文档文本内容
专题15 基因工程
考点概览
考点01 重组DNA 技术的基本工具
考点02 基因工程的基本操作程序和应用
考点03 蛋白质工程
重组DNA 技术的基本工具
一、单选题
1．（2025·山西·三模）某研学小组实验时出现了异常现象，他们对实验进行了改进。下列改进措施错误的
是（ ）
异常现象
改进措施
①
用质量浓度为0.5g/mL 的蔗糖溶液观察不到洋葱质
壁分离复原现象
将质量浓度为0.5g/mL 的蔗糖溶液更换成质量浓
度为0.3g/mL 的蔗糖溶液
②
用95%的酒精、二氧化硅和碳酸钙提取新鲜菠菜绿
叶中的色素时提取液颜色偏浅
在95%的酒精中加适量无水碳酸钠
③
用2mol/L 的NaCl 溶液提取新鲜洋葱DNA 并用二
苯胺试剂检测时蓝色偏淡
将2mol/LNaCl 溶液更换成1mol/L
④
用光学显微镜观察蝗虫卵巢看不到减数分裂各时期
细胞
换用蝗虫精巢为实验材料重复实验
A．①
B．②
C．③
D．④
2．（2025·山东泰安·三模）关于“DNA 的粗提取与鉴定
、
”
“DNA 片段的扩增及电泳鉴定
实验，下列
”
说法正确的是（ ）
A．将过滤的洋葱研磨液低温放置几分钟，取沉淀物备用
B．在白色丝状物中加入二苯胺试剂即可出现蓝色
C．根据待分离DNA 片段的大小，用扩增缓冲液配制成琼脂糖溶液
D．加样孔要留出一个孔加入指示分子大小的标准参照物
3．（2025·甘肃白银·三模）下列有关“DNA 粗提取与鉴定”“DNA 片段的扩增及电泳鉴定
实验的叙述
”
，
错误的是（ ）
A．将洋葱研磨液离心后保留上清液并加入冷酒精静置后，可收集到DNA
考点01
B．电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理
C．电泳鉴定DNA 时，将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液不能没过凝胶
D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需停止电泳，并取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
4．（2025·山西晋城·三模）几种限制酶的识别序列和切割位点如表所示。下列相关叙述正确的是（ ）
限制酶
识别序列和切割位点
BamHI
5'-G↓GATCC-3'
Sau3AI
5'-↓GATC-3'
Acc65I
5'-G↓GTACC-3′
A．3 种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端
B．经Acc65I 酶切后得到的黏性末端序列为5'-GTAC-3′
C．能用Sau3AI 酶切的DNA 序列亦可被BamHI 酶切
D．目的基因和质粒分别用BamHI 和Sau3AI 酶切后，用DNA 连接酶连接形成的重组质粒可被BamHI
酶切
5．（2025·辽宁·三模）限制酶来源于细菌的
限制
“
-修饰
系统（
”
R-M 系统）。典型的R-M 系统由限制酶
和甲基化酶构成，通常成对出现，一般具有相同的DNA 识别位点。如图为细菌利用
限制
“
-修饰
系统抵
”
御噬菌体入侵的示意图，下列相关叙述错误的是（ ）
注：REase 表示限制酶，MTase 代表甲基化酶。
A．REase 能识别双链DNA 上的特定碱基序列并切割特定部位的磷酸二酯键
B．DNA 分子经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式
C．MTase 作用时可阻止噬菌体的限制酶破坏细菌的DNA 分子
D．R-M 系统中限制酶和甲基化酶成对出现是细菌在进化中形成的防御机制
6．（2025·福建泉州·三模）基因工程的诞生和发展，离不开科学发现和技术发展的支持。下列有关叙述错
误的是（ ）
A．质粒的发现为基因工程提供了基因转移的
分子运输车
“
”
B．DNA 合成仪的问世为目的基因的检测与鉴定提供了方便
C．PCR 为获取目的基因提供了有效手段
D．基因组编辑技术的发明为目的基因的定向变异提供新途径
二、解答题
7．（2025·广东惠州·三模）桃源黑猪是我国地方猪种的典型代表，具有瘦肉率低的缺陷。MSNT（肌肉生
长抑制素）是控制动物
双肌性状
的基因，其功能为可抑制动物骨骼肌增生，增加脂肪沉积。研究人员
“
”
利用sgMSNT/Cas9 复合物敲除MSNT 基因获得了桃源黑猪新品种。图1 中的sgMSNT/Cas9 复合物中，
sgMSNT 是能准确识别MSNT 基因序列的RNA，并引导Cas9 蛋白对DNA 进行切割。图2 为利用该技术成
功敲除MSNT 基因后，通过胚胎工程获得桃源黑猪新品种的操作步骤。回答下列问题：
(1)Cas9 蛋白相当于 酶，可催化 键断裂，若图1 中复合物所识别的DNA 序列为5′-CCATC-3′，则
sgMSNT 的序列为 。
(2)图1 所示技术可弥补桃源黑猪瘦肉率低的缺陷的原因是 。
(3)图2 中形成重构胚后可通过 法（写1 种）激活，为获得更多胚胎，可在胚胎发育到 期时进行
。
8．（2025·浙江·三模）生物某种性状缺失的原因有多种，如基因突变、染色体畸变、DNA 甲基化等。为
确定某易感锈病小麦的易感性状是否为基因突变导致的，对该易感锈病小麦的DNA 进行了相关检测。回
答下列问题：
(1)DNA 鉴定时，先利用 技术扩增DNA，再经 后电泳分离，根据电泳条带情况判断是否为
基因突变引发。更精确的方法是对易感锈病小麦进行DNA ，并将结果与基因数据库中小麦基因组序
列进行 ，判断是否发生突变以及突变的 。
(2)提取DNA 时，需对样本进行冷冻研磨。研磨前进行冷冻的目的是 ，研磨时加入的研磨液中含有
十二烷基硫酸钠（SDS）和乙二胺四乙酸二钠（EDTA），其中EDTA 的作用是 。
(3)PCR 时，向离心管中加入PCR 扩增缓冲液、模板DNA、F1-R1、F2-R2和F3-R3三对引物、无菌水，还有
，离心后进行PCR，PCR 条件程序为预变性10min→循环（变性1min→退火1min→延伸1min）35 轮
延
→
伸10min，其中预变性10min 的目的主要是 。
