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第51 讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
考点一 重组DNA 技术的基本工具
1.基因工程的概念
2.基因工程的工具
(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
①将一个基因从DNA 分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平
末端。
②限制酶不切割自身DNA 的原因是原核生物DNA 分子中不存在该酶的识别序
列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA 连接酶——“分子缝合针”
①DNA 连接酶连接的是两个DNA 片段，而DNA 聚合酶是把单个的脱氧核苷酸
连接到已有的核酸片段上。
②DNA 聚合酶起作用时需要以一条DNA 链为模板，而DNA 连接酶不需要模板。
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
[创新拓展] 基因工程中限制酶的选择、标记基因与重组表达载体的筛选
1.限制酶的选择原则
(1)根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。
②不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选
择Sma Ⅰ。
③善用“双酶切”，注意方向性。“双酶切法”可防止载体和目的基因环化，避
免目的基因与载体反向连接。目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA 聚
合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、
乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
④巧用“同尾酶”。同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不
适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
提醒 同尾酶要慎用，多数同尾酶虽然切割形成的黏性末端对应序列相同，但黏
性末端两侧的识别序列并不相同，连接后的序列无法再被识别和酶切，除非使用
仅识别黏性末端序列的限制酶进行切割，如下图所示。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
提醒 保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则。如图乙中不选择Sma
Ⅰ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切
破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出
现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无
效筛选)。
(3)根据Ti 质粒的T－DNA 片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti 质粒均不宜选取，而丙Ti 质粒宜选取(切割目的基因的限制酶
为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：
[例1] 利用图1 中目的基因和图2 中P1 噬菌体载体构建图3 中的重组DNA，限
制酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT) 、EcoRⅠ(G↓AATTC) 和
Sau3AⅠ(↓GATC)。请回答问题。
(1)用BglⅡ和Sau3AⅠ分别切割目的基因和P1 噬菌体载体，这两种限制酶的识
别序列和切割位点均不相同，但切出的DNA 片段的特点是
__________________________________________________________________。
(2)只用EcoRⅠ切割目的基因和P1 噬菌体载体，在构建表达载体时，可能出现
的问题是什么？______________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)只有用 和 切割目的基因和P1 噬菌体载体，
构建的重组DNA 中RNA 聚合酶在插入目的基因上的移动方向，才会与图3 一致。
答案 (1)具有相同的末端序列 (2)出现正向连接、反向连接、目的基因自身环
化、P1 噬菌体载体环化等多种连接方式 (3)EcoRⅠ Sau3AⅠ
2.标记基因与重组表达载体的筛选
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插
入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因
插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)细菌有三种：未转化的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组
质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5 菌落，再利用灭菌的绒布影
印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养
基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5 菌落。最后，可在含氨苄青
霉素的培养基上挑取1、5 菌落进行培养。
[例2] 幽门螺杆菌(Hp)的Ipp20 基因编码其特有的蛋白质，研究者欲利用基因工
程制备Hp 疫苗。3 种常见的限制酶识别序列如图1 所示，该实验所用的质粒结
构如图2 所示，基本操作流程如图3 所示。
(1) 该基因工程中，构建基因表达载体时选用的限制酶是
__________________________________________________________________。
(2)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，实验可以采用影印法：用无菌毡布压在
培养基A 的菌落上，带出菌种，平移并压在培养基B 上，培养一段时间后的结
果如图3 所示，数字表示不同的菌落。培养基A 中添加的抗生素是
，培养基B 中添加的抗生素是 。图3 中符合要求的菌
落
是
(
填
数
字
)
，
请
说
明
理
由
。
________________________________________
__________________________________________________________________。
答案 (1)XbaⅠ、XhoⅠ (2)潮霉素 氯霉素 3、5 符合要求的菌落，应该能
在含潮霉素的培养基上生长，但不能在含有氯霉素的培养基上生长
考向 基因工程的三种工具[科学思维]
