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专题12 基因工程与安全
2 大考点概览
考点01 基因工程
考点02 生物技术的安全与伦理
1．（2025·浙江嘉兴·一模）不对称PCR 常用于制备DNA 探针。在PCR 反应体系中加入一对数量不相等
的引物（如图所示），第一阶段，扩增产物是双链DNA，当限制性引物耗尽后进入第二阶段，此时非限
制性引物将引导合成大量单链DNA 探针。
下列叙述错误的是（ ）
A．为标记DNA 探针，可掺入含
32P 的dNTP
B．第一阶段的扩增以DNA 的两条链为模板
C．限制性引物的作用是增加第二阶段扩增的模板
D．制备的单链DNA 探针与目标DNA 的
链互补
【答案】D
【详解】A、DNA 探针的基本组成单位是脱氧核苷酸，因此，为标记DNA 探针，可掺入含
32P 的dNTP，
A 正确；
B、第一阶段，扩增产物是双链DNA，因此该阶段扩增是以DNA 的两条链为模板进行的，B 正确；
C、限制性引物的作用是增加第二阶段扩增的模板，进而为获得更多的非限制性引物引导的单链DNA 探
针，C 正确；
D、第二阶段中，非限制性引物结合目标 DNA 的β 链（3’→5’）并以其为模板延伸，合成的单链探针与
β 链互补，即与 α 链序列相同（而非互补），D 错误。
故选D。
2．（25-26 高三上·浙江·强基联盟一模）SYBR 是一种荧光染料，其与双链DNA 结合后会发出荧光，未
与双链DNA 结合的SYBR 不会发出荧光。科研小组在PCR 反应管①、②中加入模板DNA、耐高温的
DNA 聚合酶、dNTP、缓冲液、H2O、过量SYBR 以及不同引物，进行PCR 反应后观察荧光现象。模板
DNA 及引物序列如下表所示。下列叙述错误的是（ ）
考点1
基因工程
模板DNA 序列
—ATGCGTAATC……TCCGAGTAC—
反应管①中引物序列
—ATGCGTAATC—
—GTACTCGGA—
反应管②中引物序列
—CCGCGTAATC—
—GGACTCGGA—
注：“……”为未写出的序列，表中引物与模板DNA 中未写出序列不会发生特异性结合。
A．反应管①PCR 产物电泳后，可进行二苯胺染色以判断DNA 条带位置
B．反应管②中引物序列不能与模板链完全碱基互补，仍会出现荧光现象
C．调节反应管①②的退火温度，可使两支反应管中出现相似的荧光强度
D．SYBR 可用于比较不同PCR 反应中反应管DNA 模板初始含量的差异
【答案】A
【详解】A、二苯胺染色是一种用于溶液中DNA 定性的比色法，需要沸水浴加热，通过颜色变化（蓝
色）检测DNA，但无法用于琼脂糖凝胶电泳后DNA 条带位置的判断；凝胶电泳中常用溴化乙锭（EB）
或SYBR 类荧光染料进行染色，在紫外灯下观察荧光条带，A 错误；
B、反应管②中引物序列（5'-CCGCGTAATC-3'和5'-GGACTCGGA-3'）与模板DNA（5'-
ATGCGTAATC...TCCGAGTAC-3'）不完全碱基互补，导致扩增效率低或无特异性扩增；但PCR 反应初始
时存在双链模板DNA，SYBR 与之结合可发出荧光，因此PCR 后仍会出现荧光现象，B 正确；
C、调节退火温度可影响引物与模板的特异性结合：反应管①在最佳退火温度下扩增效率高，荧光强度大；
反应管②在较低退火温度下可能发生非特异性结合和扩增，产生一定量双链DNA，出现荧光。通过调整
退火温度（如提高温度使管①扩减少，或降低温度使管②非特异性扩增增加），可使两支反应管的荧光
强度相似，C 正确；
D、SYBR 与双链DNA 结合后荧光强度与DNA 量成正比，在实时荧光定量PCR（qPCR）中，通过监测
荧光信号（如Ct 值）可比较不同反应管中DNA 模板初始含量的差异，D 正确。
故选A。
3．（2025·浙江·稽阳联谊一模）紫杉醇是一种天然抗癌药物，最初从红豆杉的树皮中提取，但产量极低。
随着生物工程的发展，科学家们通过多种方法提高其产量：
方法一
关键酶基因转入红豆杉体细胞
通过植物组织培养技术获得高产植株
方法二
关键酶基因转入酵母菌
利用微生物发酵技术生产紫杉醇前体
方法三
对红豆杉愈伤组织进行基因改造
直接从培养物中提取紫杉醇
下列关于三种方法叙述正确的是（ ）
A．方法一和方法三都利用了植物细胞的全能性
B．方法二的核心技术不属于细胞工程范畴，而属于发酵工程
C．方法三相较于方法一，能更好地解决资源短缺问题，且不受季节、气候等限制
D．方法一和方法三中，外源基因成功转入受体细胞后，均能正常表达及稳定遗传
【答案】C
【详解】A、方法一通过植物组织培养获得植株，利用了细胞的全能性；方法三仅培养愈伤组织并直接提
取产物，未发育成完整个体，未体现全能性，A 错误；
B、方法二的核心技术是基因工程（将关键酶基因转入酵母菌），属于基因工程范畴，而发酵工程是后续
生产手段，B 错误；
C、方法三通过细胞培养直接生产紫杉醇，无需依赖植株生长，可大规模工业化生产，资源利用率高且不
受自然条件限制，C 正确；
D、外源基因的稳定遗传需整合到受体细胞基因组中，且表达受调控影响，方法一（体细胞转基因）和方
法三（愈伤组织转基因）均无法保证基因必然正常表达及稳定遗传，D 错误。
故选C。
4．（2025·浙江·名校新高考一模）科学家利用蛋白质工程研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，赖
脯胰岛素经皮下注射后易吸收、起效快。下列相关叙述错误的是（ ）
A．赖脯胰岛素在受体工程菌的核糖体上合成
B．通过蛋白质工程获取赖脯胰岛素的过程是④⑤⑥①②③
C．必须先合成天然胰岛素基因，再定点突变获得赖脯胰岛素基因
D．物质a 是mRNA，物质b 是多肽链，二者序列对应关系由密码子决定
【答案】C
【详解】A、赖脯胰岛素基因导入工程菌后，合成的场所确实在受体工程菌核糖体上，A 正确；
B、蛋白质工程的思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→
找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，即图中④⑤⑥①②③过程，
B 正确；
C、利用蛋白质工程获得新蛋白基因，也可直接合成带有突变位点的DNA 序列，C 错误；
D、物质a 是mRNA，b 是翻译形成的多肽链，二者序列对应关系由密码子决定，D 正确。
故选C。
5．（2025·浙江·金华一模）粪便无创DNA 检测技术通过分析粪便中脱落肠道细胞的DNA 来评估肠癌发
病风险，具有无创便捷、灵敏度高等优点。该检测需采集粪便样本，进行DNA 提取、扩增等过程。下列
叙述正确的是（ ）
A．提取DNA 时，研磨液经过滤、离心后取上清液，再加入冷酒精
B．随着PCR 反应进行，DNA 聚合酶、引物、脱氧核苷酸数量逐步减少
C．因粪便中的DNA 均源于肠壁脱落细胞，因此该技术的灵敏度高
D．若检测发现原癌基因并未突变，则可判断该检测者未得肠癌
【答案】A
【详解】A、提取DNA 时，需裂解细胞释放DNA，离心后细胞碎片等杂质沉淀，DNA 存在于上清液中，
加入冷酒精可使DNA 析出，A 正确；
B、PCR 反应中，脱氧核苷酸和引物会被消耗而减少，但耐高温的DNA 聚合酶（如Taq 酶）在反应中不
会被分解，其活性可能随高温循环逐渐降低，但数量不会“逐步减少”，B 错误；
C、粪便中的DNA 不仅来自肠壁脱落细胞，还可能包含肠道微生物或食物残留的DNA，C 错误；
D、癌症发生是多个基因突变（如原癌基因和抑癌基因）共同作用的结果，仅原癌基因未突变不能排除癌
症可能，D 错误。
故选A。
6．（2025·浙江·县域教研一模）编码核糖体RNA 的基因（rDNA）广泛存在于微生物中，比对不同生物
的rDNA 序列可以推测生物间的亲缘关系。下表是用于扩增的PCR 体系，引物A、B 是一对用于扩增
rDNA 的引物。以下关于PCR 操作正确的是（ ）
成分
体积/uL
成分
体积/uL
10×扩增缓冲液
X
Taq DNA 聚合酶
1
dNTP
2
酵母细胞悬液
1
引物A
2
无菌水
Y
引物B
2
总体积
20uL
引物A 溶液：序列为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
引物B 溶液：序列为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
A．表格中“X”的数值为5，”Y”的数值为7
B．配置PCR 体系时每加完一种溶液，都要更换微量移液器
C．用亚甲基蓝染色后，需在紫光灯下观察条带的数目和位置
D．该基因一条链两端的序列是5'-TCCGTAGGT……AGCGGAGGA-3'
【答案】D
【详解】A、表格中“X”为10×扩增缓冲液体积，在20μL 总体积中，10×缓冲液应加2μL；“Y”为无菌水
体积，Y=20μL-(2μL+2μL+2μL+2μL+1μL+1μL)=10μL，A 错误；
B、配置PCR 体系时，为防止交叉污染，每加一种溶液需更换微量移液器的吸头（枪头），但无需更换
整个微量移液器，B 错误；
C、亚甲基蓝为可见光染料，染色后DNA 条带在白色光源（如日光灯）下观察即可，C 错误；
D、引物A 序列为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，引物B 序列为5'-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。扩增的rDNA 片段中，一条链的5'端与引物A 序列相同（以
TCCGTAGGT 开头），3'端与引物B 的互补序列相同（引物B 互补序列为5'-
GCATATCAATAAGCGGAGGA-3'，其后部分为AGCGGAGGA），D 正确。
故选D。
7．（2025·浙江嘉兴·一模）通过改造猪的基因组，可培育人类异种器官移植的“心脏供体猪”。流程如
下：①从特定品种猪耳部获取成纤维细胞；②利用基因编辑技术改造会引起人体免疫排斥的相关基因；
③将基因编辑成功的细胞核移植到去核的猪卵母细胞中，构建重组胚胎；④将重组胚胎移植到代孕母猪
体内，获得基因编辑克隆猪。下列叙述错误的是（ ）
A．过程①中，酶解猪耳部组织获得的细胞即为成纤维细胞
B．过程②中，基因编辑系统能识别并切割相关基因中的特定序列