(4)电泳时，将样品加到靠近电源 的加样孔内，电泳缓冲液中含有少许溴酚蓝，溴酚蓝在琼脂糖凝胶
中的迁移速率比DNA ，因此可根据溴酚蓝的所在位置确定 时间。凝胶中含有荧光染料，便
于在 光下观察DNA 条带位置。
基因工程的基本操作程序和应用
一、单选题
1．（2025·贵州遵义·三模）骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织变薄为特征的系统性骨病。研究者将人
BMP-2 基因、CXCR4 基因与双歧杆菌ClyA 基因拼接后，导入双歧杆菌，用于治疗模型鼠骨质疏松症。其
过程及作用机制如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
注：ClyA 为双歧杆菌的一种细胞膜蛋白；BMP-2 为骨形态发生蛋白2；CXCR4 可以将基质细胞迁移到骨
质疏松处
A．重组质粒上应含有双歧杆菌ClyA 基因的特异性启动子
B．BMP-2 基因和CXCR4 基因需要拼接到ClyA 基因下游
C．培养重组双歧杆菌的培养基中应加入抗生素防止杂菌污染
D．胞外囊泡可能诱导基质细胞迁移到骨质疏松处并分化为成骨细胞
2．（2025·江苏·三模）琼脂糖凝胶电泳通常用于PCR 产物的鉴定，相关叙述正确的是（ ）
A．DNA 分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快
B．用微量移液器将PCR 产物与核酸染料的混合物缓慢注入凝胶的加样孔内
C．电场强度增大，DNA 在凝胶中的迁移速率加快，电泳时的电压一般为1~5V
D．PCR 非特异性扩增产物电泳、样品上样量过多电泳均会导致电泳条带模糊
3．（2025·湖北·三模）科学家将金鱼草的橙色花青素合成基因导入水稻，培育出
黄金大米
。为确保其
“
”
安全性，需特别检测（ ）
A．花青素合成基因是否整合到水稻基因组
考点02
B．转基因大米中维生素A 前体含量是否稳定
C．花青素合成酶是否会引起人体过敏反应
D．转基因水稻花粉是否会导致邻近杂草变异
4．（2025·江西景德镇·三模）转基因抗草甘膦作物，如转基因的匍匐剪股颖（存在抗草甘膦的EPSPS 基
因）的大面积种植可以给我们带来巨大的经济效益，伴随而来的生态风险也引起了人们广泛关注。研究人
员将一高尔夫球场作为控制区，种入转基因甘膦匍匐剪股颖，在控制区外不同位点（如图所示）种植了若
干株非转基因的匍匐剪股颖和亲缘物种作为哨兵植物。为确定转基因作物向其同种或亲缘物种转移EPSPS
基因的情况，一段时间后需将用于监测的哨兵植物的种子收集并培育成幼苗。下列叙述错误的是（ ）
A．检测EPSPS 基因流入幼苗的方法为提取幼苗叶片中的DNA 为模板，利用针对EPSPS 基因设计的特
定引物进行PCR 并电泳
B．推测哨兵植物主要放置在顺风向的原因是花粉可以随风传播到较远的距离，从而造成基因流动
C．可以通过设置隔离带来防止转基因花粉传播到其他植物
D．可将圆锥花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株即可获得转基因匍匐剪股颖
5．（2025·福建三明·三模）关于DNA 片段的扩增及电泳鉴定实验，下列叙述正确的是（ ）
A．PCR 扩增缓冲液中，一般要添加Ca2+以激活TaqDNA 聚合酶
B．电泳缓冲液中加入琼脂糖及核酸染料后，沸水浴至琼脂糖融化
C．将电泳缓冲液加入电泳槽后，再将凝固的凝胶放入电泳槽内
D．将含指示剂的凝胶载样缓冲液与PCR 产物混合液缓慢注入加样孔内
6．（2025·贵州遵义·三模）为确定某目的基因是否导入大肠杆菌，可利用PCR 扩增受体菌的DNA，并通
过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。下列相关叙述错误的是（ ）
A．筛选导入目的基因的大肠杆菌需要选择培养基
B．大肠杆菌培养和PCR 扩增均需要进行无菌操作
C．PCR 所需引物应分别与目的基因模板链的5'端互补
D．通过凝胶电泳条带可初步判断PCR 扩增是否成功
7．（2025·甘肃白银·三模）从苏云金杆菌中提取出来的
抗虫蛋白基因是基因工程中常用的抗虫基因。
利用引物对某转基因抗虫植物中的
抗虫蛋白基因进行PCR 扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，发现电泳槽
中出现了非特异性扩增条带。其原因不可能是（ ）
A．未加入模板
B．引物特异性差
C．DNA 聚合酶质量不好
D．PCR 循环次数过多
8．（2025·河南开封·三模）某科研团队拟利用CRISPR/Cas9 技术对病毒复制酶基因进行定向编辑并导入怀
地黄细胞中，结合植物组织培养技术，培育出脱毒且抗病毒的怀地黄新品种。下列叙述正确的是（ ）
A．用茎尖进行植物组织培养获得脱毒苗是因为病毒无法进入茎尖细胞
B．CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以使病毒复制酶基因发生随机突变
C．进行植物组织培养时需要在培养基中添加干扰素以防止细菌的污染
D．需要对培育出的再生植株进行病毒接种实验以验证其抗病毒能力
9．（2025·陕西安康·三模）PCR 技术可实现基因的定点突变。研究人员设计了与蛋白A 基因结合的两对引
物（引物B 和C 中都替换了一个碱基）如图1 所示。研究人员按照如图2 所示的方式进行4 次PCR 扩增，
以获得定点突变的新的蛋白A 基因。下列相关叙述错误的是（ ）
A．PCR1 体系和PCR2 体系必须分开进行
B．PCR3 体系中应该加入引物B 和C
C．PCR4 体系中应该加入引物A 和D
D．DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
10．（2025·江西·三模）细胞核定位信号（NLS）能够促进蛋白转移到细胞核中，科学家将 NLS 序列与
绿色荧光蛋白（GFP）基因融合插入到载体pRI101 中,获得pRI101-NLS-GFP 表达载体,利用农杆菌转化法
在烟草中表达。载体pRI101-NLS-GFP 的构建图谱见下图，下列有关描述正确的是（ ）
A．对融合基因PCR 时需在引物的3'端分别添加限制酶 Nde I 和 Sma I 的识别序列
