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专题15 基因工程
考点概览
考点01 基因工程
考点02 生物技术的伦理和安全
基因工程
一、单选题
1．（2025·贵州铜仁·一模）水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现用赖氨酸替换水
蛭素第47 位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。下列叙述正确的是（ ）
A．该项替换研究中，目前可行的直接操作对象是蛋白质
B．该项替换研究中，改造前后水蛭素的空间结构未发生改变
C．该项替换研究的思路与按照中心法则合成蛋白质的思路一致
D．改造的水蛭素基因导入微生物后可利用发酵工程生产水蛭素
2．（2025·山西·一模）人参这种珍贵中药材的药效主要由人参皂苷发挥作用。科研人员将合成人参皂苷
Rh2 的关键酶基因（UGT 和D12H）导入酿酒酵母，实现了多基因表达，从而实现人参皂苷Rh2 工厂化生
产。下图为相关操作流程图，①~④表示过程。下列叙述正确的是（ ）
A．①需要先将RNA 反转录出DNA，再利用PCR 获取和扩增目的基因
考点01
B．②利用PCR 在目的基因上添加酶切位点时，需在引物的3'端引入该位点
C．③是基因表达载体的构建，将目的基因1 连接在启动子1 的上游
D．启动子是一段有特殊序列的DNA 片段，是DNA 聚合酶识别和结合的部位
3．（2025·河北邯郸·一模）下列有关“DNA 的粗提取与鉴定”“琼脂糖凝胶电泳”实验的相关说法，正
确的是（ ）
A．利用酒精初步分离DNA 与蛋白质的原理是DNA 溶于酒精
B．过滤后的研磨液放置在4℃冰箱中可防止DNA 被降解
C．琼脂糖凝胶电泳时，DNA 分子越大，迁移速率越快
D．提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后即可变为蓝色
4．（2025·山东青岛·一模）野生大豆的SAMS 基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐敏感型作物，为
提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将野生大豆的SAMS 基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株
系，具体过程如图。下列说法错误的是（ ）
A．图示过程中发生了两次转化
B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基
C．Ⅰ中的筛选可使用PCR 技术
D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力
5．（2025·山东青岛·一模）酶联免疫吸附测定是一种灵敏的免疫检测技术，过程如图。下列说法错误的是
（ ）
A．该技术可以用来检测特定抗原的浓度
B．两种抗体与特定抗原的同一区域结合
C．第二种抗体可以用蛋白质工程来制备
D．加入底物前需要漂洗掉未结合的抗体
6．（2025·山东青岛·一模）已知紫外线（UV）可诱导DNA 单链上相邻的T 之间相互结合形成嘧啶二聚体，
阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA 修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某
细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复
原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（ ）
A．PRE 可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开
B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物
C．PRE 基因发生碱基替换后，在光照下PRE 的修复功能可能正常
D．UV 诱导DNA 形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传
7．（2025·山东青岛·一模）采用PCR 技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（ ）
A．若PCR 的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶
B．预变性有利于模板DNA 充分解聚为单链
C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加
D．一个DNA 模板完成第20 轮循环需要（220-2）个引物
8．（2025·河北石家庄·一模）研究人员将胰岛素B 链的第28 位氨基酸替换为天冬氨酸，抑制了胰岛素聚
合，从而获得速效胰岛素类似物。下列叙述正确的是（ ）
A．该产品是通过直接改造胰岛素来生产的
B．改变氨基酸的种类不会影响胰岛素的空间结构
C．可通过定向诱导胰岛素基因碱基增添达到改造目的
D．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质合成过程相反
9．（2025·河北石家庄·一模）原生质体比正常植物细胞更易接受外源DNA，其制备过程主要包括取材→
剪碎→酶解。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞壁可能会阻止外源DNA 进入细胞
B．取材后需用酒精和次氯酸钠对材料灭菌
C．剪碎的目的是使酶与细胞充分接触
D．可用台盼蓝染液来鉴定原生质体活性
10．（2025·广东深圳·一模）研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合
成的DNA 片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合。重组基因在酵母菌表
达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是（ ）
A．获得融合蛋白
B．研究该段肽的作用
C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体
D．研究重组基因的功能
11．（2025·宁夏银川·一模）下图为构建基因表达载体和检测受体细胞是否含有目的基因的过程示意图，
其中LacZ 基因控制合成的酶可以分解物质X 产生蓝色物质，使平板上形成的菌落呈蓝色，否则菌落为白
色。图中③过程所用培养基含有氨苄青霉素和物质X。下列叙述错误的是（ ）
A．①过程需要使用限制性内切核酸酶和DNA 连接酶
B．实验结果中形成的蓝色菌落中的大肠杆菌含有目的基因
C．③过程使用的培养基中含有氨苄青霉素，属于选择培养基
D．可用
处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态
12．（2025·安徽马鞍山·一模）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、
TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水
稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（ ）
A．T-DNA 插入到水稻的染色体DNA 中可能会影响水稻自身基因的表达
B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因
C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA 连接酶不具有专一性
D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物
13．（2025·天津武清·一模）下列有关教材实验探究的说法正确的是（ ）
A．猪红细胞是实验“DNA 粗提取与鉴定”的良好材料
B．“探究酵母菌细胞的呼吸方式”的实验中无氧气组为对照组
C．“探究土壤微生物的分解作用”实验中，利用了减法原理“
D．设计预实验是为了避免实验数据的偶然性，减少误差
14．（2025·福建龙岩·一模）柳穿鱼花的形态有两侧对称型（野生型）和辐射对称型（突变型），柳穿鱼
花的形态与Lcyc 基因直接相关，两种类型体内Lcyc 基因的序列相同。研究人员将野生型植株A 与突变型
植株B 杂交得到
，
自交得到的
中野生型：突变型=34：5，该结果不符合典型孟德尔性状分离比。为
弄清其产生原因，研究人员进行下表所列实验，下列叙述错误的是（ ）
实验处理
结果
实验一：检测植株A、B 花芽细胞中的
mRNA
植株A 花芽细胞中含有
Lcyc 基因转录的mRNA
植株B 花芽细胞中不含
Lcyc 基因转录的mRNA
实验二：用两种限制酶对植株A、B 的Lcyc
基因进行酶切，酶切位点如图1。若识别位
点附近被甲基化则PstI 无法识别对应序列。
植株A 的Lcyc 基因经酶切
产生1.5kb、0.7kb、0.2kb
三种片段；植株B 的Lcyc
基因经酶切产生2.4kb 一种
片段
A．实验一证明植株B 花形为辐射对称的原因是Lcyc 基因不表达
B．实验二证明植株B 的Lcyc 基因中PstI 酶切位点附近发生甲基化
C．实验一、二说明植株B 碱基的甲基化特征可以遗传给后代
D．
中突变型占5/39 是Lcyc 基因选择性表达的结果
15．（2025·福建龙岩·一模）科研人员利用两种识别不同序列的限制酶（E1 和E2）处理某一基因表达载体
后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．该载体的长度约为800bp，E1 和E2 在该载体上的酶切位点最短相距约400bp
B．电泳加样时，将扩增得到的PCR 产物与电泳缓冲液（内含指示剂）混合，注入加样孔内
C．待观察到DNA 片段前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
D．凝胶中的DNA 分子与核酸染料结合后可以在紫外灯下被检测出来
16．（2025·黑龙江吉林·一模）新型蛋白质进化模型EVOLVEpro 可以利用氨基酸序列，仅通过少量学习和
最低限度的实验测试来预测蛋白质空间结构，从而获得新型高活性蛋白质改造方案。下列有关说法正确的
是（ ）
A．预测蛋白质结构需要依据肽链中肽键的结构、氨基酸的物理性质与结构
B．氨基酸是蛋白质的基本单位，氨基酸发生替换一定使蛋白质的结构和功能发生改变
C．EVOLVEpro 在蛋白质工程广泛应用后将不再需要借助基因工程手段改造蛋白质
D．通过EVOLVEpro 得到的蛋白质还需要进行进一步的功能检测实验才可以投入生产
17．（2025·广东深圳·一模）为探究DNA 片段P 与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P 不同位点
的突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如
图。下列分析正确的是（ ）
注：“－”表示未添加，“+”表示添加，指示探针的浓度很低
A．条带1 越宽说明O2蛋白与待测物的结合越强
B．显示条带2 就说明O2蛋白与P 无法结合
C．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合
D．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同
18．（2025·山东济宁·一模）端粒学说是细胞衰老的假说之一，研究发现，端粒缩短与DNA 复制方式有关。
人体细胞内DNA 复制部分过程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．图示体现了DNA 半保留复制、双向复制的特点
B．图示引物为短单链核酸，复制过程中会被酶切除
C．PCR 扩增的原理与生物体内DNA 复制的原理相同
D．端粒缩短的原因是新合成的子链5'端变短
