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易错点11 酶切位点的选择
[名师支招]
1.单酶切和双酶切
(1)单酶切
①过程：先用同一种限制酶切割载体和含目的基因的DNA 分子，获得带有相同
黏性末端或平末端的片段。再通过DNA 连接酶连接平末端或相同的黏性末端，
获得重组质粒。
②缺点：单酶切时，目的基因和载体的所有接口都是相同的，所以容易出现目的
基因反接或自身环化，如下图所示。
(2)双酶切
①过程：利用两个不同限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体均具有两
个不同的黏性末端，就可以避免反接，并减少自身环化的情况。
②方向：插入位置前后分别要有启动子和终止子，保证目的基因的表达。
2.酶切位点选择
(1)不破坏目的基因和标记基因：若在目的基因、标记基因或其他重要结构上有某
酶切位点，为避免这些结构被破坏，要避免使用相关的限制酶。
(2)根据T－DNA 片段选择限制酶：若对Ti 质粒进行操作，则酶切位点应位于T－
DNA 片段上，才能在农杆菌转化过程中将目的基因导入受体细胞基因组上。
(3)同尾酶的使用：同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制
酶。比如限制酶MboⅠ(↓GATC)和BamHⅠ(G↓GATC C)就是一对同尾酶，
NotⅠ(GC↓GGCC GC)和Bsp120Ⅰ(G↓GGCC C)也是同尾酶。尽管同尾酶切割
的黏性末端相同，可以被DNA 连接酶连接，但是由于两端的序列不同，连接后的
产物失去酶切位点，除非特殊情况，一般不会使用。
[典例赏析]
1.(2022·天津卷，15)研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶
基因P1 导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1 中含有KanR(卡那霉素抗性基
因)和SacB 两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物________和
________，并在引物的________(填“5′”或“3′”)端引入XhoⅠ酶识别序列，进
行PCR 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR 扩增载体3 中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时，引物
应包含________(填“EcoRⅠ”“HindⅢ”或“Xho Ⅰ”)酶识别序列，产物经单
酶切后连接到载体2 构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1 基因整合到载体4 构建载体5。将载体5 导入链霉素不敏感(由
RpsL 突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用
含有________的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核
DNA，且载体5 上其他DNA 片段全部丢失。该菌的表型为________。
A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C.卡那霉素和链霉素都敏感
D.卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用________技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨
酸产量。
答案 (1)1 4 5′ (2)XhoⅠ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR
解析 (1)据
可知，根据引物箭
方向可知，要想复制
图
头
KanR(卡那霉素抗性基因)
需要引物1 和4，因此
去除
效率
低的
为
筛选
较
SacB，
引物
应选择
1 和4。PCR
，
时
在引物作用下，DNA 聚合
从引物
酶
3′端开始延伸DNA
，即
链
DNA 的合成方向是
从子
的
链
5′端自3′端延伸的，因此在引物的5′端引入XhoⅠ
序列。
酶识别
(2)据图
可知，
体
载
4 中RpsL(
霉素敏感基因
链
)的两
具有
侧
XhoⅠ
序列，
体
酶识别
载
3 中
不含XhoⅠ
序列，如果将
体
酶识别
载
2 和
体
载
3
接
连
形成高效
体
筛选载
4
，需
时
要的引物
含有
应该
XhoⅠ
序列。
酶识别
(3)基因表达
体中的
基因有利于目
载
标记
的基因的初步
，据
意可知，体
检测
题
载
5 中含有RpsL(
霉素敏感基因
链
)和KanR(卡
那霉素抗性基因)，将
体
载
5
入
霉素不敏感
导
链
(由RpsL 突
造成
变
)、卡那霉素敏感
的受体菌。
得成功
入
体
为获
导
载
5 的菌株，
采用含有卡那霉素的平板
行初步
应
进
。
筛选
(4)据
意可知，
体
题
载
5
入
的受体菌
霉素不敏感
导
时
链
(由RpsL 突
造成
变
)、
卡那霉素敏感，受体菌中P1 基因脱离
体
载
5 并整合到受体菌
核
拟
DNA，且
体
载
5 上其他DNA 片段全部
失，因此
菌的表型
卡那霉素敏感、霉素不敏感，
丢
该
为
链
B 正确，A、C、D
。
错误(5)通过PCR 技
可以
目的基因是否插入受体
胞的
术
检测
细
染色体DNA 中或目的基因是否
出了
转录
mRNA，因此可采用PCR 技
定成功
术鉴
整合P1 基因的菌株。
2.(2024·河北邯
模
郸
拟节选)植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，