C．过程③中，经显微操作去除次级卵母细胞的细胞核
D．过程④中，重组胚胎发育至囊胚时，移植入代孕母猪
【答案】A
【详解】A、酶解猪耳部组织（使用胰蛋白酶等）可分散细胞，但获得的细胞包括成纤维细胞、上皮细胞
等多种类型，A 错误；
B、基因编辑系统（如CRISPR-Cas9）通过向导RNA 识别特定DNA 序列，并由Cas9 酶切割该序列，实
现靶向基因改造，B 正确；
C、核移植过程中，需将供体细胞核移植到去核的卵母细胞中；猪卵母细胞常处于减数第二次分裂中期
（MII 期，即次级卵母细胞阶段），通过显微操作去除其细胞核是标准步骤，C 正确；
D、在胚胎工程中，重组胚胎发育至囊胚阶段（具有内细胞团和滋养层细胞）时，移植入代孕母猪子宫，
以提高着床成功率，D 正确；
故选A。
8．（2025·浙江杭州·一模）FXS 综合征患者常呈现出自闭、孤独、智力低下等症状。该疾病由单对基因
引起，某个患者家系如图1 所示。已知Ⅱ-4 不携带致病基因，男性中发病率约为1/400。回答下列问题：
(1)FXS 综合征的遗传方式是____，调查该病发病率应该在____中调查。
(2)Ⅱ-3 个体细胞中最多含____个致病基因。Ⅲ-5 个体与一正常女性婚配，子代患病的概率为______。
进一步研究表明，该疾病为FMR1 基因上游非编码区出现了CGG 的异常重复所致，CGG 重复次数往往高
达100 次以上。具体情况如图2 所示。
(3)由图2 可知，FMR1 基因的编码链为____链。患者体内FMR1 蛋白质含量减少，最有可能是因为CGG
重复区影响了____。推测患者体内FMR1 蛋白中的氨基酸数量____（填增多、减少、不变或都有可能）。
Ⅲ-4 在备孕期间进行了遗传咨询，为了鉴定Ⅲ-4 个体的基因型，可进行如下操作。
(4)提取Ⅲ-4 个体的细胞，以____（A．质DNA B．基因组DNA C．基因库 D．基因组文库）作为模板，
挑选引物____（从图2 中挑选）进行PCR 扩增。对扩增产物进行电泳，若出现____，则表明Ⅲ-4 个体为
杂合子。
(5)若已确定Ⅲ-4 为杂合子，现需进一步____确定其携带的致病基因中CGG 的重复次数，则需对上一步电
泳结束后琼脂糖凝胶中目标条带进行回收，对纯化后的产物进行____，再将结果与基因数据库中的基因
信息进行____。
【答案】(1) 伴X 染色体隐性遗传 人群
(2) 2 1/802
(3) a FMR1 基因的转录 不变
(4) B 1、2 2 个条带
(5) 切胶（切割凝胶） 测序 比对
【分析】1、人类遗传病的遗传方式：根据遗传系谱图推测，“无中生有”是隐性，“无”指的是父母均
不患病，“有”指的是子代中有患病个体；隐性遗传看女病，后代女儿患病父亲正常的话是常染色体遗
传。“有中生无”是显性，“有”指的是父母患病，“无”指的是后代中有正常个体；显性遗传看男病，
儿子患病母亲正常为常染色体遗传。遗传病只在男子之间遗传的话，极有可能是伴Y 染色体遗传。
2、若要调查人群中遗传病的发病率，则首先应注意的是随机取样和调查人数足够多，以确保调查结果的
准确性。
【详解】（1）由遗传图谱可知，Ⅱ-3、Ⅱ-4 不患病，而Ⅲ-3 患病，根据“无中生有为隐性”进行判断，
该病是由隐性基因控制的遗传病，再根据Ⅱ-4 不携带致病基因可知，该病致病基因不可能位于常染色体
上，如果该病的致病基因位于常染色体，则Ⅱ-4 一定含有致病基因，也不可能是伴Y 遗传，因为男性患
病率为1/400，而不是1，所以该病是伴X 染色体隐性遗传。该遗传病是单基因遗传病，调查该病发病率
应该在人群中调查，通过随机调查，保证调查结果的准确性。
（2）Ⅲ-3 的致病基因来自Ⅱ-3，Ⅱ-3 表现正常，因此只含有1 个致病基因，但Ⅱ-3 个体细胞在有丝分裂
间期DNA 复制后，可存在2 个致病基因，所以Ⅱ-3 个体细胞中最多含2 个致病基因。Ⅲ-5 个体与一正常
女性婚配，由于Ⅲ-5 表现正常，不携带致病基因，所以只有正常女性为该病的携带者才能生出患病的孩
子。男性中发病率约为1/400，则该致病基因的基因频率为1/400，正常基因的基因频率为1-
1/400=399/400，则女性正常的基因型频率为399/400×399/400，女性携带者的基因型频率为
2×1/400×399/400，则携带者占正常女性的比例为2×1/400×399/400÷
（399/400×399/400+2×1/400×399/400）=2/401，生出的孩子中有1/4 患病，所以子代患病的概率为
2/401×1/4=1/802。
（3）RNA 聚合酶催化延伸的方向是从5’端向3’端合成RNA，只有在DNA 模板链上的移动方向是3’端向
5’端才能保证RNA 链的5’→3’合成，所以b 是模板链，则a 是编码链。FMR1 基因的表达产物是FMR1 蛋
白质，患者体内FMR1 蛋白质含量减少，原因是FMR1 基因上游非编码区出现了CGG 的异常重复所致，
说明最有可能是因为CGG 重复区影响了FMR1 基因的转录。CGG 重复区抑制了基因的转录，并未改变模
板链上碱基序列，因此转录和翻译后，FMR1 蛋白中的氨基酸数量保持不变。
（4）质DNA 仅存在于细胞质的线粒体中，不能反映核基因的基因型；要鉴定Ⅲ-4 的基因型需要提取该
个体细胞中的基因组DNA，包含该个体全部基因信息，能够通过基因检测等手段确定基因型；基因库是
一个种群中全部个体所含的全部基因的总和，主要用于研究种群水平的宏观遗传学问题，并非个体水平
的检测材料；基因组文库是将某种生物的基因组DNA 切割后导入受体菌构建的文库，包含生物全部基因，
主要用于筛选和提取特定基因，不是直接用于个体基因型鉴定的原始材料，ACD 错误，B 正确。
故选B。
提取Ⅲ-4 个体的细胞，以基因组DNA 作为模板，挑选引物1、2 进行PCR 扩增，因为引物1、2 之间的模
板包含CGG 重复序列和编码区。对扩增产物进行电泳，由于异常FMR1 基因的分子量大于正常FMR1 基
因，因此在电泳时会形成两条不同的带，如果电泳结果含有2 条带，说明既含有正常FMR1 基因，也含
有异常FMR1 基因，即为杂合子，否则只形成一条带。
（5）若已确定Ⅲ-4 为杂合子，现需进一步切胶确定其携带的致病基因中CGG 的重复次数，则需对上一
步电泳结束后琼脂糖凝胶中目标条带进行回收，对纯化后的产物进行测序，再将结果与基因数据库中的
基因信息进行比对，从而确定重复的次数。
9．（2025·浙江·北斗星联盟一模）杭州有悠久的种桑养蚕历史。蚕丝由含丝素重链、丝素轻链（FibL）
等蚕丝蛋白聚合而成，应用广泛，但抗拉性、韧性等机械性能仍相对不足。而蜘蛛丝由蛛丝蛋白聚合而
成，有着超强的抗张强度和韧性。于是研究人员将蚕丝FibL 基因和蛛丝基因中的多次重复t1 序列融合成
FibL-t1 基因，以提高蚕丝的机械性能。
注：pBac-L 和pBac-R 之间的区段能够转移并整合到受体细胞的染色体DNA 中。
回答下列问题：
(1)获取目的基因。已知丝素轻链和t1 的氨基酸序列，可以逆推得到目的基因的核苷酸序列，从而通过
_____法构建FibL-t1 基因。
(2)构建重组质粒。人工改造后的piggyBac 质粒常作为制备转基因蚕的载体，结构如图1 所示。在构建重
组质粒时，为保证目的基因的正确连接，选用的限制酶为 _____ 。构建重组质粒时，影响目的基因与载
体的连接效率的因素除了目的基因的浓度、载体的浓度，还包括 _____ 等（答出一点即可）。为方便目
的基因与载体的连接，可以通过PCR 技术在目的基因两端加上相应限制酶的识别序列，若图2 中 α 链为
模板链，为了在目的基因上游添加限制酶的识别序列，应该在引物 _____ 的 _____（填“5’”或“3’”）
端加上相应限制酶的识别序列。
(3)将目的基因导入受体细胞。利用显微注射法将重组质粒导入家蚕的 _____（填“受精卵细胞”或“丝
腺细胞”）。
(4)检测目的基因及其表达产物。为检测目的基因是否导入受体细胞，可以根据标记基因进行检测，若
_____ ，则说明目的基因导入受体细胞。研究人员通过 _____分离得到预期大小的蛋白条带，采用
_____技术，检测到转基因家蚕体内目的基因表达产生的相关蛋白质。最后，通过比较_____ 来判断转基
因是否成功。
(5)应用现代发酵工程技术生产上述蚕丝蛋白，有研究者提出如下思路：筛选出高产蚕丝蛋白的菌种经
_____ ，再接种到_____中大规模生产。
【答案】(1)化学合成
(2) SalⅠ和BamHⅠ DNA 连接酶的活性、黏性末端的情况、温度、pH 等 2 5’
(3)受精卵细胞
(4) （在荧光显微镜下）观察到家蚕发出红色荧光 凝胶电泳 抗原-抗体杂交 野生型和
转基因蚕丝的机械性能
(5) 扩大培养 灭菌的发酵罐
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根
据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和
花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方
法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA
是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目
的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）已知丝素轻链和t1 的氨基酸序列，可以逆推得到目的基因的核苷酸序列，从而通过化学合
成法构建FibL-t1 基因。
（2）已知pBac-L 和pBac-R 之间的区段能够转移并整合到受体细胞的染色体DNA 中，因此红色荧光蛋
白基因作为标记基因用于受体细胞的筛选，故不能选择NheⅠ，且在质粒上存在两个限制酶MhoⅠ识别位点，
若使用则会破坏质粒，故不能选，且要保证目的基因的正确连接，需选择两种酶切割质粒，因此选用的
限制酶为SalⅠ和BamHⅠ。构建重组质粒时，影响目的基因与载体的连接效率的因素除了目的基因的浓度、
载体的浓度，还包括DNA 连接酶的活性、黏性末端的情况、温度、pH 等。根据子链合成的方向，需要
选择引物2 和引物3，若图2 中α 链为模板链，则转录的方向为从右向左转录，为了在目的基因上游添加