19．（2025·江西·一模）由于花椰菜杂种优势在提高花椰菜产量方面发挥着巨大的作用，而利用细胞质雄
性不育系生产杂交种子，可以简化制种程序。利用原生质体非对称融合技术比较容易实现胞质雄性不育基
因的转移，某研究利用该技术成功获得了含有胞质雄性不育基因的花椰菜植株，制作流程如下，下列说法
错误的是（ ）
注：UV 处理可以随机破坏染色体结构，使其发生断裂、丢失等，使细胞不再分裂
A．原生质体非对称融合技术使得杂种植株性状更接近于供体植株
B．②过程的原理是细胞膜具有一定的流动性，常用PEG 融合法
C．培养一段时间后可通过观察叶绿体初步判断是否为异源原生质体
D．为鉴定再生植株成功获得细胞质雄性不育基因，可利用PCR 进行鉴定
20．（2025·湖北武汉·一模）PCR 技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成
的杂合分子的解链温度称为引物的Tm 值。下列叙述正确的是（ ）
A．引物与模板链的结合属于延伸过程
B．变性过程的温度一般要低于复性过程
C．复性过程的温度应设置为略低于Tm 值
D．引物的 Tm 值越接近,引物之间越容易结合
21．（2025·福建厦门·一模）RT-PCR 是将RNA 逆转录（RT）成cDNA（与mRNA 互补的DNA 单链）和
聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
A．过程Ⅰ获得cDNA 的过程与DNA 复制过程中碱基配对方式相同
B．图中A、B 两种引物在72°C 时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，则共需要加入引物的数量为63 个
22．（2025·四川巴中·一模）科学家发现一未知DNA 分子，该DNA 分子存在多种限制酶切位点。研究人
员利用三种限制酶对该DNA 分子进行不同的酶切处理，将处理后的DNA 片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果
如图所示。据图推断，下列选项最可能为该DNA 分子原始图谱的是（ ）
A．
B．
C．
D．
23．（2025·陕西西安·一模）下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”和“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验的
叙述，正确的是（ ）
A．在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象有关
B．鉴定DNA 时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．选用植物细胞提取DNA 时，研磨后用滤纸进行过滤
D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
二、多选题
24．（2025·江西·一模）除草剂有效成分草甘膦的作用机理是和PEP 竞争性结合EPSP 合酶，从而扰乱生
物体的正常氮代谢。但作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有杀伤作用，这大大限制了其在
农业生产中的应用，培育抗草甘膦作物将会解决这一难题。下列说法错误的是（ ）
A．长期使用草甘膦除草剂，会导致杂草产生抗除草剂突变，降低除草剂的效果
B．根据草甘膦的作用机理，可通过导入强启动子使EPSP 合酶过量表达获得抗草甘膦作物
C．可通过蛋白质工程直接替换EPSP 合酶个别氨基酸，使草甘膦无法与EPSP 酶结合
D．在培育抗草甘膦作物时，为避免外源基因流入杂草，最好将外源基因插入细胞核基因组
25．（2025·江西·一模）融合PCR 技术（SOE PCR）是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分作为模板进
行PCR 扩增，连接两段基因以获得目的基因的方法。通过SOE PCR 将鸡干扰素α 基因（甲）和鸡白介素
18 基因（乙）连接的过程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．融合PCR 技术的每次循环都需经历两次降温和一次升温
B．两基因融合过程既需限制酶，也需耐高温的DNA 聚合酶
C．图中PCR1 至少需经过2 次PCR 循环才可获得双链等长的DNA 片段
D．引物3 是同时依据鸡干扰素α 基因和鸡白介素18 基因的碱基序列设计的
26．（2025·河北沧州·一模）基因工程可将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，
然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品。引物是一小段能与DNA 母链
的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。下列相关叙述正确的是（ ）
A．基因工程需引物是因为DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA
B．引物设计时既要考虑目的基因的碱基序列，还要考虑载体的碱基序列
C．为便于目的基因与载体连接，需在引物的3′端加上限制酶的酶切位点
D．用同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒，在DNA 连接酶作用下可能会反向连接
27．（2025·山东枣庄·一模）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”（实验1）和“DNA 的粗提取与鉴定”
（实验2）的实验操作，下列相关叙述错误的是（ ）
A．实验1 中，DNA 电泳时需要在琼脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料
B．实验1 中，将扩增得到的PCR 产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源
C．实验2 中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为70%的冷酒精后析出DNA
D．实验2 中，需先将白色丝状物溶于2mol/L 的NaCl 溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴
定DNA
三、非选择题
28．（2025·天津蓟州·一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，
如图1 所示。请回答下列问题：
(1)进行PCR 扩增时需要耐高温的DNA 聚合酶，为使其活化应在PCR 反应缓冲液中加入 （填
“Ca2+”或“Mg2+”）。
(2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R 应在下列选项中分别选用 。
A．5'-ATGGTG……CAACCA-3'
B．5'-TGGTTG……CACCAT-3'
C．5'-GACGAG……CTGCAG-3'
D．5'-CTGCAG……CTCGTC-3'
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一过
程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是 。
(4)构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有 ，用以控制目的基因的表达。
(5)如何将重组质粒导入大肠杆菌？ 。
(6)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，符合要求的质粒为 。
29．（2025·黑龙江·一模）研究人员通过基因工程制备了能生产乙肝病毒抗原蛋白的酿酒酵母。抗原蛋白
基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3',5'-CCATGC-3'。如图表示育种过程利用的载体及限制酶的识
别序列（注：假设目的基因内不含有相应酶的识别序列）。
(1)在通过PCR 扩增目的基因片段的反应条件中，预变性的目的是 。在实际PCR 反应中，扩增效率
通常低于100%。若某次PCR 反应的扩增效率为80%（PCR 扩增效率是指在PCR 反应中，每个循环中目标
DNA 分子的实际增加倍数与理论增加倍数的比值），初始模板DNA 的量为10ng，经过25 个循环后，实
际获得的PCR 产物量为 ng。
(2)据图分析，为了构建基因表达载体，我们应选择 来切割载体。由于抗原蛋白基因无法直接插入载
体中，因此需要通过设计特定的引物，这些引物不仅包含与目的基因两端匹配的序列，还需包含特定的酶
切位点，以便在扩增后能够与载体进行连接。引物的碱基序列从5'端到3'端依次 、 。
(3)真核生物的基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基
本启动子共同组成基因表达的调控序列，可增强一个或多个基因的转录水平（如图）。基因工程所用表达
载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。
①对文中“增强子”的理解，错误的是
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA 片段
B．一个增强子只能作用于一个基本启动子
C．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
②科学家鉴定出小鼠某胚胎细胞内一个增强子附近有两个基因A 和B，为了确定这两个基因是否为特异表
达的基因，他们应该检测 。
(4)检测受体细胞是否成功导入了重组载体，除了利用利用抗生素抗性筛选，还可以利用 方法。
30．（2025·河北石家庄·一模）草甘膦是一种广泛使用的除草剂，对大多数植物都具有杀灭作用。为在作
物生长期间定向除草，研究人员改变芥菜EPSPS 基因特定位点，将其导入芥菜，培育出了抗草甘膦的新品
种，操作流程如图。回答下列问题：
(1)过程①为 ，其需要在缓冲液中进行，缓冲液的作用是 ；①与②（PCR）的反应体系相比不
同点有 （答出两点即可）。
(2)以cDNA 为模板扩增EPSPS 基因后一般通过 鉴定产物，并置于 下观察结果。
(3)芥菜EPSPS 基因定点突变原理如图2 所示，引物2 的部分核苷酸序列为5'－
GAATAGTCATGCGTTCACTC…－3'，请据此补充引物3 的核苷酸序列5'－GTGAACGCATGA …－
3'，引物3 与反义链相应的核苷酸序列 （填“相同”或“不同”）。
(4)研究人员将突变基因插入T－DNA 的绿色荧光蛋白基因上游，如图3。为使两个基因融合表达以确定
EPSPS 在细胞的位置，需要去除突变基因的 序列。
31．（2025·贵州铜仁·一模）植物在遭受生物或非生物胁迫时，往往会积累次生代谢产物来应对外界伤害。
紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种次生代谢产物，具有高抗癌活性。研究发现从红豆杉愈伤组织细
胞就可以提取紫杉醇。
回答下列问题：
(1)在利用植物组织培养技术生产紫杉醇的过程中，最好选择红豆杉的 （幼嫩茎段/成熟茎段）作
为外植体进行培养，原因是 。
(2)在一定激素和营养等条件的诱导下，外植体细胞会失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，这
个转变过程称为 。未分化的细胞进而形成愈伤组织，将愈伤组织悬浮培养可获得紫杉醇。
(3)研究人员在利用植物组织培养技术生产紫杉醇的过程中发现紫杉醇的产量很低。结合题干信息，提出一
种提高紫杉醇产量的措施 。目前利用基因工程构建稳定高产紫杉醇的工程菌研究取得很大进展，
写出利用紫杉醇合成酶基因构建基因表达载体的思路 。
32．（2025·河北唐山·一模）四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重
