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板块五 生物技术与工程
专题十三 发酵工程
1.获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。 2.发酵工程为人类提
供多样的生物产品。
大概念整合·一览纵横
【答案】醋酸菌； 碳源； 尿素； 稀释涂布平板法
命题点1 微生物的培养、分离与计数
知识整合 融会贯通
1．无菌技术常用方法
【答案】过滤除菌
2．微生物的纯化技术
（1）配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基
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（2）两种纯化微生物方法的比较
【答案】接种环； 涂布器
3．微生物分离与计数的两个实例
（1） 分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数
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（2） 纤维素分解菌的分离
【答案】（1） 选择
（2） 纤维素
［易错提醒］关注两种对照组与一种重复组
（1）将一未接种的选择培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认培养
基灭菌是否彻底（制备是否合格）。
（2）将一接种的普通培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认选择培
养基是否起“筛选”作用。
（3）进行微生物计数时，每一稀释度下至少涂布三个平板，即设置重复组，是
为了求平均值，提高计数准确度。
真题研究 体验领悟
【最新考情】
1．[2024·江苏选择考]酵母菌是基因工程中常用的表达系统。下列相关叙述正
确的是（ ）
A. 酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌，但不能灭活真菌
B. 酵母菌是真核细胞，需放置在CO2培养箱中进行培养
C. 可用稀释涂布平板法对酵母菌计数
D. 该表达系统不能对合成的蛋白质进行加工和修饰
【答案】C
【解析】选C。酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌和真菌，A 错误。酵母菌
培养的最适pH
为4.5∼5.0,最适生长温度一般为28∼30 ℃，故需将含有酵母菌
的培养基放置在28 ℃
恒温培养箱中进行培养，B 错误。可用稀释涂布平板法
对酵母菌计数，C 正确。酵母菌是真核细胞，具有高尔基体和内质网，可以对
合成的蛋白质进行加工和修饰，D 错误。
2．[2023·江苏选择考]下列关于细菌和酵母菌实验的叙述正确的是（ ）
A. 通常酵母菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比
B. 通常细菌的生长速度比酵母菌快，菌落比酵母菌落大
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C. 通常细菌培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌，酵母菌培养基用过滤除菌法除菌
D. 血球计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定
【答案】A
【解析】选A。不同微生物对营养物质的需求不一样，具有高碳氮比的生物需
要高碳氮比的营养物质，反之则低，酵母菌的碳氮比高于细菌，所以通常酵母
菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比，A 正确；通常细菌的生长速度比酵母
菌快，但形成的菌落不一定大于酵母菌，这与细菌的种类有关，部分细菌的菌
落小于酵母菌，B 错误；通常细菌和酵母菌的培养基都可以用高压蒸汽灭菌法
灭菌，C 错误；血球计数板适用于真菌的计数，D 错误。
［把脉高考］ 该知识点为高频考点。考查点主要包括无菌技术、培养基的配制、
微生物的接种方法、微生物的培养等。试题情境常涉及生活、生产实践和环境
治理，又渗透科学实验与探究。
【历年考情】
辩正误
（1） [2023·山东T15]不含氮源的平板不能用于微生物培养。（ ）
（2） [2023·广东T10]研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角
等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛
选原理来判断，最可能筛选到目标菌的条件组合是c点时取样、角蛋白氮源培养
基。（ ）
（3） [2021·江苏T18]将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染
的概率。（ ）
（4） [2021·江苏T18]为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油
为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90 %的辐照剂量诱变处理。涂布用的
菌浓度应控制在30∼300个/mL。（ ）
（5） [2021·浙江6 月T17]稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，
都可用于细胞计数。（ ）
（6） [2020·江苏T19]为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细
菌，培养结果如图所示。图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌
落。（ ）
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【答案】（1） ×
（2） √
（3） ×
（4） ×
（5） ×
（6） √
练表达
（7） [2023·全国乙T37（2）]采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为
原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是
_____________________________________________________________________
_（答出1 点即可）。
（8） [2022·河北T23（2）]枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用
__________（填“静置”或“摇床振荡”）培养。培养过程中抽样检测活菌数
量时，应采用__________________（填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计
数法”），其原因是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________。
【答案】（7） 提示：用于合成微生物细胞中的含氮化合物，如核酸、蛋白质
等
（8） 摇床振荡；稀释涂布平板法；用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一
个菌落一般都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌
也计算在内
题组模拟 素养提升
突破1 培养基的制备与无菌操作
1．[2024·南通高三调研]下表是一种筛选微生物的培养基配方，相关分析错误
的是（ ）
成分
甘露醇
KH 2 PO4
MgSO4
NaCl
含量/g
10
0.2
0.2
0.2
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成分
CaSO4
CaCO3
水
琼脂粉
含量/g
0.1
5
1 000
20
A. 该培养基为无氮培养基，说明筛选的微生物不需要氮源
B. 甘露醇既可为微生物提供碳源，也可以提供能源
C. 该培养基为固体培养基，配制后应先分装再灭菌
D. 进一步分离纯化微生物时常用平板划线法进行接种
【答案】A
【解析】选A。该培养基为无氮培养基，利用该培养基选择培养出的微生物可
以利用空气中的氮气作为氮源，而不是不需要氮源，A 错误；甘露醇是一种可
溶性的碳水化合物，可以被微生物迅速代谢产生能量，既可为微生物提供碳源，
也可以提供能源，B 正确；该培养基含有琼脂粉，为固体培养基，配制后应先
分装再灭菌，减少污染的可能，C 正确；分离纯化菌种时，常用的接种方法有
平板划线法和稀释涂布平板法，D 正确。
2．（多选）下列与微生物培养有关的说法，正确的是（ ）
A. 平板划线法每次划线前和最后一次划线后都需要对接种环进行灼烧灭菌
B. 常用的干热灭菌法包括干热空气灭菌法和火焰灼烧法等
C. 果酒发酵之后再进行果醋制作时，需要继续密闭
D. 接种微生物后，将平板倒置并放入培养箱中培养
【答案】ABD
【解析】选ABD。平板划线法每次划线前和最后一次划线后都需要对接种环进
行灼烧灭菌，防止接种环上的菌类影响划线结果和造成污染，A 正确；常用的
干热灭菌法包括干热空气灭菌法和火焰灼烧法等，B 正确；醋酸菌是好氧细菌，
故果酒发酵之后再进行果醋制作时，需要持续通入氧气或空气，C 错误；接种
微生物后，应将平板倒置并放入培养箱中培养，以防污染，D 正确。
突破2 微生物的培养、筛选与计数
3．[2024·盐城六校高三联考]（多选）鸡蛋表面污染的细菌会逐渐侵入蛋内，
缩短鸡蛋保质期。对某地不同季节及不同养殖模式下生产的鸡蛋取样，按每克
鸡蛋用1 mL无菌生理盐水清洗鸡蛋表面，收集清洗液，培养计数结果如下表所
示。相关叙述正确的是（ ）
季节
菌落数/（个·g-1）
半封闭式养殖模式
全封闭式养殖模式
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夏季
3.92×10
4
7.24×10
3
冬季
7.60×10
4
1.24×10
4
A. 稀释涂布平板法得到的鸡蛋表面细菌数比实际数略少
B. 表中数据是对清洗液稀释1×10
3倍后涂布平板获得的
C. 比较两种养殖模式可知鸡蛋表面的细菌主要来自环境
D. 冬季鸡舍更需要消毒以减少鸡蛋表面的细菌污染
【答案】ACD
【解析】选ACD。由于两个或多个细胞可能聚集在一起形成一个菌落，因此稀
释涂布平板法得到的鸡蛋表面细菌数比实际数略少，A 正确；稀释涂布平板法
涂布的菌液体积通常为0.1 mL，菌落数为30∼300
的平板适于计数，根据题表
数据分析，半封闭式养殖模式对清洗液稀释1×10
2
倍后涂布平板，全封闭式养
殖模式对清洗液稀释1×10
1
倍后涂布平板，B 错误；半封闭式养殖模式下的鸡
蛋表面细菌数明显多于全封闭式养殖模式，这说明环境中的细菌更容易污染鸡
蛋表面，C 正确；从题表数据可以看出，冬季鸡蛋表面的细菌数明显多于夏季，
这可能是因为冬季气温低，细菌更容易在鸡蛋表面生存和繁殖，因此需要加强
消毒措施，D 正确。
4．[2024·宿迁高三调研]（多选）某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解
尿素的细菌的数量，进行了取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步
骤，实验操作过程如下图所示，下列说法正确的是（ ）
A. 图中接种的培养基是以尿素为唯一氮源的固体培养基，能生长的微生物都能
合成脲酶
B. 若每支试管稀释10 倍，则图中a的数值应为2.7，5 号试管共稀释了10
6倍
C. 图中左上角培养基菌落连成一片，可能是涂布不均匀造成的
D. 若仅以4 号试管接种培养基计数，5 g该土壤中分解尿素的细菌的估算数目
是1.4×10
8个
【答案】BC
【解析】选BC。本实验的目的是探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，
因此图中接种的培养基是以尿素为唯一氮源的固体培养基，但在此培养基上能
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生长的微生物不一定都能合成脲酶，如固氮菌在此培养基上也能生长，A 错误；
若每支试管稀释10 倍，即将0.3 mL 与a mL 无菌水混合稀释10 倍，则a 的数值
为2.7，5 g土壤定容到50 mL 溶液被稀释了10 倍，故5 号试管共稀释了10
6
倍，
B 正确；题图中左上角培养基菌落连成一片，可能是涂布不均匀造成的，C 正
确；若仅以4 号试管接种培养基计数，5 g该土壤中分解尿素的细菌的估算数
目是(275+285+280)÷3÷0.2×10
5×5=7×10
8（个），D 错误。
命题点2 传统发酵技术的应用
知识整合 融会贯通
1．
【答案】醋酸； 30∼35； 榨汁
2.泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
真题研究 体验领悟
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【最新考情】
1．[2024·江苏选择考]关于“利用乳酸菌发酵制作酸奶或泡菜”的实验，下列
叙述正确的是（ ）
A. 制作泡菜的菜料不宜完全淹没在煮沸后冷却的盐水中
B. 制作酸奶的牛奶须经过高压蒸汽灭菌后再接种乳酸菌
C. 发酵装置需加满菜料或牛奶并封装，以抑制乳酸菌的无氧呼吸
D. 控制好发酵时间，以避免过量乳酸影响酸奶或泡菜的口味和品质
【答案】D
【解析】选D。制作泡菜是利用乳酸菌无氧呼吸产生乳酸，所以为制造无氧环
境，制作泡菜的菜料要完全淹没在煮沸后冷却的盐水，A 错误。制作酸奶时，
将牛奶倒入灭菌后的奶瓶中，倒入的奶液量不要超过奶瓶容积的2/3，再将牛奶
加热至90 ℃，保温5 min，或将牛奶置于80 ℃恒温水浴箱中15 min。如果采
用市售未开封的鲜奶,可直接使用，不需要灭菌，B 错误。制作泡菜时泡菜装置
八成满，制作酸奶时倒入的奶液量不要超过奶瓶容积的2/3，C 错误。制作酸奶
或泡菜时，控制好发酵时间，以避免过量乳酸影响酸奶或泡菜的口味和品质，
D 正确。
2．[2023·江苏选择考]（多选）某醋厂和啤酒厂的工艺流程如图所示。酒曲含
有霉菌、酵母菌、乳酸菌；醋醅含有醋酸菌；糖化即淀粉水解过程。下列相关
叙述正确的有（ ）
A. 糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”的目的是利于糖化和灭菌
B. 发酵原理是利用真菌的无氧呼吸与细菌的有氧呼吸
C. 醋酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况
D. 啤酒酿造流程中适当增加溶解氧可缩短发酵时间
【答案】CD
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【解析】选CD。糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”均有利于灭菌，大米“蒸煮”有
利于糖化过程，A 错误；题图中制酒用到了酒曲，酒曲含有霉菌、酵母菌、乳
酸菌，霉菌属于真菌，其为需氧型，该过程中霉菌产生的淀粉酶有利于将糯米
中的淀粉分解，乳酸菌进行的是无氧呼吸，酵母菌主要进行无氧呼吸完成酿酒
的过程，醋酸发酵过程中主要利用了醋酸菌的有氧呼吸，B 错误；醋酸发酵过
程中利用了醋酸菌的有氧呼吸，在发酵过程中经常翻动发酵物，目的是控制发
酵温度和改善通气状况，C 正确；啤酒酿造利用的原理是酵母菌的无氧呼吸产
生酒精，在啤酒酿造流程前期适当增加溶解氧有利于满足酵母菌自身增殖的需
要，增加酵母菌数量，有利于缩短发酵时间，D 正确。
［把脉高考］ 该知识点为中频考点。考查点主要包括利用传统发酵技术制作泡
菜、果酒和果醋；利用发酵工程进行啤酒制作；发酵工程在食品工业、医药工
业和农牧业等领域中的应用等。试题情境多联系生活、生产实践，指导应用性
较强。
【历年考情】
辩正误
（1） [2023·浙江6 月T12]关于小曲白酒的酿造过程，糖化主要是利用霉菌
将淀粉水解为葡萄糖。（ ）
（2） [2022·山东T20]啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖
化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。焙烤是为了利用高
温杀死大麦种子的胚并进行灭菌。（ ）
（3） [2022·山东T14]目前已实现青霉素的工业化生产，选育出的高产菌株
经扩大培养后才可接种到发酵罐中。（ ）
（4） [2021·江苏T14]果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵
时。（ ）
（5） [2021·江苏T14]果醋发酵时，用重铬酸钾测定醋酸含量变化时，溶液
灰绿色逐日加深。（ ）
（6） [2021·辽宁T8]酵母菌和醋酸菌发酵过程中控制通气的情况不同。 （
）
（7） [2021·山东T12]葡萄酒的颜色是葡萄皮中的色素进入发酵液形成的。
（ ）
（8） [2020·江苏T18]某同学在家用带盖玻璃瓶制作果酒和果醋时将玻璃瓶
用酒精消毒后，装满葡萄汁，待酒精发酵后去除瓶盖，盖一层纱布，再进行醋
酸发酵。（ ）
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（9） [2019·江苏T9]利用乳酸菌制作酸奶过程中，先通气培养，后密封发酵。
（ ）
（10） [2019·江苏T9]果醋制作过程中发酵液pH逐渐降低，果酒制作过程中
情况相反。（ ）
【答案】（1） √
（2） ×
（3） √
（4） √
（5） ×
（6） √
（7） √
（8） ×
（9） ×
（10） ×
练表达
[2020· 全国ⅢT37（4）节选]（11）制作果酒需要____________菌，这一过
程中也需要O2，O2的作用是______________________________________。
提示：酵母； 促进有氧呼吸，使酵母菌大量繁殖
题组模拟 素养提升
突破1 传统发酵技术的应用
1．[2024·南通高三一模]某同学制作果酒、果醋的步骤如下：①将发酵瓶等清
洗干净后用酒精消毒；②清洗葡萄并榨汁装入发酵瓶；③将温度控制在
18∼25 ℃发酵12 d；④打开瓶盖，盖上一层纱布再发酵8 d。下列说法错误
的是（ ）
A. ①可杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
B. ②装瓶时要注意，发酵液总量不要超过发酵瓶体积的2/3
C. ③每隔一段时间旋松瓶盖一次，及时放气
D. ④需要调高温度至30∼35 ℃，该过程几乎不产生气体
【答案】A
【解析】选A。①过程将发酵瓶等清洗干净后用酒精消毒，不能杀死物体内外
所有的微生物，A 错误；②过程装瓶时要注意，发酵液总量不要超过发酵瓶体
积的2/3，B 正确；将温度控制在18～25 ℃
进行果酒发酵，并需适时旋松瓶
盖放气，C 正确；果醋发酵的菌种是醋酸菌，为好氧细菌，最适温度为
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30∼35 ℃，故④需要调高温度至30∼35 ℃，该过程几乎不产生气体，D 正
确。
2．[2024·连云港高三一模]下列关于传统发酵技术的叙述正确的是（ ）
A. 利用果酒制作果醋过程中，只需将温度提高到30～35 ℃即可进行果醋发酵
B. 果酒制作过程中发酵液pH先上升后下降，果醋制作过程中发酵液pH一直下
降
C. 泡菜制作过程中，需密封容器，置于阴凉处自然发酵
D. 制作泡菜时，为了防止杂菌污染和加速醋酸菌发酵，可加入灭菌后的陈泡菜
水
【答案】C
【解析】选C。利用果酒制作果醋过程中，需将温度提高到30～35 ℃、接种
醋酸菌、充入氧气才可进行果醋发酵，A 错误；果酒制作过程中酵母菌呼吸作
用产生CO2，使培养液pH
下降，B 错误；泡菜制作过程中，需密封容器创造无
氧环境，置于阴凉处自然发酵，C 正确；加入陈泡菜水的目的是增加乳酸菌的
数量，使乳酸菌在短时间内发展为优势菌种，而灭菌后的陈泡菜水中乳酸菌已
经死亡，达不到这个效果，D 错误。
突破2 发酵工程及其应用
3．米酒旧时称酒酿，其现代生产工艺流程如下图所示。下列说法错误的是
（ ）
A. 蒸米有利于根霉曲分解糯米中的有机物，淋冷可防止杀死根霉
B. 加酵母曲后应先通入一段时间无菌空气，再进行无氧发酵
C. 发酵结束后对发酵液进行灭菌可延长米酒的保存期
D. 若酿制的米酒有酸味，应与长期封闭酿酒容器有关
【答案】D
【解析】选D。将糯米蒸熟可以杀死糯米中绝大多数杂菌且蒸米过程会使有机
物的结构遭到一定破坏，有利于后续根霉曲分解糯米中的有机物，淋冷可防止
杀死根霉，A 正确；加酵母曲后应先通入一段时间无菌空气，促进酵母菌有氧
呼吸，使酵母菌大量繁殖，再进行无氧发酵，B 正确；发酵结束后对发酵液进
行灭菌，可以消灭杂菌，延长米酒的保存期，C 正确；若酿制的米酒有酸味，
可能是由于酿酒容器漏气，导致氧气进入，促使醋酸菌进行醋酸发酵，D 错误。
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4．[2024·南通高三调研]（多选）食用海带有补血、健脾、降低体内胆固醇的
作用，研究表明经乳酸菌发酵后的海带发酵液能较好降血脂。相关叙述错误的
是（ ）
A. 发酵过程中要经常搅拌，适度往培养基中通入无菌空气
B. 为提高发酵效率，可适时向培养基中添加适量葡萄糖、蛋白胨等