限制酶的识别序列，应该在引物2 的5’端加上相应限制酶SalⅠ的识别序列。
（3）利用显微注射法将重组质粒导入家蚕的受精卵中，以使外源基因整合并培育出转基因家蚕个体。
（4）为检测目的基因是否导入受体细胞，可以根据标记基因进行检测，红色荧光蛋白基因作为标记基因
用于受体细胞的筛选，（在荧光显微镜下）观察到家蚕发出红色荧光，则说明目的基因导入受体细胞。
研究人员通过凝胶电泳分离得到预期大小的蛋白条带，根据抗原-抗体杂交技术，检测到转基因家蚕体内
目的基因表达产生的相关蛋白质。蜘蛛丝由蛛丝蛋白聚合而成，有着超强的抗张强度和韧性，蚕丝FibL
基因和蛛丝基因中的多次重复t1 序列融合成FibL-t1 基因，可以提高蚕丝的机械性能，因此可以通过比较
野生型和转基因蚕丝的机械性能来判断转基因是否成功。
（5）发酵工程的中心环节是发酵罐中的发酵，筛选出高产蚕丝蛋白的菌种先经扩大培养后，再接种到灭
菌的发酵罐中大规模生产。
10．（2025·浙江·县域教研一模）食醋是日常生活常用的调味品，酸度越高，品质越好。醋酸菌具有较强
的发酵能力，广泛用于食醋工业化生产。为获得高产的醋酸菌，配制培养基如下：10g/L 葡萄糖、110g/L
酵母提取物、20g/LCaCO3、20g/L 琼脂、体积分数3%无水乙醇，回答下列问题：
(1)初步筛选醋酸菌
称取醋醅（经醋酸发酵后的含多种微生物及其代谢产物的混合物），加入________制备成菌悬液，梯度
稀释后，用________法接种于上述固体培养基中。培养基中的乙醇能为微生物提供生长所需的________。
经培养后，选出________即为产酸性能高的菌株。但不能以水解圈的大小作为产酸能力的唯一指标，从
培养基制作角度分析可能原因是________（写出一点即可）。
(2)鉴定醋酸菌
选出6 株菌株进行产酸性能测定，结果如表，________菌株最适合用于生产。为进一步实验，需用
________方法（写出一点）对它进行菌种类型鉴定。
野生型优良菌株的生产性状表
菌株
S5
S10
S11
S12
S27
S30
总酸度
（g·L-1）
46.21
44.7
43.14
51.08
49.47
45.36
酒精转醋酸
率（%）
64.08
61.99
59.82
70.84
68.60
62.90
(3)改良野生醋酸菌
经鉴定其为巴氏醋酸菌，该菌产醋酸能力强，但醋酸积累过多引起pH 下降，抑制该菌的生长。研究发现，
在醋酸菌中表达氨基酸解氨酶能减缓pH 变化。研究小组将某种氨基酸解氨酶基因（X 基因）与质粒PB
连接，构建巴氏醋杆菌解氨酶重组表达载体。X 基因长度为1437bp，转录时以a 链为模板链。回答下列
问题：
①构建重组表达载体：为使X 基因正向插入载体，扩增X 基因时应分别在引物1 和引物2 的5'端添加
________限制酶的识别序列。
②验证重组表达载体：本实验用________和________酶对重组质粒进行酶切，电泳结果如图2，说明重组
质粒构建成功。
③将导入重组质粒的巴氏醋酸菌在30℃下培养48h，破碎菌体，用蛋白质凝胶电泳对X 基因表达产物
（氨基解氨酶）进行检测，应以导入________的醋酸菌为对照组，各泳道都没有明显条带，从启动子角
度分析，可能是因为________。
【答案】(1) 无菌水 稀释涂布平板 物质和能量（碳源） 水解圈（透明圈）/菌落直径
比值大的菌落 不同培养皿平板的厚度不同/不均匀
(2) S12 分子生物学法（PCR 得到rDNA，测序后与基因数据库比对）；菌落鉴定法
(3) SalⅠ和XbaⅠ XhoⅠ XbaⅠ PB（空白）质粒 PB 质粒中的启动子无法高效地表达
X 基因
【分析】筛选醋酸菌：1、关键鉴定指标：总酸度（直接反映产酸能力）、酒精转醋酸率（反映发酵效
率），两者越高菌株越优良2、菌种纯化方法：平板划线法、稀释涂布平板法（分离单菌落，获得纯培
养）。3、菌种分类鉴定：基因测序（分子水平精准鉴定醋酸菌种类）。选择两种限制酶分别切割目的基
因两端和载体多克隆位点，使目的基因和载体都产生不同的黏性末端，既能防止载体自身环化、目的基
因自连，又能保证目的基因正向插入载体。
【详解】（1）称取醋醅后，需用无菌水制备菌悬液，避免杂菌污染。平板划线法或稀释涂布平板法对筛
选出的优良菌株进行纯化的常用方法。作为微生物的碳源，其氧化分解能释放能量供微生物利用。透明
圈大的菌落说明产酸能力越强；琼脂添加量过多，培养基过硬，微生物无法扩散生长。
（2）若为菌种种类鉴定，基因测序是鉴定醋酸菌种类的常用分子方法
（3）质粒PB 的多克隆位点中，要使X 基因正向插入，需让扩增的X 基因两端酶切位点与质粒的酶切位
点方向匹配。选择的两种酶能将重组质粒切成与空质粒不同的条带，通过电泳条带差异验证构建成功。
对照组需排除质粒骨架的干扰，因此用导入空PB 质粒的巴氏醋杆菌作为对照。启动子突变、缺失，导致
X 基因转录无法启动。
11．（2025·浙江嘉兴·一模）水稻是我国第一大粮食作物。随着生物技术的发展，水稻育种进入精准设计
时代，回答下列问题。
(1)单倍体育种助力水稻育种。取水稻花药离体培养，获愈伤组织，调节培养基的营养和______，愈伤组
织经生芽和______过程后发育为单倍体幼苗，这一途径称之为器官发生途径。单倍体幼苗经秋水仙素处
理，可获得纯合二倍体水稻。也可对单倍体愈伤组织用______酶处理，获得相应的原生质体，再将同种
原生质体进行______，获得纯合二倍体水稻细胞。
(2)基因工程培育特色水稻。将花青素合成基因拼接到T-DNA 上，再用______法将基因导入水稻细胞，培
育出紫米水稻。对水稻中镉吸收相关基因进行______处理，可培育低镉水稻。
(3)基因工程改良水稻抗性。为提高对除草剂的抗性，先从______获得抗除草剂基因的序列，再利用基因
编辑技术改变基因特定位点的______，使该基因表达产物的空间结构发生改变，这种设计和改造蛋白质
的技术称为______工程。编辑后的水稻可能与近缘杂草经杂交发生______，产生“超级杂草”，所以应
对其进行风险评估。
【答案】(1) 激素的种类和配比 生根 纤维素酶和果胶 细胞融合
(2) 农杆菌转化 敲除
(3) 基因数据库 核苷酸序列 蛋白质 基因漂移
【分析】1、基因的分离定律的实质是：在杂合体的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一
定的独立性，在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配
子中，独立地随配子遗传给后代。
2、单倍体育种：采用花药(花粉)离体培养的方法来获得单倍体植株，然后经过人工诱导使染色体数目加
倍，重新恢复到正常植株的染色体数目。
【详解】（1）单倍体育种助力水稻育种。取水稻花药离体培养，获愈伤组织，调节培养基的营养和激素
的种类和配比，愈伤组织经生芽和生根过程后发育为单倍体幼苗，这一途径称之为器官发生途径，该过
程的原理是染色体变异和植物细胞的全能性。单倍体幼苗经秋水仙素处理，可获得纯合二倍体水稻。也
可对单倍体愈伤组织用纤维素酶和果胶酶处理，获得相应的原生质体，再将同种原生质体进行细胞融合，
获得纯合二倍体水稻细胞，进而通过植物组织培养获得纯合二倍体。
（2）基因工程培育特色水稻。将花青素合成基因拼接到T-DNA 上，再用农杆菌转化法将基因导入水稻
细胞，培育出紫米水稻。对水稻中镉吸收相关基因进行敲除处理，进而可以减少对镉的吸收，进而可培
育低镉水稻。
（3）基因工程改良水稻抗性。为提高对除草剂的抗性，先从基因数据库获得抗除草剂基因的序列，再利
用基因编辑技术改变基因特定位点的核苷酸序列，使该基因表达产物的空间结构发生改变，这种设计和
改造蛋白质的技术称为蛋白质工程。通过蛋白质工程可获得自然界不存在的蛋白质，编辑后的水稻可能
与近缘杂草经杂交发生基因漂移，产生“超级杂草”，所以应对其进行风险评估，而后进行推广。
12．（25-26 高三上·浙江·金丽衢一模）科研人员以小鼠胚胎细胞为材料进行动物细胞培养，通过传代获
得了三种细胞系：单层生长的A、以及堆积生长的B 和C．取不同细胞进行融合实验，思路及结果如下：
第1 组：细胞系B 的细胞+细胞系A 的细胞→癌变的杂交细胞；
第2 组：细胞系B 的细胞+正常细胞→正常的杂交细胞。
回答下列问题：
(1)离体培养时，组织脱离了体内的运输系统，无法有效获取养分和排出代谢产物。为解决该问题，需进
行的操作是_____。
(2)用适量强度的电流刺激时，细胞膜发生的变化是_____，使不同膜发生融合。比较两组融合实验的结果，
表明细胞系A 属于_____细胞系。
(3)ras 和myc 是常见的与癌变相关的一类基因，其突变型可通过添加“m-”前缀表示。在克隆这些基因时，
涉及载体、目的基因及限制酶的信息如图所示。其中，P1和P2表示与邻近链互补的引物，箭头方向表示
从5'→3'。
限制酶
识别序列及切割位点
Sma I
Nbe I
Xba I
Nsi I
PstI
为保证目的基因与载体的正确连接，载体切口左右两侧的黏性末端分别由限制酶_____切割形成。在通过
PCR 技术扩增目的基因时，为便于后续的酶切和连接操作，引物P1的5'端需添加的碱基序列为：
5'_____3′。在使用高活性的T4DNA 连接酶进行重组DNA 分子构建时，通常选择在较低温度（如：
16°C）下进行，并将反应时间适当延长，主要原因是_____。
(4)将上述克隆的基因注入到正常的小鼠胚胎细胞，并将受体细胞移植到免疫缺陷小鼠的皮下。实验结果
显示，只有导入m-ras 和m-myc 的实验组小鼠形成肿瘤。综合上述实验，可得出的结论是_____。
【答案】(1)用胰酶将组织分散成单个细胞，定时更换培养液
(2) 损伤并重排 良性无限（不死）
(3) PstⅠ、XbaⅠ CTGCAG 较低的温度条件下有利于氢键的形成，获得较多的连接产物
(4)正常细胞经多次突变才能转化成癌细胞
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞
→目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）离体培养时，组织脱离了体内的运输系统，无法有效获取养分和排出代谢产物，为解决该
问题，需进行的操作是用胰酶将组织分散成单个细胞，定期更换培养液，这样可以为细胞补充营养物质，
