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限时练26 基因表达载体的构建及基因工程的技术应用
(选择题每小题3 分)
一、选择题
1.(2025·福建漳州模拟)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记
基因构建的质粒如图1 所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质
粒,构建基因表达载体,并转化到受体菌中。利用影印法(用无菌绒布轻盖在已长好菌落
的原培养基上,然后不转动任何角度,“复印”至新的培养基上)筛选菌株,过程如图2 所示。
下列叙述正确的是( )
图1
图2
A.为防止目的基因与质粒的反向连接,可用Hind Ⅲ和Sca Ⅰ酶切
B.将质粒用Sca Ⅰ酶切后,所得产物经琼脂糖凝胶电泳可出现3 个条带
C.目的基因插入TetR中,筛选时A 培养基含四环素,B 培养基含氨苄青霉素
D.利用影印法筛选时,能在B 培养基中生长的是转化成功的菌落
2.(2025·江西模拟)受到外源DNA 入侵时,细菌能将外源DNA 中特异性序列整合到
CRISPR 基因上。当再受到同样外源DNA 入侵时,细菌可从CRISPR 基因上提取特异性
片段,转录出sgRNA;Cas 基因则表达产生Cas 酶,对外源DNA 进行分解,两者共同作用完
成对细菌自身的保护,过程如图所示。下列说法错误的是( )
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A.细菌将外源DNA 整合到CRISPR 基因上属于基因重组
B.sgRNA 能对外源DNA 进行定位且序列越短定位越准确
C.Cas 酶能切割磷酸二酯键催化外源DNA 分解
D.通过设计sgRNA 可对动物细胞实现特定基因的定位
二、非选择题
3.(11 分)(2025·四川卷)杆菌M2 合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉
索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA 进入核糖体位点2。有人将合
成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如
下图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3 和F4 为与相应位置的DNA 配对的单链引物,“→”指引物5'-3'方向。
②密码子对应的氨基酸为AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA
—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
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(1)用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时,应选用 引物。
本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是
。
(2)采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应
产生 条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带 (填氨基酸名称)的tRNA 进
入结合位点,导致
,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取
的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是
。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有
(答出1 点即可)。
4.(11 分)(2025·黑吉辽蒙卷)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。
通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询基因N 的编码序列,设计特定引物。如图1 所示,a 链为转录
模板链,为保证基因N 与质粒pYL 正确连接,需在引物1 和引物2 的5'端分别引入
和 限制酶识别序列。PCR 扩增基因N,特异性酶切后,利用 连接
DNA 片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb 为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒
pYL 对应部分大小基本不变。
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图1
注:M 为指示分子大小的标准参照物,1~4 为菌株号。
图2
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4 号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1 和引物2 进行
PCR 扩增,电泳PCR 产物,结果如图2。在第5 组的PCR 反应中,使用无菌水代替实验组
的模板DNA,目的是检验PCR 反应中是否有 的污染。初步判断实验组
(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是
。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序
列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA 等。a 是诱变第240 位脯氨酸
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编码序列的引物(GCA 为诱变序列),b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙氨酸的引物,
其配对模板与a 的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA 外,还有 。
a:5'…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…3'
b:5'…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…3'
c:5'…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…3'
d:5'…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较,可以选出最优的
香树脂醇合酶基因的改造方案。
5.(11 分)(2025·广东卷)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和
生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键
酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的
红色荧光蛋白mKate2 为模式蛋白,测试质粒功能。回答下列问题。
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA 短肽的mKate2,将质
粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状
况,结合PCR 及 检测,筛选获得重组菌株W1。
图a
(2)将W1 在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有
(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是
。培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是
。
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图b
(3)研究者选用启动子PX、X 基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒
②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2 的生长
趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为
。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞
内酶A 活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽
草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质
粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路:
。
碳源→前体
……
莽草酸
……
细胞生长必需物
图c
6.(11 分)(2025·河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为
具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种
用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题。
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是
。将培养后的菌液混匀并充分 ,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG 活
性最高的菌种。
(2)为构建携带cg(CG 的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg 的PCR 扩增产物和
质粒进行双酶切,随后用E.coli DNA 连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg 转录模
板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和
T4 DNA 连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各
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自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是
。
限制酶的识别序列和切割位点如下:
图1
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是
,随后在含 和 的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明
圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高
CG 的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明
该位点对酶的功能越关键),如图2 所示。根据分析结果,选择第 位的氨基酸替
换成半胱氨酸最合适,原因是
。
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图2
7.(12 分)(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造,利用
农杆菌转化法将Ti 质粒上的T-DNA 随机整合到小麦基因组中,筛选到2 个种子休眠相
关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组
序列信息已知。
注:LB/RB 为T-DNA 的边界序列;Kanr为卡那霉素抗性基因;bp 为碱基对。
甲 Ti 质粒与抗除草剂基因信息
(1)Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的
Sma Ⅰ对抗除草剂基因X 进行完全酶切,再选择Sma Ⅰ和 对Ti 质粒进行完
全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是 。利用DNA 连接酶
将酶切后的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接,构建重组载
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体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切
并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2 条带,较短的条带长度近似为 bp,则一
定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA 插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组
DNA,经酶切后产生含有T-DNA 的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR
难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为 (填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制
酶,且T-DNA 中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ,才能利
用引物P1 和P2 成功扩增未知序列。PCR 扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可
以判断出2 条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为
