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必备整合3 基因工程及其应用
1．基因工程的三种基本工具
2．基因工程的基本操作程序
[深度思考] ①目的基因主要是指编码蛋白质的基因，在已有mRNA 前提下，可通过逆转录
法获取目的基因。当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。
②目的基因应插在启动子与终止子之间。
③农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti
质粒上的
T －
DNA
转移到被侵
染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体
DNA
上。
3．限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图
甲不能选择限制酶Sma Ⅰ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质
粒，如图甲可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末
端，如图乙)。
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
(3)根据Ti 质粒的T－DNA 片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti 质粒均不宜选取，而丙Ti
质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。
4．蛋白质工程
5．DNA 的粗提取与鉴定
1．(2025·山东，25)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，利用农杆菌
转化法将Ti 质粒上的T－DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2 个种子休眠相关基因的
插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为____________________。选用图甲中
的SmaⅠ对抗除草剂基因X 进行完全酶切，再选择SmaⅠ和__________对Ti 质粒进行完全
酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是__________。利用DNA 连接酶将酶切后
的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠
杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶__________进行完全酶切并电泳检测，若
电泳结果呈现一长一短2 条带，较短的条带长度近似为__________bp，则一定为正向重组质
粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T－DNA 插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组
DNA，经酶切后产生含有T－DNA 的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR
难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为__________(填“4”“6”或“8”)个碱基对的
限制酶，且T－DNA 中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段__________，才能利
用引物P1 和P2 成功扩增未知序列。PCR 扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以
判断出2 条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为____________________(填“琼脂
糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生
型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
答案 (1)复制原点 XbaⅠ DNA 聚合酶 SpeⅠ、SmaⅠ 550 (2)4 连接成环(或环化)
测序和序列比对 (3)不能
解析 (1)Ti 质粒和普通质粒一样，具有复制原点，与其在宿主中的复制能力密切相关。选
择载体上的酶切位点，首先BamH Ⅰ不能选，因为涉及终止子序列被切开；其次，能与
SmaⅠ组合的只剩下XbaⅠ和PstⅠ，这两个限制酶能切出黏性末端；第三，涉及要补平黏
性末端，只有XbaⅠ切出的黏性末端(5′端突出的末端)可以作为模板，在DNA 聚合酶的催
化下，从其互补链的3′端开始连接脱氧核苷酸补平黏性末端，如图1 所示；而PstⅠ切出
的黏性末端是3′端突出的末端，无法作为模板，无法从其互补链的5′端开始连接脱氧核
苷酸，如图2 所示。
首先，补平的载体和SmaⅠ切割的抗除草剂基因X 既可以正向连接也可以反向连接；其次，
SmaⅠ切出的平末端和补平的XbaⅠ的黏性末端连接后形成的重组位点，两个限制酶识别序
列消失，另一边2 个SmaⅠ位点连接后形成的重组位点仍然能保留该酶切位点；第三，能
切出较准确片段的只剩下SmaⅠ和目的基因内的SpeⅠ两个酶切位点；第四，在进行目的基
因和载体连接过程中，由于使用了单酶切，因此，存在载体自连、载体串联、载体和单一基