B．推测农杆菌细胞的解旋酶基因前端含有 NLS 核定位信号
C．融合基因插入到T-DNA 中确保其能整合到烟草的质 DNA 中
D．含该重组质粒的农杆菌侵染烟草，一段时间后观察发现荧光仅存在细胞核
11．（2025·陕西宝鸡·三模）新冠疫情防控的一个重要技术手段是荧光定量PCR。该技术原理如图，在
PCR 反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的TaqMan 荧光探针，当耐高温的DNA 聚合酶催
化子链延伸至探针处时会水解探针，使荧光基团R 分离下来，发出荧光。通过反应体系的荧光达到指定强
度时的扩增轮数，即CT 值，来判断待测样品中目标核酸的含量。下列叙述不正确的是（ ）
A．新冠病毒采集的样品需先进行逆转录再进行荧光定量PCR
B．CT 值越高，采集样品中的新冠病毒含量也越高
C．TaqMan 探针的设计应主要依据新冠病毒RNA 内部的一段序列
D．如果没有检测到荧光信号，初步推测样本中不含有新冠病毒
12．（2025·河北秦皇岛·三模）科学家利用PCR 技术扩增人乳头瘤病毒HPV—16L1 基因，构建了含HPV
—16L1 基因的表达载体pBI——L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因
烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV——16Ll 蛋白。下列叙述正确的是（ ）
A．构建表达载体pBI——L1 时可使用两种不同限制酶以确保正确连接
B．可以用DNA 分子杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1 蛋白
C．利用PCR 扩增HPV—16L1 基因的不需要已知该基因的一段碱基序列
D．必须选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因
13．（2025·四川达州·三模）将抗除草剂基因转入油菜中，得到转基因油菜，在转基因油菜种植多年后，
调查发现在公路边的野生油菜有70%含有抗除草剂基因。下列叙述错误的是（ ）
A．野生油菜体内的抗除草剂基因主要源自转基因油菜的花粉
B．70%的野生油菜体内出现抗除草剂基因可能是基因重组的结果
C．将抗除草剂基因转入油菜细胞后即可培育出新物种
D．大量使用单一除草剂会导致环境污染，降低生物多样性
二、多选题
14．（2025·江苏常州·三模）如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列说法正确的是（ ）
A．花粉管通道法可适用获得转基因抗虫棉花
B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作
C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
D．外源DNA 不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
15．（2025·江西景德镇·三模）CRISPR/Cas9 基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核
酸酶Cas9 切割与sgRNA 配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA 的过程中会改变连接部位的碱基序列。科
研人员通过删除编码PD-1 蛋白基因的2、3、4 片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1 基因敲除鼠的流程
如图1 所示。已知P1 和P2 是PCR 的引物，下列相关分析正确的是（ ）
A．核酸酶Cas9 敲除2、3、4 片段作用在磷酸二酯键，引起的变异属于基因重组
B．如果想让某个基因失去功能，也可以利用基因编辑来破坏目的基因
C．欲将基因的2、3、4 共3 个片段切除，敲除前需要设计2 个向导sgRNA
D．sgRNA 会因错误结合而出现
脱靶
现象，一般
“
”
sgRNA 序列越短，脱靶率越低
16．（2025·湖南郴州·三模）蛋白A 是动物细胞分泌的一种优质蛋白，为使得大肠杆菌具备合成蛋白A 的
能力，研究人员进行了如图1 所示的操作，图2 表示3 种限制酶的切割位点。下列叙述正确的是（ ）
A．利用PCR 技术扩增基因A 应选择的一对引物是引物2 和引物3
B．为使得扩增出的目的基因带有限制酶的切割序列，上游引物序列为5'……
GGATCCATTACGGATCG……3'
C．抗生素M 应为氯霉素，在该平板上能生长的菌落就是含有重组质粒的大肠杆菌
D．从动物细胞提取DNA 扩增获得的基因A 正确导人大肠杆菌后能正常表达出蛋白质A
17．（2025·吉林·三模）春季是感冒多发季，很多人感染甲流或细菌性感冒，出现高烧、咳嗽、乏力、呕
吐等症状，为确诊病原体是否为甲流病毒（遗传物质为单链RNA），通常采用PCR 和琼脂糖凝胶电泳技
术鉴定，以下分析正确的是（ ）
A．呼吸道取样，提取RNA，先逆转录成cDNA，再进行PCR 扩增
B．PCR 扩增时，引物越短，特异性越强，鉴定时只出现特异性条带
C．电泳原理是利用DNA 的带电粒子向与它所带电荷相反的电极移动
D．若确诊患者感染甲流病毒，可通过注射抗生素进行治疗
三、实验题
18．（2025·山西晋中·三模）聚乙烯（PE）塑料因结构稳定难以降解，易造成
白色污染
。某研究团队
“
”
拟通过基因工程改造大肠杆菌，使其分泌PE 降解酶，并通过发酵工程规模化生产该工程菌。请回答下列
问题：
(1)基因表达载体的构建过程中常采用两种不同的酶进行切割，使用双酶切的优点是 。
(2)尽管目的基因成功导入大肠杆菌，大肠杆菌也未必能成功产生PE 降解酶，可能的原因有 （答
出1 点）。
(3)为检验工程菌对PE 的降解效果，科研人员设计了对照实验，对照组为含PE 薄膜的培养基+普通大肠杆
菌，实验组的处理是 ，其他条件相同且适宜，培养一段时间后，可观察的指标包括 （答
出2 项）。
(4)若在实际应用中发现用发酵工程产生的发酵液处理PE，PE 被降解的效率较低，则可能的原因是