1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3 和酶4)、DNA 连接酶
为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、
连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3 切割，用E.coli DNA 连接酶连接
B.质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E.coli DNA 连接酶连接
答案 C
解析 酶3 切割后得到的是平末端，为使其高效连接，应该用T4 DNA 连接酶连
接，A 不符合题意；质粒用酶3 切割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到
的是黏性末端，二者不能连接，B 不符合题意；质粒和目的基因都用酶1 和酶2
切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的
连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C 符合题意；若用酶2 和
酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表
达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D 不符合题意。
2.(2026·辽宁本溪模拟)限制性内切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的识别序列及切割位
点分别为A↓AGCTT 和C↓TCGAG，下列相关叙述正确的是( )
A.两种限制酶是在同一种生物中分离出来的
B.两种限制酶切割DNA 形成的黏性末端相同
C.用HindⅢ酶切割含目的基因的DNA 片段和用XhoⅠ酶切割质粒后，目的基因
和质粒能连接成重组质粒
D.实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果
答案 D
解析 限制酶命名规则为属名首字母＋种名前两个字母＋菌株或血清型＋同菌株
的多种限制酶流水号(罗马数字)，由此可知HindⅢ和XhoⅠ是从不同的生物中
分离得到的，A 错误；两种限制酶识别和切割的序列分别为A↓AGCTT 和
C↓TCGAG，则两者切割后形成的黏性末端分别是AGCT－、TCGA－，B 错误；
两种限制酶切割形成的黏性末端不同，无法连接成重组质粒，C 错误。
3.(2026·湖北十堰模拟)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图
所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表
示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情
况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关
叙述正确的是( )
项目
细菌在含氨苄青霉素
的培养基上生长情况
细菌在含四环素的培
养基上生长情况
①
能生长
不能生长
②
能生长
能生长
③
不能生长
能生长
A.质粒的复制原点上有RNA 聚合酶的结合位点
B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2 个
D.将外源基因与质粒连接时需用DNA 聚合酶
答案 C
解析 质粒的复制原点上有DNA 聚合酶的结合位点，A 错误；①②③三种重组
后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B 错误；将外源基因与质粒连
接时需用DNA 连接酶，D 错误。
与DNA 有关的几种酶的比较
考点二 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
(2)利用PCR 获取和扩增目的基因
①在PCR 过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既
可作为合成DNA 子链的原料，又可为DNA 的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新
子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，其作用使DNA 聚合酶能够从引物的
3′端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，
均无法获得PCR 产物。
④真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR 反应缓冲液中
一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——核心
3.将目的基因导入受体细胞
(1)农杆菌特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染
能力。
②农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T－DNA
转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA 上。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti 质粒的T－
DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA 拼接到受体细
胞的染色体DNA 上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti 质粒导入农杆
菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA 导入受体细胞。
(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA 上。存在
于染色体DNA 上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成
“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
[创新拓展] PCR 的应用
PCR 不仅可以扩增目的基因，而且可以在DNA 两端添加酶切位点、对DNA 进
行定点突变，以及用于检测目的基因。
(1)利用引物添加酶切位点
(2)利用引物诱变DNA 分子
(3)利用PCR 检测目的基因
1.(2025·福建卷，10)紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科
研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质
的合成。下列叙述错误的是( )
A.农杆菌转化前应先使用Ca2＋处理烟草细胞
B.紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA 上
C.紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D.该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
