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课时4 突破基因工程类大题 考情速览 热点 考情 RT－RCR、实时荧光 定量、PCR 与反向 PCR ①2022·全国乙卷，38；②2022·江苏卷，24； ①2020·江苏卷，33；②2020·山东卷，25 PCR 定点诱变技术 ①2023·辽宁卷，25；①2021·天津卷，16 单酶切导致的正、反 接的电泳检测和 PCR 检测 ①2024·黑吉辽卷，17、25；②2024·全国甲卷，38；③2024· 河北卷，24； ④2024·湖南卷，15；⑤2024·江西卷，12；⑥2024·浙江6 月 选考，19、20； ①2023·山东卷，25；①2022·福建卷，13 突破1 基因工程的热考题型 题型一 限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点选择限制酶 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因 内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目 的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也 有这两种酶的切割位点，如图乙) (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) [例1] (2023·新 卷， 课标 6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3 和酶4)、DNA 连接酶 为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割 连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( ) A.质粒和目的基因都用酶3 切割，用E.coli DNA 连接酶连接 B.质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E.coli DNA 连接酶连接 答案 C 解析 酶3 切割后得到的是平末端， 用 应该 T4 DNA 接 接， 连 酶连 A 不符合 意； 题 粒用 质 酶3 切割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者 不能 接， 连 B 不符合 意；粒和目的基因都用 题 质 酶1 和酶2 切割后得到黏性末端， 用T4 DNA 接 接， 能保 目的基因在 粒上的 接方向，此重 表达 连 酶连 还 证 质 连 组 载 体的构建方案最合理且高效，C 符合 意；若用 题 酶2 和酶4 切割 粒和目的基因， 质 会破坏 粒上的抗生素抗性基因， 接形成的重 表达 体缺少 基因，无法 质 连 组 载 标记 行后 的 ， 进 续 筛选 D 不符合 意。 题 [例2] (2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为 标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶 切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的 是( ) A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet 的培养 基中能形成菌落 答案 D 解析 若用HindⅢ 切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入， 的 物 酶 转录 产 可能不同，A 正确；若用PvuⅠ 切，重 粒和 粒中都有四 素抗性基因 酶 组质 质 环 (TetR)，因此在含Tet(四 素 环 )培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B 正确； DNA 凝胶 泳技 可以分离不同大小的 电 术 DNA 片段，重 粒的大小与 粒不同 组质 质 能 定重 粒构建成功与否， 够鉴 组质 C 正确；SphⅠ的 切位点位于四 素抗性基 酶 环 因中，若用SphⅠ 切，会破坏四 素抗性基因，重 粒中含氨 青霉素抗性 酶 环 组质 苄 基因(AmpR)，因此携 目的基因 带 的受体菌在含Amp(氨 青霉素 苄 )的培养基中能形 成菌落，在含Tet 的培养基中不能形成菌落，D 。 错误 [例3] (2024·河北卷，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家 将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN 疫苗 并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1 所示。其中GtP 为启动子 若使r2HN 仅在水稻胚乳表达，GtP 应为____________启动子。Nos 为终止子，其 作用为________________________。r2HN 基因内部不含载体的限制酶识别位点。 因此，可选择限制酶________和________对r2HN 基因与载体进行酶切，用于表 达载体的构建。 (2)利用________方法将r2HN 基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN 表达情况， 可通过PCR 技术检测____________________，通过________技术检测是否翻译 出r2HN 蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植 株自交一代后，r2HN 纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究 的原因是________________________________________________________ ________________________________________________________________。 (4)制备r2HN 疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗 溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T 细胞(细胞毒 性T 细胞)水平，结果如图2 所示。据此分析，获得的r2HN 疫苗能够成功激活鸡 的________免疫和________免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN 疫苗的优点是_____________________ ___________________________________________________________________ (答出两点即可)。 答案 (1)在胚乳中特异性表达的基因 使转录在所需要的地方停下来 HindⅢ EcoRⅠ (2)农杆菌转化 是否转录出mRNA 抗原—抗体杂交 (3)1/4 纯合体自交后代不发生性状分离 (4)体液 细胞 (5)水稻易于种植，容易获得疫苗；水稻的产量较高，能够获得大量的疫苗(合理即 可) 解析 (1)若使r2HN 在水稻胚乳中表达， 仅 则GtP 在胚乳中特异性表达的基 应为 因启 子。 止子是基因下游的一端有特殊序列 构的 动 终 结 DNA 片段，使 在所 转录 需要的地方停下来。r2HN 插入启 子 应 动 GtP 和 止子 终 Nos 之 ，由于 间 GtP 中有限 制酶KpnⅠ的 序列，而 识别 SacⅠ的一个 序列位于 止子之后，因此不能 识别 终 选 两种限制 切割， 择这 酶 应选择HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN 和 体 行 切。 载 进 酶 (2)通 常采用 杆菌 化法将目的基因 入水稻的愈 。 农 转 导 伤组织 检测r2HN 是否表达，可 以采用PCR 技 基因是否 出 术检测该 转录 mRNA，通 抗原—抗体 交技 是 过 杂 术检测 否翻 出相关蛋白 。 译 质 (3)设r2HN 基因 为 N， 一位点插入目的基因的植株的 则单 基因型为Nn，其自交后代的基因型及比例为NN∶Nn∶nn＝1∶2∶1，r2HN 合 纯 体植株的比例为1/4。 合体自交后代不会 生性状分离，因此 合体 行 纯 发 选择纯 进 后 研究。 续 (4)抗体参与体液免疫，CD8＋T 胞 胞毒性 细 为细 T 胞，参与 胞免疫 细 细 。 分析 ， 的抗体水平及 题图 实验组 CD8＋T 胞水平的相 都高于 照 ， 明 细 对值 对 组 说 得的 获 r2HN 疫苗能 成功激活 的体液免疫和 胞免疫。 够 鸡 细 (5)水稻属于常 的 见 农 作物，易于种植，其作 生物反 器容易 得疫苗；水稻的 量高，作 生物反 为 应 获 产 为 应 器容易从胚乳中 得大量疫苗。 获 题型二 PCR 中引物的设计与选择 利用PCR 扩增目的基因(如干扰素基因)时，设计引物序列的主要依据是有一段已 知目的基因(干扰素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段单链核酸。 (1)引物的作用：Taq DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA 链。当引物与DNA 母链通过碱基互补配对结合后，Taq DNA 聚合酶就能从引物 的3′端开始延伸DNA 链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。 (2)设计引物应遵循的主要原则 ①引物长度应大于16 个核苷酸，可防止随机结合。 ②引物与靶序列间的Tm(指当50%的引物和靶序列表现为双链DNA 分子时的温 度)不应过低。G＋C 含量越高，Tm 越高。 ③引物不应有发夹结构，即不能有4 bp 以上的回文序列。 ④2 个引物间不应有4 bp 以上的互补序列或同源序列。 ⑤两条引物的复性温度相差不能大于5 ℃。操作时一般选择较低的那个复性温度 如果相差太大，另一条引物的非特异性结合就会增加。 (3)引物的处理 由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响 不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。 ①加酶切位点，便于形成重组DNA 分子。需要在2 种引物的5′端添加不同的限制 酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。 ②标记荧光，如病毒含量的测定 (4)PCR 循环时与引物相关的计算 PCR 经过n 次循环产生的DNA 数为2n，一共有2n＋1条链，其中有2 条链是DNA 母链，不含引物，其他的每1 条链均含1 个引物，并且2 种引物的数量相等，故 PCR 过程经过n 次循环，需要的引物总个数是2n＋1－2，需要某一种引物的总个数 是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一个DNA 由1 条母链和第1 种引物延伸的子链组成， 另一个DNA 由另1 条母链和第2 种引物延伸的子链组成，其他的DNA 均由2 种 引物延伸的2 条子链组成。 [例4] (2023·山 卷， 东 25)科研人员构建了可表达J－V5 融合蛋白的重组质粒并进 行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质 粒还需具备的结构有________________________________________________ (答出2 个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J 基因转录的模板链 位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因的________(填“a 链”或“b 链”) 相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相 应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内 表达了________，条带2 所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质 粒上的J 基因表达的。 