文档文本内容
专题14 基因工程
6 年真题1 年模拟
考点分类
黑吉辽蒙考情
命题规律
考点01 基因工程的基本工具
2025 黑吉辽蒙（1
题）、2024 辽宁（1
题）、
2023 辽宁（1 题）、
2022 辽宁（1 题）、
2021 辽宁（1 题）
· 情境设置：以微生物发酵生产药物（香树脂醇、PHB2 蛋
白）、酶工程改造等真实科研情境为主
· 考查重点：限制酶选择、载体构建、基因表达系统优化等核
心工具的运用
· 命题趋势：工具考查融入完整工程流程，与蛋白质工程、代
谢工程交叉综合命题
考点02 基因工程的基本操作
程序（PCR 技术及其应用）
2026 黑吉辽蒙（1
题）、2024 辽宁（2
题）、
2023 辽宁（1 题）、
2022 辽宁（1 题）、
2021 辽宁（1 题）
· 情境设置：以基因工程实际应用为背景，如抗虫玉米监管、
病毒受体监控、真菌基因改造等
· 考查重点：PCR 产物鉴定、引物设计、T-DNA 转移系统、荧光
标记技术等实验操作细节
· 命题趋势：从单一PCR 技术向多技术整合考查发展，强调实
验原理与结果分析的结合
考点03 基因工程和蛋白质工
程的应用
2021 辽宁（1 题）
· 情境设置：以工业酶改造（腈水合酶耐热性提升）等蛋白质
工程典型案例为载体
· 考查重点：定点突变、结构预测与功能改造的关系，蛋白质
工程与基因工程的层级差异
· 命题趋势：该考点考查频次较低，但综合性强，未来可能强
化与人工智能辅助设计等前沿技术结合
考点1 基因工程的基本工具
1.（2025·黑吉辽蒙·高考真题）（多选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通
过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
（1）可从 中查询基因N 的编码序列，设计特定引物。如图1 所示，a 链为转录模板链，
为保证基因N 与质粒pYL 正确连接，需在引物1 和引物2 的5'端分别引入 和
限制酶识别序列。PCR 扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA 片段，构建重组质粒，
大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基本不变。
（2）进一步筛选构建的质粒，以1-4 号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1 和引物2 进行PCR 扩增，电
泳PCR 产物，结果如图2。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR 反
应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中
成功插入了基因N，理由是 。
（3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙
氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA 等。a 是诱变第240 位脯氨酸编码序列的引物（GCA 为诱变序列），
b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a 的配对模板相同。据此分析，丙氨酸
的密码子除GCA 外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
（4）进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇
合酶基因的改造方案。
2.（2024·辽宁·高考真题）作物在成熟期叶片枯黄，若延长绿色状态将有助于提高产量。某小麦野生型
在成熟期叶片正常枯黄（熟黄），其单基因突变纯合子ml 在成熟期叶片保持绿色的时间延长（持绿）。
回答下列问题。
（1）将ml 与野生型杂交得到F1，表型为 （填“熟黄”或“持绿”），则此突变为隐性突变
（A1基因突变为al基因）。推测A1基因控制小麦熟黄，将A1基因转入 个体中表达，观察获得
的植株表型可验证此推测。
（2）突变体m2 与ml 表型相同，是A2基因突变为a2基因的隐性纯合子，A2基因与A1基因是非等位的同源
基因，序列相同。A1、A2、a1和a2基因转录的模板链简要信息如图1。据图1 可知，与野生型基因相比，a1
基因发生了 ，a2基因发生了 ，使合成的mRNA 都提前出现了 ，翻译
出的多肽链长度变 ，导致蛋白质的空间结构改变，活性丧失。A1（A2）基因编码A 酶，图2 为
检测野生型和两个突变体叶片中A 酶的酶活性结果，其中 号株系为野生型的数据。
（3）A1和A2基因位于非同源染色体上，ml 的基因型为 ，m2 的基因型为 。若将
ml 与m2 杂交得到F1，F1自交得到F2，F2中自交后代不发生性状分离个体的比例为 。
3.（2023·辽宁·高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改造
β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答
下列问题：
（1）上述过程属于 工程。
（2）PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
（3）某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热
性明显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
（4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载体。
除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