答案 A
解析 农杆菌转化前，需要将含目的基因的重组Ti 质粒转入农杆菌中，此时应
先使用Ca2＋处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分
子的生理状态，A 错误；农杆菌的Ti 质粒上的T－DNA 可转移至受体细胞，并
且整合到受体细胞的染色体DNA 中，因此紫杉醇合成的相关基因会随T－DNA
整合到烟草染色体DNA 上，B 正确；紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能，通过抑
制纺锤体的形成，阻碍肿瘤细胞的有丝分裂，从而发挥抗癌作用，C 正确；利用
转基因技术生产紫杉醇前体物质，可减少对天然红豆杉的采伐，有利于保护其天
然资源，D 正确。
2.(2025·陕晋宁青卷，21)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马
铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S 基因的表达与其冷耐受性
调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR 扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2＋的缓冲液
和耐高温的DNA 聚合酶。DNA 聚合酶在PCR 的 步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S 基因中限制酶的切割位点。为将S 基因正确插入载体，
PCR 扩增S 基因时需在引物的 (填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别
序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′－ －3′，切割载
体时应选用的两种限制酶是 。PCR 扩增产物和载体分别被限制酶切割
后，经纯化和连接，获得含S 基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－
DNA 进入愈伤组织细胞，将S 基因整合到 上，抗性基因 可用
于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获
得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
答案 (1)(4 种)脱氧核苷酸 延伸 (2)5′端 AGATCT BamH Ⅰ与EcoR Ⅰ
(3)染色体DNA 2 再分化
解析 (1)PCR 扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、(4 种)脱氧核苷酸、含
Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶。PCR 过程一般可以分为变性、复性、延
伸，DNA 聚合酶在延伸步骤中起作用，即DNA 聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的
3′端进行子链的延伸。(2)为将S 基因正确插入载体，PCR 扩增S 基因时需要在引
物的5′端添加相应的限制酶识别序列。为保证目的基因的正确插入，应使用双酶
切；载体中含有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ的酶切位点，S 基因上含有Xba
Ⅰ、Nde Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位点，为保证S 基因结构的完整性，不能在S 基因
两端添加Xba Ⅰ、Nde Ⅰ、BamH Ⅰ的识别序列；分析表格数据，Bgl Ⅱ切割
产生的黏性末端和BamH Ⅰ切割产生的黏性末端相同，结合S 基因的转录方向
和载体上启动子的转录方向可知， 应在上游引物添加 Bgl Ⅱ的识别序列，即5′
－AGATCT－3′， 下游引物添加EcoR Ⅰ的识别序列。因此，切割载体应选用的
两种限制酶为BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ。(3)用携带S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯
愈伤组织时，农杆菌能将基因表达载体中的T－DNA 转移到愈伤组织细胞的染
色体DNA 上。分析载体，T－DNA 中含有抗性基因2， 若T－DNA 成功整合到
被侵染细胞的染色体DNA 上，则该细胞具有抗性基因2 对应的抗性，因此，抗
性基因2 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、 根，
继续培育可获得抗寒能力显著增加的马铃薯植株。
目的基因的获取方法
(1)利用PCR 获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因
(3)从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在
染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性
来获取目的基因。
考点三 DNA 的粗提取与鉴定、DNA 片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA 的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)实验步骤
(3)注意事项
2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
(2)PCR 实验操作步骤
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被
检测出来。
①为避免外源DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏
水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必
须更换，避免试剂的污染。
③电泳时，DNA 的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA 的相对分子量越小，
迁移速率越快。
(1)土豆DNA 溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色。(2025·四川卷，5A)(×)
提示 沸水浴条件下。
(2)DNA 的粗提取与鉴定实验可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”。(2025·
湖南卷，2A)(×)
提示 猪成熟的红细胞没有细胞核和众多细胞器，不含DNA。
(3)在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快。(2024·黑吉辽卷，
7C)(×)
提示 在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA 片段实际上是向正极迁移的，