C. 随发酵时间延长，培养的温度升高，发酵速度加快
D. 可通过检测发酵液的pH监测发酵进程
【答案】AC
【解析】选AC。乳酸菌属于异养厌氧细菌，乳酸菌发酵需要隔绝空气，故发酵
过程中不能通入无菌空气，A 错误；葡萄糖和蛋白胨可以为乳酸菌提供碳源和
氮源，故为提高发酵效率，可适时向培养基中添加适量葡萄糖、蛋白胨等，B
正确；适当提高温度，可以加快发酵速度，但温度过高会导致发酵菌种死亡，
发酵速度降低，可见随发酵时间延长，培养的温度升高，发酵速度不一定加快，
C 错误；乳酸菌发酵过程中产生大量乳酸，会导致发酵液pH
发生变化，故可通
过检测发酵液的pH
监测发酵进程，并便于适时调节pH，保证发酵效率，D 正
确。
专题强化训练
一、单项选择题
1．下列有关微生物的培养与应用，叙述错误的是（ ）
A. 湿热灭菌后倒的平板和接种后的平板均需倒置
B. 将未接种的平板培养并观察有无菌落，以判断培养基灭菌是否合格
C. 同一稀释度下至少要涂布三个平板，待菌落数稳定后计数
D. 对尿素分解菌进行计数时，可采用平板划线法
【答案】D
【解析】选D。平板倒置既可防止培养皿皿盖上凝结的水滴滴入培养基造成污
染，又可避免培养基表面的水分过快挥发，A 正确。将未接种的平板培养并观
察有无菌落，若未接种的培养基表面有菌落生长，则培养基灭菌不合格，若未
接种的培养基表面无菌落生长，则培养基灭菌合格，B 正确。同一稀释度下至
少要涂布三个平板，进行重复实验，并且要培养到菌落数在30∼300 再计数，C
正确。平板划线法不能对菌落进行计数，D 错误。
2．[2024·南通高三调研]某中学兴趣小组从垃圾堆放点的土壤中分离出一株分
解柴油的芽孢杆菌。相关叙述正确的是（ ）
A. 配制培养基时应以柴油为唯一氮源，并加入琼脂
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B. 配制好的培养基应先分装，再用干热灭菌法灭菌
C. 土壤样液可先进行富集培养，再进行涂布筛选
D. 选择平板中的菌落数必须在30∼300之间
【答案】C
【解析】选C。配制培养基时应以柴油为唯一碳源，A 错误；培养基灭菌采用
湿热灭菌法，配制好的培养基应先分装，再灭菌，B 错误；土壤样液可先进行
富集培养，增加菌株数量，再进行涂布筛选，C 正确；分离分解柴油的芽孢杆
菌，采用稀释涂布平板法时，对平板中的菌落数可以不做要求，D 错误。
3．[2024·扬州高三四校联考]制备筛选支原体的培养基时，需要在基础培养基
里添加动物血清、酵母浸液、青霉素等。多数4～5 d长出“油煎蛋”状菌落。
下列相关叙述错误的是（ ）
A. 动物血清可以提供营养和生长因子促进支原体的生长和增殖
B. 在筛选支原体的培养基里添加青霉素可以防止杂菌污染
C. 实验时不能用无水乙醇对实验员的手进行消毒
D. 临床上根据菌落特征确诊是否支原体感染是高效而准确的
【答案】D
【解析】选D。支原体的生长和增殖需要培养基提供营养和生长因子，动物血
清可以满足，A 正确；添加青霉素可以杀死其他杂菌，防止杂菌污染，B 正确；
对实验员的手消毒不能用无水乙醇，C 正确；根据菌落特征筛选支原体需要制
备筛选支原体的培养基，过程繁琐，且支原体菌落特征不明显，不好与其他杂
菌的菌落区分开，运用核酸和抗原检测是高效且准确的，D 错误。
4．“以曲酿酒”是我国白酒酿造工艺的典型特征。原始酒曲实际上来源于发霉
或发芽的谷物，现代酒曲在生产上通常以小麦、大麦和豌豆为原料进行发酵。
下列叙述错误的是（ ）
A. 传统酒曲是自然接种和开放式培养，原料和环境是其微生物的来源
B. 酒曲中的酵母菌可通过无氧呼吸作用将原料中的淀粉直接转化为酒精
C. 酒曲中的霉菌可产生蛋白酶、脂肪酶等多种水解酶降解原料中的大分子物质
D. 酒曲中的乳酸菌可产生乳酸，抑制其他不耐酸的微生物生长繁殖
【答案】B
【解析】选B。分析题意可知，原始酒曲实际上来源于发霉或发芽的谷物，传
统酒曲是自然接种和开放式培养，原料（发霉或发芽的谷物）和环境是其微生
物的来源，A 正确；淀粉属于多糖，不能直接被酵母菌利用，酿酒的原理是酵
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母菌通过无氧呼吸将葡萄糖分解为酒精和CO2，B 错误；酒曲中的霉菌可产生
蛋白酶、脂肪酶等多种水解酶降解原料中的大分子物质，C 正确；微生物的生
长需要适宜的环境，酒曲中的乳酸菌可产生乳酸，抑制其他不耐酸的微生物生
长繁殖，D 正确。
5．[2024·常州高三模拟]胶质芽孢杆菌可以分解含钾矿物质硅酸盐并释放出钾
离子供植物利用，它还可产生多种生物活性物质，促进植物生长。某实验室在
土壤中分离到了胶质芽孢杆菌NS 05。下列有关NS 05的分离、纯化和计数的叙
述，正确的是（ ）
A. 培养基中的氮源仅能提供N
B. 培养基pH的调节在灭菌前后进行都可以
C. 可采用平板划线法对胶质芽孢杆菌进行分离和计数
D. 分离纯化NS 05时需使用含钾矿物质硅酸盐作为唯一钾源的培养基
【答案】D
【解析】选D。培养基中的氮源除提供N
外，还可提供无机盐，A 错误；微生
物培养应注意无菌操作，应该在灭菌之前调节pH，B 错误；平板划线法可对微
生物进行分离，但不能用于计数，计数应采用稀释涂布平板法，C 错误；分离
纯化NS 05
时需使用含钾矿物质硅酸盐作为唯一钾源的培养基，在该培养基上只
有能分解含钾矿物质硅酸盐的目的菌能够生存，D 正确。
6．下列有关果酒和果醋制作的叙述，错误的是（ ）
A. 为降低杂菌污染，发酵前需要对原料和器具进行灭菌处理
B. 装置密闭发酵过程中，酒精度的变化是先增加后趋于稳定
C. 葡萄酿酒过程中，使用果胶酶利于出汁，还能提高酒的透明度
D. 由果酒制作转为果醋制作时，不仅要升高发酵温度，还要注意通气
【答案】A
【解析】选A。为降低杂菌污染，发酵前需要对器具进行灭菌处理，而原料不
需要灭菌，因为菌种来自原料本身，灭菌会导致菌种被杀死，A 错误；装置密
闭发酵过程中，随着发酵的进行酒精积累，酒精度逐渐增大，而在发酵后期由
于底物被大量消耗，酒精度趋于稳定，B 正确；果胶酶能破坏细胞壁，利于葡
萄汁的榨取，还能使酒变得清澈透明，C 正确；果酒制作需要的菌种是酵母菌，
在无氧条件下将葡萄糖分解为酒精，果酒制作的适宜温度是18～25 ℃，制作
果醋需要的菌种是醋酸菌，为好氧细菌，果醋制作的适宜温度是30～35 ℃，
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因此由果酒制作转为果醋制作时，不仅要升高发酵温度，还要注意通气，D 正
确。
7．下列关于分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数实验操作的叙述，错误的是
（ ）
A. 利用稀释涂布平板法估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B. 若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨
培养基作为对照
C. 将培养皿倒置于恒温箱中培养1～2 d，每24 h观察一次
D. 在超净工作台上和酒精灯火焰附近进行操作，是为了防止杂菌污染
【答案】B
【解析】选B。利用稀释涂布平板法估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度，
涂布平板后菌落数要在30～300 之间，A 正确；若要判断选择培养基是否起到
了选择作用，需要设置接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，当选择培养基上
的菌落数少于牛肉膏蛋白胨培养基时，说明起到了选择作用，B 错误；将培养
皿倒置于恒温箱中培养1～2 d，每24 h 观察一次每个培养皿中的细菌菌落，C
正确；在超净工作台上和酒精灯火焰附近都有无菌区域，操作时可以防止杂菌
污染，D 正确。
8．[2024·无锡高三调研]下列有关发酵工程及其应用的叙述，正确的是（ ）
A. 作为微生物饲料的单细胞蛋白，可通过发酵工程从微生物细胞中提取
B. 菌种的选育是发酵工程的中心环节，优良菌种可从自然界筛选出来
C. 酱油制作中利用黑曲霉将原料中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸
D. 啤酒发酵过程中糖的分解和代谢物的生成主要在后发酵阶段完成
【答案】C
【解析】选C。作为微生物饲料的单细胞蛋白是微生物菌体，并不是通过发酵
工程从微生物细胞中提取获得的，A 错误；发酵生产是发酵工程的中心环节，
B 错误；酱油制作中利用黑曲霉将原料中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，
C 正确；啤酒发酵过程中糖的分解和代谢物的生成主要在主发酵阶段完成，D
错误。
二、多项选择题
9．[2024·苏锡常镇高三调研]为筛选出可高效抑制番茄枯萎病菌（一类真菌）
的芽孢杆菌菌株，科研人员从土壤中采集、分离、筛选芽孢杆菌菌株作为待测
菌株，并采用平板对峙培养法观察各待测菌株的抑菌能力。下图为研究过程示
意图，下列叙述正确的是（ ）
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A. 过程①常利用涂布器蘸取0.1 mL菌液涂布平板
B. 过程②可根据芽孢杆菌菌落的形态、颜色进行挑选
C. 若甲、乙、丙三个平板的平均菌落数为12 个，则10 g土样中芽孢杆菌约有
1.2×10
9个
D. 实验筛选出的菌株仍需进行大田种植试验以检测防治效果
【答案】BD
【解析】选BD。过程①常利用移液管吸取0.1 mL
菌液，滴加到培养基表面，
然后用涂布器涂布平板，A 错误；每种细菌的菌落都有特定的形态、大小和颜
色，所以过程②可根据芽孢杆菌菌落的形态、颜色进行挑选，B 正确；若甲、
乙、丙三个平板的平均菌落数为12 个，不符合30～300 的菌落计数要求，故不
能进行计算，C 错误；筛选出的菌株需要进一步确定其抑制番茄枯萎病菌的效
果，所以需进行大田种植试验，以检测防治效果，D 正确。
10．[2024·泰州高三一模]某种物质A（一种含有C、H、N的有机物）难以降
解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究人员按照下图所示流程
从淤泥中分离得到能高效降解A 的细菌菌株。图中③将M中的菌液稀释一定倍
数后，取0.1 mL涂布到平板上，初步估测摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为
2.4×10
8个。相关叙述正确的是（ ）
A. 实验时，淤泥及盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
B. 乙中需要加琼脂和物质A 等，实验需设平行重复实验，需另外设置空白对照
C. 步骤③的接种工具是接种环，菌落数目稳定时，大小不同的菌落形成的起始
时间一般不同
D. 若乙平板上菌落数平均为240 个，则接种的菌液的稀释倍数为10
5
【答案】BD
【解析】选BD。实验时，要从淤泥中分离得到能高效降解A 的细菌菌株，淤泥
中有菌种，因此不能对淤泥进行灭菌处理；盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸
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汽灭菌法进行灭菌，A 错误。③是用稀释涂布平板法将菌种接种到以A 为唯一
碳源和氮源的选择培养基上，因此乙为固体培养基，需要加琼脂和物质A 等，
为了提高准确度，实验需设平行重复实验，且需要另外设置空白对照，以检测
培养基配制是否合格，B 正确。乙培养基中菌落分布较均匀，③接种方法为稀
释涂布平板法，接种工具是涂布器，大小不同的菌落是分解菌分解能力不同导
致的，C 错误。若乙平板上的菌落数平均为240 个，假设稀释倍数为a，根据摇
瓶M
中1 mL
菌液中细菌数为2.4×10
8
个，在每个平板上涂布0.1 mL
稀释后的菌
液，则有240×a÷0.1=2.4×10
8，则稀释倍数a=10
5，D 正确。
11．[2024·苏锡常镇高三调研]用高盐稀态发酵法酿造的酱油风味独特、具有
复杂香气，其生产工艺流程如下图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 利用产生蛋白酶的米曲霉，可将蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸
B. 发酵阶段加入酵母菌、乳酸菌等主要用于控制米曲霉的种群密度
C. 制醪阶段提高冷冻盐水浓度，可降低杂菌污染概率，但不能缩短发酵周期
D. 灭菌阶段常采用高压蒸汽法灭菌以保证酱油的品质和风味
【答案】AC
【解析】选AC。米曲霉可产生蛋白酶将蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，A
正确；酵母菌、乳酸菌在发酵阶段加入，也为发酵菌种，它们产生的酶可以分
解蛋白质、脂肪，增加酱油的香味、口感、营养价值，B 错误；制醪阶段提高
冷冻盐水浓度，降低温度，能降低杂菌污染的概率，但不能缩短发酵周期，C
正确；灭菌阶段不能采用高压蒸汽法灭菌，D 错误。
三、非选择题
12．我国早在公元前22 世纪就采用发酵法酿酒，制酱、制醋、制腐乳、制泡菜
等也具有悠久的历史。回答下列问题：
（1） 传统啤酒酿造的发酵过程是在敞开式发酵池中进行的，麦芽汁中接种酵
母菌后通入大量无菌空气，之后会产生大量气体翻腾逸出，形成厚厚的气泡层。
其中，气泡层起__________的作用，有利于酒精的生成。
（2） 制作泡菜时煮沸的盐水须冷却后再倒入装好干净蔬菜的坛中，以免高温
__________________________。
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发酵过程中，除乳酸菌外，其他微生物在密封发酵2 天后均大幅度减少，主要
原因是__________________________________________________。
（3） 乳酸菌常用于制作酸奶等发酵食品。制作酸奶时，若牛奶中含有抗生素，
会影响酸奶的制作效果，原因是________________________________。
（4） 研究人员为探究发酵温度对红树莓果酒发酵的影响做了相关实验，得到
下图结果：
① 据图可知，发酵的最适温度是24 ℃，理由是该温度时
____________________________。
② 发酵进行一段时间后残糖量不再降低，推测原因可能是
________________________________。
【答案】（1） 隔绝空气
（2） 杀死蔬菜表面的乳酸菌；只有乳酸菌能耐受酸性且缺氧的发酵液环境
（3） 抗生素能抑制乳酸菌的生长
（4） ① 残糖量最低，酒精度最高
② 酒精度过高导致酵母菌死亡
13．链孢霉是食用菌生产过程中常产生的一种竞争性真菌，具有危害范围广、
繁殖快、防治困难等特点。研究人员从菌袋的污染部位挑取链孢霉孢子，进行
了下图所示实验，所得实验结果（即菌落直径，单位：mm）如下表所示。回答
下列问题：
杀菌剂种类
不同稀释倍数下的菌落直径
100
300
百菌清
5.5
11.8
多菌灵
2.3
6.3
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霉菌克星
1.6
5.7
高效洁霉净
1.4
5.3
链孢克星
0
4.4
克霉灵
0
3.5
（1） 图中除了____________外，其余操作均需在燃烧的酒精灯火焰附近进行。
步骤①为配制好的PDA培养基经________________法灭菌后，冷却至不烫手
（或50 ℃左右），实验组分别加入
____________________________________________，然后进行步骤②。
（2） 接种②是使用________（填接种工具）将孢子悬液用________________
法接种在培养基表面。分析表中数据，可以得到的实验结论有
_____________________________________________________________________
_________________________（答出两点即可）。
（3） 链孢霉虽可采用化学药剂防治，但因存在
____________________________（答出两点即可）等缺点，研究者欲尝试分离
纯化能抑制链孢霉生长的细菌，采用上图中接种方法，将分离得到的单株纯化
细菌接种到接种有链孢霉的培养基平板上培养3 天，若某细菌和链孢霉之间存
在拮抗线（两个不同的菌种相互抵御对方的侵入，从而在两个菌种之间形成一
条深色线），则说明____________________________。
【答案】（1） 配制培养基；高压蒸汽灭菌；等量不同种类、不同稀释倍数的
杀菌剂
（2） 涂布器；稀释涂布平板；6 种杀菌剂对链孢霉均有抑菌作用、稀释100
倍的克霉灵及链孢克星的抑菌作用最好
（3） 污染环境、易产生抗药性；该细菌可抑制链孢霉生长
专题十四 细胞工程与基因工程
1.植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术。 2.动物细胞
工程包括细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞的应用等技术。 3.对动物早期
胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体。 4.基因工程是一种DNA重组
技术。 5.蛋白质工程是基因工程的延伸。 6.转基因产品的安全性引发社会的广
泛关注。 7.我国禁止生殖性克隆人。 8.世界范围内应全面禁止生物武器。
大概念整合·一览纵横
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【答案】细胞的全能性； 细胞增殖； 细胞质膜的流动性； 细胞核的全能性；
获能； 桑葚胚、囊胚； 将内细胞团均等分割； 限制酶； 利用PCR
获取和扩
增； 基因表达载体的构建； 分子水平； 基因
命题点1 植物细胞工程
知识整合 融会贯通
1．植物细胞工程的两大技术
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【答案】全能性
2．植物组织培养的条件
（1） 植物组织培养的关键
①条件：②____，一定营养物质（添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压），
激素（生长素、细胞分裂素）等。
②培养基状态：固体培养基。（加入的琼脂不能被利用）
③体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。
（2） 植物激素的使用
生长素与细胞分裂素的比值
作用效果
高
促进根分化、抑制③__形成
低
促进芽分化、抑制根形成
适中
促进④__________形成
【答案】（1） 离体
（2） 芽；愈伤组织
3．植物体细胞杂交的关键
（1）酶解法——用⑤__________和⑥________去除细胞壁。
（2）融合的方法（不能利用病毒融合法）——聚乙二醇( PEG)法、电融合法等。
（3）杂种细胞的形成标志——⑦__________的形成。
（4）培养杂种植株的技术——植物组织培养。
（5）杂种植株培育成功的原理——细胞具有全能性。
【答案】纤维素酶； 果胶酶； 新细胞壁
真题研究 体验领悟
【最新考情】
1．[2024·江苏选择考]图示植物原生质体制备、分离和检测的流程。下列相关
叙述正确的是（ ）
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A. 步骤①添加盐酸以去除细胞壁
B. 步骤②吸取原生质体放入无菌水中清洗
C. 原生质体密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间
D. 台盼蓝检测后应选择蓝色的原生质体继续培养
【答案】C
【解析】选C。步骤①添加纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，其原理是酶的专一
性，A 错误；步骤②吸取原生质体放入等渗溶液中清洗，放入无菌水中会导致
原生质体吸水涨破，B 错误；结合题图可知原生质体处于甘露醇和蔗糖溶液之
间，因而可推测原生质体的密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间，C 正确；
台盼蓝检测后应选择无色的原生质体继续培养，因为染成蓝色的原生质体活性
较差或已死亡，D 错误。
2．[2023·江苏选择考]研究者通过体细胞杂交技术，探索利用条斑紫菜和拟线
紫菜培育杂种紫菜。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 从食用紫菜的动物消化道内提取蛋白酶，用于去除细胞壁
B. 原生质体需在低渗溶液中长期保存，以防止过度失水而死亡
C. 检测原生质体活力时可用苯酚品红或甲紫溶液处理，活的原生质体被染色
D. 聚乙二醇促进原生质体融合后，以叶绿体颜色等差异为标志可识别杂种细胞
【答案】D
【解析】选D。从食用紫菜的动物消化道内提取的蛋白酶不能用于去除细胞壁，
因为紫菜细胞的细胞壁主要成分是纤维素和果胶，A 错误；获得的原生质体若
处在低渗溶液中会吸水涨破，B 错误；检测原生质体活力时可用台盼蓝染液染
色，活的原生质体不能被染色，C 错误；聚乙二醇可促进原生质体融合，对于
杂种细胞可以叶绿体颜色等差异为标志来进行识别，D 正确。
［把脉高考］该知识点为中低频考点。试题情境常与生活、生产、育种紧密联