（5）目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不
同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确
连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
（6）采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR
的模板。
4.（2022·辽宁·高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N 蛋白胞外段，制备相应
的单克隆抗体，增加其对N 蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N 蛋白胞外段抗原制备，流程如图1
（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 。
用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体
（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
（2）质粒在包装细胞内组装出由 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表
达并分离、纯化N 蛋白胞外段。
Ⅱ．N 蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2
（3）用N 蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用 酶处理，制
成细胞悬液，置于含有混合气体的 中培养，离心收集小鼠的B 淋巴细胞，与骨髓
瘤细胞进行融合。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96 孔板，进行
培养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N 蛋白胞外段抗体，又能大量增
殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集 ，提取单克隆抗体。
（5）利用N 蛋白胞外段抗体与药物结合，形成 ，实现特异性治疗。
5.（2021·辽宁·高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制人宫
颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小为
0．9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其
作为PCR 反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序
列不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入
和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，
可选用 （填“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTTTTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTGGTC↑GAC
PstI
CTGCA↓G G↑ACGTC
KpnI
GGTAC↓CC↑CATGG
BamHI
G↓GATCCCCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、
3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
（5）将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞
周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的
原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
考点2 基因工程的基本操作程序（PCR 技术及其应用）
1.（2024·辽宁·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
2.（2023·辽宁·高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达和
转运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接
过程的关键步骤是除去（ ）
A. CD163 基因中编码起始密码子的序列
B. CD163 基因中编码终止密码子的序列
C. RFP 基因中编码起始密码子的序列
D. RFP 基因中编码终止密码子的序列
3.（2022·辽宁·高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转
基因生物安全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（
）
A. 预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
4.（2021·辽宁·高考真题）下列有关病毒在生物学和医学领域应用的叙述，错误的是（ ）
A. 灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合
B. 用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体
C. 基因工程中常用噬菌体转化植物细胞
D. 经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防