（答出2 点）。
(5)科学家在工程菌中引入
自杀基因
，使其在特定环境信号（如光照、特定化学物质缺乏）下启动自毁
“
”
程序。科学家这样设计的意义是 。
19．（2025·四川乐山·三模）我国科学家将抗虫基因A、抗冻基因B 导入番茄，获得了抗虫、耐寒的转基
因番茄。所选用的抗虫基因A、抗冻基因B 及质粒的限制酶切割位点如图所示。
(1)将抗虫基因A 和质粒连接的过程需要用到的酶有 （填图中限制酶）和DNA 连接酶。将抗虫基
因A 与质粒连接后，再将抗冻基因B 连接到重组质粒上所用的限制酶是 。
(2)构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。我国科学家采用了他们独创的一种方法
，将目的基因导入番茄细胞。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。
(3)农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA 转移到 ，并且将其
整合到 上。
(4)抗虫基因A 导入番茄细胞后，若要检测抗虫基因A 是否插入番茄染色体中，需要从番茄细胞中提取
进行DNA 分子杂交，DNA 分子杂交时应使用的探针是 。
(5)若要通过实验检测抗虫基因A 在番茄细胞中是否表达为抗虫蛋白，请简要写出实验思路 。
20．（2025·安徽·三模）流感病毒分为甲、乙、丙三型，根据H 抗原和N 抗原不同，甲型流感病毒又分为
许多亚型，其中H3N2 主要感染人类，H5 亚型毒株不仅对禽类危害大，还能感染人类。某科研团队基于人
一禽流感共预防的设想，尝试了共表达DNA 疫苗—p—H5/H3 质粒的策略。回答下列问题：
(1)获取H3 病毒和H5 病毒的RNA，通过 过程得到它们的DNA，并进一步获取H3 基因和H5 基因。
(2)利用p 质粒和H3 基因、H5 基因构建p—H5/H3 的设计思路如下图；其中限制酶XhoI、NheI、ClaI 识别
序列和切割位点分别是：5′-C↓TCGAG-3'、5′-G↓CTAGC-3'、5′-AT↓CGAT—3'。
任选限制酶
①
XhoI、NheI 和ClaI 中的一种，写出经其切割产生的DNA 片段的末端 。
据图判断，过程
中处理
②
Ⅱ
p—H5 质粒的限制酶是 ；参照图中H3 基因上限制酶切割位点的标识方
法，标出H5 基因上限制酶的切割位点 。
(3)结果检测：实验组小鼠分别注射p—H5/H3、p—H5、p—H3，对照组注射质粒p，在完成三次免疫的10
天后从脾脏中分离淋巴细胞，分别加入H5 或H3 流感亚型病毒，进行特异性刺激，48h 后进行淋巴细胞增
殖检测；检测结果表明，p—H5/H3 可以针对相关亚型流感病毒形成有效保护。
从脾脏中分离淋巴细胞，是因为
①
。
进行淋巴细胞增殖检测时，悬浮细胞用离心法收集，贴壁细胞的收集方法是
②
。
21．（2025·河南开封·三模）河南省伏牛山地区分布着多种耐旱植物，柽柳是其中重要的生态修复物种。
研究发现，柽柳
基因的表达产物可显著增强植物对干旱和高盐胁迫的耐受性。某科研团队利用下
图所示
质粒构建基因表达载体，然后通过农杆菌转化法将
基因导入伏牛山濒危植物太行花中，
以提高其抗逆性。回答下列问题。
(1)启动子
应与
①
基因
链的 (填“3'”或“5'”)端相连。
(2)为验证转化后的农杆菌是否携带重组质粒，该科研团队采用多重
技术(一种在单次反应中通过多对
引物同时扩增多个目标序列的技术)进行检测。具体方法为：将下表所示的3 对引物加入同一
体系中，
对转化后的农杆菌
进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。
引物
扩增片段
扩增
基因
扩增
基因
扩增
基因
转化成功的农杆菌电泳结果应显示 个条带；如果用同样的方法检测转化成功的太行花植株，结果
仅显示2 个条带，原因是 。
(3)已知组成型启动子可以持续、高效地启动基因的表达，干旱诱导型启动子仅在干旱胁迫下启动基因表达。
若将启动子
设计为干旱诱导型启动子，则启动子
应设计为
①
②
(填
组成
或
干旱诱导
“
”
“
”)型启
动子，这样导入太行花组织细胞的结果是 。
(4)科研团队对转基因太行花进行 水平验证，结果显示转基因太行花的抗逆性并未达到预期。为提
升
蛋白的生物活性，科研团队计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤(含2 个干扰项)，
请按正确顺序排列： 。
通过
①
射线衍射技术分析原始
蛋白的盐碱敏感区域空间结构
利用计算机优化原始
②
蛋白三维构象
采用定点突变技术修改
③
基因的脱氧核苷酸序列
通过
④
技术随机诱变
基因序列
推导出耐盐碱功能所需的关键氨基酸替换位点
⑤
将改造后的
⑥
基因导入受体细胞并检测其耐盐碱能力
推测出
⑦
序列并人工合成新的氨基酸链
22．（2025·陕西咸阳·三模）水稻在生长过程中容易感染病虫害，从而引起作物减产。C 蛋白和V 蛋白分
别对水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫有较强的杀伤效果，科研人员构建了C—V 抗虫融合基因（简称C—V
基因）表达载体，通过农杆菌转化法将C—V 基因表达载体导入水稻叶肉细胞，使其表达出C—V 联合蛋
白，从而培育出转基因抗虫水稻新品种，过程如图1。所示。回答下列问题：
(1)科研人员进行PCR1 和PCR2 时，扩增体系中需要分别加入C 基因和V 基因，其作用均是 。
(2)据图分析，PCR 扩增时需要设计引物，为了使C 基因和V 基因能够正确相连，设计引物2 和引物3 时，
引物序列除了能与模板DNA 结合，还需要遵循的原则是 ，因此PCR1 和PCR2 需要在
（填
同一个
。或
不同
）
“
”
“
”
PCR 反应体系中进行。同时，为了使连接后的C—V 基因能够正确插入载
体中，需要在引物1 和引物4 的5 端插入相关 酶的识别序列。
(3)进行PCR3 时，不需要额外添加引物，此反应体系中具有引物效果的是 。
(4)用抗C 蛋白抗体和抗V 蛋白抗体检测转基因抗虫水稻中的蛋白质，结果如图2 所示，1～7 为被检测的