同时清除代谢废物，维持细胞生长的适宜环境。
（2）用适量强度的电流刺激时，细胞膜发生损伤并重排使不同膜发生融合。比较两组融合实验的结果，
第1 组细胞系B 的细胞和细胞系A 的细胞融合得到癌变的杂交细胞，第2 组细胞系B 的细胞和正常细胞
融合得到正常的杂交细胞，说明细胞系A 的细胞与正常细胞不同，能使杂交细胞癌变，表明细胞系A 属
于良性无限（不死）细胞系。
（3）据图可知目的基因内部有Nsi I 和Nbe I 限制酶切位点，所以不能选择这两种限制酶来切割载体，
Sma I 切切割形成的是平末端，所以也不能用，根据图所示载体切口左侧黏性末端游离端是3'端，所以应
该选择限制酶PstI，载体切口右侧黏性末端游离端是5'端，所以应该选择限制酶Xba I；
由于引物P1 是目的基因的上游，构建表达载体时应该接在载体切口的左侧，所以引物P1 需要添加的碱
基序列为5'-CTGCAG-3'（限制酶PstI 识别序列）；因为在较低的温度条件下有利于氢键的形成，获得较
多的连接产物，所以在使用高活性的T4DNA 连接酶进行重组DNA 分子构建时，通常选择在较低温度
（如：16℃）下进行，并将反应时间适当延长。
（4）只有导入m-ras 和m-myc 的实验组小鼠形成肿瘤，说明正常细胞经多次突变才能转化成癌细胞。
13．（25-26 高三上·浙江台州·一模）围食膜是对虾胃部成膜细胞合成分泌的一层半透性膜，围食膜的骨
架是由几丁质构成的，其中嵌入大量的围食膜蛋白。研究发现，在围食膜受损时，围食膜蛋白基因
（PT）表达水平会显著上调。回答下列问题：
(1)为验证围食膜受损时，围食膜蛋白基因（PT）表达水平会显著上调。研究人员设计了以下实验：
①取围食膜损伤对虾（损伤组）和正常对虾（正常组）的_______细胞，分别提取其总RNA，通过
_______得到RNA-cDNA 杂交双链作为PCR 的模板，并使用______将引物、dNTP 和TaqDNA 聚合酶等加
入离心管中进行扩增。
②扩增产物经电泳得到如图1 所示结果。图中黑色条带的宽度代表_______，由此可知损伤组PT 表达量
显著大于正常组。图中的内参基因在不同组织、不同处理条件下表达量是恒定的，推测内参基因在本实
验中的作用可能是为了排除正常组和损伤组的________量、逆转录效率和______效率等无关变量对实验
的影响。
(2)PT 模板链序列如图2 所示（1 号碱基处为3 端），围食膜蛋白第1 至19 位氨基酸肽段（信号肽）能把
正在合成的围食膜蛋白引导至______（细胞器）中，进而分泌到胞外。为验证该肽段的功能，可扩增不
含信号肽对应区域的PT 序列（PTWSP），将PTWSP 与______载体相连构建重组DNA，导入受体细胞后
可用_______作为探针检测其是否分泌出围食膜蛋白。PCR 扩增时，PTWSP 模板链对应的引物可设计为
______（…代表限制酶识别序列）。
A．5'-…ATGAGGTCCAATACGTTCTT-3'
B．5'-…ATGAGAGACTTGCGAGCTAA-3'
C．5'-…AGAGACTTGCGAGCTAAACG-3'
D．5'-…TCTCTGAACGCTCGATTTGC-3'
【答案】(1) 胃部成膜 逆转录 微量移液器 DNA 含量 总RNA PCR
(2) 内质网 表达 带标记的抗围食膜蛋白抗体 B
【分析】1、围食膜受损时，围食膜蛋白基因（PT）表达水平会显著上调，以便修复受损的围食膜或产生
新的围食膜替换受损的围食膜，在分子水平上，则对虾胃部成膜细胞中相应的mRNA 和蛋白质含量会增
多，可测定它们含量变化确认基因表达水平是否显著上调。
2、以逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板可以合成单链cDNA，随后可以以单链cDNA 模板通过DNA
聚合酶合成双链cDNA。cDNA 只包含外显子，不包括内含子和调控序列。
3、PCR 技术是体外扩增DNA 的技术，需要引物、酶、模板、能量等形成的反应体系。
【详解】（1）①由题干可知，围食膜是由对虾胃部成膜细胞形成的，因此本实验的实验材料是对虾胃部
成膜细胞，通过对比正常组和损伤组中通过逆转录获得的DNA 含量差异来判断基因的表达水平是否显著
上调。实验是先提取对虾胃部成膜细胞的总RNA，包括PT 转录得到的mRNA 和其他基因转录形成的
mRNA，由RNA 得到DNA 需要通过逆转录才能完成，但此时DNA 的数量比较少，无法明显看到实验结
果，因此可以通过PCR 技术扩增DNA 的数量，便于在电泳时获得明显的实验结果。PCR 技术需要的都
是微量物质和能量，因此物质的转移和获取常用的器具是微量移液器。
PCR
②
技术是用来扩增DNA 的，所以将扩增产物电泳后，电泳条带的宽度代表了DNA 的含量。对虾胃
部成膜细胞除了含有PT 外，还含有其他基因，可以把除了PT 之外的基因称为内参基因，根据内参基因
在不同组织、不同处理条件下表达量是恒定的特点，可以推测内参基因在本实验中的作用可能是为了排
除正常组和损伤组的总RNA 量、逆转录效率和PCR 效率等无关变量对实验的影响。
（2）围食膜蛋白第1 至19 位氨基酸肽段是信号肽，信号肽可以把核糖体合成的多肽引导进入内质网，内
质网切除信号肽，然后对多肽进行加工和包装，再经高尔基体处理运往细胞膜，分泌到细胞外。把目的
基因送入受体细胞中能稳定存在且能表达，需要将目的基因与表达载体相连构建重组DNA 分子，之后再
导入受体细胞。检测受体细胞是否能分泌出围食膜蛋白，可以根据抗原—抗体杂交技术的原理，可以利
用带标记的抗围食膜蛋白抗体来作为探针进行检测。围食膜蛋白第1 至19 位氨基酸肽段是信号肽，需要
模板链中19×3=57 个碱基，所以图2 中深色部分是形成信号肽的碱基序列，因此除了深色部分是PTWSP
的模板链，模板链中98-100 三个碱基是TAC，对应的是mRNA 上的起始密码子AUG，因此58-97 碱基序
列为基因的上游序列，1 号碱基处为3’端，根据模板链与编码链碱基互补，在编码链1 号碱基处为5’端，
若用5’-…ATGAGAGACTTGCGAGCTAA-3’作为引物可以和编码链上游序列（58-97 碱基序列）互补配对，
则引物与模板链互补配对，B 正确，ACD 错误。故选B。
14．（2025·浙江·名校新高考一模）虾青素是雨生红球藻产物，具有抗氧化和提高免疫力等特点，但并非
其基本生命活动必需的产物。某科研团队从雨生红球藻中克隆虾青素合成关键酶基因（crtZ），通过基因
工程改造酿酒酵母构建工程菌株，并结合发酵工艺优化实现虾青素产业化生产。请回答下列问题：
(1)目的基因的获取。提取雨生红球藻的总DNA 作为___________，设计特异性引物扩增crtZ 基因，此过
程每次循环可以分为___________三步。
(2)构建重组DNA 分子。图中质粒还缺少的必备元件是___________。质粒中启动子的作用是结合
___________，驱动目的基因高效转录。为使基因crtZ 片段能正确连接到图中质粒，应选用限制酶
___________来处理质粒。
(3)目的基因导入受体细胞。将重组质粒导入大肠杆菌后，需在含___________的培养基上筛选，以排除未
导入质粒的大肠杆菌；再从阳性大肠杆菌中提取重组质粒，导入URA3 基因缺失的酿酒酵母，应在
___________的培养基上筛选工程酵母，理由是___________。
(4)虾青素的部分代谢途径如图所示，通过基因编辑技术将crtZ 基因定向整合到酿酒酵母染色体上的
ERG3 基因中，该方法可避免因___________（生理过程）导致的目的基因丢失，提高遗传稳定性；同时
能进一步提高虾青素产量，原因是___________，这一方案体现了基因工程对微生物___________的定向
改造。
(5)发酵过程中，常选用富含玉米浆和葡萄糖的培养液，其中玉米浆除提供碳、氮源、水外，还能提供
___________（答出一类）；智能发酵罐在酵母菌对数生长期动态补加葡萄糖和玉米浆，目的是
___________；若溶解氧不足，会导致酵母通过厌氧呼吸产生___________，既浪费碳源又可能抑制虾青
素合成。
【答案】(1) 模板 变性、退火、延伸
(2) 复制原点（复制起点） RNA 聚合酶 BamHI 和EcoRI
(3) 氨苄青霉素 不含尿嘧啶
基因缺失的酵母无法合成尿嘧啶，只有导入含
基
因重组质粒的工程酵母才能在不含尿嘧啶的培养基上存活
(4) 有丝分裂（细胞增殖）
基因被破坏，使更多前体物质用于虾青素合成途径 代谢
途径
(5) 生长因子（或无机盐、维生素） 为酵母快速增殖提供充足营养 酒精（或乙醇）
【分析】基因工程包括四个基本程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入
受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）目的基因扩增以雨生红球藻总DNA 为模板，特异性引物可精准结合目的基因（crtZ 基
因）两端序列，启动扩增。PCR 技术每次循环分为三步：变性（高温使DNA 双链解旋）、退火（降温让
引物与模板链结合）、延伸（Taq 酶催化子链合成），通过多轮循环实现目的基因大量复制。
（2）重组质粒的必备元件包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点（保证质粒在受体细胞
中自主复制），图中质粒缺失该元件。启动子是RNA 聚合酶的结合位点，RNA 聚合酶结合后可启动目的
基因转录为mRNA。限制酶选择：需保证目的基因完整且质粒多克隆位点匹配。BamHI 和EcoRI 的酶切
位点分别位于目的基因两端，且不破坏质粒的启动子、终止子、标记基因，故选用这两种酶，可避免目
的基因反向连接或自身环化。
（3）大肠杆菌的筛选标记基因为Amp⁺（氨苄青霉素抗性基因），故需在含氨苄青霉素的培养基上筛选，
未导入质粒的大肠杆菌无抗性，会被淘汰。 酿酒酵母缺失URA3 基因，无法合成尿嘧啶，而重组质粒含
URA3 基因，故需在不含尿嘧啶的培养基上筛选。只有导入重组质粒的工程酵母，才能通过URA3 基因合
成尿嘧啶，在该培养基上存活，从而区分成功转化的酵母。
（4）若目的基因仅存在于质粒上，酵母有丝分裂（细胞增殖） 过程中，质粒可能随机分配，导致部分