系，考查教材知识的内涵和外延。
【历年考情】
辩正误
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（1） [2022·辽宁T14]宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体。（ ）
（2） [2022·浙江1 月T7]农作物秸秆的回收利用方式很多，其中之一是将秸
秆碎化后作为食用菌的栽培基质。碎化秸秆中纤维所起的作用，相当于植物组
织培养中固体培养基的琼脂+蔗糖。（ ）
（3） [2021·江苏T5]植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得
的再生苗不会出现变异。（ ）
（4） [2018·江苏T22 改编]植物体细胞杂交过程中，需先脱分化再诱导融合。
（ ）
【答案】（1） ×
（2） √
（3） ×
（4） ×
练表达
（5） [2022·浙江T29（3）]为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌
种，通过__________后再筛选获得，或利用转基因、________________等技术
获得。
（6） [2020·天津T15（1）]在诱导形成愈伤组织阶段时通常选择茎尖、幼叶
等作为外植体，原因是
____________________________________________________。
（7） [经典高考题]
① 植物快速繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种快
速繁殖技术的特点有______________________________________________（答
出2 点即可）。
② 用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植
物____进行组织培养。
【答案】（5） 人工诱变；原生质体融合
（6） 提示：细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织
（7） ① 能保持优良品种的遗传特性、繁殖速度快
② 茎尖
题组模拟 素养提升
1．[2024·扬州四校高三联考]为实现多肉植物的规模化生产，科研人员开展了
如下研究。下列相关叙述正确的是（ ）
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A. 过程①宜选择成熟叶片，分别用氯化汞和70 %的酒精浸泡30 s
B. 过程②应避光培养，防止愈伤组织分化成筛管、维管等
C. 过程③应配制2 种培养基，其主要目的是满足不同阶段试管苗对营养的需求
D. 过程④应在珍珠岩中添加适量蔗糖，为幼苗生长提供碳源
【答案】B
【解析】选B。过程①宜选取幼嫩叶片，选取的叶片应该在体积分数为70 % 的
酒精浸泡10 s
后，再用无菌水冲洗2∼3
次，用无菌滤纸吸干表面水分，浸没在
质量分数为0.1% 的氯化汞溶液中约5 min，A 错误；过程②诱导愈伤组织期间
一般不需要光照，目的是防止愈伤组织分化成筛管、维管等，B 正确；过程③
应配制2 种培养基，其主要目的是满足不同阶段试管苗对特定激素的需求，生
长素浓度/细胞分裂素浓度值高有利于根的形成，生长素浓度/细胞分裂素浓度值
低有利于芽的形成，C 错误；过程④将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等
环境中生活一段时间后，再移栽到大田土壤中，此过程不需要在珍珠岩中添加
适量蔗糖作为碳源，D 错误。
2．[2024·南通高三二模]（多选）三白草和鱼腥草因疗效相近且具有叠加效应
常被中医用作“药对”。研究者欲利用原生质体融合技术将复方的配伍（两种
或两种以上药物配合使用）提前到杂种细胞，并实现有效成分的工厂化生产，
操作如下图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A. ①过程可用盐酸和酒精混合液(1:1)配制的解离液来完成
B. ②过程通常在略高渗溶液中采用灭活的病毒诱导原生质体融合
C. ③过程融合的原生质体需先形成细胞壁再进行有丝分裂
D. ④过程配制培养基时需要添加植物生长调节剂和琼脂
【答案】ABD
【解析】选ABD。过程①为获得原生质体的过程，此过程要利用纤维素酶和果
胶酶去除细胞壁，然后用低速离心等方法分离纯化获得原生质体，盐酸和酒精
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混合液(1:1)
配制的解离液会杀死细胞，A 错误；过程②通常在等渗或略高渗溶
液中采用化学融合法（如PEG
法）或物理融合法（如电融合法）诱导原生质体
融合，不能用灭活的病毒诱导，B 错误；杂种原生质体再生出细胞壁是杂种细
胞形成的标志，只有先形成杂种细胞，才能进行有丝分裂，C 正确；④过程配
制的培养基用于培养愈伤组织细胞来获得细胞产物，该培养基是液体培养基，
且不需要加入植物生长调节剂，D 错误。
命题点2 动物细胞工程及胚胎工程
知识整合 融会贯通
1.
2．单克隆抗体的制备（原理：细胞质膜的流动性、细胞增殖）
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【答案】特定的抗原蛋白； 特定抗体
3．动物体细胞克隆技术（核移植技术）（原理：动物细胞核的全能性）
【答案】中期Ⅱ； 去核； 重组细胞
［易错提醒］核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个
原因：
（1）克隆动物的遗传物质来自两个亲本。
（2）发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。
（3）外界环境可能引起不可遗传的变异。
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4．胚胎移植（“胚胎”来自合优良性状的“自然”胚胎，转基因技术、核移植
技术等形成的胚胎）的操作流程及生理基础
（1）操作流程
（2）生理学基础
【答案】超数排卵； 妊娠
5．胚胎分割
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【答案】桑葚胚或囊胚； 动物的无性繁殖或克隆
真题研究 体验领悟
【最新考情】
1．[2024·江苏选择考]（多选）从牛卵巢采集卵母细胞进行体外成熟培养，探
究高温对卵母细胞成熟的影响，结果如图所示。下列相关叙述错误的有（ ）
A. 选取发育状态一致的卵母细胞进行培养
B. 体外培养卵母细胞时通常加入湿热灭菌后的血清
C. 对采集的卵母细胞传代培养以产生大量卵细胞
D. 体外培养时高温提高了卵母细胞发育的成熟率
【答案】BCD
【解析】选BCD。选取发育状态一致的卵母细胞进行培养，这样可以排除其他
因素的干扰，保证实验结果是由温度这一变量引起的，A 正确；体外培养卵母
细胞时通常加入血清，但是动物血清并不能进行湿热灭菌，否则会使其中部分
有效成分失活，B 错误；卵母细胞不能进行传代培养，因为卵母细胞是生殖细
胞，不具有连续分裂的能力，C 错误；由图可知，高温降低了卵母细胞发育的
成熟率，而不是提高，D 错误。
2．[2023·江苏选择考]（多选）我国科学家利用猴胚胎干细胞首次创造了人工
“猴胚胎”，研究流程如图所示。下列相关叙述正确的有（ ）
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A. 猴的成纤维细胞和胚胎干细胞功能不同，但具有相同的基因组
B. 囊胚细胞②③都由细胞①分裂分化形成，但表达的基因都不同
C. 移植前细胞和囊胚的培养都要放在充满CO2的培养箱中进行
D. 移植后胚胎的发育受母体激素影响，也影响母体激素分泌
【答案】AD
【解析】选AD。由于猴的成纤维细胞和胚胎干细胞都由猴胚胎干细胞分裂分化
而来，故二者虽然功能不同，但基因组相同，A 正确；囊胚细胞②③都由细胞
①分裂分化形成，表达的基因有一部分相同（如呼吸酶基因），B 错误；培养
箱中没有CO2
会影响细胞的正常生长，但CO2
浓度过高也会影响细胞的正常生长，
因此移植前细胞和囊胚的培养不能放在充满CO2
的培养箱中进行，C 错误；胚
胎移植后胚胎的发育受母体激素影响，也影响母体激素分泌，D 正确。
［把脉高考］ 该知识点为高频考点。试题常结合免疫调节和基因工程进行综合
考查，涉及人体健康、制药，渗透社会责任。
【历年考情】
辩正误
（1） [2023·湖南T21]研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自
组装或与成熟细胞组装成肺类装配体。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、
温度、渗透压、pH、无菌、无毒环境、含95 %空气和5 %CO2的气体环境等基本
条件。（ ）
（2） [2023·北京T12]研究者制备单克隆抗体用于快速检测甲状旁腺激素
( PTH )，制备过程中能筛选分泌多种抗体的单个杂交细胞。（ ）
（3） [2023·广东T3]科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植
到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种
群数量。此过程不涉及精子获能处理。（ ）
（4） [2023·浙江1 月T12]胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。（ ）
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（5） [2022·湖北T7]某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现
其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是血清经过高温处理后加入培养
基。（ ）
（6） [2021·江苏T11]将骨髓瘤细胞和B 淋巴细胞混合，经诱导后融合的细
胞即为杂交细胞。（ ）
（7） [2021·江苏T11]早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体
内发育成个体。（ ）
（8） [2018·江苏T10]胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚
胎的排斥反应。（ ）
【答案】（1） √
（2） ×
（3） ×
（4） ×
（5） ×
（6） ×
（7） √
（8） ×
练表达
（9） [2023·湖北T22（1）（2）（3）]
① 添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞质膜的作用是
_____________________________________________________________________
_________________________________________。
② 在杂交细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培
养基对________________________和____________________________生长具有
抑制作用。
③ 单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是
____________________________________________________________。
（10） [2022·全国甲T38（1）（3）]
① 为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是__________。
在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是
_____________________________________________________________________
___________。
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② 请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具
有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是
____________________________________________________________________。
【答案】① 提示：使细胞接触处细胞质膜的脂类分子发生疏散和重组，从而导
致细胞质膜相互亲和，促进融合
② 未融合的（亲本）细胞；融合的具有同种核的细胞
③ 通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交细胞
（10） ① 冷冻保存；刚排出的精子不能与卵子受精，只有获能后才具备受精
能力（合理即可）
② 对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植
题组模拟 素养提升
突破1 动物细胞的培养及核移植
1．灭活疫苗是将培养扩增的活病毒通过物理或化学手段灭活后，经过系列纯化
制备的生物制剂。国产新冠病毒灭活疫苗的大致生产流程如下，将抗原性强的
病毒接种到Vero细胞中培养，再使病毒经过β -丙内酯灭活等过程制备成疫苗。
下列相关说法错误的是（ ）
A. Vero细胞的细胞质膜上存在新冠病毒能够特异性识别的受体
B. 培养Vero细胞时，需要对培养液和所有培养用具进行灭菌，以保证无毒的环
境
C. 培养时，需将Vero细胞置于含95 %空气和5 % CO2的气体环境中
D. β -丙内酯灭活会使新冠病毒失去感染能力但不会破坏其抗原结构
【答案】B
【解析】选B。由题意可知，生产疫苗时用Vero 细胞培养新冠病毒，因此Vero
细胞的细胞质膜上存在新冠病毒能够特异性识别的受体，A 正确；培养Vero 细
胞时，需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理，以保证无菌的环境，B 错
误；需将Vero
细胞置于含有95 %
空气和5 % CO2
的混合气体的CO2
培养箱中进行
培养，C 正确；β -丙内酯灭活会使新冠病毒失去感染能力，但不会破坏其表面
的蛋白结构，保留其抗原性，D 正确。
2．[2024·苏锡常镇四市高三二模]下列关于体细胞克隆猴的叙述正确的是
（ ）
A. 核移植操作之前，必须先用显微操作法对供核细胞进行取核
B. 重组细胞需用物理或化学方法激活，以进行细胞分裂和发育进程
C. 用遗传背景相同的克隆猴进行药物筛选，可避免实验误差
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D. 体细胞核移植的理论研究较为透彻，技术研究较为滞后
【答案】B
【解析】选B。核移植操作之前，可以不用显微操作法对供核细胞进行取核，
可以直接将供核细胞完整地注入受体的去核卵母细胞中，A 错误；用物理或化
学的方法激活重组细胞，使其完成细胞分裂和发育进程，进而通过培养获得可
移植的早期胚胎，B 正确；用遗传背景相同的克隆猴进行药物筛选，使实验结
果更具有说服力，不可避免实验误差，C 错误；相对于技术研究，核移植的理
论研究较为滞后，D 错误。
突破2 动物细胞融合及单克隆抗体
3．[2024·苏锡常镇四市高三一模]曲妥珠单抗是抗人表皮生长因子受体
( HER2)的单克隆抗体，能竞争性阻止人表皮生长因子与HER2结合，进而抑制
乳腺癌细胞生长。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 乳腺癌细胞具有无限增殖的能力，因此体外培养癌细胞时只需提供血清
B. 曲妥珠单抗制备时至少需要2 次筛选，第2 次筛选常用选择培养基进行
C. 曲妥珠单抗本身不具备治疗乳腺癌的作用，只有携带抗癌药物才起作用
D. 乳腺癌细胞中人表皮生长因子受体基因的表达量一般比正常乳腺细胞高
【答案】D
【解析】选D。乳腺癌细胞属于动物细胞，因此体外培养癌细胞时不仅需要血
清，还需要营养物质、气体环境、无菌无毒环境等，A 错误；曲妥珠单抗制备
时至少需要2 次筛选，第1 次筛选常用选择培养基进行，第2 次筛选利用多孔
培养皿培养和抗原—抗体杂交法，获得产生特定抗体的杂交细胞，B 错误；由
题干可知，曲妥珠单抗本身可以具备治疗乳腺癌的作用，C 错误；乳腺癌细胞
具有无限增殖的能力，生长因子与生长因子受体( HER2)
结合后能促进细胞增殖，
推测乳腺癌细胞中人表皮生长因子受体基因的表达量一般比正常乳腺细胞高，
D 正确。
4．[2024·南通高三二模]（多选）研究表明，髓系细胞触发受体2(TREM 2)是
一种免疫抑制受体，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。因此，TREM 2抗体药物
有望提高肿瘤免疫疗法的疗效。下图为TREM 2单克隆抗体的制备流程图，相关
说法正确的是（ ）
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A. 步骤①和⑤分别向小鼠注射TREM 2蛋白和TREM 2抗体
B. 步骤③筛选得到的细胞需传代培养以防止出现接触抑制
C. 植物组织培养需要的气体条件和步骤⑥不同
D. TREM 2单克隆抗体的使用可以增强免疫系统的监控功能
【答案】CD
【解析】选CD。步骤①向小鼠注射TREM 2
蛋白，让小鼠发生免疫反应，获得
能产生抗体的B 淋巴细胞；步骤⑤向小鼠腹腔注射杂交细胞，目的是获得单克
隆抗体，A 错误。步骤③筛选得到的是杂交细胞，能无限增殖，不会出现接触
抑制，B 错误。动物细胞培养过程中加入二氧化碳用于调节培养液的pH，而植
物组织培养的过程中不需要二氧化碳培养箱，C 正确。TREM 2单克隆抗体具有
特异性，能与TREM 2
特异性结合，提高肿瘤免疫疗法的疗效，增强免疫系统的
监控功能，D 正确。
突破3 胚胎工程的综合应用
5．[2024·泰州高三一模]（多选）医学和农业生产上经常应用胚胎工程技术，
相关叙述错误的是（ ）
A. 为使雌性动物超数排卵，可在其饲料中添加适量的促性腺激素
B. 可以使用雄性动物获能的精子与成熟的卵母细胞完成受精作用
C. 早期胚胎中初次发生分化的细胞一部分形成内细胞团，将来发育成胎盘和胎
膜
D. 为提高胚胎利用率，可采用胚胎分割等无性繁殖技术
【答案】AC
【解析】选AC。促性腺激素属于蛋白质类激素，在饲料中添加促性腺激素，其
会因在动物的消化道中被分解而失去促进超数排卵的作用，A 错误；雄性动物
新鲜的精子获能后才具备受精能力，因此，可以使用雄性动物获能的精子与成
熟的卵母细胞完成受精作用，B 正确；内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，C
错误；可采用胚胎分割等无性繁殖技术提高胚胎利用率，D 正确。
6．[2024·南通高三调研]（多选）我国学者成功构建了胚胎干细胞广泛参与形
成各种组织、器官，甚至胎盘和生殖细胞的嵌合体猴，过程如下图所示，相关
叙述正确的是（ ）
A. 甲猴胚胎干细胞的遗传信息可遗传给嵌合体猴的后代
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B. ①过程中，应选择处于囊胚期的乙猴早期胚胎
C. ②过程前，对受体猴进行超数排卵和同期发情处理
D. 本研究对理解灵长类胚胎干细胞全能性具有重要意义
【答案】AD
【解析】选AD。甲猴胚胎干细胞的遗传信息可出现在睾丸中，因此可遗传给嵌
合体猴的后代，A 正确；由题图可知，①过程中，应选择处于桑葚胚期的乙猴
早期胚胎，B 错误；②过程前，对受体猴进行同期发情处理，对供体母猴进行
超数排卵，C 错误；胚胎干细胞具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任
何一种组织细胞，本研究对理解灵长类胚胎干细胞全能性具有重要意义，D 正
确。
命题点3 基因工程、生物技术安全与伦理问题
知识整合 融会贯通
1．基因工程的操作流程
（1）目的基因的获取
［易错提醒］（1）目的基因主要是指编码蛋白质的基因。
（2）在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。
（3）当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。
（2）基因表达载体的构建——重组质粒的构建
［易错提醒］（1）基因工程中的载体与细胞质膜上的载体不同。
（2）启动子、终止子
①启动子（DNA片段）≠起始密码子（位于mRNA上）。
②终止子（DNA片段）≠终止密码子（位于mRNA上）。
③目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
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④利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺蛋白基因的启动子连
接到一起。
（3） 将目的基因导入受体细胞
［易错提醒］农杆菌转化法中的“两个两次”
（4） 目的基因及其表达产物的检测鉴定
【答案】（3） Ca
2+处理法
（4） DNA分子杂交；分子杂交；抗原—抗体
2．蛋白质工程