5.（2026·黑吉辽蒙·高考真题）平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死
率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发
“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。
注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。
（1）为提高Tps 基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因
序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是 。
实验如上图，用限制酶EcoRV 切割pPK2 质粒，然后与Tps 基因连接，用 （填“E．
coli”或“T4”）DNA 连接酶可获得更高的连接效率。
经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在 。为鉴定
重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是
和 。
A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb
C．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb
农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA 会转移并整合到平沙绿僵菌的 上。
为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR 技术进行鉴定。Tps 基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…
AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是 。
A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′ B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′
C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′ D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′
（2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。
相关指标培养
物
访
问
次
数
（次/小时）
停留时间（分
钟/小时）
2 小时感染率
（%）
LT50（天）
第7 天死亡率
（%）
平沙绿僵菌
0.9
1.1
100
5.84
62.4
工程菌
2.4
5.9
100
4.04
84.3
注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。
已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7 天死亡
率更高的原因是 。
（3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的 评价，符合标准后方可推广。
6.（2024·辽宁·高考真题）将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒（辅助T-DNA 转移）和不含有
Vir 基因、含有T-DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，
为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3 表示引物；T-DNA-LB 表示左边界；T-DNA-RB 表示右边界；Ori 表示复制原点；KanR表示
卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%
的预冷酒精，其目的是 。
（2）本操作中获取目的基因的方法是 和 。
（3）穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其
目的可能是 。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛
选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
和 。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B. 将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
题干关键信息
所学知识
信息加工
从苏云金杆菌提取DNA 时，需
加入蛋白酶
酶具有专一性
从苏云金杆菌提取DNA 时，需
加入蛋白酶，其作用是除去蛋白
质杂质
提取过程中加入体积分数为95%
的预冷酒精
DNA 在冷酒精中溶解度较低
提取过程中加入体积分数为95%
的预冷酒精，其目的是溶解蛋白
质等物质，析出不溶于酒精的
DNA
考点3 基因工程和蛋白质工程的应用
1.（2021·辽宁·高考真题）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。
利用蛋白质工程技术在N0的α 和β 亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。
下列有关叙述错误的是（ ）
A. N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B. 加入连接肽需要通过改造基因实现
