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第50 课时 微生物的培养技术与应用
考点一 微生物的基本培养技术
1．培养基的配制
(1)培养基的概念、用途和类型
①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
②用途：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
③培养基的种类(按物理性质分)
培养基种类
培养基特点
作用
固体培养基
加凝固剂，如琼脂
微生物的分离与鉴定，活菌计数，保
藏菌种
半固体培养基
容器放倒不致流出，剧
烈震动则破散
观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基
不加凝固剂
常用于工业生产、微生物的扩大培养
(2)培养基的配方
①主要营养物质：水、碳源、氮源、无机盐。
②其他条件：pH、特殊营养物质和氧气。如表：
微生物
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
特殊
需求
添加维生素
一般pH 调至酸性
一般pH 调至中
性或弱碱性
无氧
2.无菌技术
(1)目的：获得纯净的微生物培养物。
(2)关键：防止杂菌污染。
(3)常用方法：灭菌和消毒。
(4)无菌技术的主要方法及适用对象
(5)注意事项
①实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
②为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
提醒 选择无菌技术的原则：一要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；二要考虑
操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。
3．微生物的纯培养概念辨析
4．纯培养的过程(以酵母菌为例)
(1)不含氮源的平板不能用于微生物培养(2023·山东，15)( × )
提示 不含氮源的平板可用于固氮菌的培养。
(2)可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌(2022·湖北，4)(
√ )
(3)接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃(2023·山东，15)( × )
提示 使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污
染环境。
分析微生物平板划线和培养的具体操作
微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，据图回答下列问题：
(1)图中①～⑧不正确的操作及其原因分别是什么？
提示 ②拔出棉塞后完全握住棉塞会造成杂菌污染，应握住棉塞上部；⑥划线时不能将培养
皿完全打开，应在火焰附近将培养皿打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条
平行线，盖上皿盖；⑦划线时第5 次的划线不能与第1 次的划线相连；⑧平板应倒置培养。
(2)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
提示 划线后，线条末端菌种的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能
使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(3)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
提示 需要；划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感
染操作者。
归纳总结 平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
考向一 微生物的基本培养技术
1．(2025·江苏，11)从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、
纯化、鉴定。下列叙述正确的是( )
A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D．鉴定后的致病菌可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
答案 B
解析 制备的培养基需用高压蒸汽灭菌锅灭菌，紫外线仅用于表面或空气消毒，无法达到灭
菌目的，A 错误；将土样加入无菌水制成悬液，经梯度稀释后，取各稀释度菌液涂布于培养
基表面，分离并计数，B 正确；连续划线时，每次应从上次划线的末端开始划线，以逐步稀
释聚集的菌种，若从起始端开始划线，则无法有效分离出单菌落，C 错误；斜面培养基保存
菌种需置于4 ℃短期保存，长期保存需用甘油管或冷冻干燥法，D 错误。
2.为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正
确的是( )
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
答案 B
解析 温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A 错误；
由题图可知，随着划线次数增多，细菌密度逐渐减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取
单菌落，B 正确；菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得
到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C 错误；刚果红能与纤维素形成红色复合物，菌落周