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【答案】设计改造； 新的蛋白质； 蛋白质结构； 相关DNA
序列
3．生物技术安全与伦理问题
（1）理性看待转基因技术
①清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
②看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
③靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
（2）我国对转基因技术的方针是一贯的、明确的,就是研究上要大胆,坚持自主
创新；推广上要慎重,做到确保安全；管理上要严格,坚持依法监管。
（3）治疗性克隆与生殖性克隆的关系
项目
类型
治疗性克隆
生殖性克隆
区别
目的
用于医学研究和治疗疾病
用于生育，获得人的复制品
水平
细胞、组织或器官水平
个体水平
联系
都属于无性生殖；产生的新个体或新组织遗传信息相同
（4）区分试管婴儿和设计试管婴儿
①设计试管婴儿比试管婴儿多出的是过程⑨______。
②试管婴儿主要解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿可用于致命血液病等
疾病的治疗。
【答案】d
真题研究 体验领悟
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【最新考情】
1．[2024·江苏选择考]为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将
EL P50片段插入pET — SOD构建重组质粒pET — SOD — EL P50，以融合表达
SOD — ELP50蛋白，过程如图1。其中，EL P50是由人工合成的DNA片段，序列
为：限制酶a识别序列—(GTTCCTGGTGTTGGC )50 —限制酶b识别序列，50 为
重复次数。请回答下列问题：
图1
（1） 步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是
________________________。
（2） 步骤②转化时，科研人员常用____________处理大肠杆菌，使细胞处于
感受态；转化后的大肠杆菌采用含有__________的培养基进行筛选。用PCR技
术筛选成功导入pET — SOD — EL P50的大肠杆菌，应选用的一对引物是
____________________。
（3） 步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译
SOD — ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，
将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是
______（从图2 的“A ∼D”中选填）。
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图2
（4） 步骤④为探寻高效纯化SOD — ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、
NaCl对SOD — ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。
图3
（ⅰ） 20 ℃时，加入NaCl后实验结果是
__________________________________________。
（ⅱ） 100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是__________________。
（ⅲ） 据图分析，融合表达SOD — ELP50蛋白的优点有
_____________________________________________________________________
_______________________。
【答案】（1） Eco RⅠ、HindⅢ
（2） CaCl2；卡那霉素；S - F和E - R
（3） 启动子；C
（4） （ⅰ） SOD — ELP50组纯化蛋白数量更多
（ⅱ） 高温使蛋白变性
（ⅲ） 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的
保持
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【解析】
（1） 目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，EL P50应插入
pET — SOD
之后，由题图可知，限制酶a
和限制酶b
分别是Eco RⅠ、HindⅢ。
（2） 将目的基因导入大肠杆菌时常用CaCl2
处理大肠杆菌，使其处于感受态。
由题图可知，重组DNA
含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆
菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET — SOD — EL P50
同时含
有pET — SOD
和EL P50，结合图示可知，选引物S — F
和E — R
可特异性对
pET — SOD — EL P50 进行扩增。
（3） RNA
聚合酶与启动子结合后，启动转录。已知蛋白质中氨基酸残基的平
均相对分子质量约为0.11 kDa,SOD为462 bp、ELP50为750 bp，则形成的
SOD — ELP50
蛋白质大约含有(462+750)÷3= 404
个氨基酸，则SOD — ELP50
蛋
白相对分子质量为0.11×404 = 44.44 kDa，电泳后应该为条带C。
（4） （ⅰ） 由题图可知，20 ℃时，与不加NaCl 相比，加入NaCl 后纯化蛋
白数量更多。
（ⅱ） 100 ℃
时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。
（ⅲ） 20 ℃，加入NaCl
时，与SOD
组相比，SOD — ELP50组沉淀中蛋白质相
对含量较高，说明低温下添加NaCl
有利于SOD
蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于
酶活性的保持。
2．[2023·江苏选择考]为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用
重组酶技术构建质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
图1
（1） 分别进行PCR扩增片段F 1与片段F 2时，配制的两个反应体系中不同的
有__________________________________________，扩增程序中最主要的不同
是____。
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（2） 有关基因序列如图2。引物F 2- F、F 1- R应在下列选项中选用__。
EGFP基因序列：5' ATGGTGAGCAAGGGC ⋯⋯GACGAGCTGTACAAG3'
AnB1基因序列：5' CATGTCCAGCTGCAG⋯⋯CCAAAACCACAACCA 3'
图2
A. ATGGTG⋯⋯CAACCA
B. TGGTTG⋯⋯CACCAT
C. GACGAG⋯⋯CTGCAG
D. CTGCAG⋯⋯CTCGTC
（3） 将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质
粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的
酶主要有________________________________。
（4） 转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有
______。
A. 稀释涂布平板需控制每个平板30∼300个菌落
B. 抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C. 抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D. 抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
（5） 为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，
用引物F 1- F和F 2- R进行了PCR扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图
3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。
图3
（6） 对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确
认，原因是
_____________________________________________________________________
_________________________________________________。
【答案】（1） 模板（片段F 1、片段F 2）、引物；引物
（2） CD
（3） 限制性内切核酸酶（限制酶）
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（4） C
（5） P3、P4
（6） 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待
检测DNA分子的碱基序列
【解析】
（1） PCR 反应进行的条件：引物对、Taq酶、dNTP、模板、缓冲液和Mg
2+
等。
分别进行PCR
扩增片段F 1
与片段F 2
时，配制的两个反应体系中不同的有模板
（片段F 1、片段F 2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两
条链的3'
端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR
反应成败的最重要因
素，因此扩增程序中最主要的不同是引物。
（2） 由题图1 可知，引物F 2- F
的部分序列能与F 1 片段( EGFP)
进行碱基互
补配对，引物F 1- R
的部分序列能与F 2
片段( AnB1)
进行碱基互补配对，据此可
推出引物F 2- F、F 1- R应选择C、D 项。
（3） 传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其
具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA
连接酶将目的基因和质粒连接
成重组质粒。将PCR
产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA
连接酶的作用下
可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）。
（4） 用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，应选择有30～300
个菌落的平板，A 正确；培养基温度太高会将接种的菌种杀死，导致抗性平板
上无法长出菌落，B 正确；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，
一般含有重组质粒的大肠杆菌才能长出菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，
C 错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布
平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D 正确。
（5） EGFP 为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为
720 bp+390 bp=1 110 bp，用引物F 1- F
和F 2- R
进行了PCR
扩增，其大小
接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6） 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA
分子的大小，无法确定待
检测DNA
分子的碱基序列，因此对于PCR
产物电泳结果符合预期的质粒，通常
需进一步通过基因测序确认。
［把脉高考］ 基因工程和蛋白质工程代表了生物科学技术的前沿，体现了生物
科学的应用性和创新性，因此该知识点属于高频考点，也是高考的必考点，试
题情境专业性较强，常涉及PCR、电泳技术和基因表达的调控机制等。基因工
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程也常与细胞工程、遗传、育种等知识联系并结合生活、生产、临床实践，探
究科技前沿，渗透生命观念和社会责任。
【历年考情】
辩正误
（1） [2023·全国乙T38]启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因
翻译。（ ）
（2） [2022·山东T25]两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对。
（ ）
（3） [2022·山东T20]通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短
啤酒的发酵周期。（ ）
（4） [2021·湖北T16]某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除
目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2 条非特异条带（引物和模板
不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，可以提高退火的温度。
（ ）
（5） [2020·天津T11]目的基因是基因工程的关键要素，必须从动物、植物
或微生物的基因组文库中直接获取。（ ）
（6） [2019·江苏T16]将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行
基因治疗，改造后的遗传物质不会遗传给子代。（ ）
【答案】（1） ×
（2） √
（3） √
（4） √
（5） ×
（6） √
练表达
（7） [2023·全国甲T38（1）（4）]乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫
苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。
回答下列问题。
① 接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是
____________________________________________________________________。
② 若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出
实验思路。
_____________________________________________________________________
_______________________。
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（8） [2022·全国乙T38（4）]已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）
的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大
量蛋白S。基因工程的基本操作流程是
_____________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
（9） [2022·湖北T22（4）]制备转基因植物时，用农杆菌侵染植株叶片外植
体，其目的是________________________________________________________。
（10） [2022·广东T22（2）]研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在
梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启
动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
________________________________________________________，
终止子的作用是____________________________________________。
【答案】① 提示：重组乙肝疫苗主要成分为蛋白质，无法在宿主体内增殖
② 通过使用相应抗体，利用抗原—抗体杂交技术，检测目的基因是否翻译形成
蛋白质
（8） 目的基因的获取→ 基因表达载体的构建→ 将目的基因导入受体细胞→
目的基因及其表达产物的检测鉴定
（9） 通过农杆菌的转化作用，使目的基因插入植物细胞
（10） 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞；终止转录，使转录
在需要的地方停下来
题组模拟 素养提升
突破1 基因工程的操作步骤及应用
1．[2025·南京、盐城高三调研]透明质酸是一种应用广泛的黏多糖，研究者欲
改造枯草芽孢杆菌，通过添加诱导型启动子来协调菌体生长与产物生产之间的
关系。回答下列问题：
（1） 图1 中透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，由此可以推测基因H
的转录是从其____（填“左侧”或“右侧”）开始的。透明质酸合成酶基因H
上的一段核苷酸序列为“— ATCTCGAGCGGG —”，则对该序列进行剪切的限
制酶X ho Ⅰ识别的核苷酸序列（6 个核苷酸）最可能为
__________________________________。
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图1
（2） 为通过外源添加诱导剂来控制基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型
启动子的p质粒。为保证图1 中酶切后的基因H按照正确的方向与p质粒连接，
p质粒上位点1 和2 应分别含限制酶________________________的识别序列，基
因H与p质粒经双酶切后，应加入______________酶使它们形成重组质粒。
（3） 为协调菌体生长与产物生产之间的关系，将构建好的重组质粒转入经
______________________________处理的枯草芽孢杆菌（D 菌），在含
________的培养基上进行筛选，得到枯草芽孢杆菌E（E菌）。对E菌进行工业
化培养时，应先以蔗糖为唯一碳源，接种2 小时后添加____，以诱导E菌产生
更多的透明质酸。
（4） 质粒在细菌细胞中易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源
区段互换的方法将基因H插入枯草芽孢杆菌D 的基因组mpr位点，得到整合型
枯草芽孢杆菌F（F菌）。请在图2 方框中画出F菌的基因组。
图2
（5） 对三种枯草芽孢杆菌进行培养，结果如图3，________最适合用于工业
发酵生产透明质酸，请阐明理由：
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
__________________。
图3
【答案】（1） 右侧；— CTCGAG —或— GAGCTC —
（2） X hoⅠ和BsaⅠ；DNA连接
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（3） Ca
2+（或CaCl2）；四环素；木糖
（4） 如图所示
（5） F菌；F菌较E菌生长迅速，透明质酸产量较高，培养基中不需要添加四
环素，且F菌的基因H整合到了细菌DNA上，不易丢失
【解析】
（1） 基因的转录方向是5' →3'，由于图1 中基因H
的a 链为转录模板链，故基
因H
的转录是从其右侧开始的。限制酶所识别的序列一般都具有反向对称、重
复排列的特点，故推测对该序列进行剪切的限制酶X ho Ⅰ识别的核苷酸序列最
可能为— CTCGAG —
或— GAGCTC —。
（2） 已知转录的方向是5' →3'，再结合图1 质粒中启动子的方向可知，图1
中p 质粒位点1 和2 应分别含限制酶X ho Ⅰ和Bsa Ⅰ的识别序列。DNA连接酶
可以连接DNA
片段，基因H
和p
质粒经双酶切后可使用DNA
连接酶连接。
（3） 将目的基因导入枯草芽孢杆菌常用Ca
2+
处理受体细胞，使受体细胞变得
容易接受外来的DNA
分子的生理状态。由图1 可知，p质粒含有四环素抗性基
因，因此可在含四环素的培养基上筛选重组质粒。由于枯草芽孢杆菌E（E菌）