答案 (1)RNA 聚合酶 复制原点、标记基因、限制酶切割位点等 (2)F1 和R2 或者F2 和R1 a 链 (3)J－V5 融合蛋白 不是 解析 (1)与 甲中启 子 合的 是 图 动 结 酶 RNA 聚合 。 甲中有启 子和 止子等 酶 图 动 终 作 体， 粒 需具 的 构有限制 切割位点、 基因、复制原点等。 为载 质 还 备 结 酶 标记 (2)据 甲可知，引物 图 F2 与R1 或F1 与R2 合部位包含 结 J 基因的碱基序列，因此 推 了确定 测为 J 基因 接到 粒中且插入方向正确，行 连 质 进 PCR ，若 用一 检测时 仅 引物， 甲中的引物 对 应选择图 F2 和R1 或F1 和R2。b 是模板 ，而根据 上启 链 图 动 子和 止子的位置可知， 上 方向是从左向右， 的模板 方向 是 终 图 转录 对应 链 应该 3′→5′，非模板链(也就是a 链)是5′→3′；考 到 虑 DNA 复制的方向是子 的 链 5′→3′， 引物基 上延伸的方向肯定是 础 5′→3′，所以引物 合的 其方向是 结 单链 3′→5′；中 图 F1 是前引物，在左 ，所以其配 的 是 侧 对 单链 3′→5′的b ，故其序列 与 链 应该 a 相 链 部分的序列相同。 应 (3)据 乙可知，只有抗 图 V5 抗体 ，出 条 时 现 带1，抗V5 抗体能与V5 序列表达 编码 短 标签 肽V5 特异性 合，只有抗 结 J 蛋白抗体 ，出 条 时 现 带1 和条带2，且条带1 ， 明 物 能与抗 较宽 说 该 质 J 蛋白抗体特异性 合，因此出 条 结 现 带1 明 胞内表 证 细 达了J－V5 融合蛋白，而条带2 可能是杂 。 质 突破2 PCR 定点突变技术 题型一 重叠延伸PCR 技术 重叠延伸PCR 技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2 和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链 的两种DNA 片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基 因。如某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定 突变，使水蛭素第47 位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子 为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图： 题型二 大引物PCR 技术 大引物PCR 需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、 常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR 利用突变上游引物和常规下游引物 进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA 片段；第二轮PCR 利用第一轮扩 增产物中的一条DNA 链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整 的含有突变位点的DNA 片段。原理如图。 题型三 反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列 当DNA 的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向 PCR 技术。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA 连接酶将获得的酶切 产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA 分子。以该 已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对 未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。 [例] (2024·山 聊城高三模 东 拟)α－环糊精是食品、医药等常用原料。α－环糊精葡 萄糖基转移酶(cgt)生产α－、β－和γ－环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt 在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt 的372 位天冬氨酸和89 位酪氨酸 是酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨 酸后，形成的重组cgt 催化特异性提高了27 倍。 图1 (1)蛋白质工程的第一步通常是________。重叠PCR 是常用的DNA 定点突变技术 其原理如图1 所示。与细胞内的DNA 复制相比，PCR 不需要用到________酶。要 完成两处位点的突变，至少要设计________种引物。 (2)如图2 是该酶编码链的部分序列，请你设计替换372 位天冬氨酸(密码子： GAU、GAC)为赖氨酸(密码子：AAA、AAG)的引物FP2 和RP1：________(只写 372 位对应的3 个碱基)。 FP2：5′－TAGACCGGCGATGGC________CCCAACAACCGG－3′ RP1：5′－CCGGTTGTTGGG________GCCATCGCCGGTCTA－3′ 图2 (3)用大肠杆菌大量生产重组cgt 需要解决酶的分泌问题。