并与植物建立共生关系的一类微生物。
(1)某酵母菌能分泌一种可高效降解纤维素的酶，这种酶由W 基因编码。为在放
线菌中表达W 基因，需以图中质粒为载体。W 基因以乙链为转录模板链，转录时
mRNA 自身延伸的方向为________。
注：
中
图
MfeⅠ与EcoRⅠ切割后
生的黏性末端相同，其余不相同。
产
①很多启动子具有物种特异性，在质粒中插入W 基因，其上游启动子应选择
________(填字母)。
A.酵母菌启动子 B.芽孢杆菌启动子 C.放线菌启动子
②应使用限制酶________切割图中质粒，使用限制酶________切割图中含W 基
因的DNA 片段，以获得能正确表达W 基因的重组质粒。
(2)利用PCR 技术对放线菌是否含有W 基因进行________水平鉴定，应根据目的
基因(W 基因)两端的碱基序列来设计________进行扩增。
答案 (1)5′→3′ ①C ②MfeⅠ、HindⅢ EcoRⅠ、HindⅢ (2)分子 引物
解析 (1)
，
转录时mRNA 自身延伸方向为5′→3′。①
基因工程是将酵母菌的
该
W
基因
入放
菌，想
导
线
让W 基因在放
菌中成功表达，当
放
菌启
子。
线
应
选择
线
动
②
按照
限制
的原
合分析，
选择
酶
则综
MfeⅠ与EcoR Ⅰ切割后
生的黏性末端相同
产
但MfeⅠ会破坏目的基因，所以
粒使用限制
质
酶MfeⅠ、HindⅢ切割，含W 基因
的DNA 片段使用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ切割。
(2)PCR 技
是
术
DNA 分子的体外复制技
，属于分子水平。利用
术
PCR 技
增，
术扩
根据目的基因两端的碱基序列
引物，使引物与模板
能特异性
合。
应
设计
链
结
3.(2024·河北邢台模拟)二十碳五烯酸(EPA)能促进体内饱和脂肪酸代谢，具有降
低血液黏稠度、预防心脑血管疾病的功效。研究人员利用转基因技术从海洋生物
中提取了EPA 合成途径的关键基因pfaB，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵
生产EPA。图1 和图2 分别是转基因过程中使用的含目的基因的DNA 片段和质
粒。回答下列问题：
(1)根据图1 分析，利用PCR 扩增pfaB 基因时，所选用的引物是________。在PCR
仪中进行n 次循环，需要消耗________个引物。
(2)构建基因表达载体时，应选择______________这两种限制酶分别切割含目的
基因的DNA 和质粒，采用双酶切方法进行切割的目的是
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
(3)据图2 分析，将基因表达载体导入酵母菌后，可用添加了____________的培养
基对目的基因成功导入并表达的酵母菌进行筛选。
(4)采用PCR 等技术可检测pfaB 基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR 产物
一般通过_____________来鉴定，DNA 分子的迁移速率与________________有关
答案 (1)引物5 和引物4 2n＋1－2 (2)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 避免目的基因和质
粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接 (3)氨苄青霉素 (4)琼脂糖凝胶电
泳 凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等
解析 (1)利用PCR
增目的基因
，子
的延伸方向是
扩
时
链
5′端→3′端，增
物
扩
产
应
包含
切位点序列，所以
用的引物
引物
该
酶
选
为
5 和引物4。一个DNA 分子经过n
次复制形成2n个DNA，共含有2n＋1条
，除两条
代的模板
外，剩下的每一条
链
亲
链
的形成都需要消耗引物，所以需要消耗
链
2n＋1－2 个引物。
(2)
示分析：
图
合
示分析可知，
限制
结
图
应选择
酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分
切割含目的基因的
别
DNA 和
粒。采用双
切的方
质
酶
法
含目的基因的
对
DNA 和
粒
行切割，可以避
质
进
免目的基因和
粒的自身
化，防止目的基因与
粒的反向
接。
质
环
质
连
(3)由图2 可知，四
素抗性基因会被限制
破坏，因此
目的基因成功
入并
环
酶
筛选
导
表达的酵母菌
，可用添加氨
青霉素的培养基培养酵母菌。
时
苄
(4)采用PCR 等技术检测pfaB 基因是否插入酵母菌染色体中
，得到的
时
PCR
物
产
一般通
脂糖凝胶
泳来
定，
过琼
电
鉴
DNA 分子的迁移速率与凝胶的
度、
浓
DNA 分
子的大小和构象等有关。
4.(2021·山
等
考
，
东
级
试
25)人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋
白结合位点，该位点结合BCL11A 蛋白后，γ 基因的表达被抑制。通过改变该结合
位点的序列，解除对γ 基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科
研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行
转化和荧光检测，以确定BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加
限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是