而不是向负极迁移。同时，DNA 片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段
越长，迁移速率越慢。
(4)粗提取DNA 时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA 降解。
(2022·山东卷，13A)(√)
(5)动、植物细胞DNA 的提取必须在无菌条件下进行。(2022·湖北卷，5A)(×)
提示 动、植物细胞的DNA 提取不需要在无菌条件下进行。
考向1 DNA 的粗提取与鉴定[科学探究]
1.(2024·安徽卷，14)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(
)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低
B.利用DNA 和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C.DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA 粗提物
D.将溶解的DNA 粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
答案 D
解析 若将研磨液更换为蒸馏水，则从细胞核中释放出的DNA 量会减少，从而
会降低DNA 提取的效率，A 正确；由于DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于
酒精，所以利用DNA 和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B 正
确；DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 的NaCl 溶液，
利用该原理可纯化DNA 粗提物，C 正确；二苯胺试剂可以用于鉴定DNA，不能
检测出溶液中是否含有蛋白质杂质，D 错误。
2.(2024·山东卷，13)关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(
)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案 A
解析 在DNA 的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4
℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液倒入烧杯，也可以直接将研磨液用离心机进
行离心后取上清液，A 正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA 在上清
液中，应将上清液倒入烧杯中，B 错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA 双螺
旋结构会发生改变，C 错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5 分钟以
上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设
置一个加二苯胺不加DNA 的对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D
错误。
考向2 DNA 片段的扩增及电泳鉴定[科学探究]
3.(2025·新课标卷，6)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4 的电泳
结果如图所示(“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1 和2 中
的DNA 分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R 的一个酶切位点，样品3 和4 中有
一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是( )
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA 分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA 分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3 可能是甲被酶R 完全酶切后的产物
答案 D
解析 配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH 稳定，
保证核酸分子正常泳动，A 正确；电泳时，样品向“＋”极移动，说明在该实验
条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，
B 正确；电泳中，DNA 分子的迁移速率与分子的大小、构象等多种因素有关。
甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA 分子的迁移速率的因素很多，所以
碱基对的数量可能不同，C 正确；甲只有限制酶R 的一个酶切位点，若被酶R 完
全酶切，只会得到2 种DNA 片段(2 个条带)，这两个条带的碱基数量比甲要少，
电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4 才是甲被酶R 完全酶切后的产物，
D 错误。
4.(2024·黑吉辽卷，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述
正确的是( )
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C.在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
答案 A
解析 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA 分子在凝胶中的迁移率，因此琼脂糖凝胶
浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小，A 正确； 凝胶载样缓冲液指示剂的
作用是指示电泳进度，B 错误；在琼脂糖凝胶电泳中，在同一电场作用下，
DNA 片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段越长，迁移速率越慢，C 错
误；琼脂糖凝胶中的DNA 分子在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来不是紫光
灯，D 错误。
限时练51 基因工程的基本工具和基本操作程序
(时间：30 分钟 分值：40 分)
【对点强化】
考点一 重组DNA 技术的基本工具
1.(2026·辽宁大连模拟)在基因工程的操作中，需要三种工具，分别是“分子手术
刀”“分子缝合针”和“分子运输车”，关于这三种工具的叙述，正确的是(
)
A.“分子手术刀”指的是限制性内切核酸酶，可以断开DNA 和RNA 的磷酸二
酯键
B.“分子缝合针”指的是DNA 聚合酶，可以催化生成断裂的磷酸二酯键