中存在木糖诱导型启动子，因此对E
菌进行工业化培养时，应先以蔗糖为唯一
碳源，接种2 小时后可添加木糖，以诱导E 菌产生更多的透明质酸。
（5） 由图3 可知，D菌不产生透明质酸，F菌比E 菌更适合用于工业发酵生产
透明质酸，原因是F
菌生长较迅速，透明质酸产量较高，培养基中不需要添加
四环素，且F
菌的基因H
整合到了细菌DNA
上，不易丢失。
2．烟草易受烟草花叶病毒(TMV )感染而大幅度减产。绞股蓝（一种植物）细胞
中含有抗TMV 的基因，能抵抗TMV 感染。研究人员利用转基因技术培育出了抗
TMV 烟草。回答下列问题：
（1） 下表是相关研究中的一些步骤，请结合所学基因工程知识完成以下表格。
实验步骤
方法要点
目的基因的获取
从绞股蓝细胞中提取总RNA，通过逆转录获得
DNA；再通过①________技术扩增出大量目的基
因片段
________________________
②
将目的基因插入Ti质粒
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转化细胞
常用③____________法将重组质粒导入受体细胞
__________________
④
在含有卡那霉素的培养基上培养受体细胞
获得再生植株
运用⑤________________技术培育
转基因植株分析
从分子水平与⑥____水平上对转基因植株进行检
测鉴定
（2） 为研究干旱胁迫基因LEA和VOC对绞股蓝油脂的积累机制，科研人员构
建了两个基因表达载体。其中基因LEA与荧光素酶基因( Luc)构建成基因表达载
体甲，基因VOC和标记基因构建成基因表达载体乙，相关序列及酶切位点如下
图所示。箭头表示转录方向。
① 利用PCR扩增基因LEA时，需要在引物的__________（填“3'端”或“5'
端”）添加限制酶的识别序列，添加序列对应的限制酶是
________________________。
② 为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的
引物的碱基序列为
____________________________________________________________，扩增
______代后会得到等长的8 条DNA片段。
③ 乙酰— CoA羧化酶基因( AC )是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯脂酶
基因( ATGL)是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植
物细胞培养成转基因植株A、B，在干旱胁迫的环境下培养两种转基因植株和
正常植株，分别检测植株体内基因AC和ATGL的表达水平，结果如下图所示。
Ⅰ.在分子水平上，用________________方法检测AC酶和ATGL酶的含量可得到上
述结果。
Ⅱ.基于以上研究，干旱胁迫基因LEA和VOC在绞股蓝油脂积累中的机制是
_____________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________
______________________。
【答案】（1） PCR；基因表达载体的构建；农杆菌转化；筛选转基因细胞；
植物组织培养；个体
（2） ① 5'端；Eco RⅤ和XbaⅠ
② 5' — GATATCATGGGC — 3'和5' — TCTAGACTAGTG — 3'；4
③ 抗原—抗体杂交；在干旱胁迫的环境下，基因LEA通过促进基因AC的表达
使植物油脂增加；基因VOC通过抑制基因ATGL的表达减弱油脂的降低
【解析】
（1） 目的基因的获取：从绞股蓝细胞中提取RNA，以RNA
为模板通过逆转录
获得DNA，再通过PCR
技术扩增出大量目的基因片段；基因表达载体的构建：
将目的基因插入Ti
质粒，利用基因重组形成重组DNA；转化细胞：常用农杆菌
转化法将重组质粒导入受体细胞；筛选转基因细胞：在含有卡那霉素的培养基
上培养受体细胞，通过标记基因将含有目的基因的细胞筛选出来；获得再生植
株：利用植物细胞的全能性，运用植物组织培养技术培育；转基因植株分析：
从分子水平与个体水平上对转基因植株进行检测鉴定。
（2） ① 引物与目的基因所在DNA
分子遵循碱基互补配对原则，所以扩增基
因LEA
时，需要在引物的5'
端添加限制酶的识别序列；由于Luc
基因中存在
Bam HⅠ识别序列，Bam HⅠ会将Luc
基因切断，并且一种限制酶切割会导致载
体、基因LEA
自身环化及基因LEA
反向连接，因此选择的限制酶是Eco RⅤ和
XbaⅠ。
② 根据已知序列，由于引物只能引导子链从5'
端→3'
端延伸，根据碱基互补
配对原则，用PCR
扩增时的两个引物的碱基序列为5' — GATATCATGGGC — 3'
和5' — TCTAGACTAGTG — 3'，要得到等长的8 条DNA
片段，应该扩增4 次。
③ 在分子水平上采用抗原—抗体杂交技术检测酶的含量；根据检测结果，转基
因A
植株的AC
酶含量增加了，转基因B
植株的ATGL
酶含量降低了，可以推测
在干旱胁迫的环境下，基因LEA
通过促进基因AC
的表达使植物油脂增加；基因
VOC
通过抑制基因ATGL
的表达减弱油脂的降低。
突破2 蛋白质工程基本原理及应用
3．水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，
具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活
性。回答下列问题:
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（1） 蛋白质工程流程如图所示，物质a是________，物质b是__________。在
生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是
____________________。
（2） 蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有
____________________、__________________________________和利用PCR技
术扩增。PCR技术遵循的基本原理是______________________。
（3） 将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含
量及其抗凝血活性，结果如下图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性
差异主要与肽的____（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因
是
_____________________________________________________________________
___________________________________。
（4） 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水
蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路。
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
__________________。
【答案】（1） 多肽链；mRNA；密码子具有简并性
（2） 通过基因文库获取；通过化学合成法直接人工合成；DNA半保留复制
（3） 种类；提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋
白空间结构有不同程度破坏
（4） 取4 支试管，编号为1、2、3、4，分别加入等量的蛋白质工程改造后的
水蛭素、题述两种水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取
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同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3、4 号4 支试管中，
静置相同时间，统计4 支试管中血液凝固时间
【解析】
（1） 蛋白质工程的一般过程是先根据新蛋白质的预期功能设计蛋白质结构，
进而设计对应的氨基酸序列，在此基础上改造或合成可以产生新蛋白质的相关
DNA
序列（基因），再利用基因工程技术合成新的蛋白质。由此可知，物质a
是多肽链，物质b
是mRNA。在生产过程中，物质b
可能不同，合成的蛋白质空
间构象却相同，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。
（2） 蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有
通过基因文库获取、用化学合成法直接人工合成和利用PCR
技术扩增。PCR技
术遵循的基本原理是DNA
半保留复制。
（3） 将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据题图可知，水解产物
中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且两种酶差别不大；而水解产物的抗
凝血活性差异较大，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，产物的抗凝血活性
先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，产物的抗凝血活性
先上升后下降，且经酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理
后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝
血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的
酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
（4） 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、题述水蛭蛋白酶解产物和天然水
蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为取4 支试管，编号为1、2、3、4，分
别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、题述两种水蛭蛋白酶解产物和天然
水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的
血液加入1、2、3、4 号4 支试管中，静置相同时间，统计4 支试管中血液凝固
时间。
突破3 生物技术安全与伦理问题
4．[2024·浙江1 月选考]关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令
禁止的是（ ）
A. 试管动物的培育
B. 转基因食品的生产
C. 治疗性克隆的研究
D. 生物武器的发展和生产
【答案】D
【解析】选D。试管动物的培育属于胚胎工程，我国对此没有禁止，A 不符合
题意；我国目前不反对转基因食品的生产，B 不符合题意；我国政府坚持反对
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生殖性克隆、支持治疗性克隆，C 不符合题意；生物武器致病能力强、攻击范
围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D 符合题意。
5．（多选）为研究治疗性克隆能否用于帕金森病的治疗，科研人员利用“人帕
金森病模型鼠”进行了如图所示实验，下列相关说法正确的是（ ）
A. 上述过程体现了动物细胞的全能性
B. 过程③获取的胚胎干细胞具有细胞体积小、细胞核大、核仁明显等特点
C. 鼠皮肤细胞培养与过程②所用的培养液中都需要添加血清等物质
D. 过程⑤需要对受体小鼠注射相应的免疫抑制剂以避免发生免疫排斥反应
【答案】BC
【解析】选BC。治疗性克隆的过程没有体现动物细胞的全能性，A 错误；过程
③获取的胚胎干细胞具有细胞体积小、细胞核大、核仁明显等特点，B 正确；
鼠皮肤细胞培养与过程②所用的培养液中都需要添加血清等物质，以满足动物
细胞培养时细胞所需的营养物质，C 正确；过程⑤移植的神经元细胞由取自该
小鼠自身细胞诱导分化而来，受体小鼠不发生免疫排斥反应，故过程⑤无需注
射免疫抑制剂，D 错误。
创设情境 长句特训
事实概述类
1．植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基
因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是
__________________________________________________________________
（用流程图表示）。
【答案】含目的基因的细胞
培养
→
愈伤组织
诱导分化
→
小植株
2．在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，其目的分别是
_____________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
【答案】第一次是筛选出杂交细胞（用选择培养基）；第二次是进一步筛选出
能分泌所需抗体的杂交细胞（用抗原—抗体结合法）
3．质粒载体用Eco RⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC ⋯⋯G
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G⋯⋯CTTAA
为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用Eco RⅠ切割外，还可用
另一种限制性内切核酸酶切割，该酶必须具有的特点是
_____________________________________________________________________
_________________。
【答案】切割产生的DNA片段末端与Eco RⅠ切割产生的DNA片段末端相同
4．为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的
__________________________作探针进行分子杂交检测，又要在个体生物学水
平上进行鉴定，后者的具体过程是
_____________________________________________________________________
_________________。
【答案】抗盐基因（或目的基因）； 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土
壤中，观察该烟草植株的生长状态
5．用基因工程方法制备HIV 的某蛋白（目的蛋白）时从受体细胞中分离纯化出
目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相
应分泌蛋白是____，
该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV ，检测的原理是
__________________________。
【答案】抗体； 抗原与抗体特异性结合
原因分析类
6．若想利用植物体细胞杂交技术培养出马铃薯—草莓杂种植物，以提高土地的
利用率，____（填“能”或“不能”）把两物种细胞直接融合，理由是
________________________________________________________________。
【答案】不能； 植物细胞外面有一层细胞壁，阻碍了细胞间的杂交（融合）
7．动物体细胞进行体外培养时，________（填“需要”或“不需要”）脱分化
过程，原因是
_____________________________________________________________________
_______。
【答案】不需要； 高度分化的动物细胞分化的潜能变窄，失去发育成完整个体
的能力
8．若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作
为受体细胞，原因是
______________________________________________________________。
【答案】未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱
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实验探究类
9．重组人纤溶酶原激活剂(rhPA )能够高效特异性地溶解血栓，目前已培育成功
rhPA转基因兔，作为乳腺生物反应器批量生产药物。某科研团队构建的
PCL25/rhPA重组质粒如图1 所示（该质粒以β -casein作为调控序列，以CMV
为启动子，图1 中SalⅠ、X hoⅠ、NotⅠ所在位置表示相关限制酶切点），图
2 为培育rhPA转基因兔时用的乳腺特异性表达载体及PCR检测原理图（PCR-F、
PCR - R为引物序列）。请回答下列问题：
图1
图2
（1） 据图1 推测，PCL25/rhPA重组质粒是在PCL25质粒的__________限制
酶切位点处插入化学合成的rhPAcDNA片段构建而成。r h PA基因上游的CMV 能
被________________识别并结合，从而开启转录过程。
（2） 为获得图2 的乳腺特异性表达载体需用________________________切割
PCL25/rhPA重组质粒使之线性化。PCR - F和PCR - R设计时依据的是
____________________________________________________序列。
（3） 对实验得到的1～6号仔兔进行PCR及产物检测，得到图3 所示结果，则
成功导入r h PA基因的仔兔有________。（注：M道条带可作为双链线状DNA分
子量大小的参照，7 道为显微注射片段PCR扩增产物作阳性对照）
图3
（4） 生长激素(GH )可促进动物细胞增殖和乳腺生长发育及维持泌乳。研究人
员将GH基因导入rhPA单转基因兔体内，获得rhPA /GH双转基因兔，以期提高
兔乳清中的r h PA的表达量。
① 完成下列表格：
实验步
骤
简要操作过程
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显微注
射基因
片段的
准备
将PCL25/GH质粒双酶切而线性化，电泳分离不同大小分子量的基因
片段，回收真核基因片段待用
对兔进
行
_______
___和同
期发情
处理
选取3 只未发情的rhPA单转基因兔作为供体（标号a、b、c），适量注
射FSH /hCG（两种促性腺激素），与正常公兔配种，在母兔的
________（填部位）中形成受精卵。在供体兔配种的同时，选取成年
健康新西兰母兔作为受体，耳缘静脉注射适量hCG
双转基
因兔的
制备
将显微注射基因片段导入受精卵的原核内，适宜条件培养，胚胎移植
转基因
兔的整
合筛选
无菌剪取新生仔兔的耳尖组织少许，提取基因组。针对r h PA和GH两
种基因，设计______对引物进行PCR检测。PCR反应产物进行1%琼脂
糖凝胶电泳，确定条带大小是否正确
rhPA含
量测定
分别测定
_____________________________________________________________
_________________________乳清中的r h PA的表达量
② 分析实验结果：
样本
供体兔a
供体兔b
供体兔c
r h PA表达水平/( μ g⋅mL
-1)
42.2
42.8
15.2
样本
双转基因
兔a1
双转基因
兔a2
双转基因兔
b1
双转基因兔
c1
r h PA表达水平/( μ g⋅mL
-1)
432
444
636
248
注：双转基因兔a1、a2的亲本来源为供体兔a，双转基因兔b1的亲本来源为供
体兔b，双转基因兔c1的亲本来源为供体兔c。
实验结果表明，
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
__________________。
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【答案】（1） X hoⅠ；RNA聚合酶
（2） SalⅠ和NotⅠ；CMV 和 r h PA 基因的部分脱氧核苷酸
（3） 2、3、5、6
（4） ① 超数排卵；输卵管；2；rhPA单转基因兔和rhPA /GH双转基因兔（单
转基因兔和双转基因兔）
② rhPA /GH双转基因兔乳腺表达r h PA水平明显高于rhPA单转基因兔，GH可
协同促进r h PA在转基因兔乳腺中的高效表达
专题强化训练
一、单项选择题
1．[2024·无锡高三调研]下列关于“天竺葵的组织培养”的实验，叙述错误的
是（ ）
A. 实验材料和用具都要灭菌，接种器具采用干热灭菌法灭菌
B. 在接种过程中，每次夹取外植体前要灼烧接种器具，防止交叉污染
C. 脱分化期间一般不需要光照，再分化过程中需给予适当光照