围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D 错误。
考点二 微生物的选择培养和计数
1．区分选择培养基与鉴别培养基
种类
特点
用途
举例
选择
培养基
允许特定种类的微生物生
长，同时抑制或阻止其他
种类微生物生长
从众多微生物中分
离所需的微生物
以尿素为唯一氮源的培养
基分离得到尿素分解菌
鉴别
培养基
根据微生物的代谢特点在
培养基中加入某种指示剂
或化学药品，进而产生特
定的颜色或其他变化
鉴别不同种类的微
生物
用伊红—亚甲蓝培养基鉴
别大肠杆菌
提醒 常见选择培养基举例：(1)缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。(2)
含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。(3)无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2．微生物的选择培养和数量测定
(1)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，
随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
②涂布平板操作步骤
(2)微生物的数量测定方法
①显微镜直接计数法
提醒 显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活
菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计
数。
②活菌计数法
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
(2)实验流程
(3)实验结果分析与评价
教材隐性知识 选择性必修3 P19“探究·实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请
进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素
分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，
可确定该细菌能够分解尿素。
(1)平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒(2023·山东，15)( × )
提示 平板涂布时涂布器使用前必须先浸在酒精中，然后在火焰上灼烧，这种操作属于灭菌。
(2)利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物(2023·山东，15)( √ )
(3)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细菌计数(2021·浙江6 月选考，
17)( × )
提示 平板划线法只能用于细菌分离，不能用于细菌计数。
(4)血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定(2023·江苏，7)( ×
)
提示 血细胞计数板常用于相对较大细胞(如酵母菌细胞)的计数，不能直接用于细菌计数，
用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
理解微生物的选择培养和计数的原理
某兴趣小组从富含纤维素的土壤中取样，加入选择培养基中进行振荡培养，之后接种于鉴别
培养基上进行培养，筛选出能够高效分解纤维素的微生物。请回答下列相关问题：
1．从富含纤维素的土壤中取样的原因是什么？
提示 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。
2．分离出分解纤维素的微生物，应该配制以纤维素为唯一碳源的培养基，目的是促进纤维
素分解菌生长，抑制其他微生物的生长。
3.已知刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物无法形成，平板上会
出现以菌落为中心的透明圈(如图)，几号真菌降解纤维素的能力最强，理由是什么？
提示 ④；④形成的透明圈与菌落直径的比值最大。
4．三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量，在对应稀释倍数为106的稀
释液中各取0.1 mL 涂平板，得到以下统计结果：
甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236 和260，取平均值248；
乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是209、240 和250，取平均值233；
丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212 和256，取平均值163；
在三位同学的统计中，乙同学的统计是正确的，据此计算，每克土壤样品中含细菌
2.33
×
10
9 个。
归纳总结
考向二 目标微生物的筛选与鉴定
3．(2025·山东，15)深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下，该细菌在
以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜，实验处理及结果
如表所示。下列叙述正确的是( )
A．可用平板划线法对该菌计数
B．制备培养基的过程中，应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C．由②④组可知，在以纤维素为唯一碳源的培养基上，该菌可在常压下生长
D．由③④组可知，高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
答案 D
解析 平板划线法是用来分离和纯化微生物，获得单个菌落的技术，其主要目的是分离而不
是计数，用于活菌计数的方法通常是稀释涂布平板法，A 错误；制备培养基时，应先进行高