要物质。bdhA 基因的表达产物是降低TTMP 含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA 基
因提高TTMP 产量。回答下列问题：
(1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固
体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。
(2)利用下图中的3 对引物扩增出bdhA 基因的上、下游片段和cat 基因，将3 种扩增产物和质粒1 分别酶切
后进行连接以获得质粒2。为使cat 基因位于质粒2 的上、下游片段之间，在设计引物5、6 时，应在引物
的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。
(3)用质粒2 转化菌株E 时，可用 处理菌株E 以提高转化的成功率。质粒2 与菌株E 的DNA 发生同
源重组（质粒2 中的上、下游片段分别与E 中bdhA 基因上、下游片段配对，并发生交换）使E 的bdhA 基
因替换为cat 基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。
(4)为检验E-的bdhA 基因被成功敲除，以E-的基因组DNA 为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增
只获得一种大小为 bp 的DNA 片段。对于PCR 产物电泳结果符合预期的DNA 片段，通常还需进一
步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA 基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直
接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E 一致。
33．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E 蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因
（如图1 所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑
马鱼的vtg 基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2 所示）连接，形成
vtg-Luc 基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2 中Luc 表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素
氧化产生荧光；
为氨苄青霉素抗性基因，
表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、
BsrGⅠ为限制酶。
(1)为使vtg 基因与Luc 基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc
基因载体，其优点是 。
(2)为使vtg 基因与Luc 基因载体形成重组载体，通过PCR 技术扩增vtg 基因时，需设计合适的加端引物。
依据图1、图2 信息推测引物2 包含的碱基序列为
。一个vtg 基因经过4 轮循环后，得到的子
代DNA 分子中，只含有1 种引物的DNA 分子所占的比例为 。
(3)若筛选导入vtg-Luc 基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养
基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加
进行检测。
34．（2025·内蒙古阿拉善盟·一模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱
甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2 基因编码双乙酰合成中的关键酶，GSH1 基因编码谷胱
甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，
过程如图，其中CUPI 基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性。请分析回答：
SalⅠ
5'-G↓TCGAC-3'
Kpn
Ⅰ
5'-G↓GTACC-3'
Sph
Ⅰ
5' -GCATG↓C
-3
Xba
Ⅰ
5'-T↓CTAGA-3''
Bgl
Ⅱ
5'-A↓GATCT-3'
Pst Ⅰ
5'-CTCC↓AG-3'
(1)分析图1 可知，需用 （填限制酶名称）切割质粒1 以获取CUPI 基因。
(2)转化后的啤酒酵母应置于含 的培养基中进行初步筛选。
(3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的 为模板，用图示两种引物进行PCR 扩增。若扩增
产物的大小约为1300bp，则说明 基因已整合到啤酒酵母的染色体上。
(4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图2。
据图2 分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力 。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显
未转化的受体菌，原因是 。
35．（2025·河北邯郸·一模）逆转录转座子是真核生物基因组中最丰富的一类可移动基因元件。逆转录转
座子经过转录和逆转录后可整合进基因组中达到复制自身的目的，且插入基因组中时表现出精细的插入位
点特异性。某研究团队为了研究4.5SRNA 逆转录转座子的生物学作用，对4.5SRNA 逆转录转座子DNA 进
行了克隆，部分过程如图1 所示。回答下列问题：
(1)获取鼠肝细胞总RNA 时，使用异硫氰酸胍法提取，从保护RNA 完整性的角度推测，异硫氰酸胍的作用
是 。过程①和②中需要使用的酶分别是 、 。
(2)过程②获得的DNA 补平且磷酸化后形成平末端，电泳鉴定结果如图2 所示，优先使用 酶将
DNA 与pGEM3Zf 连接形成重组质粒pGEM3Zf—4.5S．将重组质粒导入大肠杆菌中进行克隆。从大肠杆菌
中提取质粒，选择限制酶 和 进行双酶切，酶切产物经过电泳鉴定，出现大小为139bp 的条
带，说明克隆成功。
(3)将4.5SRNA 逆转录转座子DNA 接入表达载体的SV40 启动子的上游后，脂质体转染法将表达载体导入
小鼠骨髓瘤细胞NS—1、SP2/0 和人乳腺癌细胞Bca61 中，研究4.5SRNA 逆转录转座子对荧光素酶基因表
达的影响，结果如图3 所示，说明 。
(4)请你提出逆转录转座子在基因工程中的应用前景，逆转录转座子可作为 （写出1 点即可）。
36．（2025·河北保定·一模）由P 基因编码的P 蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面
发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P 蛋白的转基因玉米，图1 表示P 基因片
段和农杆菌的Ti 质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题：
(1)若b 链为P 基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，
切割Ti 质粒应选用的两种酶为 。
(2)用含重组 Ti 质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用
PCR 验证P 基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2 所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为
阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。
(3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。
(4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根
和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。
37．（2025·河北承德·一模）为解决猪肉中多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量不足的问题，研究人员获取了
控制PUFAs 合成的两个必需酶基因fat2 和fat1，并构建pCAG-fat1-fat2 融合表达质粒（如图所示），该质
粒全长15300 bp（碱基对），CMV 启动子启动EGFP 基因表达绿色荧光蛋白，CAG 启动子启动融合基因
fatl-fat2 的表达，AflⅡ和DraⅢ为两种限制酶的酶切位点。科研人员将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细
胞，并最终获得转fatl-fat2 融合基因的转基因猪。请回答下列问题：
(1)启动子是 识别和结合的部位，其作用是 。图中的EGFP 起到了 的作用，便于重组
DNA 分子的筛选。
(2)用DraⅢ酶切如图所示质粒时，可断裂 个磷酸二酯键，且酶切产物是 bp 和1700 bp 两个片
段。
(3)科研人员通过 法将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，可通过 等技术检测目的基因是否
进入受体细胞，该技术的原理是 。
(4)将含目的基因的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移入 中，通过 法使两细胞融合形成重构胚，并
用特定方法激活重构胚，使其发育为转基因猪，该技术属于 （填“有性”或“无性”）繁殖技术。
38．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E 蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的
表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1 中的vtg 基因与
图2 中Luc 基因载体连接，形成vtg-Luc 基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染
水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc 表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori 为
复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI 为限制酶，→表示转录方向。
注：图1DNA 片段不含有图2 所示限制酶的识别序列
(1)为使vtg 基因与Luc 基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc 基因载体可降低“空载”概
率。通过PCR 技术获取vtg 基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1 包含的碱基序列为5′
3′。（写出已知的所有碱基序列）
(2)将“vtg-Luc 基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含
的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。
(3)Luc 基因载体上有一段P2A 序列，其功能如图所示，据此推测P2A 的作用 。