子代细胞丢失目的基因；整合到染色体上可避免这一问题，提高遗传稳定性。据代谢途径可知，ERG3 基
因控制合成麦角固醇，crtZ 基因整合到ERG3 基因中会破坏其功能，使前体物质无法流向麦角固醇合成途
径，转而更多用于虾青素合成，故产量提高。该方案通过定向整合基因，改变微生物的代谢流向，体现
了基因工程对微生物代谢途径的定向改造。
（5）玉米浆成分复杂，除碳、氮源、水外，还含生长因子（或无机盐、维生素） ，这些物质是酵母生
长繁殖和代谢所需的微量营养物质。对数生长期酵母增殖速度快，动态补加葡萄糖和玉米浆可提供充足
营养，维持酵母快速增殖，为虾青素合成积累足够菌体和酶系。酵母厌氧呼吸的产物为酒精（乙醇） ，
溶解氧不足时厌氧呼吸增强，酒精积累会浪费碳源（葡萄糖），且可能抑制酵母代谢和虾青素合成。
15．（2025·浙江·精诚联盟一模）马尔尼菲青霉菌（PM）是青霉菌中唯一的温度双相型致病菌，是一种
罕见的致病菌。PM 可引起人类和动物的系统性感染，尤其在免疫缺陷人群中具有高致病性，且死亡率较
高。科学家发现基因SKN7 与该病菌的氧化应激反应发生有密切关系，欲对其进行序列测定和扩增。回
答下列问题：
(1)PM 菌种的活化和培养。配制马铃薯蔗糖培养基后，将pH 调成中性偏____性，经高压蒸汽灭菌后冷却，
在____中用接种环挑取斜面中的PM 菌落中的部分菌体，接种到液体培养基中，置于摇床中振荡以实现
____培养。
(2)体外扩增SKN7 基因。科学家利用SKN7 基因的部分序列制成图中的序列1 和2 作为引物，先以该基因
的转录产物mRNA 为起点，经过程①逆转录形成cDNA，并经过如图的PCR 过程，将产物经过____，显
示出的条带要比直接用SKN7 基因得到的条带更____（填“接近”或“远离”）加样孔，原因是____。
（写出2 点即可）
(3)形成重组表达载体。如图所示，在SKN7 基因的扩增过程中，TaqDNA 聚合酶会在序列3’端额外加入
一个A；然后选用图中的限制酶EcoRV 对pMD18-T 载体进行酶切产生____末端，经末端转移酶处理可在
切口处加入一个T，最后用DNA 连接酶将SKN7 基因与载体连接形成重组载体，该重组方法存在的主要
缺点是____。（写出2 点即可）
(4)筛选受体菌。将如图正确构建的重组载体与经CaCl₂ 溶液处理的大肠杆菌共培养一段时间，最后进行
短暂的热刺激处理，目的是提高____；再将大肠杆菌放在含有____的LB 固体培养基中培养，最终从形成
的____色菌落获取菌体，作为后续对SKN 基因研究的重要材料。
【答案】(1) 酸 超净工作台 扩大
(2) 琼脂糖凝胶电泳 远离 SKN7 基因转录形成的mRNA 要经过加工，导致逆转录形成的
cDNA 比原基因长度短；引物2 的结合位点在cDNA 的中间部分，引导TaqDNA 聚合酶从该点开始延伸，
导致得到的PCR 产物的大小要远小于SKN7 基因。
(3) 平 目的基因和载体的反向连接、黏性末端短小导致连接效率降低
(4) 对外源DNA/重组载体的转化率 氨苄青霉素和X-Gal 白色
【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的筛选和获取，②基因表达载体的构建，③将
目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。
2、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序应为：配制培养基、调节pH、分装、包扎、灭菌、倒平板。
【详解】（1）据题意，PM 是一种真菌，培养PM 的pH 应中性偏酸；菌种的接种需要在专用的超净工作
台中进行操作，以保证不发生杂菌的污染；PM 是一种需氧真菌，要将其置于摇床中振荡培养以实现菌体
的扩大培养。
（2）据图1 可知，过程①以mRNA 为模板形成cDNA 的过程为逆转录，形成双链DNA 后，进行PCR，
应用序列1 和序列2 为引物，最后形成的产物大多数为过程④后得到的DNA 片段，经电泳只形成1 个条
带，该条带要比真正的SKN7 基因形成的条带短，即更远离加样孔的原因主要有两个：一是能分析真核
生物的基因转录形成mRNA 时要加工切除原来内含子对应的序列；二是能从图1 中分析出序列2 引物并
未从cDNA 的3’端开始。
（3）据题意可知，经限制酶EcoRV 对pMD18-T 载体酶切后形成了平末端；图2 所用的重组载体形成方
法相当于单酶切法，其主要问题就是容易导致目的基因和载体的反向连接（注意：这里不发生目的基因
和载体的自身成环）、形成的黏性末端短小导致连接效率降低等。
（4）将重组载体导入大肠杆菌时，受体菌经CaCl₂ 溶液处理变为感受态，经共同培养后，最后进行短暂
的热刺激处理，以提高外源DNA/重组载体的转化率；据图2 中载体上的2 个标记基因的功能，可判断在
培养基中应加入氨苄青霉素和X-Gal 这两类物质，以实现对含有重组载体受体菌的筛选；因重组载体中的
氨苄青霉素抗性基因正常表达而lac-Z 基因被目的基因插入后失活，最后形成的白色菌落中的菌体是含有
重组载体的。
16．（25-26 高三上·浙江·新阵地联盟一模）常染色体隐性遗传性耳聋9（DFNB9）的患者通常表现为重
度或完全听力损失，其发病机制为OTOF 基因突变导致耳畸蛋白缺陷，从而引起内毛细胞功能障碍，无
法将声音刺激转变为电信号传给听觉神经通路，引起耳聋。近期中国科学家基于腺相关病毒（AAV）载
体递送技术获取重组AAV（流程如图），通过局部给药的方式将人源OTOF 基因靶向导入内耳，补偿内
毛细胞缺失的耳畸蛋白，治疗疾病。
回答下列问题：
(1)获取OTOF 基因。可在________查询OTOF 基因的编码序列，然后利用_______（方法）得到OTOF 基
因。因OTOF 基因片段约6kb，超过单个AAV 载体的包载能力（4.7kb），则利用PCR 扩增OTOF 基因两
个片段，扩增时需要用到的引物有_______（填序号）。
(2)构建重组AAV 表达载体。该重组载体除了有OTOF 基因片段外，为了OTOF 基因在内毛细胞特异性表
达，还应有_______。
(3)在受体细胞中进行表达。将重组的AAV 表达载体、衣壳质粒和辅助质粒共转染入人胚胎肾细胞，在人
胚胎肾细胞的培养过程中，需提供5%的CO2来_______，添加_______抑制细菌的生长。培养一段时间后，
可在上清液获得病毒克隆，同时需要裂解人胚胎肾细胞以提取总蛋白。利用电泳技术对总蛋白进行分离，
总蛋白的迁移速度取决于_______（至少答两点）。电泳分离结束后，转移到特殊膜上，利用_______技
术检测以验证转染后耳畸蛋白是否成功表达。
(4)导入内毛细胞。为了靶向治疗内毛细胞，科学家在麻醉小鼠后采用_______（填“肌肉注射”、“静脉
注射”或“显微注射”的方式）给药，并观察小鼠的行为变化等指标。
(5)药效检测。临床试验结果表明，一次注射用药一般可以长期维持效果，幼儿完全恢复听力，请推测这
种基因治疗方式长期维持效果的原因是______。
【答案】(1) 序列数据库 化学合成法 ②③一对、⑥⑦一对
(2)内毛细胞的特异性启动子
(3) 维持培养液的pH 抗生素 分子大小、分子结构、带电性质的差异等 抗原-抗体杂
交
(4)显微注射
(5)OTOF 基因进入到内毛细胞后不会降解，并且在特异性启动子的帮助下能够高效表达
【分析】1、PCR 是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与
DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
2、引物的作用是使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
【详解】（1）查询OTOF 基因的编码序列可在基因数据库中进行，这些数据库提供了基因的完整序列信
息，从数据库获得序列信息后，可以使用化学合成法合成出OTOF 基因。
由于OTOF 基因全长约6kb，超过单个AAV 载体的包载能力（4.7kb），需要将基因分为两个片段（1-
2790bp 和2791-5994bp）进行PCR 扩增，扩增时需要用到两对引物，引物应该结合在模板链的3'端，从序
列图中可以看出，应选择引物②③和⑥⑦。
（2）为了使OTOF 基因在内毛细胞中特异性表达，重组载体除了包含OTOF 基因片段外，还应包含内毛
细胞特异性启动子，这种启动子可以确保基因只在目标细胞类型中表达，提高治疗的靶向性。
（3）在人胚胎肾细胞的培养过程中，需提供5%的CO2 来维持培养液的pH，添加抗生素（如青霉素）
来抑制细菌的生长，确保细胞培养的无菌环境。利用电泳技术对总蛋白进行分离时，总蛋白的迁移速度
主要取决于分子量大小、分子结构、带电性质的差异等。分子量越小、所带电荷越多，迁移速度越快。
电泳分离后，蛋白质被转移到特殊膜（如硝酸纤维素膜）上，然后利用抗原-抗体杂交技术进行检测，该
方法使用特异性抗体验证耳畸蛋白是否成功表达。
（4）为了靶向治疗内毛细胞，科学家在麻醉小鼠后采用显微注射的方式给药，这种方法允许精确地将重
组AAV 载体注入内耳局部，确保基因高效导入内毛细胞。
（5）这种基因治疗方式能够长期维持效果的原因是OTOF 基因进入到内毛细胞后不会降解，并且在特异
性启动子的帮助下能够高效表达，从而长期补偿耳畸蛋白的功能。
17．（25-26 高三上·浙江温州·一模）组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种广泛用于溶解血栓的蛋白质
类药物，但t-PA 在血液中的半衰期很短（3～5 分钟），在临床治疗中须大剂量静脉注射才能维持其有效
浓度，但会增加出血风险。研究团队借助PCR 技术改造t-PA 基因，最终获得药效时间更长的突变型t-
PA。
回答下列问题：
(1)研究人员设计突变型t-PA 的空间结构，推测其______，再根据“中心法则”逆推t-PA 基因的核苷酸序
列。研究发现，将t-PA 的第117 位天冬酰胺替换为谷氨酰胺可延长其作用时间。已知决定谷氨酰胺的密
码子是CAA 或CAG，则改造后的基因编码链上对应的碱基序列是______。
(2)利用山羊乳腺生物反应器生产突变型t-PA
①重组载体的构建。乳球蛋白（BLG）是山羊乳汁中主要的乳清蛋白。研究人员首先通过查找______获