压蒸汽灭菌，再倒平板，B 错误；②组为常压 ＋ 纤维素，结果无菌落，而④组为高压 ＋
纤维素，结果有菌落，说明在以纤维素为唯一碳源的条件下，该菌不能在常压下生长，能在
高压下生长，C 错误；③④组形成对照，变量是碳源，实验结果表明，在高压条件下，该细
菌可以利用纤维素生长，但不能利用淀粉生长，D 正确。
4．(2025·黑吉辽蒙，4)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素
(C22H23ClN2O8)能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述
错误的是( )
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH 满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
答案 D
解析 稀释涂布平板法需用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，而接种环用于平板划线法
(分离单菌落)。用接种环无法保证菌液涂布均匀，D 错误。
考向三 微生物的分离与计数
5．(2025·湖南，5)采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是( )
A．稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B．完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C．土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分解成乙酸
D．用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
答案 B
解析 平板划线法只能用于微生物的分离，不能用于计数，A 错误；为了检测培养基是否彻
底灭菌，完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照，B 正确；醋酸菌是好
氧细菌，在有氧条件下才能将葡萄糖分解成乙酸，C 错误；筛选尿素分解菌的培养基应以尿
素为唯一氮源，培养基中不能含有蛋白胨，D 错误。
归纳总结 两种纯化方法的比较
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
分离结果
关键操作
接种环在固体培养基表面
连续划线
①一系列的梯度稀释；
②涂布平板操作
接种用具
接种环
涂布器
优点
可以观察菌落特征，对混
合菌进行分离
可以计数，可以观察菌落特征
缺点
不能计数
操作复杂，需要涂布多个平板
共同点
都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表
面形成单个的菌落，都可用于观察菌落特征
6.产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。
请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。
编号
①
②
③
④
物品
培养基
接种环
培养皿
涂布器
灭菌方法
高压蒸汽
火焰灼烧
干热
臭氧
(2)称取1.0 g 某土壤样品，转入99 mL 无菌水中，制备成菌悬液，经__________后，获得细
胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL 菌悬液涂布在固体培养基上，其中10 倍稀释的菌悬液
培养后平均长出了46 个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌________个。
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行__________育
种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以__________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间
后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径______的菌落，纯化后获得A、B 两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B 两菌株的
相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，
理由是_____________________________________________________________________。
答案 (1)④ (2)等比稀释 4.6×105(或460 000)
(3)诱变 脂肪 较大 (4)B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净
化效果好
解析 (2)利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行等比稀释，以获
得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数为30～300 的平板最适于计数。0.1 mL 菌悬液
中含有46 个酵母菌落，则1 mL 菌悬液中含有460 个酵母菌落；1.0 g 土壤样品首先稀释100
倍，然后稀释10 倍，共稀释了1 000 倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌460×1 000＝
4.6×105(个)。(3)采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵
母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直