C. 获得N1的过程需要进行转录和翻译
D. 检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
1.（2026·内蒙古呼和浩特·一模）T4 噬菌体基因编码的T4DNA 连接酶，可连接具有黏性末端和平末端的
DNA 分子，下列有关T4DNA 连接酶的叙述正确的是（ ）
A. 组成元素为C、H、O、N、P
B. 在T4 噬菌体的核糖体上合成
C. 能连接黏性末端和平末端，不具有专一性
D. 可降低DNA 分子间形成磷酸二酯键所需的活化能
2.（2026·辽宁辽阳·一模）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A. 利用酒精初步分离DNA 与蛋白质的原理是DNA 溶于酒精
B. 预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA 水解
C. DNA 粗提取时，通过离心研磨液可以加速DNA 的沉淀
D. 将DNA 丝状物加入二苯胺试剂，沸水浴加热出现蓝色
3.（2026·黑龙江齐齐哈尔·一模）冠瘿是植物被农杆菌感染后根部长出的肿瘤（如图1 所示），冠瘿的
形成与天然农杆菌的Ti 质粒（如图2 所示）有关，其中Vir 基因编码的产物可激活T-DNA 转移。下列相关
叙述正确的是（ ）
A. 长出冠瘿的植物根部某些植物激素水平较高
B. T-DNA 区域的基因可在植物细胞的细胞质基质中复制、转录、翻译
C. 若用Ti 质粒作为基因的载体，可将目的基因插入Vir 基因的内部
D. 若利用农杆菌进行基因工程转化，需将其Ti 质粒上的所有基因去掉
4.（2026·黑龙江齐齐哈尔·二模）为鉴定目的基因是否正确插入质粒中，某同学准备设计引物进行PCR
鉴定，如图所示为a、b、c3 种引物在正确重组质粒中的相应位置，Tet
R为四环素抗性基因。下列说法错误
的是
A. 可选择引物a 和c 进行扩增，来判断目的基因是否插入到质粒中
B. 可选择引物b 和c 进行扩增，来判断目的基因是否正确插入质粒中
C. 选择引物a 和b 进行扩增，若扩增产物约为650 bp，说明基因反向插入质粒中
D. 将质粒导入大肠杆菌后，若表现出四环素抗性，说明导入的质粒含有目的基因
5.（2026·内蒙古包头·二模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（ ）
A. PCR 扩增DNA 片段时DNA 双链的解聚原理与细胞内相同
B. 耐高温的DNA 聚合酶可直接在模板链的3′端从头合成子链
C. 电泳可鉴定不同长度的DNA 分子是因为它们在凝胶中的迁移速率不同
D. 染色后的凝胶条带的位置可以反映DNA 分子碱基序列的组成
6.（2026·辽宁锦州·一模）二化螟和田间杂草极大影响了稻米的产量和品质，科学家利用转基因技术将
抗虫（cry1C）基因和抗草甘膦（EPSPS）基因成功转入水稻细胞中，并利用Cre/loxP 重组酶系统特异性
删除种子胚乳中的外源基因，获得了胚乳中无外源基因的抗虫、抗除草剂转基因水稻。转基因水稻的部分
培育过程如图1 所示。
Cre/loxP 重组酶系统由Cre 重组酶和loxP 位点组成，多基因串联体左侧loxP 位点的部分序列如图2 所示。
当DNA 分子中存在两个相同的loxP 序列且同向时，Cre 重组酶能特异性识别并删除两个位点间的DNA 序列。
注：LB、RB：多基因串联体左右边界序列，Kanr：卡那霉素抗性基因，PstI、SacI、EcoRI：限制性核酸内
切酶
（1）启动子与起始密码子发挥作用的阶段分别在基因表达的 阶段、 阶段。
（2）结合图2 信息，为删除两个loxP 位点间的DNA 序列，多基因串联体右侧loxP 位点间隔区的编码链序
列为5’- -3’。
（3）人类食用的精米主要是由水稻种子的胚乳加工制成，二化螟主要通过钻蛀叶鞘、叶心、茎秆等绿色
组织而危害水稻。结合题干信息，为实现水稻中外源基因的精准表达与特异性删除，启动子1、2、3 分别
为 、 、 。（编号选填）。
①胚乳特异性启动子②绿色组织特异性启动子③组成型启动子（在所有组织中都能保持活性）
（4）为使多基因串联体与质粒PC1300Z 高效连接，需在其两侧添加 的识别序列。
（5）转基因水稻To 培育过程中，过程III 中诱导生根时，培养基中要适当增加 的
浓度。
（6）为评估外源基因的敲除是否具有组织特异性，科研人员分别提取转基因水稻各组织细胞的总RNA，通
过RT - PCR（是以mRNA 为模板进行的特殊PCR）和凝胶电泳检测各细胞中不同基因的表达情况。结果如表
所示，“+”表示“表达”，“-”表示“不表达”。表格结果中分别符合目标水稻的根细胞及胚乳细胞的
是 。（编号选填）
编号
cry1C 基因
EPSPS 基因
①
-
+
②
+
-
③
+
+
④
-
-
7.（2026·黑龙江哈尔滨·一模）（多选）CRISPR/Cas12a 系统是由crRNA 和Cas12a（Cpf1）蛋白形成的
复合体。crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA 序列，引导Cas12a 蛋白到相应位置剪切DNA。低温适应性
的荧光假单胞菌可引发乳制品腐败变质。科研人员结合PCR 扩增技术与CRISPR/Cas12a 系统建立一种荧光
检测方法，用于乳制品中荧光假单胞菌的快速检测。图1 是CRISPR/Cas12a 系统的工作原理示意图。回答
下列问题。
（1）据题意推测，CRISPR/Cas12a 系统的功能类似于______（多选）。
A. 解旋酶
B. DNA 连接酶
C. DNA 聚合酶
D. 限制性内切核酸酶
（2）在CRISPR/Cas12a 系统中，crRNA 序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含
种核苷酸。PCR 每次循环一般分三步，其中 需要降温，该过程的目的是
。