取乳球蛋白信号肽（BLGSP）核苷酸序列信息，并通过______法获得该DNA 序列。其次，将该序列与t-
PA 突变基因（如图1 所示）构建获得融合基因（图2）；为了确定BLGSP 序列和t-PA 突变基因正确连接，
需进行PCR 检测，若仅用一对引物，则应选择图2 中的引物______（A．F2、R1B．F2、R2C．F1、R1D．
F1、R2）。最后，将融合基因与表达载体（图3）经_______酶处理构建形成重组载体。
②重组载体的表达与检测。重组载体经筛选后借助_______（填仪器名称）导入山羊受精卵，经胚胎体外
培养、________等技术获得转基因山羊。在泌乳期收集转基因山羊的乳汁，分离提纯后，用________技
术检测确定乳汁中存在突变型t-PA。
(3)t-PA 突变基因只在山羊乳腺上皮细胞中表达，而不在其他组织细胞内表达的原因是_______。采用转基
因山羊乳腺生物反应器生产t-PA，具有药用蛋白活性更高、_______等优点。
【答案】(1) 氨基酸序列 CAA 或CAG
(2) 基因数据库/序列数据库/基因银行 化学合成法 D KpnI、XhoI 和DNA 连接酶
显微操作仪或显微注射针 胚胎移植 抗原抗体杂交
(3) 乳腺特异性表达载体/BLG 启动子，只有在乳腺细胞中才能表达/在其它组织细胞不能表达
可通过乳汁持续获取/乳汁成分相对简单明确，便于药物的提纯/频繁采集不会对动物产生危害/产量高
【分析】蛋白质工程首先要建立蛋白质功能与结构的联系，然后依据所需蛋白质的功能，设计改造天然
蛋白质的空间结构，推测出其氨基酸的序列，并根据“中心法则”逆推出基因的核苷酸序列，进而利用
基因工程技术改变DNA 上特定位点的核苷酸序列，最终将改造了的基因导入受体细胞后进行表达。可见，
蛋白质工程是通过设计和改造编码蛋白质的基因获得特定功能的蛋白质。
【详解】（1）蛋白质工程首先要建立蛋白质功能与结构的联系，然后依据所需蛋白质的功能，设计改造
天然蛋白质的空间结构，推测出其氨基酸的序列，并根据“中心法则”逆推出基因的核苷酸序列；mRNA
是以基因中非编码链为模板转录形成的，所以mRNA 中碱基序列和编码链中的碱基序列相同，决定谷氨
酰胺的密码子是CAA 或CAG，则改造后的基因编码链上对应的碱基序列为CAA 或CAG。
（2）基因工程第一步是获取目的基因，获取乳球蛋白信号肽（BLGSP）核苷酸序列信息，需要在基因数
据库、序列数据库或基因银行中查找，确定其序列后通过化学合成法来合成该序列；PCR 检测时引物的
选择要根据目的基因及引物的方向来选择，根据图2 可以得出选择的引物应该是F1 和R2；
基因工程第二步是基因表达载体的构建，构建基因表达载体过程中需要用到限制酶和DNA 连接酶，而限
制酶的选择要注意限制酶的位置和种类，根据图1 和图3 可知，限制酶应该选目的基因两端的也就是
KpnI、XhoI；
基因工程第三步是将目的基因导入受体细胞，导入动物受精卵常用的方法是显微注射法，需用到显微操
作仪或显微注射针等仪器；
导入后的受精卵经过胚胎体外培养发育到一定时期后通过胚胎移植技术获得转基因山羊；检测目的基因
及其表达产物是基因工程操作的第四步，运用抗原-抗体杂交技术可以检测目的基因是否表达出相应的蛋
白质。
（3）t-PA 突变基因含有BLG 启动子，而BLG 启动子只在山羊乳腺上皮细胞中表达，而不在其他组织细
胞内表达；采用转基因山羊乳腺生物反应器生产t-PA，具有药用蛋白活性更高、可通过乳汁持续获取、
乳汁成分相对简单明确，便于药物的提纯、频繁采集不会对动物产生危害、产量高等优点。
18．（25-26 高三上·浙江丽水·一模）谷蛋白含量低的稻米适合肾病患者食用。自然条件下，野生型水稻
中基因B1 与B2 之间以及B2 的DNA 片段发生部分缺失，会形成低谷蛋白水稻LGC-1，机理如图1 所示。
在研发、鉴定低谷蛋白水稻时，使用的PCR 技术仅能扩增2kb 以内的片段。
注:K～N 代表该位点可结合的引物
回答下列问题：
(1)产生LGC-1 的变异类型属于______。已知基因B1 与B2 的序列相同，而LGC-1 中基因B2 失去了
______，导致转录得到的mRNA 内部形成互补的双链结构，从而影响了该基因的______过程，谷蛋白合
成量减少。在鉴定野生型植株和LGC-1 时，若选用引物______（填字母）进行PCR，出现阳性结果的只
有LGC-1。
(2)科研人员构建基因编辑载体，对水稻细胞内基因B1、B2 的DNA 片段进行剪切，研发同类型低谷蛋白
水稻。研发中，可选择限制酶______对图2 所示的基因编辑载体和Ti 质粒进行酶切，利用______酶将酶
切产物连接，形成重组Ti 质粒；再将其导入______处理过的农杆菌；然后，利用含重组Ti 质粒的农杆菌
侵染野生型水稻愈伤组织，在含有______的培养基上筛选。基因编辑载体在水稻细胞内表达，生成的产
物能特异性识别并剪切Spl、Sp2 序列，使水稻DNA 断裂，细胞自身对DNA 断裂处进行修复的过程中可
能会丢失DNA 片段。
(3)经基因编辑处理，基因B1、B2 的DNA 段中存在不同程度的缺失，形成了多种突变体。若要筛选出
图3 所示类型的突变体，需选用引物______（填字母）进行PCR,经电泳验证，结果为阳性。为了进一步
鉴定该植株是否具备目标性状，还需要测定______，并与野生型、LGC-1 相对比。
【答案】(1) 基因突变 终止子 翻译 L、N
(2) BamH Ⅰ、Hind Ⅲ DNA 连接酶 氯化钙 潮霉素
(3) M、N 水稻籽粒谷蛋白含量
【分析】基因的表达是指基因通过mRNA 指导蛋白质的合成，包括遗传信息的转录和翻译两个阶段。
【详解】（1）DNA 分子中发生碱基对的增添、缺失和替换等变化，引起基因结构的改变，属于基因突变，
产生LGC-1 的变异类型属于基因突变。已知基因B1 与B2 的序列相同，那么LGC-1 中基因B2 失去终止
子后，会导致转录得到的mRNA 内部形成互补的双链结构，进而影响核糖体与mRNA 的结合，从而影响
了该基因的翻译过程。在鉴定野生型植株和LGC-1 时，野生型有B1、B2 基因，能被引物K、L、M、N
结合扩增；LGC-1 中B2 失去终止子，且B1 与B2 之间的片段缺失，只有引物K、L、N 能结合到相应部
位进行PCR 扩增，选用引物L、N 进行PCR，则野生型L 和N 均结合基因B1，无法扩增呈阴性；LGC-1
中L 和N 结合缺失的启动子区域，可扩增出片段呈阳性。因此，仅LGC-1 出现阳性结果的引物是L、N。
（2）由图2 可知，基因编辑载体和Ti 质粒都有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点，所以可选择限制酶BamH Ⅰ
和Hind Ⅲ，利用DNA 连接酶将酶切产物连接，形成重组Ti 质粒；再将重组Ti 质粒导入Ca²⁺（或CaCl₂
溶液）处理过的农杆菌，Ca²⁺处理农杆菌可以使其成为感受态细胞，易于吸收外源DNA；然后，利用含
重组Ti 质粒的农杆菌侵染野生型水稻愈伤组织，在含有潮霉素（或抗潮霉素基因对应的抗生素）的培养
基上筛选，因为重组Ti 质粒中含有抗潮霉素基因，导入重组Ti 质粒的农杆菌和转化后的水稻细胞具有抗
潮霉素的特性，可以在含潮霉素的培养基上生长，而未转化的则不能生长。
（3）已知在研发、鉴定低谷蛋白水稻时，使用的PCR 技术仅能扩增2kb 以内的片段，由图3 可知，经基
因编辑处理，要筛选出图3 所示类型的突变体，需要选用引物M、N 进行PCR，为了进一步鉴定该植株
是否具备目标性状（低谷蛋白），还需要测定水稻籽粒谷蛋白含量，并与野生型、LGC-1 相对比，如果
该植株谷蛋白含量低，则说明具备目标性状。
19．（2025·浙江·金华一模）土壤中的污染物RDX 具有高毒性和不易降解的特点。研究人员拟将细菌的
RDX 降解酶基因XplA 与XplB 整合为融合基因，导入柳枝稷草使其根细胞分泌RDX 降解酶，以修复污
染土壤。图1、2 为降解酶基因XplA、XplB 及农杆菌转化流程示意图。
回答下列问题：
(1)获取XplA 与XplB 基因。随着测序技术的发展，可通过检索______获取XplA 与XplB 的相关序列，然
后用_______法制备得到。
(2)通过融合PCR 获得XplB-XplA 融合基因。为使两基因能正确融合并表达，引物_____和_____的
_______端需包含部分互补序列。同时部分引物还应包含相应的限制酶识别序列。PCR 循环步骤中，
_______步骤的温度需根据引物的碱基组成（GC 含量）调整，引物长度一定时，GC 含量增加（合理范围
内），该步骤温度应______，其目的是______。
(3)图2 中，将融合基因插入Ti 质粒T-DNA 区后，可通过PCR 验证重组质粒是否构建成功，该过程中常
采用_________技术鉴定PCR 产物，再将重组质粒与经________处理的农杆菌混合以实现转化。在添加潮
霉素的LB 培养基中_______（填“能”或“不能”）直接筛选出导入融合基因的农杆菌。
(4)获得融合基因转化成功的目的农杆菌后，对其进行_______。再用农杆菌侵染经消毒的柳枝稷草外植体，
其Ti 质粒上的T-DNA 可将融合基因整合到柳枝稷草细胞的_____。若经组织培养获得了转基因柳枝稷草，
但其根细胞仍不能合成RDX 降解酶，从基因表达调控角度分析，可能的原因是____（结合载体具体元件
分析）。
【答案】(1) 基因数据库 化学合成
(2) 2 4 5' 退火 升高 提高引物与模板结合的特异性，减少引物与非目标序列
结合导致的非特异性扩增
(3) 琼脂糖凝胶电泳 CaCl2 不能
(4) 扩大培养 染色体DNA 柳枝稷草的根细胞中缺乏识别融合基因启动子的RNA 聚合酶
（该融合基因启动子在柳枝稷草根细胞中活性不足）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】（1）现代分子生物学中，目的基因的序列可通过基因数据库检索获得，若序列已知，可通过化
学合成法直接合成。
（2）构建融合基因需把基因XplA 的b 链的3'端与基因XplB 的a 链的5'端相连，理由是DNA 两条链反向
平行，基因XplA 和XplB 共用启动子和终止子，且转录时只能以模板链的3'→5'方向为模板进行转录，要