径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪(碳源)多，直径小的说明产酶
能力弱，利用的脂肪(碳源)少。(4)通过分析题图可知，相同时间内，菌株B 细胞密度大，说
明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B 利用的脂肪多，脂肪剩余
量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。
一、基础排查
1．判断下列有关微生物培养基的成分与配制过程的叙述
(1)培养基中添加的牛肉膏可为微生物提供碳源、氮源和维生素等( √ )
(2)与液体培养基相比，固体培养基含有琼脂成分( √ )
(3)培养硝化细菌时，培养基中需要加氮源，不需要加入碳源( √ )
(4)为防止杂菌污染，灭菌后的培养基应立即倒入培养皿中并盖上皿盖，待冷却后倒置( ×
)
提示 刚灭菌的培养基需冷却到50 ℃左右才能倒平板。
(5)在培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱酸性( × )
提示 在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。
(6)配制培养基过程中应先调pH 再进行高压蒸汽灭菌( √ )
2．获得纯净微生物培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。判断下列有关无菌操作的叙述
(1)牛奶可使用巴氏消毒法，其优点是能够杀死全部微生物，保留牛奶风味( × )
提示 牛奶可使用巴氏消毒法，其优点是能够杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不破
坏牛奶的营养成分。
(2)在接种箱或超净工作台的使用过程中，可用紫外线照射30 min 来进行消毒( × )
提示 在接种箱或超净工作台使用之前，可用紫外线照射30 min 来进行消毒。
(3)灼烧灭菌的对象可以是金属用具和某些玻璃器皿，在酒精灯火焰充分燃烧层进行( √ )
(4)高压蒸汽灭菌时的灭菌条件通常是100 kPa、121 ℃，15～30 min( √ )
(5)若培养皿盖和培养皿底之间溅有培养基，则不宜用此培养皿培养大肠杆菌( √ )
(6)倒平板时应该把培养皿盖完全打开，以免培养基溅到培养皿盖上( × )
提示 为防止空气中的杂菌落入培养皿中，倒平板时不能把培养皿盖完全打开，正确的操作
是将培养皿打开一条稍大于锥形瓶瓶口的缝隙。
(7)倒平板后，对空白培养基进行培养，可检测培养基是否被污染( √ )
(8)接种前后接种环都必须灼烧灭菌( √ )
(9)倒平板和接种操作都需要在酒精灯的火焰附近进行( √ )
3．判断下列有关微生物分离、纯化、计数及培养的叙述
(1)平板划线法接种时不能划破培养基，第3 次划线应从第2 次划线的末端开始( √ )
(2)平板划线法接种时，若在平板上划线4 个区，则需灼烧接种环5 次( √ )
(3)用涂布器蘸取少量菌液滴加在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀( ×
)
提示 涂布时，用移液器取0.1 mL 菌液滴加到培养基表面，而后用涂布器进行涂布，涂布
时涂布器可以不动，可转动培养皿，使涂布均匀。
(4)在筛选产纤维素酶的微生物时，含纤维素和刚果红的固体培养基既是选择培养基也是鉴
别培养基( √ )
(5)接种后需立即倒置培养以避免皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染( × )
提示 接种后需等到菌液被培养基吸收后倒置平板，目的是防止培养皿盖上的冷凝水滴落，
造成污染，同时也能避免培养基中的水分蒸发过快。
(6)对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔在皿底标记( √ )
(7)菌落的大小、颜色、隆起程度等特征都可作为菌种鉴定的依据( √ )
(8)同一稀释度下应至少对3 个平板进行重复计数，然后求平均值( √ )
(9)利用显微镜直接计数，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和( √ )
(10)用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物计数时，所得数据往往比实际数据偏小( ×
)
提示 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故用稀释涂布平
板法进行微生物计数时，所得数据往往比实际数据偏小，但用平板划线法不能对微生物计数。
二、要语必背
1．(选择性必修3 P10)培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源等。
2．(选择性必修3 P10)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术除用来防
止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。
3．(选择性必修3 P12)菌落是指分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成
肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微
生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养
物。
4．(选择性必修3 P16)选择培养基是指在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时
抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
