虫细胞属于真核细胞表达系统,能对肽链进行正确的加工(盘曲折叠、组装、
修饰),保证了表达蛋白的活性(答案合理即可)
解析 (1)PCR 技术要求引物与模板链的3'端互补配对,且DNA 聚合酶从引物的3'端开始
延伸子链。启动子是一段位于基因编码链的5'端上游的DNA 序列,转录时RNA 聚合酶
识别并结合启动子后,沿基因的模板链从3'→5'方向转录出mRNA,也即RNA 聚合酶从
编码链的5'端开始延伸子链。由图2 可知,vpl 基因模板链的3'端在右侧,因此vpl 基因反
转180°后才能与启动子准确连接,同时vpl 基因和His 基因的模板链位于一条链上,如下
图。要判定vpl 基因与His 基因连接成的融合基因已准确连接,需要选择能扩增出融合
基因的引物组合。因此,引物1 和引物3 可以分别与融合基因中vpl 基因的3'端和His 基
因的3'端互补配对,从而扩增出准确连接的融合基因。
若His 基因反转180°后进行连接,如下图,则引物2 和4 能判定vpl 基因与His 基因连接成
的融合基因存在,但该融合基因不能被启动子正确启动和表达。
(2)基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因。启动子位于目的基因的
首端,终止子位于目的基因的尾端,昆虫高效表达外源基因与载体上的强启动子有关;外
源基因和病毒DNA 都具有规则的双螺旋结构,可以拼接;病毒只能寄生在活细胞中,因此
构建重组病毒要在昆虫细胞系中共转染。
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(3)结合图示分析,外源基因与病毒DNA 通过同源重组实现拼接,需要将Lef-2 和甲、乙
基因互换,然后再将乙、vpl、Lef-2 及杆状病毒基因组连接到一起。SF9 细胞中能合成重
组杆状病毒而不能合成野生型杆状病毒,说明野生型杆状病毒具备的是△ORF,在进行共
转染同源重组时,BAC 线性DNA 上的甲替换了重组转移载体质粒上的乙,使重组杆状病
毒能在昆虫细胞中复制,说明乙为ORF,因此SF9 细胞中只能合成重组杆状病毒而不能
合成野生型杆状病毒,A 项符合题意。线性DNA 通过同源重组形成环状重组病毒,不是
SF9 细胞中能合成重组杆状病毒而不能合成野生型杆状病毒的原因,B 项不符合题意。
抗生素抗性基因作为标记基因,用于筛选重组质粒,与病毒生成无关,C 项不符合题意。
BAC 线性DNA 含杆状病毒基因组,才能提供病毒复制和包装所需的遗传物质,从而使得
SF9 细胞中能合成重组杆状病毒,D 项符合题意。
(4)为扩大疫苗产量,昆虫HF 细胞应选择悬浮生长型细胞,原因是悬浮型生长的细胞可以
更好地与营养物质、氧气等接触,有利于细胞的增殖以及快速高效表达。大肠杆菌缺乏
真核细胞修饰加工系统,可能导致蛋白质错误折叠或抗原性丧失。与大肠杆菌为受体细
胞相比,昆虫细胞属于真核细胞表达系统,能对肽链进行正确的加工(盘曲折叠、组装、
修饰),保证了表达蛋白的活性,因此用昆虫细胞作为受体细胞生产VLP 可更好的保留vpl
蛋白的抗原性。
3.答案 (1)ENA1 基因两侧的碱基序列 耐高温的DNA 聚合(或TaqDNA 聚合)
(2)1、4 获得扩增产物
(3)农杆菌转化法 转基因大豆DNA 的PCR 产物 A Bar 和ENA1 基因已经分别转入
受体大豆中,且在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传
(4)草甘膦对植物生长的影响 抗原—抗体杂交
解析 (1)利用PCR 方法从酵母菌基因组中扩增ENA1 基因时需根据ENA1 基因两侧的碱
基序列设计引物,PCR 反应体系中除加入ENA1 基因、4 种脱氧核苷酸等物质外,还需加
入耐高温的DNA 聚合酶或TaqDNA 聚合酶。
(2)为了检测目的基因是否正向插入,可选用图中的引物1 和引物4 对其进行扩增,并对扩
增产物进行电泳,若结果为获得扩增产物,则说明ENA1 基因正向插入。
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(3)将目的基因导入植物细胞常采用的方法为农杆菌转化法。图中1 组为标准对照组,2
组为加水对照组,3 组为加入野生型大豆DNA 的PCR 产物组,则4~7 组为加入转基因大
豆DNA 的PCR 产物组,已知ENA1 基因扩增条带大小为550 bp,Bar 基因扩增条带大小
为441 bp,则图A 表示扩增的基因为ENA1。连续三代PCR 检测结果说明Bar 和ENA1
基因已经分别转入受体大豆中,且在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。
(4)Bar 基因为抗草甘膦基因,大豆在生长过程常喷洒草甘膦进行除草,推测该实验在转入
ENA1 基因的同时还转入Bar 基因,目的是使转基因植物能够抗草甘膦,从而排除草甘膦
对植物生长的影响。从分子水平检测转基因大豆体内目的基因是否完成了表达,可采用
抗原—抗体杂交方法。
4.答案 (1)RNA 聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA
(2)磷酸二酯 限制酶和DNA 连接酶
(3)从生物安全性角度,切除FGFP 和PuroR 基因可避免其表达产物引发动物机体的免疫
排斥反应;能防止基因漂移,避免这些外源基因传播到其他生物体内,防范对生态系统及
生物多样性的潜在威胁
(4)提取基因编辑后奶山羊细胞的基因组DNA;根据GFP 和PuroR 基因序列设计特异性
引物以提取的DNA 为模板进行PCR 扩增;然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测