使融合基因能正常转录，需将基因XplA 的b 链的3'端与基因XplB 的a 链的5'端相连。利用PCR 拼接融
合基因时，需在引物2 和引物4 的5'端加入互补序列，这样在PCR 过程中，引物2 和引物4 扩增出的片段
就能通过互补序列连接形成融合基因。PCR 的复性（退火）步骤温度由引物GC 含量决定：GC 碱基对含
3 个氢键，稳定性更高，因此GC 含量增加时，复性温度需升高，以提高引物与模板结合的特异性，减少
引物与非目标序列结合导致的非特异性扩增。
（3）PCR 产物的鉴定常用琼脂糖凝胶电泳（根据片段大小判断是否扩增出目标融合基因）。农杆菌转化
需用CaCl2 处理，使其细胞膜通透性增加，成为感受态细胞。 潮霉素抗性基因是载体上的标记基因，导
入了重组质粒和空质粒的农杆菌均能在添加潮霉素的LB 培养基中生长，因此不能直接筛选出导入融合基
因的农杆菌。
（4）目的农杆菌需先扩大培养（至对数期），以保证侵染效率。农杆菌Ti 质粒的T-DNA 可将携带的融
合基因整合到受体细胞（柳枝稷草）的染色体DNA 上，实现稳定表达。 基因表达需启动子（驱动转
录）和终止子（终止转录）等关键元件：若柳枝稷草的根细胞中缺乏识别融合基因启动子的RNA 聚合酶
（该融合基因启动子在柳枝稷草根细胞中活性不足）则无法启动转录，最终导致根细胞不能合成RDX 降
解酶。
20．（2025·浙江·名校新高考一模）油用向日葵（以下简称为“油葵”），籽粒含油量较高，耐盐能力较
强。同时，油葵也是典型的喜光植物，对光环境的变化较敏感。为了给盐碱地光伏农业发展提供理论依
据，科研人员以油葵为试验对象，采用盐碱地大田遮光的方式，模拟盐碱地光伏系统环境，探究遮荫对
油葵生长和生理特性的影响，部分实验数据如下表所示。
指标
CK
S30
S60
S90
株高（cm）
90
96
95
78
茎粗（mm）
30
27
22
12
叶绿素a 含量（mg·g⁻¹）
0.93
1.8
2
1.2
羧化酶活性（nmol·min⁻¹·mg⁻¹）
4.5
6.2
10.1
12.2
注：CK 为无遮荫处理，S30、S60、S90 分别为30%、60%、90%遮荫处理；羧化酶是CO₂ 固定过程中的
关键酶
请回答下列问题：
(1)油葵成熟期，叶片光合作用产生的有机物以____________________（物质）形式运输至籽粒并转化为
脂肪，使其含量大幅上升，该物质与脂肪从元素组成角度分析差异是___________。油葵种子在萌发过程
中，有机物种类___________（填“增加”或“减少”）。为促进油葵种子萌发和生长，可以施用
___________。（选填编号）
①生长素②细胞分裂素③赤霉素④乙烯⑤脱落酸
(2)太阳光中的可见光由不同颜色的光组成，其中油葵光合作用利用的光主要是___________。据表可知，
遮荫___________（填“促进”或“抑制”）油葵叶片中叶绿素a 的积累，这对植物适应环境的意义是
___________。
(3)据表分析，___________组的油葵株高较对照组高，但各遮荫处理均抑制了油葵茎粗生长，且茎粗与光
照强度的大小呈___________。
(4)实验结果显示，遮荫胁迫增强了油葵的羧化酶活性，有利于CO₂ 固定，从而加快卡尔文循环中的
___________过程，以形成更多的光合产物，这是油葵减弱环境胁迫对光合作用___________的一种调节
机制。
(5)盐碱地的油葵很容易受到棉铃虫侵袭，为快速获得抗虫油葵新品种并实现大规模种植，选择的现代生
物技术方法是___________。
【答案】(1) 蔗糖 H 的比例低，O 的比例高 增加 ①②③
(2) 红光和蓝紫光 促进 遮荫后光照强度减弱，植物通过增加叶绿素a（光合色素）的含量
可增强对光能的吸收和利用，从而保障一定的光合作用效率
(3) 30%、60%遮荫组（S30 和S60 组） 正相关
(4) 三碳酸的还原 抑制
(5)基因工程和植物组织培养/植物体细胞杂交技术
【分析】光合作用过程分为光反应阶段和暗反应阶段，光反应阶段是水光解形成氧气和还原氢的过程，
该过程中光能转变成活跃的化学能储存在ATP 中；暗反应阶段包括二氧化碳的固定和三碳化合物的还原，
二氧化碳固定是二氧化碳与1 分子五碳化合物结合形成2 分子三碳化合物的过程，三碳化合物还原是三碳
化合物在光反应产生的还原氢和ATP 的作用下形成有机物和五碳化合物的过程。影响光合作用的环境因
素包括：光照强度、温度、二氧化碳浓度、含水量以及矿质元素的含量等。
【详解】（1）植物光合作用产生的有机物主要以蔗糖形式运输，因其是植物体内安全高效的碳源运输载
体，可转运至籽粒转化为脂肪。蔗糖相比脂肪，H 的比例低，O 的比例高。种子萌发时，储存的大分子有
机物分解为小分子，同时合成新的有机物，故有机物种类增加。激素选择：①生长素促进细胞伸长，②
细胞分裂素促进细胞分裂，③赤霉素打破休眠、促进萌发和生长；④乙烯促进成熟，⑤脱落酸抑制萌发，
故选①②③。
（2）叶绿体中的叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，类胡萝卜素辅助吸收蓝紫光，故油葵光合作用利用的光
主要是红光和蓝紫光。据表可知，S30、S60 组叶绿素a 含量（1.8、2mg・g⁻¹）均高于CK 组（0.93mg・
g⁻¹），故遮荫促进叶绿素a 积累。适应意义：遮荫下光照减弱，叶绿素a 增加可增强光能吸收和转化能力，
弥补光照不足的影响，保障光合作用效率。
（3）株高对比：CK 组株高90cm，S30（96cm）、S60（95cm）组高于对照组，S90（78cm）组低于对照
组，故答案为30%、60% 遮荫组（S30 和S60 组）。茎粗与光照的关系：光照强度CK＞S30＞S60＞
S90，茎粗30＞27＞22＞12，呈正相关。
（4）卡尔文循环中，羧化酶催化CO2 固定形成三碳酸，后续三碳酸的还原需光反应提供的ATP 和
NADPH，羧化酶活性增强有利于该过程推进，形成更多光合产物。遮荫属于环境胁迫，会抑制光合作用，
油葵通过增强羧化酶活性减弱这种抑制作用，是自身的调节机制。
（5）快速获得抗虫新品种：通过基因工程将抗虫基因导入油葵细胞，获得转基因抗虫植株；再通过植物
组织培养快速繁殖，实现大规模种植。植物体细胞杂交可融合不同物种细胞，若有抗虫相关细胞，也可
作为技术选择。
21．（2025·浙江·稽阳联谊一模）H2O2是植物代谢的产物，其含量与植物的抗病性呈正相关，但过量积累
会损伤细胞结构；ROD1 蛋白可抑制植物的免疫功能，CaLB 是降解H2O2的酶，研究证实ROD1 蛋白能通
过与CaLB 结合加强CaLB 的作用。其中（CaLB 单独不能发挥作用）。已知光敏蛋白P 能被红光激活，
激活后可以与蛋白F 结合：远红光下失活，失活后与F 蛋白分开。为实现对植物体内H2O2含量的调控提
供一种新方向，研究人员利用RODI 蛋白缺陷型的植株开展了如下研究：
(1)获取目的基因：研究人员检索_____，获取CaLB、ROD1、P 和F 蛋白基因的序列信息，设计引物进行
PCR：在PCR 反应前，利用_____将PCR 体系各成分加在微量离心管中后离心，离心的目的是_____：若
PCR 体系中加入10×PCR 扩增缓冲液5uL，则PCR 反应体系总体积为_____，除去PCR 反应体系中所加的
必须成分的体积外，不足的部分用_____补足。
(2)构建融合基因：将PCR 获得的光敏蛋白P 基因与ROD1 蛋白基因构建融合基因，记为P-ROD1 融合基
因。融合基因构建的方法如图：在引物P2 和P3 的5'端添加_____，分别进行PCR1 和PCR2，再将所得产
物混合，获得末端互补的杂交链，延伸后获得融合基因，然后用引物_______扩增融合基因。用相同的方
法再构建_____融合基因。
(3)构建表达载体：下图a 为载体的部分结构，b 所示序列为P-ROD1 融合基因的_____（填“模板链”或
“编码链”）。为使P-ROD1 融合基因正确接入载体并成功表达出P-ROD1 融合蛋白，在扩增P-ROD1 融
合基因的引物的5'端添加相关限制酶识别序列，其中P-ROD1 融合基因上游引物序列应为5'______3'（包
括添加的限制酶识别序列，共写9 个碱基）。c 为相关限制酶识别序列，这些限制酶识别序列不影响融合
蛋白基因的表达。
b：P-ROD1 融合基因部分序列：5'ATGCTGCACACCTGC…………CAACAGAACATTAG³'
c：EcoRI 识别序列为5'-GAATTC-3，BamHI 识别序列为5-GGATCC-3'
注：LB/RB 为T-DNA 边界序列；Hygr：潮霉素抗性基因；Ampr：氨苄青霉素抗性基因AUG 为起始密码
子；UAA、UGA 和UAG 为终止密码子
(4)转化植物细胞：将上述构建成功的两种表达载体与感受态农杆菌在低温条件下共培养一段时间，目的
是_______；再对农杆菌进行短暂的_____处理完成转化。将转化成功的农杆菌与植物细胞共培养，一段
时间后往培养基中加入_______筛选得到转化成功的植物细胞。
(5)植物体内H2O2含量的检测：分别用远红光和红光照射后检测植物体内H2O2含量，发现用远红光照射后
的H2O2含量比红光照射后的含量_____（填“高”或“低”）。通过此方法对H2O2含量进行调控，以应
对植物在不同条件下的生存。
【答案】(1) 基因数据库/生物信息数据库/序列数据库 微量移液器/移液枪 使反应液集中于
试管底部，充分混合 50uL 无菌水
(2) 一段互补序列 P1 和P4 F-CaLB
(3) 编码链 GAATTCATG
(4) 使表达载体黏附在农杆菌的表面 热刺激/热击 潮霉素
(5)高
【分析】PCR 是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C 左右）时引物与单
链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度（72°C 左右），DNA 聚合酶沿着
磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，
复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】（1）要获得基因序列的相关信息，可通过检索基因数据库；在配制PCR 反应体系的时候，用微