5．(选择性必修3 P12)平板冷凝后，要将平板倒置的原因是平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，
凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基中的水分过快地挥发，
又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
6．(选择性必修3 P13)操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染
培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一
次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次
划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环
上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
7．(选择性必修3 P13)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是避免接种环温
度太高，杀死菌种。
8．(选择性必修3 P18)血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌
孢子等的计数。用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
9．(选择性必修3 P18)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计
的菌落数往往比活菌的实际数目少。
10．(选择性必修3 P19)检测培养物中是否有杂菌污染的方法是同时培养灭菌后的未接种的培
养基，观察是否有菌落产生。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是配制牛肉膏蛋白胨
培养基作为对照，观察选择培养基上的菌落数是否远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目。
课时精练
[分值：100 分]
[1～8 题，每题5 分；9～13 题，每题6 分。共70 分]
一、选择题
1．(2025·淮阴中学调研)下列关于灭菌、消毒、无菌操作的叙述，正确的是( )
A．配制培养基、倒平板、接种均需要在酒精灯火焰旁进行
B．可用高压蒸汽灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
C．为防止杂菌污染，应将配制好的选择培养基分装到培养皿中进行高压蒸汽灭菌
D．为防止蛋白质变性，不能使用高压蒸汽灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
答案 B
解析 倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行，配制培养基不需要在酒精灯火焰旁进行，A
错误；实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等可以使用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，以防
止杂菌污染，B 正确；为了防止杂菌污染，应将配制好的选择培养基分装到锥形瓶中再进行
高压蒸汽灭菌，C 错误；牛肉膏蛋白胨培养基需要利用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，D 错误。
2．(2025·湖北七市州二模)细菌培养常用牛肉膏蛋白胨培养基，酵母菌培养常用马铃薯琼脂
培养基。下列有关细菌和酵母菌纯培养实验的叙述，正确的是( )
A．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
B．酵母菌培养基通常比细菌培养基有更高的碳氮比
C．制备培养基的步骤为配制培养基→倒平板→灭菌
D．可用血细胞计数板测定酵母菌和细菌的种群数量
答案 B
解析 未长出菌落的培养基也需要灭菌后才能丢弃，A 错误；制备培养基的步骤为配制培养
基→灭菌→倒平板，C 错误；血细胞计数板适用于真菌的计数，细菌计数板适用于细菌的数
量测定等，D 错误。
3．(2025·信阳高级中学月考)某研究团队用化合物A、磷酸盐、镁盐和微量元素等配制了培
养基，成功筛选出能高效降解化合物A 的目的菌。下列叙述正确的是( )
①筛选目的菌的培养基属于选择培养基，可用湿热灭菌法灭菌
②可以用液体培养基进行扩大培养，以增加目的菌的数量
③可以用平板划线法对目的菌进行筛选和活菌计数
④以菌落数为30～300 的平板进行计数，通常统计的菌落数比实际活菌数多
⑤可以通过改造细菌的基因来获得能够降解化合物A 的目的菌
A．①③④
B．②④⑤
C．②③⑤
D．①②⑤
答案 D
解析 平板划线法不能对微生物进行计数，③错误；以菌落数为30～300 的平板进行计数，
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故通常统计的菌落数比实际
活菌数少，④错误。
4．(2025·郑州二模)土壤中的解磷细菌能够分泌磷酸酶溶解磷酸盐固体，提高土壤的肥力。
科研工作者通过分离、培养解磷细菌制备菌肥，应用到农业生产中。下列关于解磷细菌的分
离和培养的叙述，正确的是( )
A．解磷细菌合成和分泌磷酸酶时需要核糖体、内质网、高尔基体等细胞器的参与
B．分离解磷细菌时，需取少量土壤，在以磷酸盐固体为唯一磷源的培养基中培养
C．筛选解磷能力强的菌株时需在特定固体培养基上挑选降解圈最大的菌落
D．测定解磷菌肥活菌的数目时宜用平板划线法而不宜用显微镜直接计数法
答案 B
解析 解磷细菌属于原核生物，其细胞结构中不含内质网和高尔基体，A 错误；分离解磷细
菌时，需取少量土壤，在以磷酸盐固体为唯一磷源的培养基上分离单菌落，B 正确；筛选解
磷能力强的菌株时需在特定固体培养基上挑选降解圈直径与菌落直径比值最大的菌落，C 错