（3）研究人员设计了针对荧光假单胞菌aprX 基因序列的7 对PCR 引物并进行筛选，电泳结果如图2
（A），引物对 能产生特异性扩增条带。使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物，DNA 分子的迁
移速率与
有关。对初筛中表现良好的引物对，使用包括荧光假单胞菌在内的3 种不同细菌的DNA 进行
PCR 扩增，验证其特异性，结果如图2（B）所示。请结合两张电泳图，确定本实验应选择
作
为
荧
光
假
单
胞
菌
PCR
扩
增
引
物
，
给
出
选
择
的
理
由
。
注：M-DNA 分子量标准（Marker）；Blank-空白组（不加荧光假单胞菌基因组）；1-单独的荧光假单胞
菌基因组。图2（A）：2-8 依次对应7 对引物：F1R1 至F7R7。图2（B）：2-金黄色葡萄球菌；3-大肠
杆菌。
（4）为检测模拟荧光假单胞菌污染的巴氏杀菌乳样品，研究人员对已建立的PCR 和CRISPR/Cas12a 荧光
检测技术的性能进行可靠性评估。可采用 法对相同样品进行计数检测。
8.（2026·内蒙古呼和浩特·一模）腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA 缺陷型非包膜病毒，是临床基因
治疗广泛使用的载体。Otof 基因（6kb）编码R 蛋白，突变可导致常见先天性耳聋。中外科研人员利用AAV
双载体系统递送人源正常Otof 基因，通过基因工程技术治疗先天性耳聋取得显著疗效。请分析回答：
（1）体外可利用 技术扩增Otof 基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺
点是感染率和成活率低。
（2）Otof 基因和AAV 基因组如图1、图2 所示，单个AAV 能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为
可选择的酶切位点，则图1 需要将Otof 基因拆分为大小分别为 的5′-Otof 和Otof-3′
片段，分别装入AAV 载体形成AAV 重组载体1 和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载
体中需包括启动子和 等序列。
（3）重组载体1 和2 共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2 表达Cre 酶切割重组载体1 和
2 中的lox 位点，产生黏性末端，实现两段DNA 精准对接。若重组载体1 中lox 序列如图4，则重组载体2
的lox 序列可否为图5 所示序列，请说明理由 。
（4）为了使R 蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1 应选择 （填器官名称）部细胞
中特异性表达基因的启动子。为减少Cre 酶对受体细胞的其他影响，重组载体2 的启动子应选择
（填“强”或者“弱）启动子。
（5）若要从个体水平检测Otof 基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof
基因敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV 双载体，对 （答出一种即可）进行检测，以确
定Otof 基因在受体细胞中重组并表达。
9.（2026·辽宁辽阳·一模）通过研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成可
以更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1 基因，通过基因工程将Ers1 基因
反向连接在启动子后，筛选转入反义Ers1 基因的草莓，达到延长储藏期的效果。回答下列问题：
（1）使用相关技术获得DNA 后，需要通过PCR 技术进行扩增Ers1 基因（如图）。为使目的基因与质粒连
接，在设计PCR 引物扩增Ers1 基因时需添加限制酶XhoI（识别序列为5′－CTCGAG－3′）的识别序列。
已知Ers1 基因左端①处的碱基序列为－TTCCAATTTTAA－，则其中一种引物设计的序列是5′－
－3′。PCR 技术扩增出Ers1 基因，该技术的原理为 。在PCR 反应体系中因参与反应不断消
耗而浓度下降的组分有 （答出两点即可）。
（2）采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物时，在凝胶中DNA 分子的迁移速率与DNA 分子大小呈
（填“正相关”或“负相关”），此外DNA 分子的迁移速率还与 （答两点）等有关。
（3）应将Ers1 基因反向连接到质粒的 之间。将筛选得到的反向连接质粒与Ca²⁺处理过的农
杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成转化实验。农杆菌转化后的植物组织，应在添加了
的固体培养基上培养筛选。
（4）转入反义Ers1 基因的草莓，乙烯受体的合成受阻，可达到延长储藏期的效果，其原因是
。
10.（2026·黑龙江齐齐哈尔·一模）利用Golden Gate 构建基因表达载体的原理是利用TypeⅡs 型限制酶
（如BsaⅠ）的酶切位点在识别序列之外的特性，使重组DNA 分子上不会留下使用的酶切位点，这样就可
以在同一反应体系中进行酶切和片段连接，且可以通过设计自定义序列（NNNNN）同时进行多片段的有序
连接。镉是水体污染中常见的重金属元素，为治理水体中的镉污染，研究人员将镉离子结合蛋白基因
CADR、黄色荧光蛋白基因YFP 利用Golden Gate 法融合并接入质粒，转入莱茵衣藻细胞后利用含镉培养液
进行培养。质粒构建过程如图所示（RFP 表示红色荧光蛋白基因），请回答下列问题。
（1）重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有 （写出一项）。利用BsaⅠ
切割时DNA 分子的 键发生断裂，形成黏性末端；理论上利用BsaⅠ切割后最多可以产生