转基因抗虫水稻，WT 表示野生型水稻。
转基因抗虫水稻
①
6 体内未检测到C 蛋白和V 蛋白，其原因可能是 （答两点）。
为评价转基因抗虫水稻的抗虫效果，探究思路是向非转基因水稻和转基因抗虫水稻
②
（填序号）
接种等量的 ，观察其抗虫效果。
23．（2025·湖南永州·三模）在应对全球粮食危机和气候变化的双重挑战下，中国科学家团队研发了人工
淀粉合成途径（ASAP），利用10 余种酶将CO2和H2O 高效转化为淀粉。现需构建重组大肠杆菌来合成其
中的三种关键酶：酶a（基因A，1.5kb）、酶b（基因B，2.0kb）和酶c（基因C，2.5kb），科研人员选择
质粒pET28a（5.3kb）为载体。将从甲植物中扩增出的基因A、B、C 依次插入到多克隆位点（MCS，约含
30 个碱基对），如下图所示。回答下列有关问题：
注：①F1~F3、R1~R3为引物；P1~P5为启动子；KanR为卡那霉素抗性基因；ori 为复制原点。
限制酶
②
SalⅠ
与XhoⅠ的识别序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同。
(1)启动子决定了基因的转录位置和方向，从转录角度分析图中P1、P3 与P2 的相对方向不同的原因是
。在构建基因表达载体时，为了使来自甲植物的基因A、B、C 在受体菌中高效表达，其上游的启动子P4
应选择 （填
甲植物
或
大肠杆菌
）的启动子。
“
”
“
”
(2)pET28a 中只有一个SalⅠ和NotⅠ酶切位点，且无酶XhoⅠ的识别序列。为了使基因A、B、C 依次正向插
入pET28a 的MCS 中，在PCR 扩增基因A、B、C 时需在引物 的5'端添加限制酶XhoⅠ的识别序列，
其它引物的5'端添加限制酶 的识别序列。
(3)初步检验重组质粒pET28a-ABC 是否构建成功：获取部分重组质粒，用限制酶SalⅠ、NotⅠ、XhoⅠ充分处
理，电泳分离酶切产物。从泳道中的条带数量和大小分析（过小的DNA 片段无法通过电泳有效检测出
来），当电泳结果为 时，表明成功构建了pET28a-ABC。
(4)将重组质粒导入大肠杆菌前，需先用钙离子处理大肠杆菌，作用是 。最后利用 工程
对纯化的转基因大肠杆菌大规模培养生产酶。
(5)与植物光合作用合成淀粉不同，
人工合成淀粉途径
实现了在实验室中从
“
”
CO2到淀粉分子的全合成。
该研究成果尚处于实验室阶段，若未来能够大面积推广应用，可解决当前人类面临的哪些生态环境问题：
（至少答出两点）。
24．（2025·河南·三模）IKK 激酶山IKKα、IKKβ 和IKKγ 三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分
化。临床上发现某重症联合免疫缺陷（SCID）患儿的IKKβ 基因编码区第1183 位碱基T 突变为C。为研究
该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR 定点诱变技术获得突变基因，并培育出SCID 模型小鼠。图1
为定点诱变获得突变基因的过程。
(1)在定点诱变获取突变基因时，PCR1中使用的引物有 ，PCR2中使用的引物有 。
PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是 。
(2)PCR 在第一个循环之前通常将DNA 样品加热至95℃数分钟进行预变性处理，其目的是 。由于
大引物较长，含C 与G 的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应采取的措施是
。
(3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切的优点是
。研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE 与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。
对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE 三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK 激酶的三种亚基
进行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID 患者免疫缺陷产生的机制是 。
25．（2025·江西景德镇·三模）已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术将EG 基因
等基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。
(1)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG 基因的表达载体。
双酶切法：如上图标注了载体、
①
EG 基因的限制酶切点、EG 基因两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能
合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。
结合图中信息分析，在扩增EG 基因时应在引物的 （填“5'”或“3'”）端添加 限制酶的识
别序列，设计的引物序列为 。（从5'端书写，写出前12 个碱基序列即可）
同源重组法：是指发生在两个
②
DNA 分子的同源序列（DNA 序列相同或近似）之间直接进行交换的一种
重组形式。利用同源重组的方法可以将目的基因插入到表达载体上，如右图所示。该操作可通过PCR 技术
在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA 序列，在重组酶
的作用下即可实现质粒上的同源重组，被称为体外同源重组。真核生物有性生殖过程中发生在 之间
的基因重组，为体外同源重组提供了依据。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是
。