C.“分子运输车”指的是载体，常用的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体
D.质粒是具有自我复制能力的环状RNA 分子
答案 C
解析 “分子手术刀”是限制性内切核酸酶(限制酶)，能识别双链DNA 特定的
核苷酸序列，并在特定的位点切割使磷酸二酯键断裂，A 错误；“分子缝合针”
是DNA 连接酶，能将具有相同末端的DNA 片段连接起来，B 错误；基因工程中
的“分子运输车”即载体，有质粒、动植物病毒、噬菌体等，其中质粒是基因工
程中最常用的载体，C 正确；质粒是具有自我复制能力的环状双链DNA 分子，
D 错误。
2.(2026·湖北武汉模拟)某细菌DNA 分子上有4 个Sau3A Ⅰ的酶切位点，经
Sau3A Ⅰ处理后会形成4 个大小不同的DNA 片段。若是用BamH Ⅰ处理，则只
会形成2 个大小不同的DNA 片段。Sau3A Ⅰ和BamHⅠ的识别序列及切割位点
如下表所示。下列叙述错误的是( )
限制酶名称
识别序列及切割位点
BamHⅠ
G↓GATCC
Sau3AⅠ
↓GATC
A.若用两种酶共同处理，会形成6 个大小不同的DNA 片段
B.上述两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端
C.该DNA 分子上有2 个BamH Ⅰ的酶切位点
D.该细菌DNA 分子是环状的
答案 A
解析 分析题干信息可知，该DNA 分子上有4 个Sau3A Ⅰ的酶切位点，有2 个
BamH Ⅰ的酶切位点，但是BamH Ⅰ识别序列中包含Sau3A Ⅰ的识别序列，所
以同时用两种酶共同处理，不会形成6 个大小不同的DNA 片段，A 错误。
3.(2026·福建南平模拟)研究表明，DNA 连接酶能够封闭DNA 双螺旋骨架上的切
口(图1)，却无法封闭缺口(图2)，下列相关叙述正确的是( )
A.DNA 连接酶的封闭是指催化核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成
B.DNA 单链发生缺失，在DNA 聚合酶作用下沿缺口3′→5′方向修复
C.DNA 连接酶可以将来源不同的DNA 片段拼接成新的DNA 分子
D.DNA 连接酶封闭切口时，需要识别DNA 片段特定的核苷酸序列
答案 C
解析 DNA 连接酶的封闭是指催化脱氧核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成，A
错误；DNA 单链发生缺失，在DNA 聚合酶作用下沿缺口5′→3′方向修复，B 错
误；DNA 分子的空间结构都是相同的，所以DNA 连接酶可以将来源不同的
DNA 片段拼接成新的DNA 分子，形成重组DNA，C 正确；DNA 连接酶封闭切
口时，不需要识别DNA 片段特定的核苷酸序列，D 错误。
考点二 基因工程的基本操作程序
4.(2026·江苏连云港模拟)我国科学家钱嘉韵发现并分离了耐高温的DNA 聚合酶，
将PCR 变成了真正成熟的技术。下列关于PCR 技术的叙述，正确的是( )
A.两种引物在DNA 聚合酶的作用下与两条单链DNA 结合
B.除了耐高温的DNA 聚合酶外，PCR 还需要用到解旋酶
C.PCR 技术是依据细胞内基因表达的原理进行研发的
D.在基因工程中，PCR 技术可以用于目的基因的检测
答案 D
解析 两种引物与两条单链DNA 结合依据碱基互补配对原则自动形成氢键，不
需要DNA 聚合酶的作用，A 错误；PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶的
作用，高温条件下氢键可自动断裂，B 错误；PCR 技术是依据细胞内DNA 半保
留复制的原理进行研发的，C 错误；目的基因的检测与鉴定有分子水平的检测和
个体生物学水平的鉴定，其中分子水平的检测可以利用PCR 技术，D 正确。
5.(2026·山东聊城模拟)如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报
告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K 呈现蓝色。转化
过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的
培养基中生长。下列相关叙述正确的是( )
A.过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA 中，导致T－DNA 片段失活
B.过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化
C. 农杆菌在自然条件下能侵染裸子植物，但不能侵染双子叶植物，且对大多数
单子叶植物没有侵染能力
D.过程③应在培养基中加入除草剂和物质K
答案 D
解析 过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA 中，不会导致T－DNA 片段失活，
A 错误；过程①使用两种限制酶，且这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，才
可以防止酶切产物自身环化，B 错误；农杆菌在自然条件下能侵染裸子植物和双
子叶植物，C 错误；过程③应在培养基中加入除草剂和物质K，除草剂是用来检
测目的基因是否正确表达，物质K 是用来检测目的基因有没有导入植物细胞中，
加入除草剂可保留转化的愈伤组织和附着农杆菌但未转化的愈伤组织，其中变蓝
的为转化的愈伤组织，D 正确。
考点三 DNA 的粗提取与鉴定、DNA 片段的扩增及电泳鉴定
6.(2025·陕晋宁青卷，5)对下列关于中学生物学实验的描述，错误的是( )
①探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用 ②观察植物细胞的质壁分离现象 ③探
究培养液中酵母菌种群数量的变化 ④观察植物细胞的有丝分裂 ⑤观察叶绿体
和细胞质的流动 ⑥DNA 的粗提取与鉴定
A.①⑥通过观察颜色判断实验结果
B.③⑥均须进行离心操作
C.②④均可使用洋葱作为实验材料
D.②⑤实验过程均须保持细胞活性
答案 B
解析 ①检测试剂为斐林试剂，通过观察有无砖红色沉淀来判断结果。②观察植
物细胞的质壁分离现象，可选择紫色洋葱鳞片叶外表皮作为实验材料，同时只有
活细胞的细胞膜才具有选择透过性，才能发生质壁分离。③探究培养液中酵母菌
种群数量的变化，用血细胞计数板进行观察计数，无须离心操作。④观察植物细
胞的有丝分裂常选择洋葱根尖分生区组织。⑤活细胞的细胞质才能流动，因此实
验过程中须保持细胞活性。⑥DNA 的粗提取与鉴定，提取DNA 时既可用静置
沉降法，也可以用离心机离心法；DNA 遇二苯胺试剂在沸水浴条件下会呈现蓝
色，可通过观察颜色判断实验结果。综上所述，B 错误。
7.(2023·福建卷，4)关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA 的粗
提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作，下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中，PCR 实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR 产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定