种黏性末端。若要在同一反应体系中完成载体构建，除BsaⅠ酶外，还需要在反应体系中加入
。
（2）为保证目的基因与载体正确连接且重组质粒上不保留酶切位点，研究人员需要设计不同的BsaⅠ切
割位点，若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'-CCATGGAGACC-3'，则CADR 基因左侧切割后
形成的黏性末端序列为5'- -3'（写出同一单链碱基）。
（3）构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶作用底物的是 。
（4）为筛选构建成功的重组载体，用酶切并连接处理后的DNA 分子转化靶细胞，培养一段时间后在荧光
显
微
镜
下
观
察
，
观
察
到
部
分
发
红
色
荧
光
的
细
胞
，
原
因
是
。若通过培养，观察到某细胞株系发出黄色荧光， （填“能”或“不能”）确定该株系适合
用于镉污染治理。
11.（2026·吉林·一模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高
温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了耐热性强的淀粉
酶AmyS2 基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1 所示。回答下列问题。
（1）科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27 位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶
（AmyS2），其研究基本思路如下：预期AmyS2 功能→设计目标蛋白的结构→ →找到并
改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）→将获得的基因导入芽孢杆菌生产AmyS2，要替换蛋白质基因中相
对应的碱基可以采用 法。
（2）根据图2 分析，利用PCR 技术扩增AmyS2 基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的
。若将1 个基因扩增4 次，共需要引物 个。
（3）将AmyS2 基因与原始质粒A 构建成质粒B，应选择的限制酶是 ；将质粒B 与信号肽
基因构建成质粒C，应选择的限制酶是 。
（4）信号肽是一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链。据此推测，与质粒B 相比，在工业生产中
使用导入质粒C 的工程菌生产α-淀粉酶的优势是 ，从发酵液中可采取适当的
措施来获得产品。
12.（2026·辽宁·二模）在植物基因工程研究中，准确鉴定启动子的时空表达特性至关重要。研究人员
构建了RFP/GFP 双荧光载体，过程如下：
注：Hind Ⅲ、Pst Ⅰ、Xba Ⅰ、Sac Ⅰ、EcoR Ⅰ为限制酶切位点，切口都位于其中轴线的两侧；CaMV
35S 为组成型启动子，在大多数组织和细胞中都能高效表达；GFP 为绿色荧光蛋白基因；RFP 为红色荧光蛋
白基因；Nos 为终止子。
（1）构建双荧光载体的过程中，去除载体1 中Xba Ⅰ和Sac Ⅰ位点，目的是 。T4
DNA 聚合酶具有 （填“5′→3′”或“3′→5′”）聚合酶活性，将限制酶切割
产生的黏性末端补平为平末端，操作步骤一、二中选用的限制酶为：① ②
；操作步骤三中优选用 （填“E.coli”或“T4”）DNA 连接酶进行连接反应。
（2）研究人员欲利用RFP/GFP 双荧光载体验证番茄E8 启动子是果实特异性启动子，利用PCR 技术扩增E8
启动子片段时，为便于其与RFP/GFP 双荧光载体正确连接，应在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列
（如图），其中对引物Ⅰ应添加 识别序列，进行PCR 时复性温度过高，可能导
致 。
（3）将得到的E8 启动子与双荧光载体连接得到E8-RFP/GFP 载体，导入相应受体细胞，实验方案如下：
组别
载体
受体材料
预期结果
A
RFP/GFP 双荧光载体
果实细胞
绿色荧光+，红色荧光+
B
E8-RFP/GFP 载体
果实细胞
？
C
E8-RFP/GFP 载体
叶肉细胞
？
①设置A 组实验的具体作用是 。
②完善上表中的预期结果（用“+”表示有荧光，“-”表示无荧光）
（4）在植物基因工程中，RFP/GFP 双荧光载体除用于研究启动子时空表达的特异性，还有多项潜在应用
价值，下列三项有关应用正确的是________。
A. 通过比较RFP 与GFP 的荧光强度比值，定量分析启动子的驱动活性
B. 可用目的基因置换载体中RFP，通过红色荧光对目的蛋白进行定位
C. 通过启动子研究基因表达的时空模式，可揭示植物发育的调控机制
13.（2026·黑龙江哈尔滨·二模）T4 溶菌酶可溶解细菌的细胞壁，干扰细菌正常的生理代谢，常被用于
医药、食品、农业等领域。但其在较高温度下容易失去活性，科学家利用PCR 定点突变技术改造T4 溶菌酶
基因的结构，使表达的溶菌酶第3 位的异亮氨酸变为半胱氨酸，从而提高热稳定性。回答下列问题。
（1）图1 中拟突变位点①②对应的碱基分别是 。在图2 所示的基因改造方案中应对引物
（填“1”或“2”）替换碱基。
（2）扩增改造后的T4 溶菌酶基因时，PCR 仪中需要添加模板、4 种脱氧核苷酸、引物、 和缓
冲液。缓冲液中一般加入Mg2+，原因是 。
（3）分析图2 和图3，为保证改造后的T4 溶菌酶基因正确插入质粒中，应在引物1 的 （填
“3 端”或“5’端”）加上 酶的识别序列。
（4）科学家将构建的基因表达载体采用 法导入植物叶片，以获得抗细菌植物。
利用GUS 基因初步检测T4 溶菌酶基因是否导入成功。具体操作步骤如下：首先将植物叶片放在酒精中，然
后用洗涤缓冲液冲洗，最后用X-GLuc 溶液浸没植物叶片，一段时间后选取出现