(4)进一步研究发现，E 蛋白能与vtg 基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg 基因启动子
含区域1 和区域2，为研究E 蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1 和区域2
的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc 基因载体连接，连接位点位于Luc 基因的上游，形成两种重组载
体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。
39．（2025·广东湛江·一模）某种野兔的毛色黑色和灰色是一对相对性状，由E、e 基因决定。该种野兔的
尾巴长尾和短尾是另一对相对性状，由F、f 基因决定。将若干纯合的黑色长尾野兔和灰色短尾野兔进行杂
交，所得子一代均为黑色长尾野兔。将子一代分别作母本和父本，进行测交，所得后代的表型和数量如图
所示。请回答下列问题：
(1)由实验结果推测，两对相对性状的遗传遵循 定律，判定依据是 。
(2)子一代作父本测交后代中黑色长尾野兔的基因型为 ，子一代分别作母本和父本测交结果不同的原
因是 。子一代雌雄个体自由交配后代中灰色短尾野兔占比为 。
(3)野兔中染色体上毛色基因两侧MspⅠ限制酶切位点的分布存在如下两种形式。黑色野兔甲和黑色野兔乙
经杂交得到子代灰色野兔丙和未知毛色的野兔丁，分别提取甲、乙、丙、丁个体的DNA，经MspⅠ酶切后
进行电泳分离，结果如图所示：
乙个体分离出的19kbDNA 片段上含有的毛色基因为 （填“E”或“e”），理由是 ，推测野兔
丁为杂合子的概率为 。
(4)科学家将某种人类致病基因转入该种野兔中，模拟疾病的发生和发展过程，该实例说明转基因动物的应
用有 。
40．（2025·宁夏石嘴山·一模）亚洲玉米螟、黏虫是造成我国玉米减产的主要害虫。我国科研人员通过图
示过程将Bt 基因（能够控制合成Bt 毒蛋白）转入玉米细胞培育出了抗虫转基因玉米。回答下列问题：
(1)用PCR 扩增下面的Bt 基因的DNA 片段：5'-GACCTGTGGAAGC．.....CATACGGGATTG-3' 3'-
CTGGACACCTTCG......GTATGCCCTAAC-5'供选择的引物有：①5'-GACCTGTGGAAGC-3' ②5'-
CTGGACACCTTCG-3' ③5'-GTTAGGCATAC-3'④5'-CAATCCCGTATG-3'共四种，应选择________（填字
母）。
A．①②
B．②③
C．③④
D．①④
(2)据图分析，为确保目的基因能够与Ti 质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti 质粒，科研人员应选
用限制酶 切割Ti 质粒和含Bt 基因的DNA 片段。在获得重组Ti 质粒后，可将其加入经
处理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 成为转基因玉米植株。
(3)为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员首先利用 法检测Bt 基因是否成功翻译：在进行个
体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，
多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3:1 和15:1
两种情况。出现15:1 的原因是 。
(4)某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，
棉铃虫并没有被杀死，这说明 ，为此，科学家对棉花植株中的Bt 毒蛋白基因进行了修饰，结果食
用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt 毒蛋白基因的修饰属于 。
41．（2025·广东湛江·一模）柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重危害柑橘产量。科研人
员将M 基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。如图是培育转基因
柑橘的过程示意图，已知限制酶HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ的识别序列及切割位点分别为5'-A↓AGCTT-3′、5′-
G↓GATCC-3′、5-G↓TCGAC-3'。请回答下列问题：
(1)构建的基因表达载体，除了含有目的基因外，还必须含有 （回答2 点）等。据图分析，在基因表
达载体构建过程中，应使用 对M 基因和质粒进行切割，原因是 。
(2)利用PCR 技术克隆M 基因时，应选择下图中的引物 （填序号），引物的作用是 。
(3)将图中农杆菌先后置于含 的培养基中培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测转基因柑橘
幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染，在个体生物学水平上，操作方法是 。
(4)图中由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了 技术，该技术的原理是 ，由柑橘细胞获得愈
伤组织的过程称为 。
42．（2025·广东深圳·一模）在植物基因组中天然存在着一类自私的基因或遗传元件，能够使得自身传递
给后代的比例大大提高，被称为基因驱动元件。受天然基因驱动元件的启发，我国研究团队开发了一种名
为CAIN 的基因驱动系统，如图。
CRISPR/ Cas9 能够靶向切割NPG1 基因的编辑工具；NPG1 表示花粉萌发所必需的基因
回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 由人工合成的短链RNA 和一种来自细菌的核酸酶Cas9。短链RNA 作为“向导”；核酸酶
Cas9 切割目的DNA，使DNA 双链断裂。短链RNA 作为“导向”作用的具体原理是 。
(2)CAIN 系统基于“毒药—解药”机制，据图分析，通过 的作用在植物花粉中产生毒药效应；再以
作为解药，让花粉正常萌发。图中重新编码后的NPG1 需要具备的条件是 ，为实现这一目的，研究
人员利用了密码子的 现象对NPGI 进行重新编码，最终实现了 的花粉能够正常萌发。
(3)研究人员选用了自交繁殖的拟南芥作为材料，研究结果如下图。
①若是双剪切，基因驱动工具CAIN 系统在人工杂交世代中表现出了显著的高效遗传，理论上后代带有
CAIN 个体为100%，远高于孟德尔遗传的期望比例 。
②若是单剪切，如下图所示，则可以产生 种雄配子，理论上后代带有CAIN 个体的比例为 。
43．（2025·广西·一模）塑料的主要成分为聚氯乙烯（PVC）、聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）等，会造成
难以降解的“白色污染”。自然界有多种细菌可以降解塑料的不同成分，研究人员欲通过筛选，并利用基
因工程技术培育能降解多种塑料成分的“超级菌”。
(1)研究人员欲比较大肠杆菌YT1 和芽孢杆菌YP1 两类细菌降解PE 塑料的能力，配置固体培养基，接种菌
株后表层覆盖0.1 mm 厚的PE 塑料。分组实验结果如表所示：
培养基及接种菌株
培养基1
培养基2
培养基3
单独培养并
单独培养并
提取YT1 和YP1 的核酸，并
与YT1 和YP1 混合，培养一
接种YT1
接种YP1
段时间后选取YP1 接种
降解圈（直径D/mm）
3.5
1.8
4.2
①筛选能分解PE 塑料的菌株时，应将菌株接种到以 为唯一碳源的培养基，从功能上讲，属于
培养基。
②培养基3 中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是 。
(2)研究人员发现一种胞外酶基因A，有降解PVC 塑料的功能。对A 基因测序可知，其调节功能区增加一
个碱基对A/T，可增强其表达能力。通过PCR 定点诱变技术在体外改造A 基因（如图1），然后构建表达
载体（如图2），导入受体菌培育“超级菌”。
注：LacZ 基因编码产生的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色
①图1 所示，大引物②是指以 （选填“引物1”或“诱变引物”）延伸得到的DNA 链为模板，
（选填“引物1”或“诱变引物”）与之结合延伸得到的DNA 子链。获得图1 中的改良A 基因至少需要
个PCR 循环。
②图2 中要实现质粒和改良A 基因的正确连接，应选用的限制酶是 。将构建的表达载体导入受体菌
后，在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养，长出的 （选填“蓝色”或“白色”）菌落是成功
导入重组质粒的菌株，依据是 。
44．（2025·江西赣州·一模）二化螟的幼虫主要危害水稻的叶和茎，转Bt 基因水稻能一定程度抵抗二化螟
的侵害。科研人员构建了GAL4/UAS 基因调控系统的转基因水稻，过程如图1 所示：GAL4/UAS 系统调控
基因表达的机理如图2 所示：UAS 序列可抑制靶基因表达，GAL4 蛋白是一种转录活性因子，可特异性地
识别并结合UAS 序列，激活UAS 下游基因的转录。
(1)图1 中①②操作过程涉及到的酶有 。③④过程除了要进行目的基因的检测和鉴定外，还需要进行
才能将细胞培养成转基因个体。
(2)现已获得crylC 基因、Bt 基因和绿色荧光蛋白GFP 基因，crylC 基因能促进Bt 基因的表达。若要以GFP
基因为标记基因筛选受体细胞，在构建UAS-靶基因表达载体时，应将crylC、Bt、GFP 三个基因插入到图
3（Ti 质粒的T-DNA 片段示意图）中的位置分别是 （用序号①②③作答）。
(3)将GAL4 转基因个体与UAS-Bt 转基因个体杂交得
，
中出现了抗虫植株，其表现抗虫性状的原因是
。利用
中抗虫个体自交得
，若
中表型及其比例为 ，则GAL4 基因和Bt 基因插入同一对同源染
色体上；若
中表型及其比例为 ，则GAL4 基因和Bt 基因插入两对同源染色体上（假设插入的基因
均有效，个体的存活率相等）。
(4)采用在水稻叶片和茎鞘中特异性表达的GAL4 基因的启动子，构建表达载体，得到转基因抗虫水稻，在
食品安全方面的意义是 。
45．（2025·天津武清·一模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和野猪引起的一种高致病性传
染病。科研人员在病毒ASFV 的K 基因（大小为790bp）中间插入荧光素酶基因（Gluc 基因）和增强型绿
色荧光蛋白基因（EGFP 基因），从而构建可以进行快速观察及定量检测酶活性的重组病毒（ASFV-Gluc-
EGFP）体系，如图1 所示。回答下列问题：
(1)构建出图1 所示的融合基因，需要借助的工具酶有 。Gluc 基因和EGFP 基因有助于重组病毒
的筛选，起到基因表达载体中 （填结构）的作用。
(2)为了初步鉴定重组病毒是否构建成功，科研人员提取相应病毒的DNA，选用图1 中的一对引物
进行PCR 扩增，扩增结果有1、2 两种类型，如图2 所示。该实验结果表明Gluc 基因和EGFP 基因
（填“有”或“没有”）插入病毒ASFV 的K 基因.
(3)若要验证重组病毒中Gluc 基因和EGFP 基因是否成功表达，科研人员可将猪肺泡巨噬细胞（PAMS）培
养一段时间后，平均分成A、B 两组，其中A 组接种病毒ASFV，B 组接种 ，过一段时间后检测
两组是否发出绿色荧光及 。
(4)同时科研人员又分别测定了A、B 两组的病毒数量变化，发现两者无显著差异，该结果表明 。
因此，该重组病毒体系的构建可为后续研究ASFV 的致病机制及药物治疗奠定基础。
46．（2025·福建龙岩·一模）科研人员采用重叠延伸PCR 技术，成功构建了突变的IKBA 基因（以下称
IKBAm），使IKBA 蛋白中第32、36 位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA 蛋白的磷酸化，