DNA
答案 C
解析 为避免外源DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、
蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压灭菌处理，A
错误；PCR 产物进行凝胶电泳，应先加样后接通电源，B 错误；DNA 不溶于酒
精，细胞中的某些蛋白质可溶于酒精，因此离心后取上清液加入等体积的冷酒精
进行DNA 的粗提取，C 正确；鉴定DNA 时，应先将白色丝状物溶解在2 mol/L
的NaCl 溶液中，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴，D 错误。
8.(2024·河北卷，13)下列相关实验操作正确的是( )
A.配制PCR 反应体系时，加入等量的4 种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR 产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果
C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板
D.将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落
答案 B
解析 配制PCR 反应体系时，应加入4 种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料，A
错误；凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出
来，B 正确；配制的酵母培养基先进行高压蒸汽灭菌处理，并冷却至50 ℃左右
时，再在酒精灯火焰旁倒平板，C 错误；烧红的接种环需在酒精灯火焰旁冷却后
才能蘸取菌液，否则会杀死菌种，D 错误。
【综合提升】
9.(2025·河南卷，21)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降
解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶
(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是
__________________________________________________________________。
将培养后的菌液混匀并充分 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了
CG 活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg(CG 的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg 的PCR 扩增
产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA 连接酶连接。为保证连接准确性和
效率，cg 转录模板链的5′端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了
各不相同的双酶切组合和T4 DNA 连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分
子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原
因是
__________________________________________________________________。
限制酶的识别序列和切割位点如下：
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要选用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目
的是___________________________________________，随后在含 和
的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。
为提高CG 的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保
守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2 所示。根据分析结果，选择
第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是
__________________________________________________________________。
答案 (1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够降解卡拉胶的微生物的可能性较大
稀释 (2)BamH Ⅰ Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割后均产生平末端，Spe Ⅰ和Xba Ⅰ
切割后产生的黏性末端相同，两种情况均会导致部分cg 反向连接，新的序列无
法被原有酶识别 (3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态
卡拉胶 四环素 (4)44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二
硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
解析 (1)生物在长期的进化过程中，会逐渐形成适应特定环境条件的特性。在
富含卡拉胶的环境中存在能够降解卡拉胶的微生物的可能性较大，这些微生物体
内含有可以降解卡拉胶的酶，使其能够利用卡拉胶作为碳源，从而在这样的环境
中生存和繁衍。(2)转录过程沿模板链的3′端到5′端进行，所以转录模板链的5′端
为靠近终止子的一端，由于E.coli DNA 连接酶连接黏性末端的效率较高，连接
平末端效率低，因此不选用EcoRⅤ和Sma Ⅰ酶切，Xba Ⅰ与Spe Ⅰ切割产生
的黏性末端相同，容易反向连接，所以cg 基因转录模板链的5′端应包含BamH
Ⅰ的酶切位点。 T4 DNA 连接酶可以连接黏性末端和平末端。选择不同的双酶
切组合后，若重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列，会导致重组
质粒无法使用构建表达载体的双酶切组合进行切割。(3)用Ca2＋处理大肠杆菌细
胞，可以使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态。为筛选出成
功导入表达载体的大肠杆菌，应在培养基中添加卡拉胶和四环素，培养一段时间
后，根据菌落周围有无水解透明圈来判断。(4)空间上邻近的两个半胱氨酸容易
形成二硫键，提升蛋白质的耐热性，第44 位赖氨酸空间上离半胱氨酸更近，容
易形成二硫键提升蛋白质的耐热性，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小。