D. 挑出的愈伤组织先转接到生芽培养基，生芽后再转接到生根培养基
【答案】A
【解析】选A。植物组织培养需要无菌操作，防止杂菌污染，所用器具需灼烧
灭菌，外植体需消毒操作，A 错误；在接种过程中，每次夹取外植体前要灼烧
接种器具，防止交叉污染，B 正确；脱分化期间一般不需要光照，再分化过程
中需给予适当光照，C 正确；诱导愈伤组织形成试管苗的过程中，需要将生长
良好的愈伤组织先转接到生芽培养基中，分化出幼芽后，再将其转接到生根的
培养基上，进一步诱导生根，D 正确。
2．[2024·南通高三调研]摇摆式间歇浸没生物反应器通过摆动架的倾斜摆动，
使培养液周期性间歇浸没组培苗，实现组培苗的快速生长。相关叙述正确的是
（ ）
A. 获得组培苗的培养基含有水、无机盐、蔗糖、琼脂和激素等多种营养物质
B. 获得组培苗的步骤：外植体→ 脱分化形成胚状体→ 再分化形成试管苗
C. 间歇摆动提高培养液溶氧量，有利于组培苗进行有氧呼吸，提高生长速度
D. 经过间歇浸没培养获得的植株需要消毒后炼苗再移栽到经灭菌处理的土壤中
【答案】C
【解析】选C。琼脂是凝固剂，不提供营养物质，A 错误；外植体脱分化可以
形成愈伤组织，愈伤组织可诱导形成胚状体，B 错误；间歇摆动提高培养液溶
氧量，有利于组培苗进行有氧呼吸，有氧呼吸能为组培苗的生长发育提供能量，
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因此可以提高生长速度，C 正确；植物组织培养是在无菌条件下进行的，经过
间歇浸没培养获得的植株不需要消毒处理，D 错误。
3．[2024·宿迁高三调研]下列关于胚胎工程和细胞工程的叙述，错误的是
（ ）
A. 动物细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常需要添加血清等物质
B. B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合经诱导后融合的细胞就是杂交细胞
C. 胚胎工程可用于稀有动物的种族延续
D. 诱导人成纤维细胞重编程为肝细胞的成果表明，已分化细胞的状态是可以改
变的
【答案】B
【解析】选B。动物细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常需要添加血清等
物质，A 正确;将骨髓瘤细胞和B 淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞不都是杂
交细胞，还有B 淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞等，B
错误；胚胎工程可用于稀有动物的种族延续，C 正确；诱导人成纤维细胞重编
程为肝细胞的成果表明,已分化细胞的状态是可以改变的，D 正确。
4．[2024·苏锡常镇四市高三一模]“标记”是生物技术与工程常用的技术手段，
下列相关叙述错误的是（ ）
A. 诱导植物原生质体融合时，通过红绿荧光蛋白标记检测细胞融合情况
B. 分析工程酵母发酵产物的合成及分泌时，通过同位素标记监测产物转移路径
C. 验证转基因抗虫棉是否成功时，通过RNA分子标记检测目的基因是否表达
D. 对目的基因进行扩增时，通过荧光标记技术实时定量测定产物的量
【答案】C
【解析】选C。诱导植物原生质体融合时，利用红绿荧光标记蛋白，通过红绿
荧光蛋白混合情况检测细胞融合情况，A 正确；利用同位素标记法可以监测工
程酵母发酵产物的合成及分泌时的转移路径，B 正确；验证转基因抗虫棉是否
成功时，应该通过接种实验验证，即为转基因抗虫棉接种相应的害虫，检测抗
虫棉是否表现出抗虫特性，C 错误；对目的基因进行扩增时，可通过荧光标记
技术，实时定量测定产物的量，D 正确。
5．[2024·扬州高三四校联考]“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列
相关叙述正确的是（ ）
A. 诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体即可筛选出
异种融合细胞
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B. 用灭活的仙台病毒处理B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞，用来筛选出杂交细胞
C. 培育耐盐转基因植株时，用特异性探针进行DNA分子杂交显示出杂交带即可
筛选出耐盐植株
D. 制备工程菌时，可通过标记基因对成功转化的受体细胞进行筛选
【答案】D
【解析】选D。诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿
体不一定能筛选出异种融合细胞，也可能是白菜叶肉细胞自身融合的细胞，A
错误；用灭活的仙台病毒处理B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞，促进二者融合，而不
是筛选杂交细胞，B 错误；培育耐盐转基因植株时，用特异性探针进行DNA
分
子杂交显示出杂交带，表明植株含有目的基因，但不一定表达，所以不一定能
筛选出耐盐植株，C 错误；制备工程菌时，可通过标记基因对成功转化的受体
细胞进行筛选，D 正确。
6．[2024·盐城高三二模]为了降低对国外奶牛种质的过度依赖，提高优良母牛
的扩繁速度成为关键，而试管牛技术产业化则可以有效解决这一难题。下图是
试管奶牛的生产流程示意图，下列有关叙述正确的是（ ）
A. ①是核移植技术，反映了动物细胞核具有全能性
B. 从优良母牛的子宫中采集卵母细胞
C. 在过程①中精卵识别阶段时，卵细胞正处于减数第二次分裂后期
D. 进行过程②胚胎移植前，需取囊胚的滋养层细胞进行性别鉴定
【答案】D
【解析】选D。由题图可知，①是体外受精，精卵结合的过程，A 错误；卵母
细胞是在卵巢中采集到的，B 错误；在过程①中精卵识别阶段时，卵细胞正处
于减数第二次分裂中期，C 错误；在进行胚胎移植之前，需对早期胚胎进行性
别鉴定，可取囊胚期的滋养层细胞进行DNA
分析，D 正确。
二、多项选择题
7．为获得导入R基因的转基因小鼠，科研人员进行了如下图所示的操作过程。
相关叙述正确的是（ ）
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A. 过程①需用促性腺激素处理以获得更多的卵母细胞
B. 过程②操作中通常需多个表达载体和多个受精卵
C. 过程③需使用药物抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥
D. 过程④处理的目的是使多只雌鼠b处于受孕准备状态
【答案】ABD
【解析】选ABD。为了胚胎移植成功往往需要更多的卵母细胞，所以过程①用
促性腺激素对供体进行超数排卵处理，A 正确；将目的基因导入受体细胞用多
个表达载体和多个受精卵可以提高成功率，所以过程②操作中通常需多个表达
载体和多个受精卵，B 正确；受体对移入子宫的外来胚胎一般不发生免疫排斥
反应，故过程③不需要使用药物抑制雌鼠b 对植入胚胎的免疫排斥，C 错误；胚
胎移植成功需要受体和供体达到相同的生理状态，所以过程④处理的目的是使
多只雌鼠b 处于受孕准备状态，D 正确。
8．[2024·盐城高三二模]为解决杂交细胞在传代培养中出现来自B 淋巴细胞的
染色体丢失问题，研究者将抗原刺激后的B 淋巴细胞，用EBV （一种病毒颗
粒）感染，获得“染色体核型稳定”的EBV 转化细胞。EBV 转化细胞能够在
HAT培养基中存活，但对Oua敏感。骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能存活，但对
Oua不敏感，下图表示操作过程。下列分析正确的是（ ）
A. B 淋巴细胞可从多次间歇注射某种抗原的动物脾脏中获得
B. HAT培养基和Oua筛选去除的是未融合的EBV 转化细胞
C. 杂交细胞染色体丢失可能会导致抗体的产生能力下降
D. 图中获得的杂交细胞需经抗体检测筛选后才可用于生产
【答案】ACD
【解析】选ACD。对动物进行间歇注射抗原处理，以刺激动物机体产生相应的
B 淋巴细胞，B 淋巴细胞分布于淋巴结和脾脏等处，故B 淋巴细胞可从多次间
歇注射某种抗原的动物脾脏中获得，A 正确。据题意“EBV 转化细胞能够在HAT
培养基中存活，但对Oua
敏感。骨髓瘤细胞在HAT
培养基中不能存活，但对Oua
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不敏感”可知，HAT培养基去除的是未与EBV
转化细胞融合的骨髓瘤细胞和骨
髓瘤细胞自身融合的细胞，Oua筛选去除的是未与骨髓瘤细胞融合的EBV
转化
细胞和EBV
转化细胞自身融合的细胞，B 错误。抗体是由浆细胞分泌的，杂交
细胞若丢失来自B 淋巴细胞的染色体，可能会导致抗体的产生能力下降，C 正
确。题图获得的杂交细胞还需要进一步筛选，专一抗体检测呈现阳性的杂交细
胞才能用于生产单克隆抗体，D 正确。
9．[2024·南京、盐城高三一模]基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多
方面的应用发展迅速，下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途
径。下列叙述错误的是（ ）
A. 若某基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的，则该基因中不含启动
子序列
B. 扩增目的基因时，利用热稳定的DNA连接酶从引物a、b的3'端进行子链合成
C. 导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞
D. 利用农杆菌转化法可将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色
体DNA上
【答案】BCD
【解析】选BCD。mRNA是由基因启动子后面的序列编码而来的，若某基因是
从人的细胞内提取mRNA
经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列，A 正
确；扩增目的基因时，利用热稳定的DNA
聚合酶从引物a、b的3'
端进行子链合
成，B 错误；导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞，而是受精
卵或早期胚胎细胞，C 错误；将目的基因插入到Ti 质粒的T - DNA
特定区段上，
通过农杆菌的转化作用，可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA
上，
D 错误。
三、非选择题
10．植物基因工程中常用到植物组织培养技术。为获得纯合的转K基因植株，
某同学设计了一个实验流程，其主要内容如下图所示。回答下列问题：
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（1） 上图中A 代表的是____________________________________________，
B 代表的是________________。
（2） 若不考虑培养过程中可能发生的染色体变异和基因突变，最终得到的二
倍体植株即为纯合的转K基因植株，K基因纯合的原因是
_____________________________________________________________________
_________________________。
（3） 在组织培养中，不用高温高压灭菌而常用____的方法对赤霉素溶液进行
除菌，不用高温高压灭菌的原因是____________________________。
（4） 将K基因导入该植株时，不宜用显微注射法将含K基因的表达载体直接
注入花粉粒，其主要原因是________________________________（答出1 点即
可）。
【答案】（1） 已转入含K基因表达载体的农杆菌；秋水仙素处理
（2） 单倍体转K基因愈伤组织经染色体加倍后，位于染色体上的K基因随之
加倍
（3） 过滤；赤霉素在高温下容易分解
（4） 花粉细胞具有坚硬的细胞壁
【解析】
（1） 题图中A
代表的是已转入含K
基因表达载体的农杆菌，然后让其去感染
愈伤组织，B代表的是秋水仙素处理，使愈伤组织染色体数目由n
变成2n。
（2） 若不考虑培养过程中可能发生的染色体变异和基因突变，最终得到的二
倍体植株即为纯合的转K
基因植株，K基因纯合的原因是单倍体转K
基因愈伤组
织经染色体加倍后，位于染色体上的K
基因随之加倍。
（3） 在组织培养中，不用高温高压灭菌而常用过滤的方法对赤霉素溶液进行
除菌，原因是赤霉素在高温下容易分解。
（4） 将K
基因导入该植株时，不宜用显微注射法将含K
基因的表达载体直接
注入花粉粒，其主要原因是花粉细胞具有坚硬的细胞壁。
11．[2024·南京、盐城高三一模]恶性肿瘤往往先向淋巴结初始转移形成淋巴
结转移瘤，再经淋巴结实现远端转移。科学家开展实验探索肿瘤初始转移的机
制以及淋巴结转移对远端转移的影响。
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（1） 正常情况下，原位瘤细胞转移至淋巴结会激活NK细胞和细胞毒性T细胞，
前者非特异性杀伤瘤细胞，后者则在辅助T细胞分泌的________的作用下，经
__________过程产生激活的细胞毒性T细胞裂解瘤细胞。
（2） 将原位瘤细胞F 0和淋巴结转移的瘤细胞ln6等量接种于同一健康小鼠体
内进行研究，过程如图1 所示。
图1
① 已知F 0和ln6的增殖能力无显著差异，图1 结果说明________向淋巴结转移
的能力更强。
② 为排除红绿荧光蛋白可能存在的检测差异干扰实验结果，需增设一组实验，
大致思路为
_____________________________________________________________________
_________________________。
（3） 为探究原位瘤细胞初始转移的机制，科研人员又开展了如下实验：
① 将F 0中编码MHC -1分子关键蛋白的基因敲除，再将其接种于小鼠体内，发
现其向淋巴结转移的能力降低，但去除该小鼠的NK细胞后其转移能力恢复。说
明NK细胞通过识别________（填“高表达”或“低表达”）的MHC -1杀伤瘤
细胞。
② PD - L1可与T细胞表面的特定蛋白结合，抑制其杀伤作用。进一步研究表明
原位瘤细胞通过调节MHC -1分子和PD - L1的表达量，抑制NK和T细胞的杀伤
作用，以增强转移能力。请在表格中填写“高”或“低”，将支持上述结论的
实验结果补充完整。
肿瘤细胞的类型
MHC -1分子表达量
PD - L1分子表达量
来自正常小鼠的淋巴结转移瘤
a.__
b.__
来自T细胞缺失小鼠的淋巴结转
移瘤
c.__
低
来自T和NK细胞缺失小鼠的淋
巴结转移瘤
低
d.__
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（4） 细胞因子TGF - β 能促进调节性T细胞的增殖，从而加强后者对辅助T细
胞的抑制作用。科研人员将F 0和ln6接种在野生型小鼠体内，检测该小鼠血清
中的TGF - β 浓度和瘤细胞远端转移率（图2）；又将不同类型的瘤细胞混合
DT毒素（可清除调节性T细胞）接种于小鼠体内，检测瘤细胞的远端转移率
（图3）。
图2
图3
综合上述相关信息和免疫学相关知识可知，淋巴结转移可____（填“促进”或
“抑制”）远端转移，其可能的机制是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________。
【答案】（1） 白介素；增殖分化
（2） ① ln 6
② 对F 0转入红色荧光蛋白基因，对ln6转入绿色荧光蛋白基因，重复题中实验
（3） ① 低表达
② 高；高；高；低
（4） 促进；原位瘤细胞发生淋巴结转移后诱导机体释放的TGF - β 增多，
TGF - β 促进调节性T细胞增殖，后者抑制辅助T细胞的功能，抑制机体的体液
免疫和细胞免疫功能，从而促进瘤细胞的远端转移
12．[2024·连云港高三一模]猪繁殖和呼吸综合征病毒( PRRSV )是感染猪的一
种常见病原体，科研人员利用RNA干扰( RNAi)技术培育PRRSV 抗性猪品种，原
理如下图所示。据图回答下列问题：
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（1） 构建表达载体时，科研人员需要根据______________________设计表达
载体中的cDNA序列。
（2） 将构建完成的表达载体与猪胚胎成纤维细胞混合后，需要在培养基中加
入__________以筛选转化成功的细胞。将筛选出的细胞移植入猪__________细
胞内，得到重组细胞。重组细胞在体外培养至早期胚胎后，进行__________，
获得转基因猪。
（3） 获得转基因猪后，科研人员需要在多个水平上检测转基因是否成功。将
下列表格填写完整：
检
测
水
平
实验方
法
实验操作
实验结果
DNA
水
平
荧光定
量
PCR(qPC
将从转基因猪体
内提取的DNA和
等量标准样品，
用shRNA表达载
体特异性引物进
行qPCR，qPCR
中加入了荧光染
料，荧光强度与
双链DNA数量成
正比，每个循环
检测荧光强度，
其达到标准值所
标准样品Ct值为18，提取DNA的Ct值为20，说
明提取DNA中含有表达载体量是标准样品的
①________倍
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需的循环数称为
Ct值
RNA
水
平
核酸分
子杂交
从转基因猪和非
转基因猪体内提
取
②__________，
用放射性标记的
③__________片
段作为探针与其
进行杂交
转基因猪有杂交带，非转基因猪没有
个
体
水
平
鉴定抗
病毒性
状
用
④____________
____感染转基因
猪和非转基因猪
相对于非转基因猪，转基因猪
⑤_________________________________________
___________
（4） 在转基因成功的猪体内，cDNA转录出shRNA后，Dicer酶通过切割
__________键加工shRNA产生siRNA，siRNA通过
_____________________________________________________________________
___来抑制病毒增殖。
【答案】（1） PRRSV 基因序列
（2） G 418；去核卵母；胚胎移植
（3） 1/4；mRNA；目的基因；等量PRRSV ；存活率更高（或患病率更低，
或体内病毒更少）
（4） 磷酸二酯；与RISC蛋白形成RISC — siRNA复合体，水解病毒mRNA
【解析】
（1） 构建表达载体时，首先要根据PRRSV
基因碱基序列设计表达载体中的
cDNA
序列。
（2） Neo 基因表达糖苷酶降解细胞毒素G 418，所以将构建完成的表达载体与
猪胚胎成纤维细胞混合后，需要在培养基中加入G 418
以筛选转化成功的细胞。
将筛选出的细胞移植入猪去核卵母细胞内，得到重组细胞。重组细胞在体外培
养至早期胚胎后，进行胚胎移植，获得转基因猪。
（3） 目的基因的检测和鉴定：荧光定量PCR 进行DNA 水平检测，PCR扩增结
果显示，在总DNA
模板量相等的条件下，标准样品Ct
值为18，提取DNA
的Ct
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值为20，设标准样品相应的DNA
数为x，提取DNA
数为y，则有x×2
18= y ×2
20，
y =(1/2
2)x，即从理论上估算，提取DNA
中含有表达载体量是标准样品的
1/2
2=1/4（倍）。核酸分子杂交中从转基因猪和非转基因猪体内提取mRNA，
用放射性标记的目的基因片段作为探针与其进行杂交，转基因猪有杂交带，非
转基因猪没有，说明转录成功。个体水平鉴定抗病毒性状，培育PRRSV
抗性猪
品种，所以用等量PRRSV
感染转基因猪和非转基因猪，若相对于非转基因猪，
转基因猪存活率更高，说明成功。
（4） 分析题图可知，当目的基因成功导入受体细胞，转基因成功的猪体内，
cDNA转录出shRNA
后，Dicer酶通过切割磷酸二酯键加工shRNA
产生siRNA，
siRNA与RISC
蛋白形成RISC — siRNA
复合体，水解病毒mRNA。
热考提升练（五） 基因工程的操作过程及应用
1．[2024·无锡高三调研]为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋
白，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG
类抗体结合），再利用该标签在病毒敏感细胞（如非洲绿猴肾细胞）中快速纯
化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，具体过程如下图所示。其中X hoⅠ、SmaⅠ、
Eco RⅠ、Bam HⅠ表示限制酶，PCMV 、T 7表示启动子，Kozak序列是翻译起
始因子结合位点的编码序列，Am p
r表示氨苄青霉素抗性基因，ori表示复制原
点。请回答下列问题：
（1） 为成功构建重组质粒pcDNA 3.1- S -TAP，在利用PCR扩增S基因时，应
在S基因的5'端引入______________________________序列，3'端删除
__________________的编码序列。为了防止PCR扩增发生突变，常选择高保真
的Pyrobest DNA聚合酶，该酶具有Taq酶所不具备的3' →5'核酸外切酶活性，