________，在R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物
扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6 与R
扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7 与R 扩增产物的受体细
胞无荧光。含F7 与R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4 与R 扩增产物的受体细胞不再有荧
光，而含F5～F6 与R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与
引物序列所对应的位置不含有BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测
BCL11A 蛋白结合位点位于________________________________________
________________________________________________________________，
理由是__________________________________________________________
________________________________________________________________。
答案 (1)SalⅠ EcoR Ⅰ 6
(2)F7 与R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3)引物F4 与F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判
断F1～F4 与R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4 所对应调控序
列的下游(右侧)；F5～F6 与R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5
所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4 与F5 在调控序列上所
对应序列之间的区段上
解析 (1)从
干中
的几种限制
的序列和切割位点来看，可以
题
给
酶识别
发现
MunⅠ和EcoR Ⅰ
生的末端相同，可以用
产
DNA
接
接起来，
连
酶连
XhoⅠ和
SalⅠ
生的末端相同，可以用
产
DNA
接
接起来。因
需
连
酶连
为
要将
增
物定向
扩
产
插入到
体，指
光蛋白的表达，而
光蛋白基因要表达必
在其上游
载
导荧
荧
须
(右侧)
有启
子，
才能从右向左
，直到
止子。而启
子可能存在于
增
物
动
这样
转录
终
动
扩
产
中，因
启
子在
为
动
γ 基因的上游(左侧)，它
控的
是从左向右的，控两个基
调
转录
调
因表达的启
子方向相反，需将
增
物左右反
后接入
体中。而要将
增
动
扩
产
转
载
扩
产
物插入到
光蛋白基因的右
，其右
有
荧
侧
侧
MunⅠ、EcoR Ⅰ和XhoⅠ的切割位点，
但由于EcoR Ⅰ
有一个切割位点在
光蛋白基因内部，会将
基因破坏，所以
还
荧
该
在构建基因表达
体
载
时，不能选择EcoRⅠ。因
需要在
增
物两端加上相
的
为
扩
产
应
限制
序列，而在
酶识别
γ 基因上游的
控序列和启
子部分有
调
动
Mun Ⅰ和Xho Ⅰ
的
序列，防止任意切割，所以在
理
增
物
，两种
不能用，但
了
识别
为
处
扩
产
时这
酶
为
将
增
物定向插入
体，所以需要
增
物两端有与
扩
产
载
扩
产
MunⅠ和XhoⅠ切割产
生的相同的末端，所以可以
在
增
物左
选择
扩
产
侧(F1～F7)加上SalⅠ的
序列
识别
，
在插入
体
，就可以定向
接到
载
时
连
XhoⅠ切割的末端，而右侧(R)加上EcoR Ⅰ的
序列，可以定向
接到
识别
连
MunⅠ切割的末端。
程中要用到的
有
该实验过
酶
TaqDNA 聚合酶(PCR
增
扩
时)、MunⅠ和XhoⅠ(切割
体
载
时)、EcoR Ⅰ和Sal
Ⅰ(
理
增
物
处
扩
产
时)、DNA
接
连
酶(
接
增
物和
体
连
扩
产
载
)，共6 种
。
酶(2)将构建的
体
入除去
载
导
BCL11A 基因的受体
胞，成功
化后，含
细
转
F1～F6 与R
增
物的
扩
产
体表达
光蛋白，受体
胞有
光，明
光蛋白基因表达了，即插入的含
载
荧
细
荧
说
荧
F1
～F6 与R 的
增
物中含有启
子，能起始
；含
扩
产
动
转录
F7 与R
增
物的受体
扩
产
细
胞无
光
明
区
荧
说
该
域不含完整的启
子，
光蛋白基因未表达。
动
荧
(3)P 序列是雌激
素
下
作用的启
子，向培养液中加入雌激素，
诱导
发挥
动
诱导P
作用，从而表
发挥
达BCL11A 蛋白基因，合成BCL11A 蛋白，而
蛋白就可以与
控序列中的
合
该
调
结
位点
合，抑制
光蛋白基因的表达，胞无
光
生。根据
意，若
结
荧
细
荧
产
题
γ 基因上游
控序列上与引物序列所
的位置不含有
调
对应
BCL11A 蛋白的
合位点序列，所
结
以不考虑F1～F7、R 所在的位置，含F1～F4 与R
增
物的受体
胞不再有
扩
产
细
荧
光，
明
说
BCL11A 蛋白的
合位点在
结
F4 的右
，
致含
侧
导
F1～F4 与
增
物中有
扩
产
合
该结
位点。而含F5～F6 与R
增
物的受体
胞仍有
光。明含
扩
产
细
荧
说
F5～F6 与
R
增
物中无
扩
产
BCL11A 蛋白的
合位点，
合位点在
结
则结
F5 的左
。
合考
侧
综
虑
BCL11A 蛋白的
合位点在引物
结
F4 与F5 在
控序列上所
序列之
的区段
调
对应
间
上。