误；平板划线法用于分离、纯化菌种，无法直接计数活菌数目，D 错误。
5．(2025·河北，18 改编)隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻。多在海水中腐烂的植物叶片上
生长繁殖，是工业生产DHA(一种功能性脂肪酸)的藻类之一，从海洋中筛选获得的高产油
脂隐甲藻，可用于DHA 的发酵生产。下列叙述错误的是( )
A．隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B．采集海水中腐烂的叶片，湿热灭菌后接种到固体培养基，以获得隐甲藻
C．选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素，以减少杂菌生长
D．适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，以提高DHA 产量
答案 B
解析 隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖，由此可
知，隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源，A 正确；采集海水中腐烂的叶片进行湿热
灭菌后，会杀死其中的微生物，此时接种到固体培养基上无法获得隐甲藻，B 错误；隐甲藻
为真核生物，抑制细菌生长的抗生素可通过抑制细菌细胞壁的合成或影响代谢过程发挥作用，
不会影响真核生物的生命活动，因此在筛选或培养隐甲藻时，加入抑制细菌生长的抗生素可
有效减少杂菌生长，C 正确；隐甲藻为好氧生物，因此利用隐甲藻进行DHA 发酵生产时，
适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，以提高DHA 产量，D 正确。
6．(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白
的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到
目标菌的条件组合是( )
A．a 点时取样、尿素氮源培养基
B．b 点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b 点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c 点时取样、角蛋白氮源培养基
答案 D
解析 研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要
耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c 点时取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选
择培养，D 符合题意。
7．(2025·马鞍山模拟)为检验某品牌冰激凌中大肠杆菌含量是否超标，研究小组利用配制的
伊红－亚甲蓝琼脂培养基进行检测。下列叙述正确的是( )
A．检测中用到的接种方法为平板划线法
B．配制培养基，高压蒸汽灭菌后，调节pH
C．检测中应设一个不接种的平板作为阴性对照和一个接种大肠杆菌的平板作为阳性对照
D．检测的培养基为固体培养基，大肠杆菌在该培养基上会形成红色且有金属光泽的菌落
答案 C
解析 平板划线法不能用来计数，检测中用到的接种方法为稀释涂布平板法，A 错误；配制
培养基时，应先调节pH，再进行高压蒸汽灭菌，B 错误；检测中应设一个不接种的平板作
为阴性对照和一个接种大肠杆菌的平板作为阳性对照，以此来对比反映冰激凌中大肠杆菌及
其数量，C 正确；检测的培养基为固体培养基，大肠杆菌在该培养基上会形成深紫色且有金
属光泽的菌落，D 错误。
8．(2025·四川部分学校联考)工业生产中常用谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸营养缺陷型菌作为
赖氨酸的发酵菌株。科研人员将紫外线照射处理过的野生谷氨酸棒状杆菌菌液(原菌液)，经
过程①(稀释10 倍)接种在培养基甲上培养，菌落数目不再增加时如图中甲平板。过程②表
示向培养基甲中添加某种物质，继续培养。下列叙述正确的是( )
A．菌落A 是诱变产生的高丝氨酸营养缺陷型菌种
B．培养基甲是一种选择培养基，过程②向甲中添加赖氨酸
C．经过程①取0.2 mL 菌液涂布得到甲平板所示结果，则原菌液未突变菌株数量约为450
个/mL
D．发酵结束后，将过滤得到的固体物质进行干燥即可获得赖氨酸产品
答案 C
解析 野生菌种经紫外线照射，与甲平板相比，乙平板上菌落多，说明过程②往培养基中添
加的物质是高丝氨酸，新出现的菌落为高丝氨酸营养缺陷型菌种，即菌落A 是野生型菌种，
菌落B 为高丝氨酸营养缺陷型菌种，A 错误；结合题图分析可知，甲平板上只有菌落A，过
程②向培养基甲中添加高丝氨酸后出现B 菌落，这说明培养基甲中缺少高丝氨酸，是一种
选择培养基，B 错误；过程①取0.2 mL 菌液进行涂布后得到的甲平板上有9 个菌落，所以
菌液稀释10 倍后每毫升中有未突变的菌株9÷0.2＝45(个)，紫外线照射处理后的菌液中未突
变的菌株数量约为450 个/mL，C 正确；发酵结束后，将发酵产品采取适当的提取、分离和
纯化措施来获得赖氨酸产品，D 错误。
9．科研人员先在12 个固体培养基各涂上数目相等(约5×104个)的对T1 噬菌体敏感的大肠
杆菌，经5 h 培养后，平板上长出大量的微菌落(约5 100 个细胞/菌落)。取其中6 个(A 组)直
接喷上T1 噬菌体，另6 个(B 组)则先用灭菌后的涂布器把平板上的微菌落重新均匀涂布一遍，
然后喷上等量T1 噬菌体。培养后计算这两组平板上形成的抗T1 噬菌体的菌落数。结果发
现，A 组长出28 个菌落，B 组长出353 个菌落。下列叙述正确的是( )
A．该实验通过等比稀释的操作对微菌落进行计数
B．B 组中所使用的培养基为选择培养基
C．B 组的涂布使单个抗T1 噬菌体自发突变大肠杆菌形成一个菌落的概率增加
D．该实验证明重新涂布后再喷T1 噬菌体导致了抗性突变的大量发生
答案 C