现象的叶片进行下一步的检测和鉴定。这一方法在检测T4 溶菌酶基因是否导入植物细胞中的优势是
。后续鉴定转T4 溶菌酶基因植物能否在较高温度下抗细菌的实验思路是 。
（5）科学家将该抗细菌基因导入水稻，培育出抗细菌性条斑病的转基因水稻品种。请从环境保护角度，
分析该研究成果的实际应用价值有 （答出一点）。
14.（2026·黑龙江齐齐哈尔·二模）利用工程菌表达重组蛋白时，蛋白质常以未折叠和无活性的包涵体
形式积累。研究人员将乳糖酶基因LacZ(3075 bp)构建至自剪切型表达载体pTWIN1(注：CBD、Ssp DnaB 与
LacZm 形成融合基因CSL，其中CBD 编码的标签蛋白具有几丁质结合活性。Ssp DnaB 编码内含肽，具有自
我切割能力，能在特定条件下将自身与目标蛋白切割开)，其构建过程如图所示。构建完成后，将重组质
粒转入大肠杆菌，经诱导表达、纯化，制备无标签乳糖酶。回答下列问题。
（1）启动子位于基因的上游，是 识别和结合的部位，图中将基因表达载体导入
大肠杆菌的方法是用 处理大肠杆菌细胞，使其处于一种
的生理状态。
（2）研究人员首先对乳糖酶基因(LacZ)进行了扩增，为保证LacZ 基因能与质粒pUC18 正确连接，设计引
物时需要在图中LacZ 基因左右两侧引物的5＇端分别添加 的识别序列。原LacZ
基因中含有一个Bam H Ⅰ切割位点序列GGATCC，通过引物设计将其替换为GAGTCC，获得了基因LacZm，
其编码的氨基酸与LacZ 相同，原因是 。
（3）将基因LacZm 用限制酶酶切后与克隆载体pUC18 进行重组，进而构建至表达载体pTWIN1 中，从而获
得原核表达重组质粒pTWIN1-LacZm。对重组质粒pTWIN1-LacZm 进行双酶切，然后电泳，得到的结果如图
所示(泳道1 为分子量Marker，泳道2 为pTWIN1-LacZm 酶切产物，泳道3 为未酶切的pTWIN1-LacZm)。电
泳图中代表LacZm 基因的条带是 (填“a”“b”或“c”)。未酶切重组质粒分子
量大于其酶切产物，然而电泳图谱显示结果却相反，其原因是 。
（4）将重组质粒pTWIN1-LacZm 导入大肠杆菌，经诱导表达后，破碎细胞、离心、收集上清，制得粗酶液。
然后利用几丁质亲和吸附柱对粗酶液进行纯化，纯化后乳糖酶位于吸附柱；加入裂解液，在特定条件下诱
导融合蛋白进行自剪切，目的是 。
15.（2026·辽宁沈阳·二模）培育转VEGF 基因的山羊，有利于提高羊绒产量。但转基因动物含有标记基
因可能造成安全性问题。研究者利用Cre/LoxP 系统删除标记基因。回答下列问题。
（1）基因表达载体除了含有标记基因外，还应有 （写出两点）等，其中标记基因的作用是
。
（2）如图1 所示，Cre 酶能切割特定位点形成黏性末端。结合图1 和图2 分析，Cre 酶能将 （填
“①”或“②”）中的目标片段删除，并且其余片段末端可以连接形成一个DNA 分子。
（3）为保证转化后可删除标记基因并构建P1，图3 中引物a 和b 应添加的LoxP 序列分别为5’-
-3’、5’- -3’（写出已知的8 个碱基），同时限制酶识别序列需添加在LoxP 序列的 端。
用BglⅡ和HindⅢ处理P1并对产物进行电泳鉴定，结果长度为 ，说明P1构建成功。
（4）将P1导入山羊皮肤成纤维细胞，经检测VEGF 已成功表达。此时还需要 的作用将标记基因删
除。利用荧光显微镜观察，结果为 ，说明已成功删除标记基因。
16.（2026·辽宁沈阳·二模）野生型家蚕卵呈黑褐色，产红色卵的突变体由5 号染色体上单基因隐性突
变形成。不考虑性染色体同源区段。回答下列问题。
（1）选取一对经诱变处理的黑褐色卵家蚕杂交，F1中出现约1/4 的暗红色卵（雌雄比例相等），且在胚胎
末期全部死亡。由此可知：控制暗红色卵的基因是位于 （填“常”或“性”）染色体上
（填“显性”或“隐性”）基因。
（2）为探究暗红色卵基因和红色卵基因是否为等位基因，研究者选择F1全部个体与红色卵突变体进行杂
交得到F2，统计F2表型及比例为 ，说明两个基因互为等位基因，且红色卵对暗红色卵为显性。
据此分析，上述家蚕成体中相关基因型共有 种。
（3）进一步分析确定：暗红色卵基因无致死效应。研究者推测：致死表型是由同样位于5 号染色体上的
基因D 突变为d 所致。为验证此推测，利用基因工程将A 基因和B 基因分别导入暗红色卵品系，获得甲、
乙品系。每个品系个体的细胞中仅插入一个目的基因，且基因A、B、D 均独立遗传。
品系
插入的目的基因
目的基因的产物
备注
甲品系
A 基因
转录产物sgRNA
当一个细胞中同时含有
A 和B 时，sgRNA 可引
导Cas9 蛋白在基因D 的
特定位点进行切割，进
而实现将基因D 编辑为
基因d。
乙品系
B 基因
表达Cas9 蛋白
①将甲品系与乙品系杂交得到F1，在早期胚胎阶段，仅选出同时含基因A 和B 的胚胎继续培育，这些胚胎
均成活并发育为成体，测序可知，这些成体中基因D 被编辑为d 的个体占80%，那么，所培育的成体中
Dd 的个体占 。
②将上述选育的成体随机交配得到F2，其中不同时含基因A 和B 的个体占 ，在该类型个体中，
若仅考虑相同基因型的雌雄个体交配，理论上子代出现约1/4 致死的交配组合占 ，上述推测成
立。
17.（2026·吉林长春·二模）肿瘤的生长和转移具有血管依赖性，阻断血管生成是遏制肿瘤的有效策略。
KDR 基因编码的蛋白是肿瘤血管内皮细胞表面的关键受体。病毒的胸苷激酶基因（tk）编码的酶能将无毒
性的前体药物更昔洛韦（GCV）转化为毒性物质，导致细胞死亡。为特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞，科研
人员拟构建由KDR 基因启动子驱动tk 表达的重组质粒（KDR-tk），并检测其杀伤效果，部分过程如图。回
答下列问题。
限制酶
识别序列和切割位点
Nhe Ⅰ
5′-G↓CTAGC-3′
Mfe Ⅰ
5′-C↓AATTG-3′
Age Ⅰ
5′-A↓CCGGT-3′
EcoR Ⅰ