(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
注:P1、P2 表示引物。
乙 基因组DNA 酶切后含T-DNA 的片段
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野
生型基因, (填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
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参考答案
1.B 解析 若用Hind Ⅲ和Sca Ⅰ酶切质粒,由于质粒中有两个Sca Ⅰ的酶切位点,因而不
一定能防止目的基因与质粒的反向连接,A 项错误。由于图示质粒中有两个Sca Ⅰ的酶
切位点,所以用Sca Ⅰ酶切质粒,能得到三种DNA 片段,即完整的片段和两个短片段,所得
产物经凝胶电泳可形成3 个条带,B 项正确。目的基因插入TetR中,则含有重组质粒的细
菌对四环素不具有抗性,对氨苄青霉素有抗性,所以A 培养基含有氨苄青霉素,B 培养基
含有四环素,C 项错误。转化成功的菌落对氨苄青霉素有抗性,对四环素没有抗性,所以
能够在A 培养基中生长,不能在B 培养基中生长的菌落是转化成功的菌落,D 项错误。
2.B 解析 细菌将外源DNA 整合到CRISPR 基因上属于基因重组,A 项正确。sgRNA 通
过与外源DNA 分子一条单链互补配对引导Cas 酶到特定基因位点进行切割,序列越短,
定位越容易发生脱靶现象,越不准确,B 项错误。Cas 酶切割特定基因位点,相当于限制酶
作用于脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键,催化外源DNA 分解,C 项正确。sgRNA 可以
与外源DNA 分子一条单链进行碱基互补配对,通过设计sgRNA 可对动物细胞实现特定
基因的定位,D 项正确。
3.答案 (1)F2、F4 保证目的基因能在链霉菌细胞中复制
(2)2 检测重组质粒是否构建成功
(3)苯丙氨酸 翻译过程无法正常进行,细菌无法合成蛋白质
(4)目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等合理答案) 发酵的最佳条件(或提高
发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等合理答案)
解析 (1)引物需要结合到模板的3'端,且与目的基因的部分碱基序列互补配对,子链延伸
方向为5'端→3'端,因此用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时,应选
用F2、F4 引物。载体使用链霉菌的复制原点,是为了保证目的基因能在链霉菌细胞中
复制,使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。
(2)采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ完全酶切构建的重组质粒,会得到载体片段和目的基因片段,
产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生2 条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测
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重组质粒是否构建成功,若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带,说明酶切
成功,重组质粒构建可能成功。但是还需要进一步的鉴定。
(3)观察拉索西丁的作用机制图,结合所给密码子信息,可知拉索西丁与核糖体结合后,会
阻止携带苯丙氨酸的tRNA 进入结合位点。因为位点2 对应的密码子是UUC,编码苯丙
氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA 进入结合位点,会导致翻译过程无法正常进
行,进而使细菌无法合成蛋白质,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是
目的基因发生突变,导致其表达的产物结构改变,从而失去杀菌活性;也可能是目的基因
的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一
步研究的问题有:发酵的最佳条件,如温度、pH、溶氧量等;如何提高发酵产物的产量;产
物的分离和纯化方法等。
4.答案 (1)序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶
(2)其他模板 1 实验组1 的电泳条带大小与基因N 的大小接近
(3)GCC
(4)香树脂醇
解析 (1)可从序列数据库中查询基因N 的编码序列,设计特定引物。如图1 所示,a 链为
转录模板链,所以右端为启动子端,为保证基因N 与质粒pYL 正确连接,右端要与质粒
pYL 中用限制酶Spe Ⅰ切出的末端(5'-A
3'-TGATC)相连,而限制酶Spe Ⅰ会将基因N 切断,所以引物2 的5'端应引入限制酶
Xba Ⅰ的识别序列,以便切出与Spe Ⅰ相同的末端进行连接;引物1 的5'端则引入限制酶
Xho Ⅰ的识别序列。PCR 扩增基因N,特异性酶切后,利用DNA 连接酶连接DNA 片段。
(2)在第5 组的PCR 反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR 反应中
是否有其他模板的污染。初步判断实验组1 的质粒中成功插入了基因N,理由是重组质
粒的大小约9.5 kb,质粒pYL 的大小约7.2 kb,所以基因N 的大小约为2.3 kb,使用引物1
和引物2 进行PCR 扩增的是基因N,实验组1 的电泳条带大小约为2.3 kb,与基因N 的大
小接近。
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(3)a 是诱变第240 位脯氨酸编码序列的引物(GCA 为诱变序列),据图可知,a 的5'端显示
的前三个碱基GCA 即为第240 位脯氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子序列;又因为
b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a 的配对模板相同,据
图可知,只有c 的序列与a 的序列(244 位~250 位)相同,故c 链为诱变第243 位苯丙氨酸的
引物,5'端显示的前三个碱基为第243 位苯丙氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子序列
GCC。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA 外,还有GCC。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较,可以选出最优的香树
脂醇合酶基因的改造方案。
5.答案 (1)荧光(或mKate2 蛋白)
(2)显微镜直接计数法 排除培养液本身的荧光强度对实验结果的干扰,保证实验结果的