解析 题目中未提及等比稀释操作，仅涉及涂布菌液后的培养，A 错误；B 组培养基未添加
特殊成分，仅通过喷T1 噬菌体筛选抗性菌落，故B 组培养基不是选择培养基，B 错误；A
组中微菌落是聚集的，若一个微菌落内存在多个抗性突变体，它们会因位置重叠仅形成1 个
菌落，B 组重新涂布后，抗性突变体被分散，每个均可独立形成1 个菌落，因此，B 组的涂
布操作提高了单个抗性突变体形成菌落的概率，导致菌落数更多，C 正确；抗性突变是自发
产生且发生概率极低，T1 噬菌体仅起选择作用，不会诱导突变，B 组菌落数增加是因为分
散后的单个抗性突变体独立形成菌落，而非突变率提高，D 错误。
10．(2025·成都二模)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3 款消毒液
A、B、C 杀灭大肠杆菌的效果。该同学将细菌原液稀释10 倍后取0.2 mL 涂布平板，进行菌
落计数，结果如图所示，下列叙述错误的是( )
A．大肠杆菌在伊红－亚甲蓝培养基上生长的菌落呈深紫色
B．据该实验结果可知，三种消毒液中杀菌效果最好的是A 消毒液
C．若某样品菌落计数的结果是100，则对应细菌原液中大肠杆菌的浓度为5 000 个/mL
D．若采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品，计数结果前者小于后者
答案 D
解析 大肠杆菌在伊红－亚甲蓝培养基上生长的菌落呈深紫色，并有金属光泽，A 正确；A
消毒液活细菌减少量最多，杀菌效率最高，故A 消毒液的杀菌效果最好，B 正确；若计数结
果是100,1 mL 细菌原液中细菌浓度＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝(100÷0.2)×10＝5
000(个/mL)，C 正确；显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数，菌落计数法计数只计活菌
数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故计数结果前者大于后者，D 错误。
11．(2025·四川，8)微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。
有人分离到X 和Y 两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X＋Y(X∶Y＝1∶1)分别接
种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率(残留率
＝剩余量/添加量×100%)，结果如图。下列叙述正确的是( )
A．用平板划线法能测定X 菌组中的活菌数
B．Y 菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高
C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
答案 C
解析 平板划线法主要用于微生物的分离和纯化，不能用于测定活菌数，测定活菌数常用稀
释涂布平板法，A 错误；由题意知，三组含菌液体培养基中的含菌量相同，Y 菌组微塑料残
留率较高，说明Y 菌对微塑料的降解能力相对较弱，而不是菌浓度高，B 错误；由图可知，
X＋Y 混合菌种组的微塑料残留率低于X 菌组和Y 菌组，说明混合菌种对微塑料的降解能力
高于单一菌种，C 正确；该培养基中含有蛋白胨，其他能利用蛋白胨作为碳源和氮源的微生
物也可能在该培养基中生长繁殖，不一定都是能降解微塑料的微生物，D 错误。
12．(2025·河南部分学校联考)安莎霉素是一类主要由海洋中的稀有放线菌产生的次生代谢物，
具有较高的抗菌活性。经人工诱变后，部分放线菌由于某种酶被破坏，其细胞中某些化学反
应不能正常进行，就形成了氨基酸营养缺陷型菌株(不能在基本培养基上生长，只能在完全
培养基上生长)，这在工业生产上有较广阔的应用前景。利用影印法初检某种氨基酸营养缺
陷型菌株的过程如图，下列叙述错误的是( )
A．基本培养基与完全培养基存在差异的成分是氨基酸
B．进行过程①培养时，待测培养皿中是完全培养基
C．进行过程②培养时，应先将丝绒布转印至基本培养基上
D．应挑取菌落B 进行接种培养，并进一步鉴定
答案 D
解析 进行过程②培养时，为防止特定氨基酸混入基本培养基中，应先将丝绒布转印至基本
培养基上，再转接至完全培养基上，C 正确；氨基酸营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生
长，只能在完全培养基上生长，所以为了完成对初检的营养缺陷型菌株的鉴定，应挑取完全
培养基上的菌落A 进行接种培养，并进一步鉴定，D 错误。
13．(2025·武汉二模)夹层培养法可用于筛选营养缺陷型细菌，具体做法如图所示：先在培养
皿上倒一层M.M 培养基(满足野生型菌株生长的最低营养成分)，待凝固后涂布一层经过诱
变处理的某种菌液，其上再倒一层M.M。经培养后，首次出现的菌落标记为A。最后倒一
层C.M 培养基(满足营养缺陷型菌株生长的营养成分)，再培养，新出现的菌落标记为B。下
列叙述错误的是( )
A．菌落A 是营养缺陷型，菌落B 是野生型
B．诱变处理是为了获得营养缺陷型细菌
C．再倒一层M.M 可避免菌落被C.M 冲散
D．菌落B 的直径应小于菌落A 的直径
答案 A
解析 夹层培养法的原理是先在培养皿上倒一层M.M 培养基，凝固后再接种一层经过诱变
处理的菌液，其上再浇一层M.M 培养基，凝固后培养首次出现的菌落标记为A，则菌落A
为野生型，最后加上一层C.M 培养基，再经培养后，新出现的菌落多数是营养缺陷型(即菌
落B)，A 错误；细菌是原核细胞，诱变处理可发生基因突变，同时诱变是为了获得营养缺
陷型细菌，B 正确；再倒一层M.M 培养基可避免菌落被C.M 培养基冲散，C 正确；菌落B
的微生物是晚于菌落A 微生物生长的，故菌落B 的直径应小于菌落A 的直径，D 正确。
二、非选择题
14．(16 分)(2025·成都一模)活性黑5 是一种低毒性、难褪色的含氮染料。欲利用生物酶处理