(5)体细胞核移植技术、胚胎移植技术 使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致,供
体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存条件
解析 (1)启动子位于基因的上游,紧挨着转录起始位点,是RNA 聚合酶识别和结合的部
位,驱动基因转录出mRNA。
(2)Cre 酶可以识别并结合到loxP 序列的特定区域,并断开特定部位两个核苷酸之间的磷
酸二酯键,与基因工程中限制酶的作用相似;将切口重新连接以敲除两个同向loxP 间的
DNA 序列,连接DNA 片段,与DNA 连接酶功能相似,因此从作用效果来看,Cre 酶相当于
基因工程中的基本工具中的限制酶和DNA 连接酶。
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(3)EGFP 为绿色荧光蛋白基因,PuroR 为嘌呤霉素筛选基因,从生物安全性角度,切除
FGFP 和PuroR 基因可避免其表达产物引发动物机体的免疫排斥反应;能防止基因漂移,
避免这些外源基因传播到其他生物体内,防范对生态系统及生物多样性的潜在威胁。
(4)若想用PCR 技术从分子水平检测EGFP 和PuroR 基因是否被成功敲除,可提取基因
编辑后奶山羊细胞的基因组DNA;根据EGFP 和PuroR 基因序列设计特异性引物以提取
的DNA 为模板进行PCR 扩增;然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(5)图2 中涉及的生物技术有动物细胞核移植技术、动物细胞培养、早期胚胎发育、胚
胎移植等技术。在胚胎移植前,需要对代孕母羊进行同期发情处理,使胚胎在移植前后所
处的生理环境保持一致,供体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存条件。
5.答案 (1)①DNA 分子具有双螺旋结构 ②P1 和P4 GACCCCAGCTCCAAAGCT
③Nde Ⅰ、Not Ⅰ
(2)Nb205-48 可同时与FMDV 及cRBC 反应,且反应性能与Nb205 和NbRBC48 无明显差
异
(3)与传统检测方法进行灵敏度或准确性或效率比较(检测方法的稳定性;与其他病毒有
无交叉反应等)
解析 (1)①基因是有遗传效应的DNA 片段,两个不同的基因得以融合的结构基础是具有
相似的DNA 结构,即DNA 分子具有双螺旋结构。
②结合图示可知,先分别用(P1、P2)与(P3、P4)扩增得到目的链1 和目的链2,再仅使用
P1、P4 进行第二轮PCR 即能获得融合基因;引物需要与模板的3'端结合,据图可知,引物
P2 中决定linker 的碱基序列是5'-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3',这段序列编码了连接
肽的氨基酸序列,确保两个基因片段能够正确连接。
③在构建基因表达载体时,需要使用限制酶对质粒和融合基因进行酶切,以便将融合基因
插入质粒中。根据引物P1 和P4 的序列,P1 中含有Nde Ⅰ限制酶切割位点(CATATG),P4
中含有Not Ⅰ限制酶切割位点(GCGGCCGC)。因此,需要使用Nde Ⅰ和Not Ⅰ这两种限
制酶对质粒和融合基因进行酶切,确保融合基因能够正确插入质粒中。
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(2)分析题图,与缓冲液相比,Nb205-48 组别的FMDV 和cRBC 含量均显著升高,说明
Nb205-48 可同时与FMDV 及cRBC 反应,且反应性能与Nb205 和NbRBC48 无明显差异,
这一结果验证了双特异纳米抗体的功能,表明其能够用于FMDV 抗原的检测。
(3)在对融合双抗Nb205-48 进行推广前,还需进行的研究有灵敏度、准确性(进一步验证
融合双抗是否只与FMDV 抗原结合,而不与其他病毒或物质发生交叉反应)、效率比较
(检测方法的稳定性;与其他病毒有无交叉反应等)。
6.答案 (1)相同
(2)①Hind Ⅲ、BamH Ⅰ 启动子 pL 基因表达载体 ②通过农杆菌的Ti 质粒上的T-
DNA 能将其整合到植物细胞的染色体DNA 上 ③GUS 酶活性
(3)利用转基因技术将该种栽培百合中L 基因的启动子替换为岷江百合中L 基因的启动
子pL,并将该种百合的受体细胞通过植物组织培养得到新品种
解析 (1)启动子pL 与复制原点都是DNA 的片段,化学本质相同。
(2)根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点,启动子两侧都有两种酶,若要获得pL 并
连接到质粒上,可选用限制酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行酶切,以替换Ti 质粒中的启动子,从
而达到根据GUS 酶活性反映启动子活性的目的,再将其与图乙含有gus 基因的Ti 质粒
重组构建pL 基因表达载体转入农杆菌细胞中。通过农杆菌的Ti 质粒上的T-DNA 能将
其整合到植物细胞的染色体DNA 上,因此将预培养的新鲜植物叶片与适宜浓度的已成
功转化的农杆菌共培养可达到转化目的。由题干信息可知,可通过检测GUS 酶活性比
较出pL 的活性。
(3)要培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,可利用转基因技术将该种栽培百合中
L 基因的启动子替换为岷江百合中L 基因的启动子pL。