IKBA 蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。该技术采用具有互补末端的引
物，使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠
拼接起来，获得定点突变的新基因，原理如图，回答下列问题：
(1)利用重叠延伸PCR 技术诱变IKBA 基因时，将预期的突变碱基设计在PCR 的引物3 和引物4 中，分别进
行PCR 体系1 和PCR 体系2 的扩增。PCR 体系1 中加入的引物是 。PCR 体系1 和PCR 体系2 必须
分开进行的原因是 。
(2)将PCR 体系1、2 的产物（图中a、b 和c、d）混合后，继续进行下一次PCR 反应。在该PCR 反应体系
中经过高温变性后，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA 链相互结合，理论上有 种结合的可
能，其中能进行进一步延伸的是 组合的DNA 片段。
(3)质粒A 上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm 与质粒A 正确连接，在设计IKBAm 的扩
增引物时，需在引物 的
端分别添加相应的限制酶的识别序列。下表为重叠延伸PCR 引物序列表，
引物3 的①位置上有关的碱基序列是 （填写出6 个碱基）。
名称
引物序列
备注
引物1
GATCGGATCCCGTTCCAGGCGGCCGAGCGCCCCCA
BamH I 的识别序列：
G↓GATCC
引物2
TCCTGAATTCTCATAACGTCAGACGCTGGCC
EcoR I 的识别序列：
G↓AATTC
引物3
①_____TTCATGGCGTCCAGGCCGGCGTCGTGGCG
引物4
CGCCACGAC……ATGAAAGACGA
“…”表示省略的碱
基
(4)已知IKBA 基因的部分序列为：
数字94、95、96、106 表示碱基位置，丙氨酸的密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，则突变引物4 中省略
的碱基是 （选填①、②、③、④）。
①AGC、GGC、CTG、GAC、GCC
②UCG、GGC、CTG、GAC、ACC
③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC
④TCG、CCG、GAC、CTG、AGG
47．（2025·福建龙岩·一模）油菜花是两性花，其雄蕊的育性由位于同源染色体相同位置上的3 个基因（
、
、
）决定。研究人员为培育具有杂种优势的油菜新品种，利用品系1（
，雄性不育）、品
系2（
，育性正常）、品系3（
，育性正常），进行如下实验：
实验一：将品系1 与品系2 杂交，
均为雄性不育植株，将
与亲本回交获得
；
实验二：将品系1 与品系3 杂交，
均育性正常，将
与品系1 回交获得
．
(1)上述杂交实验中，在授粉前必须对品系1 采取的操作是 。
(2)若
、
、
基因中碱基数目不同，原因是基因突变时发生了 。根据杂交一、二的结果判断
、
、
之间的显隐性关系是 。
(3)SNP 是指基因组中由单个核苷酸的变异引起的DNA 序列多态性。当SNP 位点与某基因非常接近时，它
们在后代中往往保持连锁状态，使得SNP 可以作为特定基因的遗传标记。研究人员提取实验一中亲本、
、
若干植株DNA，利用PCR 扩增不同样本的SNP 遗传标记，电泳结果如下图：
①染色体互换通常发生在 时期，其引起的变异属于 。
②据图推测， 序列与雄性不育基因紧密连锁，可作为雄性不育基因的分子标记，理由是 。
③为进一步验证上述结论，研究人员提取实验二中亲本、
、
各植株DNA，并将
表现型一致的植株
DNA 混合，利用PCR 扩增不同样本的SNP 遗传标记，请在下图画出支持上述结论的电泳结果 。
48．（2025·天津河东·一模）植物为了适应干旱胁迫，在长期的进化过程中形成了从分子到表型的一系列
复杂的抗旱调控机制，其中沉积于植物表面的外角质层蜡质是防止水分散失、减轻干旱胁迫危害的重要屏
障。明确角质层蜡质调控关键基因，解析蜡质形成机理，能够为抗旱作物新品种培育提供基因资源和理论
依据。科研人员通过EMS 诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设
完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C 基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致
（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题。
(1)在C 基因两侧设计引物，PCR 扩增，电泳检测PCR 产物。如图泳道1 和2 分别是突变体Cer1 与野生型
（WT，纯合体）。据图判断，C 基因突变成c 基因的原因是 。
(2)将突变体Cer1 与纯合野生型杂交，
全为野生型，
与突变体Cer1 杂交，获得若干个后代，利用上述
引物PCR 扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR 产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道
（从1~5 中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。
(3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D 基因（位于另一条染色体上）也发生了
突变，产生了基因
，其编码多肽链的DNA 序列中有1 个碱基由G 变为T，但氨基酸序列没有发生变化，
原因是 。
(4)假设诱变过程中突变体Cer1 中的D 基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因
。CCDD 与
个
体杂交，
的表型为野生型，
自交，
野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格：
部分个体基因型
棕榈酸
16-羟基棕榈酸
颖壳蜡质
有
①
无
有
有
②
49．（2025·天津河东·一模）温度是影响微生物生长的重要因素，科研人员应用基因工程以实现通过温度
控制工程菌合成所需物质。
(1)大肠杆菌是一种常见的微生物，常被改造为基因工程菌，其原因包括 （写出2 点）。
(2)为实现温度控制蛋白质合成，科研人员设计了方案1，构建表达载体（见图1），将其导入大肠杆菌，
获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖，当培养温度为30℃时，C 基因编码的C 蛋
白形成二聚体， ，因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。
(3)为更精准调控荧光蛋白表达，将上述表达载体改造为方案2 中的载体（见图2）。与方案1 相比，方案2
的主要优势是 。
(4)为检测方案2，科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控
制见图3。依据方案2，每个菌落生长2 天后可出现4 个不同的荧光环带，请预测图4 所示菌落每个环带的
工程菌中荧光蛋白表达情况，在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色（注：环带1 形
成时间为0-48 小时，以此类推）。
菌落环带
1
2
3
4
所表达荧光蛋白的颜色
绿、红、绿
(5)聚羟基脂肪酸酯（PHA）常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA 是一种生物大分子，可由单体分子
3HB 和4HB 随机聚合，或通过分段聚合形成嵌段共聚物（见图5），其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的
合成过程如图5，请完善以下表格，通过改造方案2 以实现应用工程菌大规模生产优质PHA（不考虑各种
酶在不同温度下的活性差异）。
操作
目的
对方案2 表达载体的改造为：① 。
将构建好的表达载体导入大肠杆菌，获得工
程菌。
获得可以合成PHA 的工程菌。
以葡萄糖为原料配置培养基，灭菌后加入上
述工程菌。
配制培养基、接种。
控制发酵条件：② 。
发酵48 小时，获得3HB 比例为
25%的嵌段共聚物。
50．（2025·黑龙江吉林·一模）实验室某小组新发现一个调控水稻种子活力的基因Oshipll，并通过基因编
辑获得含有其突变基因a、b、c 的三种水稻，来鉴定该基因作用机制。利用CRISPR/Cas9 复合体进行基因
编辑时，复合体首先会定位目标序列（非模板链）的5´-NGG-3´位点（N 表示任意一种碱基），然后利用
自身所含的一段20bp 长度的向导RNA，与该位点5´端相连的序列互补配对，若能够互补，复合物会切割
互补序列某位点，使该位点插入或丢失部分碱基，可能导致基因突变失活。下图表示相应基因的非模板链
部分序列和编码的肽链的部分氨基酸序列。回答下列问题。
相应基因合成的肽链的氨基酸序列为
Oshipll MANSKSLLLCWCSLLLL……*73
a MANSKSLLLLLVLAPPP……*64
b MANSKSLLL*9
c MANSKSLLLLAAAAPPAL……*85
注：各个英文大写字母表示不同的氨基酸；*后面的数字表示肽链氨基酸个数；终止密
码子为UAA、UAG、UGA
(1)该复合物与基因工程基本操作工具中 酶作用相似，作用的化学键为 。
(2)若分析基因a、b、c 的突变位点，应设计 ，扩增相应基因，然后测序，并利用
分析比较得出突变位点。
(3)该复合物所含的向导RNA 的序列为5´- ...-3´（只填5´端前6 个碱基），b 基因所编码肽链的氨基
酸数目比Oshipll 减少的原因是 。
(4)下图图1 为携带基因Oshipll 及突变基因a、b、c 的水稻萌发处理后发芽率比较。图2 为用不同浓度
ABA 浸泡5 天后，携带基因Oshipll 及突变基因a、b 的水稻发芽指数（发芽指数可反映种子萌发的速度，
发芽指数越高种子萌发速度越快）比较。从图中数据可以得出基因Oshipll 对于水稻萌发的作用为
；出现图2 结果的作用机制可能是 。
51．（2025·山东聊城·一模）现发现一株叶色为黄绿色且雄性不育的双突变体两性植物（既可以自花传粉
又可以异花传粉），其野生型表型为叶色绿色且雄性可育。已知叶色和雄蕊的育性分别受A/a 和B/b 控制。
科研人员以该突变株（
）和野生型（
）进行了杂交，
50%为绿色雄性可育，50%为黄绿色雄性可育，
选取
中黄绿色雄性可育植株自交，所得
中绿色雄性可育：黄绿色雄性可育：绿色雄性不育：黄绿色雄
性不育=3：6：1：2．回答下列问题：
(1)结合实验分析，亲本
和
的基因型分别为 。
(2)
中绿色雄性可育中纯合子所占的比例为 ，让
中所有的黄绿色雄性可育植株间随机受粉，获得
的子代中绿色雄性不育植株的概率为
(3)如果将
中所有的绿色雄性可育株与绿色雄性不育株间行种植，则在绿色雄性不育株上收获的种子将来
发育成绿色雄性不育株的概率为 ，绿色雄性可育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率
为
(4)SSR 是DNA 中的简单重复序列，非同源染色体上、不同品种的同源染色体上的SSR 重复次数不同，故
常用于染色体特异性标记。科研人员提取出
亲本、
亲本及
中50 株雄性不育株叶肉细胞的核DNA，
利用6 号、8 号染色体上特异的SSR 进行PCR 扩增，电泳结果如图2。
①据图分析，控制雄性不育性状的基因可能位于 号染色体上。
②2 号不育株6 号染色体SSR 扩增结果出现的原因是 。
③请在图3 中画出
植株8 号染色体SSR 扩增后的电泳结果 。
52．（2025·广东梅州·一模）苯丙酮尿症是由于患者体内苯丙氨酸代谢途径中的酶发生缺陷，使得苯丙氨
酸及其代谢物酮酸在血液和组织中大量累积，进而阻碍脑的发育。研究发现，苯丙氨酸解氨酶（PAL）基
因可在大肠杆菌中表达并降解苯丙氨酸。科学家将PAL 基因导入到肠道益生菌Nissle1917 大肠杆菌