(2)导入上述重组质粒的酿酒酵母菌应在 的培养基上筛选培养。将筛选得到的菌株接种到液体培养
基中培养一段时间，通过检测 ，以确定其发酵效果。
26．（2025·内蒙古通辽·三模）组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种血栓溶解剂，难以从天然组织中提
取或人工合成。科研人员从人胎盘染色体基因库中筛选出t-PA 基因，将其与质粒结合，导入人黑色素瘤细
胞中构建工程细胞，以生产t-PA。回答下列问题：
(1)用PCR 技术扩增t-PA 基因时的步骤及设定的参数如图1 所示。引物在步骤 中与模板链结合，
步骤丁的目的是 。步骤戊应设定跳转到步骤 。
(2)PCR 需要设计两种引物，如图2 所示。图示中可作为引物的是 （填序号），原因是
。
(3)t-PA 基因及构建表达载体的过程如图3 所示。为保证t-PA 基因与质粒高效连接，应选用图3 中的限制酶
进行切割。
(4)与使用大肠杆菌为受体工程细胞相比，用人黑色素瘤细胞的优点是 。
27．（2025·广西柳州·三模）IL—2（白细胞介素—2）是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子，B7 是诱导特异
性免疫的共刺激分子。研究通过在肿瘤细胞中表达IL—2 或联合表达IL—2、B7，诱导机体产生抗肿瘤免
疫应答，为IL—2 基因治疗进入临床提供依据。回答下列问题：
(1)重组逆转录病毒的构建（部分过程见图1、图2）：根据图11-1 进行分析，对逆转录病毒载体及IL-2 基
因片段都使用 （填序号）酶处理（A．EcoRI B．HindIII C．HpaI D．BamHI），并在 酶
的作用下连接获得IL-2 重组载体。先用 处理大肠杆菌细胞，再将重组载体导入，扩增后提取大肠
杆菌DNA 鉴定目的基因。利用上述限制酶进行酶切，由图2 可知，IL-2 基因已定向插入载体内，基因长
度约为 bp。将IL-2 重组载体转染至CRIP 细胞（某种能被逆转录病毒感染的宿主细胞），在多孔细
胞板进行 培养并筛选阳性细胞，收集含有IL—2 病毒的上清液。
(2)IL-2 基因导入肿瘤细胞及表达检测：取病毒上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内 ，构
建RT—PCR（逆转录聚合酶链式反应）体系，分析确定肿瘤细胞内IL-2 基因是否正常插入到染色体
DNA。
(3)B7 基因导入肿瘤细胞及表达检测：再将B7 基因导入上述转基因肿瘤细胞，培养后提取蛋白质，加入带
有荧光染料的单克隆抗体，利用 技术检测B7 基因的表达水平。
(4)体内致瘤性实验：将同品系小鼠分成3 组，背部皮下注射 肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注
射已导入IL-2 基因的肿瘤细胞的小鼠以及已导入IL-2 和B7 双基因的肿瘤细胞的小鼠作为实验组，观察小
鼠肿瘤的生长情况，根据下图可以得出结论：
① ；② 。
(5)分析与讨论：IL—2 是重要的免疫调节细胞因子，能诱导T 淋巴细胞的增殖。转基因肿瘤细胞通过细胞
因子的分泌调节激活了小鼠体内的 免疫，使机体产生抗肿瘤免疫效应。
四、解答题
28．（2025·山西·三模）某研究者用基因工程技术获得目的基因高效表达的大肠杆菌，构建重组质粒时，
用EcoRI 和KpnI 两种限制酶同时切割质粒。图甲为两种质粒，其中lacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可
以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图乙为目的基因（呈现出两端的部分碱
基序列）。图丙为限制酶识别序列及切割位点。请回答下列问题：
(1)不选用图甲中质粒B 的原因是 。
(2)为保证目的基因能与质粒A 正确连接，科研人员需利用PCR 技术修饰并扩增目的基因，所设计的一对
引物的碱基序列分别为5'- -3'、5'- -3'（只写出前10 个碱基）。
(3)为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，排除未导入质粒的大肠杆菌和导入质粒而非重组质粒的大肠杆菌的
干扰，使用了添加 等成分的培养基进行培养。若菌落呈现 ，则为所选大肠杆菌。
29．（2025·甘肃天水·三模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，导致可溶性糖
含量高，汁多质脆。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G 蛋白的转基因甜玉米新品种。
在超量表达G 基因载体的构建中，所用DNA 片段和Ti 质粒的酶切位点如图1、2 所示。回答下列问题：
(1)为培育出超量表达G 蛋白的转基因甜玉米，应将G 基因插入Ti 质粒的T-DNA 中。为使DNA 片段能定
向插入T-DNA 中，可用PCR 技术在DNA 片段的两端添加限制酶识别序列，M、N 端添加的序列所对应的
限制酶分别是 。
(2)已知在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物，则可以用农杆菌侵染玉米等单子叶植物。用于构建基因表
达载体的质粒用限制酶切割后，可通过 的方法检测质粒是否被切开。构建好基因表达载体后，依次
在含 的培养基上培养，筛选出可能含有目的基因的农杆菌，再用 法将重组质粒导入到植物体
中。
(3)若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR 操作过程角度解释可能的原因是
（至少答出2 点）。
30．（2025·陕西咸阳·三模）科研人员将蛋白A 基因和蛋白B 基因插入质粒上构建重组表达质粒，导入酵
母菌获得融合蛋白AB，其制备过程如图所示，其中相关识别序列如表。回答下列问题：
限制酶
BamH1
EcoR I
Mbo I
HaeIII
识别序列和切割位点（5-3）
G↓GATCC
G↓AATTC
↓GATC
GG↓CC
(1)PCR1 和PCR2 是在两个不同反应体系中进行的，两个反应体系中加入的不同物质是 ，PCR1 和