因连接及载体和串联基因连接等情况，但无论何种连接方式，只有单基因和单载体的连接片
段在SmaⅠ和SpeⅠ切割下能出现一长一短两条带，且短的条带约为550 bp 才是正向连接
(图3)，而反向连接的片段切出的较短条带是200 bp(图4)。
(2)PCR 扩增的目标片段大小限制以及扩增的区域是两个引物之间的限定片段。根据题意，
一方面要求限制酶能在基因组中切割更多更小的片段，识别序列长度为4、6、8 个碱基的限
制酶在基因组中理论上分别为每44、46、48碱基对区域内会有一个酶切位点。因此，选择识
别序列为4 个碱基对的酶切割小麦基因组可产生更短的切割序列，连接后有利于后续PCR
进行。另外，要对图乙的未知序列进行扩增，只有连接成环后，才能形成两个引物之间的扩
增目标区，无论串连还是自连，都可以达到扩增引物之间区域的目的。琼脂糖凝胶电泳只能
判断产物的有无或大小，但无法确定碱基序列，所以不能用于判断是否属于同一个基因。测
序可以确定碱基序列，要确定两个片段是否属于同一个基因，进行序列比对即可。(3)如果
在突变体中检测到野生型基因存在，只能说明该基因已经整合进突变体基因组中。外源野生
型基因只有在突变体中正确表达才可能恢复野生型性状。因此，仅凭检测到野生型基因不足
以确定该植株的表型为野生型。
2．(2025·湖南，21)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA 病毒，可引起急性猪传染病。基因A 编
码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作
用。回答下列问题：
(1)制备特定抗原
①获取基因A，构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的
基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和______等；为确定基因A 已连接到质粒中且
插入方向正确，应选用图中的一对引物________对待测质粒进行PCR 扩增，预期扩增产物
的片段大小为________bp。
②将DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A 合成。
收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是____________________
________________________________________________________________________( 答出两
点即可)。
(2)制备抗蛋白A 单克隆抗体
用蛋白A 对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用
方法有____________(答出一种即可)。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和
________，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产
的抗蛋白A 单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。
答案 (1)①终止子(或复制原点) P1 和P3 782
②重组菌没有裂解或没有将蛋白A 释放到细胞外(或转速过高使蛋白A 发生沉淀或蛋白A 亲
水性较差发生沉淀或蛋白A 被大肠杆菌的蛋白酶降解) (2)PEG 融合法(或电融合法或灭活
病毒诱导法) 抗体检测
解析 (1)①PCR 时选用的两种引物应该方向相反，分析题图，P3 是唯一一个与P1 和P2 方
向相反的引物，故必选P3；PCR 的目的是确定基因A 已连接到质粒中且插入方向正确，P3
和P2 分别与基因A 两端互补配对，若选该对引物进行扩增，无论基因A 插入质粒方向是否
正确都可以扩增出片段(基因A)，不符合要求；P1 与质粒一段序列互补配对，P3 与基因A 的
一端互补配对，选P1 和P3 为引物，扩增时，若基因A 未插入质粒，则不能扩增出相应片段；
若基因A 插入质粒的方向错误，也不能扩增出相应片段，故应选P1 和P3 对待测质粒进行
PCR 扩增。预期扩增的片段包括质粒的一段序列(200 bp)和基因A(582 bp)，故扩增片段大小
为200＋582＝782(bp)。②上清液中检测到蛋白A 的条件：重组菌将蛋白A 正常表达；蛋白
A 不被重组菌中的酶降解；重组菌裂解或将蛋白A 分泌到细胞外；蛋白A 易溶于发酵液；
离心时转速合适，既能将重组菌和大的颗粒沉淀，又不会将蛋白A 沉降下来。
[命题延伸] 填充
(1)(2018·江苏，32 节选)为了便于扩增的DNA 片段与表达载体连接，需在引物的5 ′
端加上
限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使
DNA
片段能定向插入表达载体，减少自连。
(2)(2023·海南，20 节选)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，农杆菌侵染植物细胞时，
可将外源基因递送到植物细胞中的原因是农杆菌细胞内含有
Ti
质粒，
Ti
质粒中的
T －
DNA
能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体
DNA
整合到一起
。
(3)(2024·全国甲，38 节选)质粒载体上有限制酶a、b、c 的酶切位点，限制酶的切割位点如
图所示。构建重组质粒时，与用酶a 单酶切相比，用酶a 和酶b 双酶切的优点体现在避免目