重组cgt 基因位于双突 变载体(简称T 载体)上，研究人员将重组cgt 基因与pET－20b(＋)载体(简称p 载 体)上的pelB 信号肽序列连接，构成重组载体cgt－p，该过程如图3 所示。应选用 ________对T 载体酶切处理，用________对p 载体进行酶切处理，并用________ 酶构建重组载体cgt－p，导入目的工程菌。培养基中除基本营养外，还需加入 ________完成筛选。 图3 答案 (1)确定预期的蛋白质功能 解旋 6 (2)AAA 和TTT(或AAG 和CTT)(不能颠倒顺序) (3)XmaⅠ、BamH Ⅰ XmaⅠ、BclⅠ DNA 连接 氨苄青霉素 解析 (1)蛋白 工程的第一步通常是确定 期的蛋白 功能。与 胞内的 质 预 质 细 DNA 复制相比，PCR 不需要用到解旋 。由 酶 图1 可知，完成一 突 需要 处 变 2 种通用引 物和2 种突 引物，如果要完成两种突 ，需要 变 变则 2 种通用引物和4 种突 引物， 变 至少要设计6 种引物。(2)根据碱基互 配 原 ，替 补 对 则 换372 位天冬氨酸 氨酸 为赖 的引物FP2 和RP1 的372 位 的 对应 3 个碱基为AAA 和TTT(或AAG 和CTT)(不 能 倒 序 颠 顺 )。(3) 用 应选 XmaⅠ、BamHⅠ对T 体 切 理，两种限制 不会 载 酶 处 这 酶 破坏重组cgt 的完整性，由重 体 组载 cgt－p 上的 序可知，需要保持 顺 pelB 的完整 性，所以只能 用 选 BclⅠ切一端，XmaⅠ和SmaⅠ的 序列相同， 了保 重 识别 为 证 组cgt 的反向 接，用 连 Xma Ⅰ、BclⅠ对p 体 行 切 理，并用 载 进 酶 处 DNA 接 构 连 酶 建重 体 组载 cgt－p， 入目的工程菌。培养基中除基本 养外， 需加入氨 青 导 营 还 苄 霉素完成 。 筛选 限时练26 突破基因工程类大题 ( ： 时间 40 分 分 ： 钟 值 50 分) 【综合提升】 1.(2024·厦 外国 学校 研 门 语 调 )转录因子FOXO1 与DNA 结合可提高某些促凋亡 基因的转录水平，促进神经元凋亡。让FOXO1 基因发生定点突变，使其表达的蛋 白第249 位点的丝氨酸替换为天冬氨酸，用来模拟FOXO1 被蛋白激酶Cdk5 磷 酸化后的状态。 (1)定点突变是利用PCR 等方法，在引物中引入突变序列，从而实现目的基因的 定向改造。以已有的质粒a0 为模板(如图1，★代表突变位点)，将质粒a0 定点突 变成质粒a1。 ①为了将突变序列准确地定位在目标序列上，引物部分序列应与FOXO1 基因拟 突变位点两端的序列________。将FOXO1 基因与GFP(绿色荧光蛋白)基因进行 融合的目的是_____________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 ②天冬氨酸的密码子为GAC，丝氨酸的密码子为UCU，正向引物★处的碱基序 列为____________________________________________________________。 ③至少经过________轮PCR，可以得到发生定点突变的质粒a1。 ④探究引物组合1 与引物组合2 扩增目的基因的效果，根据图2 的实验结果分析 哪对引物更适合作为定点突变的引物？____________(填“引物组合1”或“引 物组合2”) ，另一引物组合没有扩增产物的原因可能是 ______________________ ____________________________________________________________________ ___________________________________________________________________。 图2 两 的 增 物 组实验 扩 产 DNA 泳 果， 电 结 M 为DNA 准参照物， 照 不加 标 对 组 模板 (2)在过氧化物诱导下，Cdk5 会磷酸化FOXO1 249 位点的丝氨酸，科研人员试图 探究其在细胞内的分布是否会发生改变。将构建好的质粒a1 转染进体外培养的 原代神经元中，对照组的神经元需要转染质粒a0。一段时间后，发现对照组的绿 色荧光主要集中在细胞核中，而实验组的绿色荧光滞留在细胞质中。推测FOXO1 被Cdk5 磷酸化后，对凋亡起到抑制作用的原理是_______________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________。 (3)为了使课题研究更加完善，现有以下两种实验思路，请补充完整。 思路1：还可对比(2)中对照组与实验组的_______________________________ ___________________________________________________________________。 思路2：利用某种药物抑制________________________，检测受过氧化物诱导后 的FOXO1 在细胞中的分布情况。 答案 (1)①能够进行碱基互补配对 根据绿色荧光的分布，定位FOXO1 被磷酸 化后在细胞中的分布 ②GAC ③2 ④引物组合2 引物组合1 的两个引物碱 基互补配对的部分占比较高，降低了与模板链结合的概率 (2)FOXO1 被Cdk5 磷酸化后，无法进入细胞核，无法提高细胞核内某些促凋亡基因的转录水平(使促 凋亡基因转录受阻) (3)某些促凋亡基因的转录水平/神经元的凋亡程度 蛋白 激酶Cdk5 活性 解析 (1)①若要将突 序列准确地定位在目 序列上，引物部分序列 与 变 标 应该 FOXO1 基因 突 位点两端的序列能 行碱基互 配 。 拟 变 够进 补 对GFP( 色 光蛋白 绿 荧 ) 可以 出 色 光，将 发 绿 荧 FOXO1 基因与GFP( 色 光蛋白 绿 荧 )基因 行融合，以根据 进 色 光的分布，定位 绿 荧 FOXO1 被磷酸化后在 胞中的分布。 细 ② 氨酸的密 子 丝 码 为UCU，中 位点 图 该 为AGA∥TCT，AGA 的密 子 对应 码 为UCU，要想 密 子 该 码 变为GAC，则AGA∥TCT 要变为CTG∥GAC，正向引物★ 与 处 CTG 互 配 ， 补 对 应为GAC。