PCR2 的目的是 。从而有利于基因A 和基因B 融合。过程
时不需要加入的引物是
②
。
(2)为了将融合基因与质粒进行正向连接，选择其中的两种限制酶切割质粒，不选另外两种限制酶的理由是
。为了使融合基因与质粒用相同的限制酶处理后能够产生相同的末端（便于连接），应在设计的引物P1
的5 端加上限制酶 的识别序列。
(3)确保重组质粒能在大肠杆菌中扩增的元件是 过程
将重组质粒导入大肠杆菌时要用
③
处理大肠
杆菌，目的是 。
31．（2025·甘肃白银·三模）全球工业化使环境雌激素（EEs）污染日益加剧，开发灵敏、简便的环境监测
方法成为一项紧迫任务。研究发现，在EEs 诱导下，斑马鱼幼鱼能够从无到有地表达卵黄蛋白原，且表达
水平与水体中EEs 浓度呈正相关。斑马鱼幼鱼通体透明，成功转入荧光蛋白基因后容易观察到其体内的荧
光情况。回答下列问题：
(1)根据斑马鱼幼鱼的特征，如果先给无启动子的荧光蛋白基因加上 基因的特异性启动子，就可利
用基因工程构建能够监测水体中EEs 污染情况的转基因斑马鱼，科研人员可以通过 （写出一种方
法）获取该特异性启动子。
(2)pEGFP-1 是一种无启动子的EGFP（一种绿色荧光蛋白）基因载体。下图为pEGFP-1 质粒简化图谱，最
好选择 酶将所选的特异性启动子序列正确地插入pEGFP-1 质粒中，然后将构建成功的基因表达载
体通过 法注入斑马鱼受精卵，最终获得转基因斑马鱼。
注：ori 为复制起点；
为卡那霉素抗性基因；MCS 为外源DNA 的插入部位；SV40poly（A）为转录
终止信号
(3)检查转基因斑马鱼是否培育成功也是基因工程的重要环节。请利用EGFP，从个体生物学水平描述转基
因斑马鱼的鉴定方法： 。
(4)经过个体生物学水平筛选成功的转基因斑马鱼能否投入实际生产使用，并说明理由：
（合理即可）。
32．（2025·山东泰安·三模）科研人员尝试利用鸡新城疫病毒（HB1）基因和传染性支气管炎病毒
（H120）基因，采用基因工程技术培育转基因工程菌，以制备二联体疫苗，所需要的限制酶的识别序列和
切割位点如表所示，培育流程如图所示。
限制酶
BclI
PvitⅡ
XbaI
Sau3AI
识别序列和切割位点（5′-3'）
T↓GATCA
CAG↓CTG
T↓CTAGA
↓GATC
(1)根据图示信息，应选用限制酶 切割质粒，不选用其他限制酶的原因是 。
(2)为保证融合基因与质粒的正向连接，在设计PCR 引物时，应在b 链对应引物的 （填“3'”或“5′”）端添
加限制酶 （填种类）的识别序列。根据图表信息，写出该引物的12 个碱基序列5′- -3′。
(3)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加 （填
四环素
或
青霉
“
”
“
素
）
”
,培养基乙中应添加 （填
四环素
或
青霉素
）
“
”
“
”
,菌落 （填图中数字）中的大
肠杆菌可用来制备疫苗。
33．（2025·湖南湘西·三模）某真菌W 基因编码的纤维素酶含有一段疏水信号肽，可在内质网加工后分泌
至胞外。已知W 基因转录产物序列如下（部分）：5'-UGAAC-GCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。
现需将其转入大肠杆菌表达，所用质粒如图1。
限制酶
BamHI
EcoRI
MfeI
KpnI
HindIII
识别序列和
切割位点
G↓GATCC
G↓AATTC
C↓AATTG
GGTAC↓C
A↓AGCTT
图3
(1)若需在细菌中表达可分泌的成熟酶，应选择 和 进行双酶切（从上述酶中选择），其
科学依据是 ；
(2)若直接将含信号肽的W 基因转入大肠杆菌，预测表达产物无法分泌的原因： 。
(3)Ca2+处理可使大肠杆菌细胞膜形成短暂通透性孔道，此时细胞处于 态。若改用Mg2+处理，转
化效率显著下降，其分子机制是 。
(4)扩增W 基因编码链时，与其模板链结合区序列为 （从转录产物推导至少4 碱基）。
34．（2025·山西临汾·三模）某科研团队从某细菌中提取抗盐基因，将该基因转入烟草培育成抗盐烟草。
下图是转基因抗盐烟草的培育过程，外源DNA 片段和Ti 质粒上都有4 种限制酶的切割位点，虚线箭头表
示转录的方向。请分析回答下列问题。
(1)用图中的Ti 质粒和抗盐基因构建重组质粒时，为防止自身环化和反向连接，最好选择图中的限制酶
，对抗盐基因进行扩增常用 技术。
(2)将重组质粒A 导入到农杆菌的方法常用 法。将抗盐基因导入植物细胞除了图中的方法外还
可以用 法（写出一点）。
(3)筛选成功导入抗盐基因的烟草细胞 （填
可以
或
不可以
）用含有
“
”
“
”
M 抗生素的培养
基进行筛选，原因是 。
(4)对转基因烟草进行个体水平的检测方法是 。
35．（2025·宁夏银川·二模）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成
胶原蛋白的基因kit 导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如图所示。请据图回答下列问题：
(1)目的基因与质粒连接后可以导入到不同物种细胞中表达出同种蛋白质，其原理是 。
(2)已知kit 基因的部分序列见下，采用PCR 技术进行扩增时，选用的引物为 （填字母）。为使基
因与质粒成功连接，适宜的方法是在引物的 端添加 两种限制酶识别序列。
5'—CGGGATCCA………………AGAATTCCG—3'
3'—GCCCTAGGT………………TCTTAAGGC—5'
A．5'—GCCCTAGGT—3' B．5'—CGGAATTCT—3'
C．5'—CGGGATCCA—3' D．5'—GCCTTAAGA—3'
(3)酶切kit 基因，并与质粒中长度为170bp 的片段进行置换，构建重组质粒pET-28a（+）-kit，用HindⅢ
酶分别酶切pET-28a（+）和pET-28a（+）-kit，获得如下表所示片段。
质粒类型
pET-28a（+）
pET-28a（+）-kit
HindIII 酶切片段
1000bp，2550bp
1000bp、2000bp、700bp