量移液器将各成分加入微量离心管中，然后进行离心，使各成分集中于试管底部，充分混合；如果用
10×PCR 扩增缓冲液5uL，则要稀释10 倍，所以PCR 反应体系的总体积为50uL，不足部分用无菌水补足。
（2）利用PCR 技术构建融合基因的关键就是在两个基因的连接部位加上一段互补序列，所以在引物的
5'端添加一段互补序列即可；引物P1 和P2 获得的P 基因和用引物P3 和P4 获得的ROD1 基因末端互补，
所以将产物混合就可以获得末端互补的杂交链，延伸之后就获得融合基因，然后用引物P1 和P4 扩增融
合基因；用相同的方法再构建F-CatB 融合基因。
（3）编码链的序列与mRNA 的序列一致，把编码链中的T 改成U 即可；根据密码子可知图示的链为编
码链；上游引物为靠近启动子的引物，根据载体结构可知，在上游引物上应添加EcoRI 的识别序列；上
游引物与模板链相应部位互补，与编码链的相应部位相同即加上编码链5'端的3 个碱基序列即可。
（4）构建好表达载体后，将其与农杆菌在低温条件下共培养一段时间，目的是为了让表达载体黏附在农
杆菌的表面，最后用短暂的热刺激农杆菌才能最终完成转化；筛选转化成功的植物细胞应选用T-DNA 内
部的标记基因，所以选择潮霉素抗性基因进行筛选。
（5）根据题干信息，光敏蛋白P 可以感受红光和远红光，在有活性的时候可以与F 蛋白结合，在无活性
的时候与F 蛋白分开；H2O2 含量与植物的抗病性呈正相关；CatB 是降解H2O2 的酶，ROD1 蛋白可抑制
植物的免疫功能，ROD1 蛋白通过与CatB 结合发挥作用。推得ROD1 蛋白通过与CatB 结合导致H2O2 被
降解导致植物免疫功能降低；所以红光照射下P 与F 结合导致ROD1 蛋白与CatB 结合导致H2O2 被降解，
所以H2O2 含量下降。
22．（2025·浙江宁波·一模）玉米作为重要的粮食和饲料作物，在转基因育种中提高其转化效率不仅能降
低成本，还能加速新品种的培育进程，更好地满足农业生产的需求。已有研究发现，提高WUS、BBM、
GRF、GF 等发育调节因子的表达量可有效提高单子叶植物的转化效率。回答下列问题：
(1)GRF 蛋白是一类调控植物生长发育的关键转录因子，GIF 蛋白是其辅助因子。通常将GRF 基因与GIF
基因组成融合基因，制备过程如图1。为使扩增出的GRF 和GIF 基因片段在混合后通过引物部分延伸融
合，引物_____和引物_____的碱基序列必须有_____（填“相同”或“互补”）片段。
(2)科研人员欲利用上述四种发育调节因子的基因加速玉米的遗传改良，构建了图2 所示的三种载体。其
中DsRed 和NPTⅡ作为_____用于筛选转化成功的受体细胞，每个插入单位均需含有_____。
(3)将三种载体分别导入玉米胚中。将构建的重组Ti 质粒导入经过_____处理的农杆菌后，稀释得到一定
浓度的农杆菌液。双子叶植物伤口处的细胞会分泌酚类化合物吸引农杆菌，但农杆菌一般难以感染单子
叶植物。为了提高转化成功率，将玉米萌发种子的胚芽尖端割伤，在伤口处施加_____，然后放入_____
中浸泡。
(4)将各组玉米胚插入诱导愈伤组织的培养基中，该过程需在______操作完成，以减少空气中微生物的污
染。培养一段时间后，将愈伤组织转接到生长素用量与细胞分裂素用量比值_____的培养基上，诱导愈伤
组织生芽。不同阶段的实验数据如下表所示，由表可知，发育调节因子能大幅度提高转基因玉米的_____。
组别
载体
胚
（个）
愈伤组
织
（个）
存活率
（%）
带芽的
愈伤组
织
（个）
再生率
（%）
转化效
率
（%）
1
对照载体
121
56
46.28
8
14.29
6.61
2
WUS+BBM
98
55
56.12
21
38.18
21.43
3
GRF-GIF
96
46
47.92
25
54.35
26.04
【答案】(1) B C 互补
(2) 标记基因 启动子、终止子
(3) CaCl2/Ca2+ 酚类化合物 农杆菌液
(4) 超净工作台上的酒精灯火焰旁 小于1 再生率和转化效率
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：
（1）目的基因的获取；
（2）基因表达载体的构建（核心）；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）为使扩增出的GRF 和GIF 基因片段在混合后通过引物部分延伸融合，根据引物设计原理，
引物需要与模板链的3'端结合，子链沿着5'→3'的方向延伸，结合图1 中混合链的组成可知，需要DNA 单
链B 和DNA 单链C 混合，所以选择引物B 和引物C，引物B 和引物C 的碱基序列必须有互补片段，这样
才能在混合后通过引物部分延伸实现融合。
（2）据题干信息“DsRed 是红色荧光基因，NPTⅡ是新霉素抗性基因”可知，DsRed 和NPTⅡ作为标记
基因用于筛选转化成功的受体细胞；插入单位需要包含启动子、目的基因（如WUS、BBM、GRF-GIF
等）和终止子，启动子是RNA 聚合酶结合位点，启动转录，终止子终止转录，以确保基因在受体细胞中
的正确表达。
（3）将构建的重组Ti 质粒导入农杆菌时，需经过CaCl2 或Ca2+处理，使农杆菌处于感受态，便于吸收
重组质粒。由于农杆菌一般难以感染单子叶植物，而双子叶植物伤口处细胞分泌酚类化合物吸引农杆菌，
所以将玉米萌发种子的胚芽尖端割伤，在伤口处施加酚类化合物，然后放入农杆菌液中浸泡，利用农杆
菌将目的基因导入玉米胚细胞。
（4）将各组玉米胚插入诱导愈伤组织的培养基中，为减少空气中微生物污染，该过程需在超净工作台上
的酒精灯火焰旁操作完成。植物组织培养中，生长素用量与细胞分裂素用量比值小于1 时，有利于诱导
愈伤组织生芽。分析表格数据，与对照载体组相比，使用发育调节因子的组（WUS+BBM 组、GRF-GIF
组）再生率和转化效率均大幅提高，所以发育调节因子能大幅度提高转基因玉米的再生率和转化效率。
1．（2025·浙江·北斗星联盟一模）一场围绕“生物技术应用的伦理与风险”的中学辩论赛中，提出了以
下观点，请你从专业角度判断哪一项说法是错误的（ ）
A．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
B．种植转基因植物可能因遗传漂变而影响野生植物的遗传多样性
C．生物武器的扩散可能引发大规模疫情，故战争中患病士兵的衣物等需及时焚烧
D．治疗性克隆对解决供体器官缺乏和器官移植后的免疫排斥反应具有重要意义
【答案】B
【详解】A、设计试管婴儿存在技术滥用风险（如筛选特定性状），该观点符合伦理争议的客观事实，A
正确；
B、“遗传漂变”指小种群中基因频率随机变化的现象，而转基因植物对野生植物的影响主要通过“基因
污染”（即外源基因通过杂交扩散），与遗传漂变无直接关联，B 错误；
C、生物武器病原体具有强传染性，焚烧污染物可阻断传播途径，符合生物安全防控原则，C 正确；
D、治疗性克隆通过体细胞核移植获得胚胎干细胞，可培育自体组织器官，有效解决供体短缺和免疫排斥
问题，D 正确。
故选B。
2．（2025·浙江嘉兴·一模）下列关于生物武器的叙述，正确的是（ ）
A．它是利用致病微生物达到战争目的的武器
B．我国坚决支持禁止生物武器的生产和扩散
C．分子杂交技术不能用于排查生物战剂
D．制备疫苗是防御生物武器的唯一手段
【答案】B
【详解】A、生物武器是利用细菌、病毒等致病微生物或毒素作为生物战剂，以达到战争目的的武器，并
非仅仅是致病微生物，A 错误；
B、我国是《禁止生物武器公约》缔约国，支持禁止其生产和扩散，B 正确；
C、分子杂交技术（如DNA 探针杂交）可用于检测特定病原体的核酸序列，因此能用于排查生物战剂，C
考点2
生物技术的安全与伦理
错误；
D、防御生物武器的手段包括接种疫苗、使用防护服、消毒灭菌、隔离检疫等，疫苗只是其中一种免疫预
防方式，并非唯一手段，D 错误。
故选B。
3．（2025·浙江·稽阳联谊一模）随着CRISPR 等基因编辑技术的成熟，“生殖系基因编辑”已成为可能，
该技术能够直接修改人类精子、卵子或早期胚胎的DNA。这项技术最令人担忧的伦理问题是（ ）
A．技术不成熟，有遗传风险
B．通过编辑基因来“设计生命”
C．价格昂贵，会占用医保资金
D．可能加剧社会不平等
【答案】B
【详解】A、“技术不成熟，有遗传风险”属于技术层面的风险，如脱靶效应可能导致基因异常，但题干
强调“伦理问题”，A 错误；
B、“设计生命”直接涉及人为干预人类基因的伦理争议，如违背自然规律、生命尊严及优生学隐患，属
于核心伦理问题，B 正确；
C、“价格昂贵”属于经济问题，虽可能引发资源分配争议，但非伦理层面的核心担忧，C 错误；
D、“加剧社会不平等”是技术应用后的潜在社会影响，属于伦理问题的衍生后果，但题干要求“最令人
担忧”的伦理问题，D 错误。
故选B。
4．（25-26 高三上·浙江丽水·一模）关于生物技术的安全性及伦理问题，下列叙述错误的是（ ）
A．生物武器最恐怖的特点是具有传染性
B．我国主张全面禁止和彻底销毁生物武器
C．皮肤细胞克隆可用于皮肤大面积烧伤的治疗
D．转基因作物进入自然生态系统有利于增加生物多样性
【答案】D
【详解】A、生物武器最恐怖的特点是具有传染性，A 正确；
B、我国主张全面禁止和彻底销毁生物武器，B 正确；
C、皮肤细胞克隆可用于皮肤大面积烧伤的治疗，C 正确；
D、转基因作物进入自然生态系统可能会破坏当地的生态平衡，不利于增加生物多样性，D 错误。
故选D。
5．（25-26 高三上·浙江·强基联盟一模）生物安全是国家安全体系的组成部分，下列选项中会给我国带来
生物安全风险的是（ ）
A．收集我国公民及生物资源的遗传信息
B．通过基因筛查阻断试管婴儿遗传病的发生
C．严格监管高风险实验室，避免病原微生物泄露
D．及时防控人类及动植物中可能爆发的重大疫病
【答案】A
【详解】A、收集遗传信息可能涉及基因资源泄露或滥用，若被恶意利用可能威胁国家生物安全，A 符合
题意；
B、基因筛查用于预防遗传病，属于医学进步，不构成生物安全风险，B 不符合题意；
C、严格监管实验室可防止病原体泄露，属于生物安全保护措施，C 不符合题意；
D、防控重大疫病是维护生物安全的必要手段，D 不符合题意。
故选A。