染料废水中的活性黑5，具体操作流程如图。从染料废水堆积池的污泥中获得优势菌群，采
用浓度梯度驯化法，进一步培养获得具备强分解活性黑5 能力的假单胞杆菌，并进行基因表
达分析。据图回答下列问题：
(1)培养基Ⅰ和培养基Ⅱ均以________为唯一氮源，从用途上来看均属于________培养基，
该类培养基的特点是______________________________________________________。培养基
Ⅱ
是
利用
________ 法进行接种，其分离
单菌落的原理是
__________________________________
______________________________________________________________________________。
(2)假单胞杆菌中，BVU5 蛋白分解活性黑5 的场所最可能为____________(填“细胞质基
质”或“溶酶体”)，判断依据是_________________________________________________。
(3)假单胞杆菌分解活性黑5 能力的强弱可能与__________________________________(答出
2 点)因素有关。
答案 (1)活性黑5 选择 允许特定种类的微生物生长(或允许能分解活性黑5 的假单胞杆
菌生长)，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 平板划线 通过接种环在固体培养基表面
连续划线，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经培养得到单菌落 (2)细胞质基质
假单胞杆菌是原核生物，没有溶酶体 (3)BVU5 蛋白的含量、BVU5 蛋白的活性、BVU5 蛋
白的空间结构
解析 (1)该培养基能筛选到利用活性黑5 的微生物，故培养基Ⅰ和培养基Ⅱ均以活性黑5 为
唯一氮源，从用途上来看均属于选择培养基，该选择培养基的特点是允许特定种类的微生物
生长(或允许能分解活性黑5 的假单胞杆菌生长)，同时抑制或阻止其他种类微生物生长；根
据题图可知，培养基Ⅱ是利用平板划线法进行接种，其分离单菌落的原理是通过接种环在固
体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经培养得到单菌落。
(2)假单胞杆菌为原核生物，没有溶酶体，核糖体是合成蛋白质的场所，因此BVU5 蛋白分
解活性黑5 的场所最可能为细胞质基质。(3)假单胞杆菌的BVU5 蛋白能分解活性黑5，假单
胞杆菌分解活性黑5 能力的强弱可能与BVU5 蛋白的含量、BVU5 蛋白的活性、BVU5 蛋白
的空间结构等因素有关。
15．(14 分)(2025·云南，21)我国研究人员发明了生产维生素C 的两步发酵法，流程如图甲。
为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化
葡糖杆菌(原始菌MCS)中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。
MCS 和IR3C 单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C 分别与普通生酮基古龙酸
菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。
回答下列问题：
(1)要使基因ccdB 在IR3C 中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，
还必须有_____________________________________________。
(2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是____________________________。当活菌达到一定
数量时，基因ccdB 编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是_________________，
开始发挥作用的时间是____________，判断理由是_________________________________。
(3)基于图丙，利用IR3C 三菌混菌发酵的产量__________(填“高于”或“低于”)MCS 三菌
混菌发酵的产量，其原因是_______________________________________________。
答案 (1)标记基因、目的基因、终止子、复制原点 (2)稀释涂布平板法 抑制工程菌IR3C
的生长增殖或诱导其凋亡 约15 h 培养15 h 后，IR3C 活菌数量开始下降，而MCS 活菌数
量仍在上升 (3)高于 基因ccdB 编码的蛋白质抑制了工程菌IR3C 的生长增殖或诱导其凋
亡，减少了其对山梨糖的竞争性消耗，更多的山梨糖用于合成2-酮-L-古龙酸
解析 (1)基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外，还要有标记基因、目的基因、终
止子、复制原点等。(2)统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图乙看出，随着时间推移，
活菌数量不断增加，在15 h 后，IR3C 活菌数量开始下降，而MCS 活菌数量仍在上升，所
以推测转入的基因ccdB 编码的蛋白质能抑制工程菌IR3C 的生长增殖或诱导其凋亡，发挥作
用的时间大约在15 h。(3)从图丙看出，IR3C 三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比
MCS 三菌混菌发酵产量高，因此可以推测，IR3C 三菌混菌发酵维生素C 产量更高，可能的
原因是IR3C 转入了ccdB 基因，抑制工程菌IR3C 生长增殖或诱导其凋亡，减少氧化葡糖杆
菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