的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化(答出两点即可)。
(4)(2023·全国乙，38 节选)GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以
GFP 基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的
GFP 突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头
为GFP 突变基因的转录方向)。图中①为终止子；②为启动子，其作用是RNA
聚合酶识别
和结合的部位，驱动基因转录出
mRNA
；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作
用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
(5)(2022·福建，13 节选)载体和CD14 片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。
用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ分别酶切CD14 和图中载体连接，CD14 接入载体时会形成正向连接和
反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14 的连接方向进行鉴定，理由
是正向连接的重组
DNA
有这两种酶切位点
( 限制酶的识别序列
) ；而反向连接的重组
DNA
会
形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点
( 没有限制酶的识别序列
) 。
3．(2023·广东，11)“DNA 的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。
下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案 D
解析 裂解是使细胞破裂释放出DNA 等物质，针对不同的实验材料，可选择不同的方法破
坏细胞，如植物细胞可选择研磨的方法，而动物细胞可选择吸水涨破的方法，A 正确；
DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L 的NaCl 溶液，将溶液过滤，即
可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA 分离，B 正确；DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶
于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA 的纯度，C 正确；将DNA 溶于NaCl
溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D 错误。
4．(2024·山东，13)关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是( )
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案 A
解析 研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA 在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B
错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA 双螺旋结构会发生改变，C 错误；加入二苯胺试剂
后沸水浴处理的时间要在5 分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为
明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D 错误。
[命题延伸] 判断
(1)用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA 量相近(2019·江苏，10A)( × )
提示：兔血液中的成熟红细胞没有DNA，因此等体积的兔血提取的DNA 量小于鸡血。
(2)“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA 的沉淀(2022·山东，13B)
( × )
提示：“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速细胞碎片的沉淀。
(3)粗提取DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入
与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特
定试剂后容易提取出DNA 相对含量较高的白色丝状物(2021·山东，13 改编)( × )
提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积
相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA 析出，不会进入滤液中。
1．(2025·泰安模拟)哺乳动物体内一定含量的ω3 多不饱和脂肪酸(LCPUFA)可以起到预防心
血管疾病的作用，但LCPUFA 在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员