③至少经过2 轮PCR 可得到 生定点突 的 粒 发 变 质 a1，第一轮PCR 只 改 了一条 上的碱基，第二 变 链 轮PCR 才会得到 粒 质 a1。④分析图2 可知，照 对 组 (不加模板)和引物 合 组 1 没有条 ，引物 合 组 带 组 2 有条 ，明引物 合 组 带说 组 2 更适 合作 定点突 的引物。引物 合 为 变 组 1 没有 增 物的原因可能是引物 合 扩 产 组 1 的两 个引物碱基互 配 的部分占比 高，降低了与模板 合的概率。 补 对 较 链结 (2)将构建好 的 粒 质 a1 染 体外培养的原代神 元中， 照 的神 元 染 粒 转 进 经 对 组 经 转 质 a0，一段 后， 照 的 色 光主要集中在 胞核中，而 的 色 光滞留 时间 发现对 组 绿 荧 细 实验组 绿 荧 在 胞 中。再 合 细 质 结 题干信息“ 因子 转录 FOXO1 与DNA 合可提高某些促凋 结 亡基因的 水平，促 神 元凋亡 转录 进 经 ”，推测FOXO1 被Cdk5 磷酸化后，凋亡起 对 到抑制作用的原理是FOXO1 被Cdk5 磷酸化后，无法 入 胞核，无法提高 胞 进 细 细 核内某些促凋亡基因的 水平。 转录 2.(2024·山 聊城二模 东 )人绒毛膜促性腺激素(hCGβ)是胎盘滋养层细胞分泌的一 种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ 基因也有表达， hCGβ 与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ 疫苗已成为近年来肿 瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题： 注：甲序列指 合成的信号 能引 后 合成的 入内 网腔； 导 肽 导 续 肽链进 质 AOX1 甲 为 醇氧化 基因的启 子，只能在以甲醇 唯一碳源的培养基中正常表达；各种限 酶 动 为 制 的 条所指 其 序列。 酶对应 线 为 识别 (1)图示hCGβ 基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的 基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加________限制酶的 识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10 个核苷酸时特异性强、效率高， 已知目的基因①处的碱基序列为—CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的 序列是5′________________3′。 (2) 图示hCGβ 基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 __________________________________________________________________ __________________________________________________________________。 从生产控制的角度分析，选用AOX1 作为hCGβ 基因启动子的优点是 ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________。 (3)阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌 ____________________________________________________________________ 的特点，从而实现重组DNA 的扩增，然后在含有________的培养基中筛选得到 含hCGβ 基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。 (4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下 哪些成分________(a.氨苄青霉素 b.组氨酸 c.无机盐 d.琼脂)，可在此培养基 上生长的酵母菌即为含有hCGβ 基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后 离心取上清液，依据________________原理进行检测。若上清液中能检测到 hCGβ 蛋白，则说明hCGβ 基因得以表达。 答案 (1)XhoⅠ、MumⅠ CTCGAGCCTTTCAGCT (2)有利于hCGβ 进入内质网加工 可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来 控制hCGβ 基因表达 (3)繁殖快，易培养、遗传物质少 氨苄青霉素 (4)a、b 抗原和抗体特异性结合 解析 (1)SmaⅠ会破坏目的基因，不能添加SmaⅠ 序列； 识别 EcoRⅠ会破坏质 粒上的氨 青霉素抗性基因 苄 ( 基因 标记 )，不能添加EcoRⅠ 序列； 识别 SalⅠ会破 坏 粒上的 氨酸合成 基因，不能添加 质 组 酶 SalⅠ 序列； 识别 XmaⅠ 序列与 识别 SmaⅠ 序列相同，会破坏目的基因，不能添加 识别 XmaⅠ 序列。因此，在 识别 hCGβ 基因两端 添加 应 XhoⅠ、MumⅠ限制 序列。根据 方向和 粒 酶识别 转录 质 AOX1 启 子位置确定 动 ，在① 插入了 处 XhoⅠ的 序列 识别 CTCGAG，则① 的碱 处 基序列为5′－CTCGAGCCTTTCAGCTCA－3′，互 中，碱基序列 补链 为3′－ GAGCTCGGAAAGTCGAGT －5′ ， 其 引物序列 对 设计 为 5′ － CTCGAGCCTTTCAGCTCA－3′，由于 得知 基因 增引物 度 经实验 该 扩 长 为10 个 核苷酸 特异性 、效率高，加上 时 强 XhoⅠ的 序列 识别 CTCGAG，共 总 16 个碱基， 因此 端 引物的序列是 设计该 对应 5′－CTCGAGCCTTTCAGCT－3′。