Pyrobest DNA聚合酶能防止突变的原因是
____________________________________________________________________。
（2） 将S基因和TAP序列的扩增产物进行__________________鉴定，结果显示
两个片段均得到扩增且与预期值大小相一致。再经测序证实正确后，将这两个
片段经______________酶连接定向克隆入质粒pcDNA 3.1。
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（3） 重组质粒pcDNA 3.1- S -TAP转染细胞前，需将vero细胞置于37 ℃、
________________________________（填气体条件）下培养18～24 h进行传代。
将传代的细胞与重组质粒pcDNA 3.1- S -TAP以适宜比例混合，在转染试剂的作
用下转染细胞（实验组），为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做
法为________________________________________________________。
将转染24 h的细胞置于载玻片，洗涤、固定后滴加正常人血清稀释液和荧光素
标记的羊抗人IgG抗体稀释液，荧光显微镜下观察，若
____________________________________________________________，则说明
S -TAP融合蛋白在vero细胞中得以表达。
（4） 通过上述检测发现，S -TAP融合蛋白表达量较低，其原因可能有__（填
序号）。
①重组质粒pcDNA 3.1- S -TAP在vero细胞中大量复制
②S -TAP融合基因在vero细胞中转录出的mRNA量较少
③S基因与病毒宿主细胞的基因有不同的密码子偏爱性，翻译相应mRNA的tRNA
数量不足
为增强融合蛋白的表达，研究人员在质粒转染前预先用重组痘苗病毒vTF 7 -3
感染vero细胞，表达出的vTF 7 -3 DNA聚合酶和T 7 RNA聚合酶（能选择性高效
激活T 7启动子）留存在细胞质基质中发挥作用。请据此解释重组质粒
pcDNA 3.1- S -TAP和重组痘苗病毒vTF 7 -3共转染细胞能提高融合蛋白表达效
率的原因
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_________。
【答案】（1） Kozak序列和SmaⅠ；终止密码子对应；能切除不正确掺入的单
核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸
（2） 琼脂糖凝胶电泳；DNA连接
（3） 95 %空气+5 %CO2；使用pcD NA 3.1空载体转染细胞，其余操作相同；实
验组细胞出现荧光标记，对照组细胞没有荧光标记
（4） ②③；重组痘苗病毒vTF 7 -3感染vero细胞表达出的vTF 7 -3 DNA聚合酶
和T 7 RNA聚合酶能选择性高效激活T 7启动子，有利于S -TAP融合蛋白基因的
转录，利于该蛋白质的表达
【解析】
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（1） Kozak
序列是翻译起始因子结合位点的编码序列，根据构建的重组质粒
图示可知，在S
基因的上游加入了Kozak
序列；为了使目的基因和质粒连接，根
据启动子的方向、质粒上的酶切位点可知，上游不能用X hoⅠ，故应在S
基因
的上游加入SmaⅠ识别序列；因为S
基因和TAP
序列需要同步表达才能利用TAP
作为S
蛋白的标签，二者共用一个启动子，故应去除S
基因下游的终止密码子编
码序列。Pyrobest DNA聚合酶具有3' →5'
核酸外切酶活性，能切除不正确掺
入的单核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸，故而可防止发生突变。
（2） 将S 基因和TAP 序列的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示两个
片段均得到扩增且与预期值大小相一致。DNA连接酶可将限制酶切割后形成的
末端连接。
（3） 细胞培养的气体条件是95 % 的空气和5 % 的CO2。对照组是为了排除空质
粒的影响，故应使用pcDNA 3.1
空载体转染细胞，其余操作相同。将转染24 h
的细胞置于载玻片，洗涤、固定后滴加正常人血清稀释液和荧光素标记的羊抗
人IgG
抗体稀释液，荧光显微镜下观察，若实验组细胞出现荧光标记，对照组
细胞没有荧光标记，则说明S -TAP
融合蛋白在vero
细胞中得以表达，荧光素标
记的羊抗人IgG
抗体才能够与TAP
标签结合发出荧光。
（4） 蛋白质表达要经过转录和翻译两个过程，重组质粒pcDNA 3.1- S -TAP 在
vero
细胞中大量复制，与蛋白表达量较低无关，①不符合题意；S -TAP融合基
因在vero
细胞中转录出的mRNA
量较少，模板少，影响翻译出的蛋白质含量，②
符合题意；tRNA在翻译过程中起到转运氨基酸的作用，tRNA数量不足影响翻译
的进行，③符合题意，故选②③。先用重组痘苗病毒vTF 7 -3
感染vero
细胞，表
达出的vTF 7 -3 DNA
聚合酶和T 7 RNA
聚合酶（能选择性高效激活T 7
启动子）
留存在细胞质基质中发挥作用，高效激活T 7
启动子有利于S -TAP
融合基因的转
录，利于S -TAP
融合蛋白表达。
2．[2024·苏锡常镇四市高三一模]热带玉米(WT )对光周期有较高的敏感性，
开花需要短日照条件(SD)，只能生活在热带。经长期驯化，进化出适应长日照
条件( LD)的温带玉米。研究表明，热带玉米光周期敏感性与ZmCCT 9基因有关，
Cas 9核酸酶敲除该基因过程中，获得了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种突变类型（图1）。在
长日照条件下种植，发现三种突变型开花时间明显提前。请回答下列问题：
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（1） 图1 方框中的三个碱基为NGG（N可为任何碱基），若该序列缺失，
Cas 9核酸酶将无法完成切割，该序列作用是
________________________________________。结合图1 分析，碱基序列中虚
线代表________________，从表达结果看，敲除基因会导致
________________________________________________。该基因敲除导致的变
异类型属于__________。
（2） 为探究ZmCCT 9基因的表达模式，研究人员测定玉米发育过程中不同部
位ZmCCT 9表达量（图2），结果表明
_____________________________________________________________________
_________________。
还测定在LD和SD下温带玉米和热带玉米的成熟叶片中ZmCCT 9的昼夜表达量
（图3），结果显示，在LD条件下，
_____________________________________________________________________
_______。
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（3） 为探究驯化过程中玉米适应长日照的分子机制，测序发现温带玉米和热
带玉米的ZmCCT 9基因编码区无显著变异位点，但前者在基因上游携带了一段
特殊序列（TE元件）。
① 据此推测，TE元件的功能是
____________________________________________________________________。
为证明TE元件的功能，需利用相关载体和元件构建LUC基因（一种荧光素酶基
因）表达载体，图4 长方框中构建的相关元件的先后位置是__________（用图
中字母排序）。
② 可以预测，实验组玉米细胞荧光比对照组玉米细胞荧光__（填“强”或
“弱”）。
③ 根据以上材料，请完善温带玉米适应长日照的调控机制。ZmCCT 9启动子
（含TE）→
____________________________________________________________→ 适应长
日照环境
【答案】（1） 便于Cas 9核酸酶进行准确定位；敲除序列区域；ZmCCT 9基因
无法正常表达出相应产物；基因突变
（2） ZmCCT 9基因在热带玉米中表达量高于温带玉米，且主要在成熟叶片表
达；热带玉米成熟叶片中ZmCCT 9基因昼夜表达量显著高于温带玉米
（3） ① 抑制ZmCCT 9的表达（抑制启动子功能，使基因无法表达）；cadb
② 弱
③ ZmCCT 9基因表达量下降→ 光周期敏感性下降
【解析】
（1） 分析题意，若该序列缺失，Cas9核酸酶将无法完成切割，说明该序列作
用是引导Cas9 核酸酶到对应位点，便于Cas9 核酸酶进行准确定位；结合题图1
分析，碱基序列中虚线代表敲除序列区域；基因决定蛋白质的合成，从表达结
果看，敲除基因会导致一些基因无法执行正常功能，导致ZmCCT 9
基因无法正
常表达出相应产物；该基因敲除是基因内碱基对的缺失，导致的变异类型属于
基因突变。
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（2） 分析题图2 可知，与温带玉米相比，ZmCCT 9基因在热带玉米中表达量
高，且主要在成熟叶片表达；据题图3 分析可知，在LD 条件下，热带玉米成熟
叶片中ZmCCT 9
基因昼夜表达量显著高于温带玉米。
（3） ① 启动子位于基因上游，可启动转录过程，分析题意可知，温带玉米和
热带玉米的ZmCCT 9
基因编码区无显著变异位点，但前者在基因上游携带了一
段特殊序列（TE元件），据此推测TE
元件的功能是抑制ZmCCT 9
的表达（抑制
启动子功能，使基因无法表达）；启动子和终止子分别调控基因的转录起始和
终止，LUC基因应插入到两者之间，而TE 元件应位于启动子上游，故题图4 长
方框中构建的相关元件的先后位置是cadb。
② 由于实验组插入TE
元件，抑制ZmCCT 9
的表达，故实验组玉米细胞荧光比
对照组玉米细胞荧光弱。
③ 据以上材料可完善温带玉米适应长日照的调控机制：ZmCCT 9启动子（含
TE）→ZmCCT 9基因表达量下降→ 光周期敏感性下降→ 适应长日照环境。
3．基因组中大片段DNA的定向整合拥有广阔的应用前景。目前细菌中的定向
整合系统存在诸多不足，如效率偏低，缺乏有效的筛选标记物，可整合的片段
大小有限(3∼4 kb)等。研究者尝试构建CRISPR RNA - guided定向整合系统以
改善上述缺陷。
（1） Cas蛋白是一种RNA引导的内切酶，能催化双链DNA在特定位点断裂。
crRNA是一种短链RNA，它一端可与Cas蛋白结合，另一端通过
________________原则与目标DNA序列结合。
（2） 转座子(Tn)是一段特殊的DNA片段。转座酶A 和转座酶B 相互结合后可
将Tn从原有的DNA链上切下，并将其整合到其他DNA片段上。为了使转座子定
向整合到特定的位置，研究者构建了如图1 所示的CRISPR RNA - guided定向
整合系统，导入大肠杆菌，并统计定向整合的效率，结果如图2 所示。
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① 构建重组质粒时，应将翻译终止序列设置在Cas基因和转座酶A 基因之后而
不是设置在两者之间，目的是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________。
② 由图2 结果可知，转座子的定向整合效率高低与____________________密切
相关。为保证转座子连接方向与预期相同，构建重组质粒的过程中，对切割转
座子和切割载体的限制酶的要求是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
______________________________。
③ 由图2 结果可知，该系统还能有效解决筛选标记物缺乏的问题，理由是
_____________________________________________________________________
___________。
（3） 研究者替换了不同长度的转座子，继续检测定向整合效率，结果如图3
所示。与现有的定向整合系统相比，CRISPR RNA - guided定向整合系统可整
合的片段大小得到提高，判断依据是
_____________________________________________________________________
_______。
（4） 利用该系统能实现基因的定向整合，举例说出其在科学研究中还可以有
哪些应用：
_____________________________________________________________________
_________________________________（举出一例即可）。
【答案】（1） 碱基互补配对
（2） ① 让Cas蛋白和转座酶A 形成融合蛋白，便于Cas蛋白引导转座酶定位
到crRNA所结合的DNA附近，实现转座子的定向整合
② 转座子整合的方向；利用两种不同的限制酶切割转座子和载体，且保证黏性
末端的连接方向与预期相同（利用两种不同限制酶切割转座子，并用这两种限
制酶切割载体）
③ RL方向的定向整合效率接近100 %，无需再用标记物进行筛选
（3） 当转座子长度大于4 kb时，定向整合效率依然接近100 %
（4） 将转座子插入特定基因，破坏该基因的结构，形成基因缺陷突变体，用
以研究该基因的功能
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【解析】
（1） RNA
和DNA
结合也遵循碱基互补配对原则，故crRNA
通过碱基互补配对
原则与目标DNA
序列结合。
（2） ① 分析题意可知，本过程需要实现定向操作，故必须让转座酶移到目标
位置，而转座酶本身没有定向作用，题中只有crRNA
有定向作用，故需要让Cas
蛋白和转座酶A
形成融合蛋白，便于Cas
蛋白引导转座酶定位到crRNA
所结合的
DNA
附近，实现转座子的定向整合。
② 由题图2 结果可知，转座子方向是RL 时，定向整合效率接近100 %，转座子
方向是LR
时，定向整合效率大约为10 %，故转座子的定向整合效率高低与转座
子整合的方向密切相关；为保证转座子连接方向与预期相同，构建重组质粒的
过程中，对切割转座子和切割载体的限制酶的要求是利用两种不同的限制酶切
割转座子和载体，且保证黏性末端的连接方向与预期相同（利用两种不同限制
酶切割转座子，并用这两种限制酶切割载体）。
③ 分析题意可知，转座子方向为RL
时，定向整合效率接近100 %，因此不需要
筛选标记物。
（3） 由题图可知，转座子长度为5.3 kb、7.5 kb、10 kb时，转座子长度都
大于4 kb，定向整合效率都接近100 %。
（4） 利用该定向整合系统可将转座子插入特定基因，破坏该基因的结构，形
成基因缺陷突变体，用以研究该基因的功能。
4．[2024·泰州高三一模]胆固醇O酰基转移酶1(SOAT 1)与肝癌的发生密切相
关，可作为潜在的肝癌生物标志物。科研人员从肝癌细胞Huh7中获取SOAT 1基
因，经原核表达、蛋白质纯化后免疫小鼠制备单克隆抗体。请回答下列相关问
题：
（1） 从肝癌细胞Huh7中提取____________，通过________获得SOAT 1的
cDNA。
（2） 根据SOAT 1的编码序列设计的两个引物如图1 所示。引物F加入的Eco R
Ⅰ酶酶切位点位于________端，引物R上添加的X hoⅠ酶识别的回文序列的6
个碱基是________________________________________。
图1
（3） 利用上述引物对SOAT 1基因进行PCR扩增，该实验设计的扩增程序中热
循环次数为30 次，一般PCR反应中设计的热循环次数不超过40 次，原因是
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_____________________________________________________________________
_______________________。PCR反应结束后，将产物经1%琼脂糖凝胶____后，
对PCR产物进行胶回收。
（4） 将胶回收后的PCR产物和载体pET 32a分别用Eco RⅠ和X hoⅠ双酶切，
加入DNA连接酶后在冰面上过夜。在冰面上操作的目的是
_____________________________________________________________________
_______________________________。在将重组质粒转化至大肠杆菌前用Ca
2+处
理大肠杆菌，使其处于________________________________________的生理状
态，以提高转化效率。
（5） 将测序正确的重组载体诱导表达并进行电泳，实验部分结果见图2，
SOAT 1重组蛋白的相对分子质量为50 kD左右，下图中基本符合要求的条带包
括______。
（6） 用纯化的SOAT 1重组蛋白免疫小鼠，利用
__________________________________技术获得SOAT 1单克隆抗体细胞株以制
备单克隆抗体。
【答案】（1） 总RNA；逆转录
（2） 5'；CTCGAG（或5' — CTCGA G — 3'）
（3） 40 次循环后可能出现大量非特异性产物（或40 次循环是PCR反应的有
效极限）；电泳
（4） 降低连接反应的速率，减少非目标重组DNA的形成（或低温使氢键稳定，
减少错配等）；感受态（或容易接受外来的DNA）
（5） 2、3、5
（6） 动物细胞培养和动物细胞融合
【解析】
（1） 为获得SOAT 1 的cDNA，需要从肝癌细胞Huh7 中提取总RNA，通过逆转
录过程获得。
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（2） Eco RⅠ酶特异性识别GAATTC 序列，从引物F
看出，Eco RⅠ酶酶切位点
位于5'
端，引物R 上添加的X hoⅠ酶识别的回文序列的6 个碱基是CTCGAG
（或5' — CTCGAG — 3'）。
（3） 由于40 次循环后可能出现大量非特异性产物（或40 次循环是PCR 反应
的有效极限），所以一般PCR 反应中设计的热循环次数不超过40 次，产物经
1%
琼脂糖凝胶电泳后，对PCR
产物进行胶回收。
（4） 双酶切、加入DNA
连接酶后在冰面上过夜，冰面温度低，使酶的活性降
低，所以在冰面上操作的目的是降低连接反应的速率，减少非目标重组DNA
的
形成。将重组质粒转化至大肠杆菌前用Ca
2+
处理大肠杆菌，使其处于感受态，
以提高转化效率。
（5） 观察电泳图，在条带2、3、5 中含有50 kD 的蛋白质分子，而SOAT 1 重
组蛋白的相对分子质量为50 kD 左右，所以符合要求的条带包括2、3、5。
（6） 可以利用动物细胞培养和动物细胞融合技术获得SOAT 1 单克隆抗体细胞
株，其特点是可以无限增殖，并产生特异性抗体。
5．IKK激酶由IKK α 、IKK β 和IKK γ 三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫
细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1
183 位碱基T突变为C，导致IKK β 上第395 位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该
患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，
主要过程如图1、图2 所示。
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（1） 在图1 获取突变基因的过程中，需要以下3 种引物：
引物A ：5' — CCCCAACCGGAAAGTGTCA — 3'（下划线字母为突变碱基）
引物B：5' — T AAGCTT
CGAACATCCTA — 3'（下划线部分为限制酶HindⅢ识
别序列）
引物C ：5' —>GAGCTC
GCTGCCCCAA — 3'（下划线部分为限制酶Sac Ⅰ识别
序列）
则PCR1中使用的引物有__________________________，PCR2中使用的引物有
____________和图中大引物的______（填“①”或“②”）链。
（2） 图2 模型鼠培育过程中杂合模型鼠( F0)的培育涉及了一系列现代生物技
术，下表是其中的一些步骤，请根据题意完成表格内容。
过
程
实
验
目
的
步骤要点
导
入
a.处
理
突
变
基
因
与
载
体
_____________________________________________________________
①
_______
b.构
建
利用DNA连接酶催化突变基因和载体连接
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重
组
载
体
c.导
入
目
的
基
因
__________________________________________________
②
发
育
d.