从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA 合成酶基因fat1，培育转fat1 基因家兔。已知fat1 基因的a
链为模板链，与b 链结合的引物5′端添加了限制酶识别序列GAATTC，其部分流程如图所
示。下列叙述正确的是( )
A．基因工程操作程序中核心步骤是目的基因的筛选与获取
B．为确保fat1 基因正向插入，另一引物5′端需添加的限制酶识别序列为GGATCC
C．扩增fat1 基因时，经过3 轮循环，得到的产物中只含一种引物的DNA 分子占比为1/2
D．检测转基因家兔细胞中fat1 基因是否转录可采用抗原—抗体杂交法
答案 B
解析 基因工程的操作程序中核心步骤是基因表达载体的构建，而不是目的基因的筛选与获
取，A 错误；已知与b 链结合的引物5′端添加了限制酶EcoR Ⅰ识别序列GAATTC，即目
的基因的右侧添加了EcoR Ⅰ识别序列，为确保fat1 基因正向插入，已知fat1 基因的a 链为
模板链，含有磷酸基团的一侧为5′端，转录时从a 链的3′端开始，因此目的基因的左侧
应该添加BamH Ⅰ的识别序列，故另一引物5′端需添加的限制酶识别序列为GGATCC，
B 正确；PCR 反应中，经过n 轮循环后，共得到2n个DNA 分子。只含一种引物的DNA 分
子是由最初的两条模板链为模板合成的，经过3 轮循环后，得到23 ＝ 8(个)DNA 分子，其
中只含一种引物的DNA 分子有2 个，占比为1/4，C 错误；检测转基因家兔细胞中fat1 基因
是否转录可采用核酸分子杂交法，利用抗原—抗体杂交法可检测fat1 基因是否翻译，D 错误。
2．(2025·河南名校联盟一模)含有荧光素酶基因Luc(可让细胞发出荧光)的基因表达载体(该
基因与其他构件的关系如图所示)可用于培育转基因植物。科研人员拟利用该基因表达载体
将抗旱基因LEA 导入烟草中以培养抗干旱烟草。下列叙述正确的是( )
A．构建基因表达载体时，一般将LEA 基因插入BamH Ⅰ位点处
B．启动子的作用是与解旋酶识别并结合，从而开启目的基因的转录
C．荧光素酶基因Luc 在基因表达载体中的作用是作为标记基因
D．被导入了基因表达载体的烟草叶肉细胞通过脱分化形成胚状体
答案 C
解析 荧光素酶基因Luc 可让细胞发出荧光，将LEA 基因插入BamH Ⅰ位点时，会破坏标
记基因Luc，A 错误；启动子是RNA 聚合酶识别并结合的部位，B 错误；可以通过受体细胞
是否发荧光判断基因表达载体是否导入受体细胞，所以荧光素酶基因Luc 在基因表达载体中
的作用是作为标记基因，C 正确；被导入了基因表达载体的烟草叶肉细胞通过脱分化只能形
成愈伤组织，还需要经过再分化才能形成胚状体，D 错误。
3．(2025·长沙一模)关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验操作，下列叙述正确的是(
)
A．根据待分离DNA 片段的大小，需用无菌水配制琼脂糖溶液
B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳取出凝胶置于紫外灯下观察
D．PCR 实验中所使用的离心管、微量移液器、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行湿热灭菌
答案 C
解析 根据待分离DNA 片段的大小，需用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，A 错误；在沸水浴
或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后，再加入适量的核酸染料混匀，B 错误；待指示剂
前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳取出凝胶置于紫外灯下观察，这样可以清晰地观察到
DNA 条带的位置和情况，C 正确；PCR 实验中使用的离心管、微量移液器、枪头和蒸馏水
等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理，微量移液器属于精密仪器，不能进行湿热灭菌，D
错误。
4．(2025·长沙模拟)疫霉菌感染会造成辣椒严重减产，已知红光可促进H 蛋白的合成，调节
植物体对病原菌的响应。水杨酸(SA)可以抵御疫霉菌侵染，P 酶催化合成SA，正常辣椒叶
片几乎不表达H 蛋白；若发生感染，4 天后叶片中的H 蛋白含量显著升高。额外施加红光处
理感染叶片，H 蛋白在1 小时内可达到相同水平。科研人员推测，H 蛋白可能调控P 基因表
达P 酶，为验证上述推测，开展如下实验。
(1)实验一：将不同组分混合保温后，电泳检测标记条带如图1 所示。本实验中的X 是
____________________。 结果表明，H 蛋白直接结合P 基因启动子。
注：“＋”表示添加， “－”表示未添加。“30×、100×”表示添加含量是标记探针的
30 倍、100 倍。
(2)实验二：进行如图2 所示操作，随后用荧光素处理该辣椒叶片，检测荧光素酶催化荧光
素氧化发出的荧光。结果显示与对照组相比，实验组植株荧光强度较高。
注：组成型启动子的作用是调控基因在全部组织中转录。
图中终止子的作用是____________；目的基因导入辣椒叶片中常用的方法是______________；
实验组质粒上甲、乙、丙处依次应为____________(填下列字母)，对照组质粒上甲、乙、丙
处依次应为__________(填下列字母)。
a. P 基因启动子
b．组成型启动子(调控基因在全部组织中转录)
c．H 基因启动子
d．P 基因
e．H 基因
f．荧光素酶基因
(3)证实“辣椒感染后H 蛋白促进P 基因表达”这一结论，实验二比实验一更具有说服力，