(2)甲序列指 合成的信号 能引 导 肽 导后 合成的 入内 网腔，因此 续 肽链进 质 hCGβ 基因需要与甲 序列一起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ 入内 网中加工，并分泌 进 质 到 胞外。 细 AOX1 甲醇氧化 基因的启 子，只能在以甲醇 唯一碳源的培养 为 酶 动 为 基中正常表达，因此 用 选 AOX1 作为hCGβ 基因启 子，可以通 控制培养液中 动 过 甲醇的有无，来控制hCGβ 基因的表达。(3)由于 化 粒上含有氨 青霉素抗性 环 质 苄 基因，因此 入 化 粒的大 杆菌具有氨 青霉素抗性，因此 在含有氨 青 导 环 质 肠 苄 应 苄 霉素的培养基中 得到含 筛选 hCGβ 基因表达 体的大 杆菌后 行 增。 载 肠 进 扩 (4)由于 环状 粒中含有 氨酸合成 基因和氨 质 组 酶 芐青霉素抗性基因，且 重 粒 大 筛选 组质 时 杆菌是在含有氨 肠 苄青霉素的培养基上培养的，因此 入重 粒的酵母 为筛选导 组质 菌，培养基中不需要再加入 氨酸和氨 青霉素 组 苄 (即a 和b)，但需要加入无机 和 盐 脂，形成固体培养基，以 目的菌体。 琼 筛选 hCGβ 是一种分泌蛋白，可被分泌到细 胞外，将培养物离心后分出 胞和培养液两部分， 胞 破碎 理后，再次离心 细 细 经 处 取上清液，可 得 多的 获 较 hCGβ，用抗hCGβ 克隆抗体分 行 ，即抗原— 单 别进 检测 抗体 交法，原理 抗原与抗体特异性 合。若培养液及上清液中均能 到 杂 为 结 检测 hCGβ 蛋白， 明 则说 hCGβ 基因在酵母菌 胞中得到表达，并能分泌到 胞外。 细 细 3.(2024·黑吉 卷， 辽 25)将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒(辅助T－ DNA 转移)和不含有Vir 基因、含有T－DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提 高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫 害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1－F3，R1－R3 表示引物；T－DNA－LB 表示左 界； 边 T－DNA－RB 表示右 界； 边 Ori 表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性 基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是___________________ ___________________________________________________________________。 提取过程中加入体积分数为95% 的预冷酒精，其目的是 ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________。 (2)本操作中获取目的基因的方法是________和________。 (3)穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是________________________，驱动目的 基因转录；插入两个p35s 启动子，其目的可能是_________________________ ___________________________________________________________________。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因 对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行 PCR，应选用的引物是________和________。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。 A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B.将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达 C.将1～1 362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D.用1～1 362 合成基因序列和1 363～1 848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 答案 (1)水解蛋白质，使得DNA 与蛋白质分离 溶解蛋白质等物质，析出不溶 于酒精的DNA (2)PCR 技术扩增 人工合成 (3)RNA 聚合酶识别并结合的部位 提高目的基因的转录效率 (4)HygBR (5)F3 R2 (6)D 解析 (1)从 云金杆菌提取 苏 DNA ，需加入蛋白 ，其作用是水解蛋白 ，使得 时 酶 质 DNA 与蛋白 分离。提取 程中加入体 分数 质 过 积 为95%的 冷酒精，其目的是溶解 预 蛋白 等物 ，析出不溶于酒精的 质 质 DNA。(2)本操作中 取目的基因的方法是人 获 工合成法和PCR 技 增法。 术扩 (3)穿梭 粒中 质 p35s 启 子，其作用是 为 动 RNA 聚合 并 合的部位， 目的基因 ；插入两 酶识别 结 驱动 转录 个p35s 启 子，其目的可能是 动 提高目的基因的 效率。 转录 (4) 合基因表达 体的示意 ，根据 中穿梭 粒上 结 载 图 图 质 的KanR和HygBR两个 基因的位置，用 标记 HygBR基因 的抗生素初步 对应 筛选转 化的棉花愈 。 伤组织(5) 棉花植株是否 入目的基因，提取棉花植株染色体 为检测 导 DNA 作模板，行 进 PCR， 用的引物是 应选 F3 和R2。(6)D 所述内容制造了新的 项 蛋白 ，属于蛋白 工程。 质 质