准确性 PGro在生长稳定期停止基因转录,且C-末端带有SsrA 短肽的mKate2 被大肠杆
菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解
(3)快速生长期荧光强度弱,生长稳定期荧光强度迅速上升
(4)用酶A 基因替换质粒②中mKate2 基因,用酶B 基因替换质粒①中mKate2 基因,构建
酶B 基因缺失的大肠杆菌突变菌株,并导入上述质粒
解析 (1)在基因工程中,结合PCR 技术扩增目的基因片段,可检测目的基因是否成功导入,
依据荧光(mKate2 蛋白)检测筛选出含有目的基因的重组菌株W1。
(2)检测培养液中细胞密度时,由于大肠杆菌细胞是肉眼无法直接观察到的,因此常用的
方法有显微镜直接计数法,显微镜直接计数法可通过细菌计数板在显微镜下直接数出细
胞数量。接种前需要检测液体培养基的荧光强度,其目的是排除培养液本身的荧光强度
对实验结果的干扰。根据图a 中的注释可知,PGro在生长稳定期停止基因转录,且C-末端
带有SsrA 短肽的mKate2 可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解,由于红色荧
光蛋白mKate2 减少,因此进入生长稳定期后荧光强度快速下降。
(3)图a 中的质粒②,由于启动子PGro在细胞快速生长期开启转录,会使X 基因编码的阻遏
蛋白X 阻遏PX开启转录,致使mKate2 荧光蛋白表达受阻,同时X 上带有SsrA 短肽,又会
被大肠杆菌不断降解,因此快速生长期荧光强度弱;而到了生长稳定期PGro停止基因转录,
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阻遏蛋白X 又被不断降解而含量下降,PX开始大量转录,荧光蛋白不断积累,荧光强度不
断上升。
(4)根据(2)(3)知,用酶A 基因替换质粒②中mKate2 基因,使其在生长稳定期能持续合成
酶A,从而促进莽草酸的合成,用酶B 基因替换质粒①中mKate2 基因,构建酶B 基因缺失
的大肠杆菌突变菌株,并导入上述质粒,使其在生长稳定期时酶B 合成大量减少,从而实
现莽草酸的大量积累。因此,为保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积
累,重组生产菌株构建思路见答案。
6.答案 (1)在富含卡拉胶的环境中,存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
(2)BamH Ⅰ 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
(3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 卡拉胶 四环素
(4)44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后
对酶功能的影响较小
解析 (1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用
前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中,存在能够分解卡拉胶的微生物的可能
性较大,因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充
分稀释,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG 活性最高的菌种。
(2)E.coli DNA 连接酶连接具有平末端的DNA 片段的效率要远远低于T4 DNA 连接酶,
因此为保证连接准确性和效率,切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶,即
不能选择EcoRⅤ和Sma Ⅰ。而Spe Ⅰ与Xba Ⅰ切割后形成的黏性末端相同,若选择
Spe Ⅰ与Xba Ⅰ切割,会出现质粒和目的基因的自连甚至目的基因倒接,因此切割质粒时
Spe Ⅰ与Xba Ⅰ中只能选择一个,而另一个限制酶需要选择BamH Ⅰ。又由于转录的方
向是由启动子→终止子,且mRNA 形成的方向是5'→3',且mRNA 与DNA 的模板链方向
相反,因此基因模板链的3'端应靠近启动子,故为保证连接准确性和效率,cg 转录模板链
的5'端最好含有BamH Ⅰ酶切位点。由于限制酶的识别序列具有专一性,若连接后的序
列不存在最初限制酶的识别序列,则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双
酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA 连接酶
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重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体
的双酶切组合进行切割,其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是使细胞
处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态,便于重组DNA 进入受体细胞。由于
具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶,使其菌落周围形成透明圈,且重组质粒上
含有四环素抗性基因,因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养
基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)据图可知,虚线长度代表氨基酸间的空间距离,由于第44 位点的氨基酸空间上离半胱
氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小,因此选择第44 位
的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
7.答案 (1)复制原点 Xba Ⅰ DNA 聚合酶 Spe Ⅰ、Sma Ⅰ 550
(2)4 连接成环(或环化) 测序和序列比对
(3)不能
解析 (1)与复制有关的结构是复制原点。根据后面的信息“用限制酶切后补平”,即在
DNA 聚合酶的作用下游离的脱氧核苷酸连到脱氧核苷酸链的3'端,故需要用Xba Ⅰ对质
粒进行切割,而不能用Pst Ⅰ;提取质粒,切割后得到两条条带,需要两个切点,题干中给出
长度的只有目的基因,故需要选择Spe Ⅰ和Sma Ⅰ两种限制酶进行切割,切割后会出现两
种长度的片段,短的长度大约为550 bp,说明基因前端被补平,大肠杆菌中导入了正向重
组质粒。
(2)限制酶识别序列越短,在识别序列出现的概率越高,切割得到的序列越短,根据题意选
用识别序列为4 个碱基对的限制酶。目的是通过PCR 扩增出图乙中的未知序列,两种引
物延伸方向相反,故需要把图乙中序列环化,或者首尾连接,再进行PCR。通过琼脂糖凝
胶电泳仅能判断DNA 片段长度,要判断是否为同一个基因需要进行测序或序列比对。
(3)野生型基因导入突变植株后无法确定其能否正常表达,故检测到野生型基因无法确定
植株的表型。