5′-G↓AATTC-3′
Xba Ⅰ
5′-T↓CTAGA-3′
Hind Ⅲ
5′-A↓AGCTT-3′
（1）启动子是 识别和结合的部位，因此无启动子的tk 无法表达。为达到使用GCV 特异性
杀伤肿瘤血管内皮细胞的目的，科研人员从众多启动子中选择了KDR 基因启动子序列构建载体，推测是
由于KDR 基因 。
（2）向①②两个PCR 反应体系中提供的组分不同的有 。将反应体系放入PCR 仪中进行反
应，每次循环按序可以分为变性、 、延伸三步。
（3 ）图中KDR 基因启动子的a 链与所在基因的模板链为同一条链，已知b 链序列为5′-
GAGCATTAAAACTGAA……CGTAGAGTCTGCGCAG-3′ ，则过程①构建的一对引物序列为
。
5′-GCATTAAAACTGAAGTGAAGTG-3′
①
5′-GCTAGCGAGCATTAAAACTGAA-3′
②
5′-GGTACCCTGCGCAGACTCTACG-3′
③
5′-ACCGGTCTGCGCAGACTCTACG-3′
④
（4 ）为保证正确连接，过程④最好选择用限制酶 处理质粒，选用限制酶
处理KDR 基因启动子-tk，此过程还需用DNA 连接酶，其催化连接的化学键是 。获得的
KDR-tk 重组质粒，经检测鉴定后导入大肠杆菌体内。
（5）研究人员提取大肠杆菌中的重组质粒，将其导入HUVEC 细胞（常用作体外模拟肿瘤的血管内皮细胞
系），一段时间后，在转化成功细胞的培养液中加入 进行培养，于不同时间检测细胞存活
率，证明实验成功的实验结果是 。
18.（2026·内蒙古·二模）为实现水稻产量提升，科研人员尝试将动物来源的肥胖基因FTO 的cDNA 导入
水稻细胞，构建含FTO 基因的T-DNA 序列（结构如图所示）。科研人员以水稻愈伤组织为受体，采用农杆
菌转化法将该T-DNA 转入水稻细胞，经植物组织培养技术获得转基因水稻植株，进而探究FTO 基因对水稻
产量的影响。回答下列问题：
（1）选择水稻启动子驱动FTO 基因表达的优势是 。农杆菌转化法中，农杆菌介导转化的
原理是 。水稻愈伤组织发育为完整转基因植株过程的理论基础是 。
（2）对转化后的水稻愈伤组织进行培养时，需在培养基中添加潮霉素，该操作的目的是 。
Flag 是一种常用于蛋白质纯化和检测的短肽标签，其与FTO 基因串联后，会表达出“FTO 蛋白+Flag 标
签”的融合蛋白，该设置的目的是 。
（3）为验证FTO 基因的表达能提升水稻产量，科研人员设置三组实验：甲组为非转基因野生型水稻，乙
组为转入空载体（仅不含FTO 基因）的水稻，丙组为转入上述重组载体的转基因水稻。将三组水稻置于相
同且适宜的环境中培养，收获后统计有效穗数、每穗粒数、千粒重。
①设置乙组实验的目的是 ；
②若实验结果为 ，则可证明FTO 基因的表达能提升水稻产量。
（4）若将该转基因水稻投入生产，还需进行田间多代种植实验，目的是 ，从生物安全角
度分析，还需评估 。
19.（2026·辽宁锦州·二模）枯草芽孢杆菌在营养不足、环境恶劣等条件下会形成抗逆性强的芽孢，环
境适宜时，芽孢恢复活性。我国科学家通过将芽孢包埋在可降解塑料PCL 中，制备出能在特定条件下加速
降解的“活塑料”（制备原理如图1），以期用于食品、日用品等包装。
（1）为获得用于制备“活塑料”的芽孢，需先在培养基中培养枯草芽孢杆菌。培养基中应提供
（答出两种）以及水和无机盐等营养物质，全程保证 操作。
（2）研究者构建图2 所示的基因表达载体转入枯草芽孢杆菌，获得只有在木糖存在时才能大量表达并分
泌脂肪酶（塑料降解酶）的工程菌。请从以下选项中选择合适的启动子和基因，将所选序号填入相应位置
。
启动子：①芽孢杆菌内源启动子②T7 启动子（只被T7RNA 聚合酶识别）③木糖诱导型启动子
基因：
A．脂肪酶基因 B．脂肪酶基因+分泌信号肽基因
C．T7RNA 聚合酶基因 D．木糖合成酶基因
（注：分泌信号肽能引导蛋白质分泌到细胞外）
（3）研究者将上述表达载体转入用 处理过的枯草芽孢杆菌中，筛选得到转化
成功的工程菌。再利用重金属刺激工程菌形成工程芽孢，进一步制备出活塑料。
（4）活塑料能实现“在日常使用时不降解、需要回收时启动降解”的目标。活塑料使用完回收后快速降
解所需的条件是 。
（5）为保证该技术在实际应用中的安全性，在选取工程菌株时，还需要考虑的是____________。
A. 对人体和动植物无致病性
B. 在完成降解任务后种群会自然衰退
C. 在自然环境中具备较强的生存和扩散能力
D. 所携带的外源基因不易转移至自然环境
20.（2026·内蒙古包头·二模）人体肠道发炎时会异常合成硝酸盐，因此硝酸盐被视作肠炎标志物。为
及时精确诊断肠炎，研究人员将重组质粒导入大肠杆菌，构建了能够感知硝酸盐并通过荧光报告肠炎的工
程菌。该质粒的部分结构如图1 所示。回答下列问题。
（1）将重组质粒导入感受态细胞后，在培养基中需添加 和 ，通过监
测荧光蛋白含量，以筛选出符合要求的菌株。
（2）用混有工程菌的饲料饲喂健康和患有肠炎的小鼠，监测腹部的荧光情况。结果发现，健康小鼠的腹
部也检测到少量荧光。研究人员对比了实验前后健康小鼠的炎症指标，发现两者无显著差异，从而排除了
导致此现象的可能性。
（3）进一步研究发现，上述结果是由于大肠杆菌的启动子在没有诱导物时也会少量启动荧光蛋白基因的
表达导致。研究人员引入“开关—触发”调控系统（图2、3），以抑制非炎症状态下荧光蛋白基因的表达。
该系统由开关RNA 和触发RNA 构成，其中开关RNA 与荧光蛋白mRNA 相连接。
据图2，3 可知，当不存在触发RNA 时，开关RNA 会形成发夹结构，使得核糖体结合位点被遮挡，从而抑制
荧光蛋白基因表达的 过程；当存在触发RNA 时，它可以与开关RNA 的踏板区域通过
的方式结合，解开其发夹结构，使得荧光蛋白基因启动表达。
（4）一个启动子一般只驱动产生一种mRNA。为实现荧光蛋白基因只在炎症状态下表达，根据上述原理，
修改了重组质粒（图4），用以构建新的工程菌。在图4 给定的4 个元件中，选择恰当的元件并以正确的
顺序补充在方框中 。
。