（EcN）中，构建工程菌EcN-PAL，用于治疗苯丙酮尿症。图1 为2.7Kb 的质粒，其中Ap 为氨苄青霉素抗
性基因，EcoRⅠ和PvuⅠ两种限制酶的酶切位点与复制原点之间的距离分别为0.6Kb 和0.8Kb。图2 为含
PAL 基因的DNA 片段。
回答下列问题：
(1)PAL 是一种胞内酶，据此推测EcN-PAL 的细胞膜上应具有 功能的蛋白质与PAL 协同工作，完成
EcN-PAL 的预期作用。
(2)利用PCR 技术扩增PAL 基因，若该基因编码区其中一条链的序列为5'-AGCCCTCC……
GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是______。
A．5'-CCTCCCCA-3'
B．5'-AGCCCTCC-3'
C．5'-GCTGGTTC-3'
D．5'-
GAACCAGC-3'
(3)据图分析，选用 酶切割PAL 基因和质粒，构建重组表达载体。为确保目的基因正确插入质粒中，
使用EcoRⅠ对重组DNA 分子完全酶切后，进行凝胶电泳分析。若电泳图谱中出现长度为 Kb 的条带，
则说明是符合要求的重组质粒。
(4)研究表明EcN 菌株不会在人体肠道中定殖，一段时间后会从胃肠道全部清除。据此推测，若服用EcN-
PAL 治疗苯丙酮尿症，需 （答出一点即可）。
53．（2025·山东济宁·一模）为筛选出能与SARS 病毒的S 蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基
因工程技术，在S 蛋白末端添加TAP 标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG 类抗体结合）形成S-TAP
融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S 蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下
列问题。
注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI 表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA 末端均
不同；F、R 表示引物；T7 表示启动子；Kozak 序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。
(1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR 扩增S 基因时，需在F 引物的5'端外侧依次添加
序列。PCR 时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。
(2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物，DNA 分子的迁移速率与 有关。
(3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP 中，T7 的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。
(4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP 融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴
加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-
TAP 融合蛋白。
54．（2025·安徽滁州·一模）滁菊是菊花中花瓣最为紧密的一种，素有“金心玉瓣，翠蒂天香”之美誉，
名列“四大名菊”之首。在滁菊的生长过程中，常常会受蚜虫的危害，使茎叶粘连、叶片卷缩等。研究发
现雪花莲凝集素（GNA）和尾穗苋凝集素（ACA）可以有效抑制蚜虫生长和繁殖，并且对蚜虫天敌的生长
无害，所以研究人员利用转基因技术获得了抗蚜虫滁菊的新品种。下图表示培育滁菊新品种的过程，图中
的α、β、γ、δ 均为限制酶。
回答下列问题。
(1)获得GNA-ACA 融合基因的过程中，可以使用β、γ 两种不同限制酶的原因是 。过程①是基因工程
的核心步骤，其目的是 ，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)重组质粒导入大肠杆菌时，需要使用Ca2+处理大肠杆菌，其目的是 。
(3)图中过程②是 ，过程③要进行光照培养，其作用是有利于 和植物光合作用。
(4)在上述培育滁菊新品种的过程中没有出现操作错误，但在对所得到的乙中的滁菊植株进行抗虫性检查时，
发现有许多滁菊植株没有抗虫性。请你分析出现以上结果的原因可能是 （答出一点即可）。
55．（2025·安徽·一模）某些植物凝集素如雪花莲凝集素和尾穗苋凝集素对一部分昆虫有毒性，可用作抗
虫转基因植物的目的基因。研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体
（pBI121）结合，然后导入棉花细胞，获得转基因抗虫棉。部分过程如图所示，图中KpnⅠ及XhoⅠ为载体
上限制酶的识别位点。回答下列问题：
(1)限制酶SmaⅠ的识别序列为
，可使用SmaⅠ处理GNA 及ACA，然后用 DNA 连接酶处理可
获得二者的融合基因。若图1 中融合基因的①链为模板链，使用限制酶KpnⅠ及XhoⅠ构建基因表达载体时，
需在融合基因的ACA 侧添加限制酶 的识别序列。
(2)将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是 （答出两种）。取一部分在添加了卡那霉素的
培养基上正常生长的棉花细胞，通过 技术获得的棉花植株不一定具有抗虫性状的原因是
（答出两点）。
(3)图2 是重组质粒的部分结构放大示意图，对单独使用KpnⅠ处理融合基因和载体得到的转基因棉花细胞
需要进行进一步鉴定：获得棉花细胞的DNA，再用图2 中的引物 进行PCR，并利用 技术对
PCR 产物进行鉴定。
56．（2025·安徽·一模）香蕉在生长过程中常因感染病原体而减产。为了增加香蕉的抗病能力，从某生物
中提取mRNA 通过逆转录获得抗病基因，构建表达载体、通过农杆菌转化法获得转基因抗病香蕉，过程如
图1。回答下列问题：
(1)DNA 在扩增的过程中需要引物，引物是指 。由mRNA 逆转录获得抗病基因时，不但需要引物，
且需在引物 端添加相应的限制酶序列。
(2)在构建重组质粒时，需要加入相应的限制酶，请写出被限制酶切制后抗病基因两端的黏性末端序列：
(3)用农杆菌侵染香蕉组织块，其目的是 。
(4)图1 中①②过程培养基中生长素和细胞分裂素的 等都会影响植物细胞的发育方向。
(5)植物组织培养获得的转基因抗病香蕉需要进行个体生物学水平的鉴定。欲从个体生物学水平来鉴定抗病
基因是否赋予香蕉抗病特性的操作是 。
57．（2025·上海·一模）重组人纤溶酶原激活剂（hPA）能够高效特异性地溶解血栓，目前已培育成功
rhPA 转基因兔，作为乳腺生物反应器批量生产药物。
某科研团队构建重组质粒PCL25/rhPA 如图1 所示（该质粒以β
casein
﹣
作为调控序列，以CMV 为启动子，
其中SalⅠ、XhoⅠ、NotⅠ所在位置表示相关限制酶切点）。
(1)重组质粒PCL25/rhPA 如图1 所示。rhPA 基因上游的CMV 能被 结合，从而开启转录过程。在
PCL25 质粒的 限制酶切位点处插入化学合成的rhPA
cDNA
﹣
片段。
(2)氨苄西林抗性基因是ampr，能否用只含有氨苄西林的培养基筛选出导入重组质粒的细胞？ 。原因
是 。
(3)为筛选出含有重组质粒P3（图2）的菌落，tetr代表四环素抗性基因，采用含有不同抗生素的平板进行
筛选后得到A、B、C 三类菌落，其生长情况如表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果
判断，应选择的目标菌落是 （填表中字母）类，另外两类菌落的质粒导入情况分别是 。
平板类型
菌落类型
A
B
C
无抗生素
+
+
+
氨苄西林
+
+
﹣
四环素
+
﹣
﹣
氨苄西林+四环素
+
﹣
﹣
58．（2025·贵州·一模）CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一把“分
子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定SgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然
后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
(2)SgRNA 可识别并特异性结合目标DNA 序列，二者结合所遵循的原则是 。Cas9 蛋白相当于
酶，可催化 键断裂，可在受体细胞中特定的基因位点进行切割，导致 （填变异类型），
改变基因结构。
(3)构建完成CRISPR/Cas9 重组质粒后，需要对其进行扩增，扩增的原理是 。
(4)CRISPR/Cas9 基因编辑技术可通过改变 的碱基序列，从而可以任意编辑基因组上的各种靶
序列。若要将目标基因从目标DNA 上切除下来，一般需要设计 种不同的SgRNA。
(5)CRISRP/Cas9 基因编辑技术中常用的SgRNA 长度为20 个碱基左右。某SgRNA 因细胞内其他DNA 序列
也含有与其相对应的序列，造成该SgRNA 错误结合而脱靶，解决的具体措施是 。
59．（2025·海南·一模）抗性淀粉是指在小肠中不能被消化吸收但能够作为肠道中某些消化细菌的底物。
由于其不能被快速分解，相比于其他淀粉来说具有较低的升糖指数，在饮食上可一定程度地缓解糖尿病。
除此之外，抗性淀粉还有降低胰岛素反应、调节肠道功能、能防止脂肪堆积等生理功能，因此其作为一种
新型的膳食纤维，正在被广泛追崇。抗性淀粉（RS）的含量与直链淀粉与支链淀粉的含量比呈显著相关。
可以通过提高直链淀粉的含量来提高 RS 的比例。
水稻是我国的主要粮食作物，是人体淀粉的重要来源。研究者设想特异性编辑水稻品种“嘉花 1 号”的
淀粉分支酶基因，通过降低或抑制该基因的正常表达，从而影响该酶功能，减少支链淀粉的合成，升高直
链淀粉和支链淀粉之间的比例，达到抗性淀粉上升的目的。
(1)如图1 是水稻中淀粉的转化情况。分析可知，淀粉分支酶 （填“SSS”“GBSS”或“SBE”）是支链淀
粉形成过程中的关键酶。
(2)CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9 基因表达产生的
Cas9 蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA 双链以敲除或破坏目标基因（靶基因）其工作原理如图2 所示。
研究发现CRISPR-Cas9 系统广泛存在于细菌细胞内，从功能上看，细菌体内的Cas9 类似于基因工程中的
，推测细菌中Cas9 存在的意义： 。
(3)自然界中的水稻不存在CRISPR/Cas9 系统，可以利用基因工程技术。为了导入CRISPR/Cas9 系统需要
获取哪些基因？ 。
科研团队选择利用农杆菌转化法将含CRISPR/Cas9 系统导入水稻细胞内。
这里所用的载体是 ，选择它的原因是 。
基因工程操作流程如下：
获取目的基因→构建重组质粒→转入 →导入水稻叶细胞→筛选得到含CRISPR/Cas9 系统的水稻细胞
→ 得到目标水稻植株，可从哪些方面去检测和鉴定得到的水稻是否达标？ （写1 点
即可）。
60．（2025·黑龙江辽宁·一模）植物中的光敏蛋白Р 可以感受红光和远红光，在活化状态下可以与核输入
蛋白（F）结合形成复合体，并被转运到细胞核中起作用；在失活状态下则与F 蛋白分离。研究人员利用
光敏蛋白的性质设计了转基因表达系统（REDMAP 系统）。回答下列问题：
(1)糖尿病是一种常见的代谢类疾病，主要通过注射胰岛素进行治疗。研究人员利用图1 所示的REDMAP
系统治疗糖尿病小鼠。当使用 （选填“红光”或“远红光”）照射时，启动子UAS 激活并顺利
表达胰岛素基因。这种治疗方式的优势在于 。研究人员用腺相关病毒（AAV）作为基因载体
将该REDMAP 系统导入糖尿病小鼠体内。使用前需要对AAV 中编码病毒蛋白的部分进行 ，以