获
取
早
期
胚
胎
利用专用培养液培养受精卵，并检测其发育状况
e.代
孕
获
得
小
鼠
________________________________________
③
f .鉴
定
、
筛
选
F0
小
鼠
利用PCR鉴定基因，筛选出杂合鼠F0
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（3） 根据图2 杂交结果，可以确认突变基因已经较稳定地整合到小鼠细胞的
染色体上，在遗传时遵循__________定律。研究人员对三种基因型小鼠胸腺淋
巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图3。请据此结果提
出SCID患者免疫缺陷产生的机制：
_____________________________________________________________________
_______________________。
【答案】（1） 引物A 和引物C；引物B；②
（2） 利用限制酶（SacⅠ、HindⅢ）分别处理突变基因和载体；利用显微注
射法将重组载体注入小鼠受精卵；利用合适的早期胚胎进行胚胎移植
（3） 基因分离；IKKB基因突变导致IKK β 含量减少，IKK激酶活性降低，T
细胞减少
情境命题最前沿15 基因编辑技术及其应用
情境链接
CRISPR／Cas 9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单
链向导RNA(sgRNA )引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如
图）。
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱
基序列互补，从而定向引导Cas 9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR／Cas 9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，
其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿
主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR／Cas 9基因编辑技术在基因治疗、
基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
情境演练
1．CRISPR /Cas9是大肠杆菌等细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫
防御系统，可用来对抗入侵的部分病毒( DNA )及外源DNA。其原理是由一条单
链向导RNA引导内切核酸酶Cas 9到一个特定的基因位点进行切割。
CRISPR /Cas9基因编辑技术是通过设计向导RNA中20 个碱基的识别序列，可
以对目标DNA上几乎任何一个位置进行删除或添加特定的DNA片段，如下图所
示。下列叙述错误的是（ ）
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A. 识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同
B. 在被切割后的目标DNA中添加特定的DNA片段需要DNA连接酶
C. 大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒( DNA )及外源DNA互补的RNA序列
D. Cas9能专一性破坏双链DNA分子中碱基之间的氢键来切割DNA分子
【答案】D
【解析】选D。识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同，
都是A — U、T — A、C — G、G — C，A 正确；在被切割后的目标DNA
中添加
特定的DNA
片段需要DNA 连接酶将DNA
片段连接起来，B 正确；大肠杆菌等细
菌细胞内能合成与入侵病毒( DNA )
及外源DNA
互补的RNA
序列，C 正确；Cas 9
能特异性的切断目标DNA
的磷酸二酯键，D 错误。
2．猪瘟病毒能与猪细胞质膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。
利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒
正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由
一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA )引导Cas 9蛋白到特定的DNA位点进行切
割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
A. 培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的
个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B. Cas 9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割
C. 改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚
胎移植
D. 通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因
【答案】B
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【解析】选B。培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，
改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟
病毒感染，A 正确；根据基因编辑的原理和题图所示过程，单链向导RNA
是通
过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA
的特定位点，从而引导Cas 9
蛋白
到达准确位置进行DNA
的切割，B 错误；改造后的受体细胞经培养发育到囊胚
或桑葚胚时，可将其进行胚胎移植或冷冻保存，C 正确；通过基因编辑技术改
造后的LamR
基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，二者是等位基因，
D 正确。
3．中国科学院遗传与发育生物学研究所李传友团队提出了一种利用多重基因编
辑技术以红果番茄（双子叶植物）为材料，快速定向创制七种不同果色番茄材
料的策略。该研究利用多重基因编辑系统靶向敲除了红果番茄中控制三类色素
合成或代谢的关键基因。下图是科研人员用CRISPR /Cas 9基因编辑技术定点敲
除目标基因的示意图，请回答下列问题：
（1） CRISPR /Cas 9系统能精准识别相关基因，依据的原理是
________________________________________________发生碱基互补配对；
Cas 9蛋白能使目标DNA中的____________（填化学键名称）断裂，从而实现对
______________（填“DNA单链”“DNA双链”“RNA单链”或“RNA双
链”）的剪切。若要插入其他基因，可以利用______________酶将它们连接起
来。
（2） 研究人员将编辑好的基因导入番茄的体细胞，常用的方法是
________________。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并
________________________________________________，
使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
（3） 含有编辑好的基因的番茄体细胞具有全能性，在一定的营养和激素等条
件下，可以经过________的过程形成愈伤组织。当培养基中的
________________________________时，主要诱导根的形成。
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（4） 五彩缤纷的水果和蔬菜不仅给人以美的视觉享受，还能提高消费者的购
买欲。在培育彩色番茄的同时我们还需要考虑该策略对番茄的
（答出2 点即可）等性状的影响。
【答案】（1） 向导RNA与目标DNA（或识别序列）；磷酸二酯键；DNA双链；
DNA连接
（2） 农杆菌转化法；将其插入植物细胞中的染色体的DNA上
（3） 脱分化；生长素含量高于细胞分裂素
（4） 单果重、单株产量、维生素C 含量
4．CRISPR /Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一
把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA )引导下，切割DNA双链以敲除目标
基因或插入新的基因。CRISPR /Cas 9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
（1） 过程①中，为构建CRISPR /Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序
列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时
所需要的酶是________________。
（2） 过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是
____________________。
（3） 过程③~⑤中，sgRNA与Cas 9蛋白形成复合体,该复合体中的sgRNA可识
别并与目标DNA序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是
____________________。随后，Cas 9蛋白可切割
______________________________序列。
（4） 某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入
到CRISPR／Cas 9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过
基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶
的工程菌。据图简述CRISPR／Cas 9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因
插入到基因组DNA的编辑过程：
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_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
________________________________________________。
【答案】（1） DNA连接酶
（2） Ca
2+处理法
（3） 碱基互补配对原则；目标DNA特定的核苷酸
（4） CRISPR /Cas 9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是
sgRNA，表达的产物是Cas 9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识
别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该
蛋白酶基因插入到基因组DNA中
【解析】
（1） 基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA
连接酶，限制酶负责切割，DNA
连接酶负责连接，因此插入时所需要的酶是DNA
连接酶。
（2） 大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞之前需
要用Ca
2+
处理细胞，细胞质膜对DNA
的通透性会发生改变，细胞变得容易接受
外来的DNA。
（3） 根据题图可知，在CRISPR /Cas9 基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因
设计的向导RNA，准确引导Cas9
蛋白切割与sgRNA
配对的靶基因DNA
序列。
Cas 9蛋白能借助sgRNA
分子与目标DNA
进行特异性结合的原因在于sgRNA
分子
上的碱基序列与目标DNA
分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则，实现
sgRNA
与目标DNA
特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas 9蛋白在功
能上属于限制酶，可切割目标DNA
特定的核苷酸序列。
（4） 根据图示可知，CRISPR／Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，
转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9
蛋白，二者形成复合体，该复合体中
的sgRNA
可识别并与目标DNA
序列特异性结合，引导Cas 9
蛋白切割目标DNA
序
列，从而将该蛋白酶基因插入到基因组DNA
中。
情境命题最前沿16 PCR 的应用
情境链接
1.实时荧光定量PCR 技术检测病毒核酸
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基
因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异
性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探
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针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图
甲），通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图
乙，荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）越小，说明病毒核酸浓度越高。
2.PCR 定点突变——重叠延伸PCR 技术
重叠延伸PCR技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物（图中的引物
2 和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点），分别进行PCR，获得有重
叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目
的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入
特定突变，使水蛭素第47 位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨
酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如下图所示。
3.PCR 定点突变——大引物PCR 技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、
常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物
进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩
增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整
的含有突变位点的DNA片段。原理如下图所示。
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4.反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向
PCR技术。原理是用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产
物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已
知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对
未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如下图所示。
5.巢式PCR
首先将目标的DNA模板与第一套引物（外引物）结合。第一套引物也可能结合
到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片
段（图中未显示可能的多种产物）。然后使用第二套引物（内引物）对第一轮
PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内
部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可
能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有
引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如下图所示。
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情境演练
1．荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量，其原理是在PCR体
系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温
的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧
光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是（ ）
A. 引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B. 反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关
C. 耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端到3'端
D. 若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶
【答案】B
【解析】选B。引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原
则，A 正确；模板DNA 含量越高，PCR扩增过程中形成的荧光分子越多，荧光
强度越大，即反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA
含量呈正相关，B 错误；
耐高温的DNA
聚合酶催化DNA 合成的方向总是从子链的5'
端到3'
端，C 正确；
若要用荧光定量PCR
技术检测某基因的转录水平，即检测细胞中mRNA
的含量，
则先要将mRNA
逆转录形成DNA
再检测，故需要用到逆转录酶，D 正确。
2．大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸
的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一
轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，右图表示利用大引物PCR对基因M进行定
点诱变。下列说法错误的是（ ）
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A. 第一轮PCR中，至少需要2 个循环才能获得相应的大引物
B. 第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
C. 扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
D. 为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的退火温度
【答案】B
【解析】选B。第一轮PCR 中，需要先合成一条链（即诱变引物延伸的子链），
再用这条链合成互补链，至少需要2 个循环才能获得相应的大引物，A 正确；
第一轮产物DNA
的一条链作第二轮PCR
扩增的大引物，第二轮PCR
仍需加入的
另一种引物是侧翼引物，B 错误；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则PCR
扩增的定点诱变产物上需具备启动子和终止子等结构，诱导基因转录和翻译，
C 正确；为了使两轮PCR 反应在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的
退火温度，第二轮PCR 的退火温度应该比第一轮高，D 正确。
3．为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR技术进行了改良，
发明了巢式PCR技术，其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第
一对引物（外引物）对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增（经过15∼30次循
环），第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物（内引物或巢式
引物）结合在第一轮扩增产物内部，经过15∼30次循环，获得第二轮扩增片段
（即目的基因），最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如下图所示。下
列叙述错误的是（ ）
A. 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段
B. 使用外引物至少经过3 次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物
C. 若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低
D. 与巢式PCR相比，普通PCR特异性更强，错误率更高
【答案】D
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【解析】选D。两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA 片段，以便与
模板互补配对，A 正确；根据DNA 半保留复制的特点，可知PCR 前2 次循环产
生的四个DNA
分子的两条链均不等长，第3 次循环产生的DNA 分子存在等长的
两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，至少经过3 次循环才能得到图
示的第一轮扩增产物，B 正确；由于内引物扩增模板是外引物扩增后的产物，
第二轮反应能否进行，也是对第一轮反应正确性的鉴定，如果第一轮扩增产生
了错误片段，那么第二轮能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，C
正确；巢式PCR
中加入的组分与常规PCR
相同，第一轮扩增中，外引物用以产
生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异
性，获得的产物特异性更强，D 错误。
4．在利用PCR技术扩增目的基因时，通常在引物一端添加限制酶切割位点，以
便将目的基因连接到载体上。如图所示，TA克隆法可以将PCR产物直接连接到
具有3' — T突出末端的载体上，这是因为普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶
的活性，可在每个PCR扩增产物的3'端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩
增产物就可以与有3' — T突出末端的载体连接。高保真Taq DNA聚合酶可切掉
PCR扩增过程中产生的错配碱基，保证扩增的准确性。
（1） PCR依据的原理是______________________，该技术通常需要2 种引物，
引物的具体作用是
_____________________________________________________________________
_。
（2） 一般情况下，利用PCR扩增目的基因时，通常在引物的________端添加
特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有________、
____________________________等。题述构建重组质粒的方法________（填
“需要”或“不需要”）限制酶，____ （填“需要”或“不需要”）DNA连接
酶，原因是
_____________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________
______。
（3） 高保真Taq DNA聚合酶不会使PCR扩增产物产生A 尾，高保真PCR扩增
后，如何加工才能进行TA克隆?
_____________________________________________________________________
___________________________________________。
【答案】（1） DNA半保留复制；使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱
氧核苷酸
（2） 5'；噬菌体；动植物病毒（顺序可颠倒）；不需要；需要；PCR扩增产
物的3'端有一个碱基A，T载体有3' — T突出末端，二者可以在DNA连接酶的作
用下直接连接
（3） 先进行PCR产物回收，将其作为模板，再加入dATP、普通Taq DNA聚合
酶等延伸一段时间
【解析】
（1） PCR 依据的原理是DNA
半保留复制；PCR需要引物，引物的具体作用是
使DNA
聚合酶能够从引物的3'
端开始连接脱氧核苷酸。
（2） PCR 扩增目的基因时在3'
端开始添加脱氧核苷酸，所以通常在引物的5'
端添加特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体和
动植物病毒等。依据题意，普通Taq DNA
聚合酶具有末端连接酶的活性，可在
每个PCR
扩增产物的3'
端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以
与有3' — T
突出末端的载体在DNA
连接酶的作用下直接连接，所以利用TA
克隆
法构建重组质粒不需要限制酶，需要DNA
连接酶。
（3） 高保真Taq DNA 聚合酶不会使PCR 产物产生A
尾，可利用普通
Taq DNA
聚合酶添加A
尾，同时要添加dATP、缓冲液等，然后在适宜温度下延
伸一段时间。