理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)未标记的P 基因启动子 (2)终止转录 农杆菌转化法 a、f、e c、f、e (3)实验
二是植物体内实验，荧光强度的检测结果可反映H 蛋白促进P 基因的表达；实验一是体外
实验，不能判断H 蛋白对P 基因的调控方向
解析 (1)本实验的结果表明，H 蛋白可直接结合P 基因的启动子，又知探针是带有标记的，
因此这里的启动子不需要标记，因此，本实验中的X 是未标记的P 基因启动子，实验结果
表明，随着P 基因启动子的含量增加，H 蛋白的含量减少，因而可证明H 蛋白直接结合P 基
因启动子，进而调控P 基因的表达。(2)基因表达载体应该有的结构有启动子、终止子、目
的基因和标记基因等，终止子能终止转录；对于植物而言，常用农杆菌转化法将目的基因导
入植物细胞；题意显示，P 酶催化合成SA，正常辣椒叶片几乎不表达H 蛋白，若发生感染，
4 天后叶片中的H 蛋白含量显著升高，H 蛋白可能作用于P 基因的启动子，调控P 基因表达
P 酶，为了验证上述推测，需要通过质粒2 将H 基因转入辣椒叶片，同时需要通过质粒1 转
入P 基因启动子和荧光素酶基因以便用于检测，因此，图2 质粒上甲、乙、丙处依次应为P
基因启动子、荧光素酶基因、H 基因，依次为a、f、e；对照组质粒上甲、乙、丙处依次应
为c、f、e，以此来说明H 蛋白对P 基因启动子的作用，与对照组相比，转基因植株荧光强
度较高，该结果可推测H 基因促进了P 基因的表达。(3) 证实“辣椒感染后H 蛋白促进P 基
因表达”这一结论，实验二比实验一更具有说服力，这是因为实验二是植物体内实验，即实
验中具有了活体环境，实验中荧光强度的检测结果可反映H 蛋白促进P 基因的表达；而实
验一是体外实验，不能判断H 蛋白对P 基因的调控方向，只能确定H 蛋白与P 基因的启动
子进行了结合。
5．科研人员根据获得的红花转录因子基因(CtWRI1)的cDNA 序列设计引物，通过PCR 获得
CtWRI1 编码序列，并通过烟草遗传转化对其功能进行研究。图甲为实验过程中使用的Ti 质
粒图谱及T－DNA 结构，其中Rifr代表利福平抗性基因，bar 代表除草剂抗性基因，LB 和
RB 分别代表T－DNA 的左边界和右边界。图乙为不同限制酶的识别序列及切割位点和
CtWRI1 的结构及转录方向。回答下列问题：
(1)为了将CtWRI1 编码序列与图甲中的Ti 质粒正确连接，构建引物F 和引物R 时应在
________端分别添加________的识别序列，通过酶切和连接后可获得连接产物。
(2)CtWRI1 转录的模板链的序列为：5′－TTAGCCT……TACCGACAT－3′，请写出引物R
的前10 位碱基序列：5′－________________________－3′。
(3)通过________法将CtWRI1 编码序列导入烟草细胞，利用含________的培养基对烟草细胞
进行初步筛选，再通过________技术获得转基因烟草。可以通过________等技术从分子水平
上检测烟草细胞的染色体DNA 上是否插入了CtWRI1 编码序列。
(4)科研人员测定野生型烟草(WT)和转基因烟草中CtWRI1 的相对表达量、脂肪酸合成基因的
相对表达量和种子含油量，结果见图丙。据图丙分析，转基因烟草种子含油量增加的可能原
因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1) 5′ Sac Ⅰ和Pst Ⅰ (2)CTGCAGTTAG (3)农杆菌转化 除草剂 植物组织
培养 PCR (4)CtWRI1 的过量表达促进了脂肪酸合成相关基因的表达，进而促进了油脂的
合成
解析 (1)引物设计时，应在5′端添加限制酶识别序列，因为DNA 聚合酶只能从引物的
3′端开始延伸子链，所以要将限制酶识别序列添加在5′端，便于后续的酶切和连接操作；
由图甲中T－DNA 结构可知，在启动子2 和终止子之间有多个限制酶酶切位点，为保证
CtWRI1 编码序列能正确插入且不破坏其他重要元件，同时考虑到限制酶切割后的黏性末端
能正确连接，结合图乙中CtWRI1 的结构及转录方向，应在引物F 和引物R 的5′端分别添
加Sac Ⅰ和Pst Ⅰ的识别序列。这样切割后产生的黏性末端可以正确连接，构建基因表达
载体。(2)已知CtWRI1 转录的模板链的序列为：5′－TTAGCCT……TACCGACAT－3′，
转录是从DNA 模板链的3′端向5′端进行，而引物R 与非模板链的3′端互补配对，即引
物R 有一段序列与模板链5′端相同。并且需要在引物R 的5′端添加限制酶Pst Ⅰ的识别
序列，所以引物R 的前10 位碱基序列为5′－CTGCAGTTAG－3′。(3)将目的基因导入植
物细胞常用农杆菌转化法，本题中将CtWRI1 编码序列导入烟草细胞也可通过农杆菌转化法。
因为Ti 质粒可以整合到植物细胞的染色体DNA 上，从而将目的基因导入受体细胞；由图甲
可知，Ti 质粒上含有bar(除草剂抗性基因)，所以利用含除草剂的培养基对烟草细胞进行初
步筛选，能够在该培养基上存活的细胞可能含有重组Ti 质粒，即可能导入了CtWRI1 编码序
列；将导入目的基因的烟草细胞培养成完整的转基因烟草植株，需要通过植物组织培养技术，
利用植物细胞的全能性，将单个细胞培养成完整植株；从分子水平上检测烟草细胞的染色体
DNA 上是否插入了CtWRI1 编码序列，可采用PCR 技术。(4)据图丙分析，转基因烟草中
CtWRI1 的相对表达量高于野生型烟草，同时脂肪酸合成基因的相对表达量也高于野生型烟
草，而转基因烟草种子含油量也高于野生型烟草。所以转基因烟草种子含油量增加的可能原
因是CtWRI1 的过量表达促进了脂肪酸合成相关基因的表达，进而促进了油脂的合成，最终
导致种子含油量增加。