减少感染时机体的 ，使其能在体内长期存在；同时基因载体上必须保留 ，使外源基因
在细胞内能自主复制。
(2)为检验REDMAP 系统治疗糖尿病的效果，研究人员使用链脲佐菌素（诱导糖尿病的物质）注射正常小
鼠，观察到小鼠出现 症状后，均分成三组在适宜条件下进行不同的实验处理。实验结果如图2 所
示，A、B、C 三组的处理分别为注射空载病毒AVV 溶液、 、 。实验结果显示，
REDMAP 系统 。
61．（2025·黑龙江哈尔滨·一模）金黄色葡萄球菌（简称Sa）可能引发从轻微皮肤感染到严重的全身感染，
尤其对免疫力低下者危害更大。预防感染的关键在于良好的卫生习惯和合理使用抗生素。但不规范使用抗
生素易出现抗药性Sa。推测Sa 产生头孢霉素抗性与其R 基因有关。为验证该推测，以下图中R 基因的上、
下游片段及质粒1 共同构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2 中的上、下游片段分别与Sa 基因组中R 基
因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa 的R 基因。
(1)操作步骤如下：
①根据图1 信息，质粒2 的构建过程中用引物 （填数字）进行PCR 扩增，每次循环一般可以分为
三步，n 次循环后可以得到等长的目的基因 个。然后选择限制酶 对扩增产物进行酶切，然后回
收上、下游片段，再与SacII 酶切质粒1 所得大片段连接，获得质粒2。
②用质粒2 转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培
养获得含质粒2 的Sa 单菌落。
③将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R 基因的概率，随后稀释涂布在含 的平板上，
筛选并获得不再含有质粒2 的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若
无法增殖，则对应菌落中细菌的R 基因可能被敲除。
(2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR 扩增，产物一般通过 （技术名称）来
鉴定。检测结果如下图所示，表明R 基因已被敲除的是 。
62．（2025·江西·一模）研究人员以酵母菌为受体细胞，运用酵母双杂技术找到了柑橘黄龙病致病菌分泌
的SDE19 蛋白在柑橘中发挥作用的靶蛋白。酵母双杂技术原理如下，酵母菌的转录激活因子包括DNA 结
合域（BD）和转录激活域（AD），这两个结构单独存在时不能激活转录。将待测蛋白X 与BD 融合，蛋
白质Y 与AD 融合，蛋白X 和Y 有相互作用时，两结构域能呈现转录因子活性，激活报告基因的表达，如
图1 所示。请回答下列问题：
AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TRP、LEU 分别编码合成Trp、Leu 两种氨基酸的酶；Sal I、Nde I、EcoR
I，BamH I，Not I，HindIII 为酶切位点。
(1)研究人员将编码SDE19 蛋白基因连接到含有编码BD 多肽基因的质粒PBD 中，获得BD-SDE19 融合表
达载体。通过PCR 获取SDE19 蛋白基因时，需在引物1 和引物2 的 （“3′或5′”）端分别添加酶切
位点 和 。
(2)为寻找SDE19 在柑橘中的靶蛋白，需要提取柑橘细胞的RNA，通过 ，再将其插入含有编码AD
多肽的基因质粒pAD 中，构建AD-Yn 表达载体（Yn 表示不同cDNA 表达的蛋白质）。
(3)研究人员选用Trp、Leu 氨基酸合成缺陷型酵母菌进行实验，原因是 ，若报告基因为LacZ（LacZ
编码的物质可以降解X-Gal 使菌落呈蓝色，否则为白色），培养基中添加X-Gal，含有靶蛋白的酵母菌菌
落会表现为 色。
(4)酵母双杂技术在研究和鉴定蛋白质互作方面有重要作用，以下适合采用此技术进行的是______。
A．判断控制某一性状的两对基因能否独立遗传
B．筛选宿主细胞上能与新冠病毒S 蛋白特异性结合的受体
C．判断RNA 聚合酶和某启动子的结合是否具有特异性
63．（2025·山西吕梁·一模）苯丙酮尿症是单基因遗传病，科学家将正常基因D 导入该病患者的细胞，以
治疗该病。图甲为A、B、C 三种质粒，图乙为含有目的基因D 的DNA 片段，图丙为重组载体的示意图。
Ap 为氨苄青霉素抗性基因，Tc 为四环素抗性基因，LacZ 为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物
Xgal 转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，EcoRⅠ（0.6Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）为限制酶及其切割位点与复制原
点之间的距离。回答下列问题：
(1)科学家将正常基因D 导入该病患者的细胞中常用的方法是 。图甲中三种质粒适宜作为载体的是质
粒 （填字母），与另外两种质粒相比，其优点是 。
(2)获取目的基因D 时应选择乙图中 限制酶对其所在的DNA 进行切割。如果仅知道D 基因首尾的部
分核苷酸序列，可根据D 基因已知核苷酸序列合成引物，利用 技术扩增目的基因。
(3)将目的基因D 和甲图中相应质粒连接后，得到图丙中三种重组质粒。为选出正向连接的重组质粒，使用
限制酶对重组质粒完全酶切后，进行电泳分析，若电泳图谱中出现长度为 Kb 的两条带，则为正向
连接的重组质粒。
(4)利用自身不含LacZ 基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，若要在已转化的含重组质粒、已转
化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是 。
64．（2025·山东菏泽·一模）北京紫眼果蝇（基因型hh）是从野生型红眼果蝇（基因型HH）中分离出来
的隐性突变体。对控制果蝇眼色的H、h 基因进行了相关研究。F1、F2、F3、P1、P2、P3 这六种引物及H
基因结构如图1 所示。
(1)为获取h 基因，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA 作为 ，用图1 中F1、P1 作为引物进行PCR，
推测这对引物中与α 链结合的引物碱基序列为5’- -3'（写出前6 个碱基），扩增得到的DNA 片段长
度超过7000bp，说明北京紫眼的h 基因是由于H 基因中插入外来片段形成的。
(2)根据图1，运用PCR 继续探究突变位点在H 基因上的大致位置，简要写出实验思路： 。
(3)为验证H 基因突变是北京紫眼性状产生的原因，运用UAS-GAL4 转基因体系将H 基因导入北京紫眼果
蝇中，流程如图2。GAL4 基因的表达产物是一种转录因子，UAS 是一段特殊的具有调控功能的DNA 片段。
UAS 上有GAL4 蛋白的结合位点，只有当GAL4 和UAS 存在于同一个体时，GAL4 才能激活与UAS 相连
接的下游基因的转录。
①H 基因在品系1、2 中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，H 基因应该插入到位点 （填
“a”、“b”或“c”）。
②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，品系1 和品系2 杂交的F1代中红眼果蝇所占比例
为 ，F1代红眼果蝇雌雄杂交得到的F2代中红眼所占比例可能为 。
65．（2025·广东深圳·一模）乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程
和分子生物学中有广泛应用。如图表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，回答下列问题：
(1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用
（填“①”或“②”）途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身
代谢，此时乳糖作为 为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与 结合，从而调控结构基
因表达。
(2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，
如图1。用蓝光照射时，GFP 基因的表达情况是 。根据该原理，研究人员构建了如图2 基因表
达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是 。
(3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG（诱导物）、光控化改造
后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4 组实验的设置情况，表格里填“－”和“+”分别表示不
处理和处理。
处理
组别
1
2
3
4
野生型大肠杆
菌
光控化改造后的大肠杆
菌
IPTG
蓝光
(4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境
下用三角形遮光板遮挡培养基（如图），适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象
。若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是 。
培养基遮光示意图（黑色区域为退光区）
处理
组别
1
2
3
4
野生型大肠杆
菌
光控化改造后的大肠
杆菌
IPTG
－
+
－
－
蓝光
－
－
+
－
66．（2025·广东汕头·一模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向
大肠杆菌体内导入含特殊DNA 序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(下图)，为环境污染治理提供新方
法。
回答下列问题：
(1)Pc 和Ps 启动子可被 酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图
上图可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活PS 启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判
定环境中的水杨酸浓度。
(2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1 替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸
条件下荧光强度扩大为原来的2 倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是 。
请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路： 。
(3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp 基因
连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR 判定融合基因已准确连
接，应选择如图中的引物组合是 。
(4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将
ccdA、ccdB 两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB 基因表达毒蛋
白可使工程菌致死，ccdA 基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB 分别插入下图中的
、 位点。
67．（2025·四川巴中·一模）草甘膦是一种应用广泛、高毒高效且可生物降解的除草剂。研究人员在施加
草甘膦的土壤中发现某种细菌体内存在抗草甘膦的EPSPS 基因，并利用农杆菌转化法将该基因转入匍匐剪
股颖(一种常用于高尔夫球场的草坪草)，从而获得对草甘膦具有抗性的转基因匍匐剪股颖。EPSPS 基因编
码区的非模板链序列为5′-ACTATG……GCTGCC-3′，针对该序列设计的一对引物FP 和RP 可用于EPSPS
基因的PCR 扩增。获得转基因匍匐剪股颖的过程如图所示。请回答下列问题：
(1)研究人员利用Ti 质粒构建基因表达载体时，需在EPSPS 基因的上游导入有特殊序列结构的启动子，启
动子的作用是 ；图中引物FP 的序列为5′- -3′(只写出前6 位碱基)。
(2)图中的选择培养基需添加 从而只允许从农杆菌中获得了T-DNA 的植物细胞增殖，SIM 培养
基通常具有较高浓度的 ，能够促进植物体芽的形成。
(3)抗草甘膦的转基因作物可能由于基因流动影响生态安全。研究人员将一高尔夫球场作为控制区，种入抗
草甘膦匍匐剪股颖，在控制区外不同位点(如图所示)种植了若干株非转基因的匍匐剪股颖和亲缘物种作为
哨兵植物。为确定转基因作物向其同种或亲缘物种转移EPSPS 基因的情况，一段时间后需将用于监测的哨
兵植物的种子收集并培育成幼苗，请写出从分子水平上检测EPSPS 基因是否流入幼苗的方法：
(答出一种即可)；经检测后发现EPSPS 基因流动的最大距离在匍匐剪股颖和亲缘物种中分别为21 公里和
14 公里，请推测哨兵植物主要放置在顺风向的原因是： ；基于上述分析，提出一条有效防止
转基因污染的策略： 。
68．（2025·山西·一模）碱基编辑系统是一种新型基因修饰技术，通过在双链造成单切口后对碱基进行单
一碱基的精准替换，提高单碱基编辑的精确性及效率，为家畜育种的精确基因修饰提供了一种更简单、更
有效的方法。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）能将G-C 碱基对替换为A-T 碱基对，作用模式如图。请回答下列
问题：
(1)CBE 的作用原理是 。欲将G-C 碱基对最终替换为A-T 碱基对，丙还需要复制
次。
(2)肌肉生长抑制素（MSTN）可抑制肌细胞的增殖与分化。科研人员利用碱基编辑工具成功改变哈萨克羊
MSTN 基因，使终止密码子提前出现，显著增加了肌肉纤维的直径和数量，获得改良品种。
①用改造后的基因构建表达载体时，还需要在该基因的上游和下游分别添加 和 ，
使用的工具酶有 ；构建的表达载体通过 的方式导入哈萨克羊的 中。
②改造后的MSTW 基因表达的蛋白质肽链比MSTN 要 （填“长”或“短”），失去其应有
的功能。
69．（2025·吉林延边·一模）药物A 是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好
的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。回答下列问题。
(1)科学家根据药物A 的氨基酸序列人工合成DNA 片段，由于 ，该方法得到的DNA 片段有多种可
能，也可以用PCR 技术从植物细胞中扩增出药物A 基因，该技术的原理为 。
(2)下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点（限制酶的识别序列和
切割位点如表所示），其中lacZ 基因表达的产物可将无色物质X-gal 催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝
色。回答下列问题。
注：kb 代表碱基对，Kanr基因为卡那霉素抗性基因
限制酶
BamHⅠ
EcoRⅠ
Sau3AⅠ
SmaⅠ
XmaⅠ
识别序列
和切割位
点
-G↓GATCC-
-G↓AATTC-
-↓GATC-
-CCC↓GGG-
-C↓CCGGG-
①利用PCR 技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如下，扩增时选用的两种引物
碱基序列为（注明序列的5′和3′端） 、 。
②分析上图，为将目的基因准确插入质粒中，最好选用 酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和
质粒需使用 （填“T4”、“E.coli”或“T4或E.coli”）DNA 连接酶处理，才能得到重组质粒。
③将目的基因导入受体菌时，若要准确筛选出含重组质粒的受体菌，需要将其培养在添加了 的培养
基上。
④若将重组质粒用EcoRⅠ充分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，可得到长度为 bp 的条带。对于琼
脂糖凝胶电泳结果符合预期的PCR 产物条带，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
70．（2025·四川·一模）构建可降解多环芳烃的转基因大肠杆菌是解决在石油及页岩油开采过程中多环芳
烃污染的手段之一。科研人员利用从石油中分离得到的石油降解菌，通过 PCR 扩增的方法得到邻苯二酚
1，2 双加氧酶(C12O)基因片段，再将C12O 基因连接到载体pET-28a 转入大肠杆菌中，期望获得可降解多
环芳烃的转基因大肠杆菌。相关信息如图所示。
(1)从石油降解菌基因组 DNA 中PCR 扩增目标基因 C12O 时，每次循环的步骤一般可以分为 。PCR
扩增时，图示中四种引物可以扩增 种不同长度的目标基因片段。
(2)为将扩增后的目标基因C12O 插入载体pET-28a.后与卡拉霉素抗性基因读取方向一致，需在引物末端添
加限制酶识别序列。据图可知，在R1、R2 和R3末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在Rx
末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从C12O 基因扩增到载体pET-28a 构建完成
的整个过程除了需要多种限制酶以外还需要 酶。
(3)与图中载体pET-28a 上卡拉霉素抗性基因的启动子结合的酶是 。将构建的载体pET-28a 成功导
入大肠杆菌后，含R1、R2与 Rx 扩增产物的大肠杆菌能够有效降解多环芳烃，含R3与 Rx 扩增产物的大肠
杆菌不能降解多环芳烃。含 R3与 Rx 扩增产物的大肠杆菌不能降解多环芳烃的原因可能是 。
71．（2025·陕西西安·一模）某科研人员将甜蛋白基因导入番茄，可提高番茄甜味，改善果实品质。如图
为甜蛋白基因和Ti 质粒上限制酶切位点示意图。回答下列相关问题：
(1)利用PCR 技术扩增甜蛋白基因时，为了特异性扩增甜蛋白基因序列，需根据 设计引物；每
次循环一般可以分为 、 、 三步。
(2)用限制酶切割含有甜蛋白基因的DNA 片段时，不用限制酶BamHⅠ的原因是 。科研人员最
终选择了限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割质粒和含有甜蛋白基因的DNA 片段，而不是选择限制酶XbaⅠ和
EcoRⅠ的理由是 。
(3)为了让甜蛋白基因进入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA 上，可以将甜蛋白基因插入Ti 质粒的
中。将基因表达载体导入农杆菌前，需用Ca2+处理农杆菌，其目的是 。为了确定农杆菌中是
否导入基因表达载体，需将农杆菌置于含 的培养基中进行培养，然后用筛选出来的农杆菌去
侵染番茄细胞。
72．（2025·江西新余·一模）土壤盐分过高对植物的伤害作用称为盐胁迫。SOS 信号转导途径是介导盐胁
迫下细胞外排Na+，维持Na-/K+平衡的重要调节机制。盐胁迫出现后，磷脂分子（PA）在质膜迅速聚集并
与能催化底物磷酸化的蛋白激酶SOS2 结合，致使SOS2 接触激活钠氢转运蛋白SOS1，并使钙结合蛋白
SCaBP8 磷酸化，具体调节机制如图所示。请回答下列问题：
(1)盐胁迫下，通过SOS 信号转导途径，细胞内的Na+/K+比值 （填“升高”或“降低”），据图推
测磷酸化的SCaBP8 的作用机理 。
(2)科学家通过基因工程在水稻中过量表达SOS1 蛋白，以期增强水稻抗盐能力。
①为获得编码SOS1 蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过 获得模板DNA，再经PCR 获得
SOS1 基因片段。
②测序表明，SOS1 基因中A+T 含量占53%，模板链中C 的含量为26%，那么编码链（非模板链）中C 的
含量为 %。
③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1 基因。序列分析发现SOS1 基因内
部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1 基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1 基因两端分别添
加 两种限制酶的识别序列，将SOS1 基因插入载体前，应选用 两种限制酶对载体酶切。
生物技术的伦理和安全
一、单选题
1．（2025·宁夏银川·一模）生物技术就像一把“双刃剑”，它既可以造福人类，也可能在使用不当时给人
类带来潜在的危害。下列叙述错误的是（ ）
A．研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染
B．干细胞培养在临床医学等领域前景广泛，但也可能面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险
C．生物武器是用病毒类、干扰素及生化毒剂类等来形成杀伤力
D．反对设计试管婴儿的原因之一是避免有人滥用此技术选择性设计婴儿
2．（2025·安徽马鞍山·一模）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、
TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水
稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（ ）
考点02
A．T-DNA 插入到水稻的染色体DNA 中可能会影响水稻自身基因的表达
B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因
C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA 连接酶不具有专一性
D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物
3．（2025·安徽黄山·一模）抗虫和耐除草剂玉米“双抗12-5”是我国自主研发的转基因品种。在转基因产
品的研发、生产、销售等环节，可采用PCR 技术进行基因监测，为转基因生物安全监管提供依据。下列叙
述错误的是（ ）
A．PCR 开始阶段的预变性可使模板DNA 变性更充分
B．PCR 循环过程中，复性的目的是使DNA 聚合酶与模板相结合
C．进行PCR 基因监测时，应使用待检目的基因的特征序列作为引物
D．安全监管中，应阻止检测出转基因扩增产物的非转基因标识农产品上市
4．（2025·浙江温州·一模）下列关于生物技术安全与伦理问题的叙述，错误的是（ ）
A．我国禁止进行任何生殖性克隆人实验
B．治疗性克隆不会产生道德、伦理问题
C．我国反对生物武器的研发、生产和扩散
D．转基因食品存在引发过敏的风险
二、多选题
5．（2025·江西·一模）除草剂有效成分草甘膦的作用机理是和PEP 竞争性结合EPSP 合酶，从而扰乱生物
体的正常氮代谢。但作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有杀伤作用，这大大限制了其在农
业生产中的应用，培育抗草甘膦作物将会解决这一难题。下列说法错误的是（ ）
A．长期使用草甘膦除草剂，会导致杂草产生抗除草剂突变，降低除草剂的效果
B．根据草甘膦的作用机理，可通过导入强启动子使EPSP 合酶过量表达获得抗草甘膦作物
C．可通过蛋白质工程直接替换EPSP 合酶个别氨基酸，使草甘膦无法与EPSP 酶结合
D．在培育抗草甘膦作物时，为避免外源基因流入杂草，最好将外源基因插入细胞核基因组