则kit 基因长度为 ，由此判定kit 基因上有 个HindⅢ酶切位点，原因是 。
36．（2025·安徽合肥·三模）低温是早春和晚秋作物生长的重要环境胁迫因子，可导致植物的叶出现脱水
萎蔫。科研人员以一种农杆菌 Ti 质粒为载体，将由低温诱导启动子RD29A 控制的拟南芥耐寒基因
AtCOR15a 导入番茄基因组，以期改良番茄的耐寒性，为培育耐寒性番茄新品种奠定基础。回答下列问题。
(1)低温诱导启动子 RD29A 的作用是 。请在图中标明重组后拟南芥耐寒基因
AtCOR15a 和低温诱导启动子RD29A 的位置 。
(2)将含有基因 AtCOR15a 的重组 Ti 质粒转入农杆菌，再用农杆菌侵染番茄无菌苗子叶，使用抗生素
筛选出具有该抗生素抗性的幼苗后，还需提取抗性幼苗的染色体DNA 进行PCR 鉴定, 目的是 。
(3)通过对番茄幼苗的总 RNA 进行测定，获得基因 AtCOR15a 相对表达量最高的3 个株系A1、A33、A37。
为进一步从个体水平对这些株系幼苗的耐寒性进行评估，简要写出实验设计思路 。
37．（2025·安徽六安·三模）A 蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科
研团队利用无缝克隆技术将A 蛋白结合蛋白基因（P 基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS 基因）融合，构建
A 蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。
注：①bar 为抗草甘膦（一种除草剂）基因；Tetr为四环素抗性基因；Ampr为氨苄青霉素抗性基因②F1、
F2、R1、R2为引物③BamH I、Sma I、Bcl I 为限制酶
(1)无缝克隆时所需的酶除T5 核酸外切酶外还有 和 。用无缝克隆技术构建GUS-P 融合
基因的关键是R2引物 端序列与 互补。
(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti 质粒，选用的限制酶为 。扩增融合基因所需的引物R1和F2
应选用下列引物组合为 。
5'-…CTTGGATGAT-3'
5'-…TAAGTTGTCT-3'
5'-…ATTCAACAGA-3'
5'-…TCTGTTGAAT-3'
①
②
③
④
38．（2025·宁夏石嘴山·三模）番茄红素具有一定的抗癌效果。普通番茄合成的番茄红素易在番茄红素环
化酶的催化下转化为胡萝卜素。科学家利用基因工程设计的重组DNA（质粒三）能表达出双链RNA（发
卡），番茄细胞可识别双链RNA 并将该双链RNA 和具有相同序列的单链RNA 一起降解，从而阻止番茄
红素的转化，提高番茄红素的产量。下图为利用质粒一和目的基因构建重组质粒三的过程示意图。回答下
列问题：
(1)质粒通常用作基因进入受体细胞的载体，它能供外源DNA 片段（基因）插入的原因是 。
(2)对质粒二开环需用到的限制酶是 。为了防止其自身环化，需进行去磷酸化，即去除开环的质粒
两端的 个磷酸基团。
(3)构建质粒三时，最好在A、B 两端分别加 、 的识别序列，目的是 。
(4)质粒三导入受体细胞并表达后，形成双链RNA（发卡）的原因是 。
发卡
在受体
“
”
进行PCR 扩增。
39．（2025·湖南长沙·三模）t-PA 蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性
不高。若将t-PA 蛋白第84 位的氨基酸替换成丝氨酸（密码子是UCU），获得改良的t-PA 蛋白，其溶解血
栓的效率明显提升。图1 和图2 为改造t-PA 蛋白基因及构建表达载体的过程。请回答下列问题：
(1)在PCR 技术中高温变性的目的是 。PCR 的产物一般通过 来鉴定。若PCR 扩增没有获
得扩增产物，下列解释合理的有 。
复性温度过高
复性温度过低
缓冲液中缺少镁离子
引物之间形成二聚体
①
②
③
④
(2)图1 中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA 蛋白，则引物b 中该位点的碱基是5'
3'（写3 个碱基）。重叠延伸得到的改良t-PA 蛋白基因非模板链序列为5'-TGAAACGCT…（中间序列）…
GTCGGCTCG-3'。为了便于将扩增后的基因和质粒pCLY11 成功构建成重组质粒，需在引物的5'端添加限
制酶酶切序列，请写出PCR3 扩增中引物a 的碱基序列5'- -3'（要求：写出15 个碱基）。
(3)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA 改良蛋白，请完善以下流程：
将
①
t-PA 改良基因与乳腺特异性启动子连接，构建表达载体；
② ；
③ ，移植到代孕母牛子宫；
筛选转基因牛，从乳汁中提取
④
t-PA 蛋白。
(4)对乳汁t-PA 进行活性检测，应以t-PA 溶液为阳性对照，以 为阴性对照。
40．（2025·甘肃白银·三模）拟南芥是科学研究中的模式植物。某科研人员将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基
因TmAFP 与Ti 质粒连接形成基因表达载体导入拟南芥细胞中，以获得耐低温拟南芥，过程所用的基因、
Ti 质粒、限制酶的识别序列及切割位点如图1 所示。请回答下列问题：
(1)对TmAFP 基因进行PCR 扩增，在PCR 反应体系中加入的缓冲液中含有Mg2+，Mg2+的作用是 。
利用PCR 的方法扩增TmAFP 基因时需要引物，引物的作用是 。
(2)为了使TmAFP 基因插入Ti 质粒，设计引物时需要在A 端引物的5'端和B 端引物的5'端分别添加
（填限制酶）的识别序列。结合目的基因的部分碱基序列，请设计引物的碱基序列。
引物1（A 端的引物）：5′— —3'；
引物2（B 端的引物）：5'— —3'。
(3)为了筛选出成功导入含抗冻蛋白基因TmAFP 的重组质粒的农杆菌，一般可进行如下步骤。
第一步：让农杆菌在含 的培养基上培养，得到如图2 所示的菌落。
第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含 的培养基上培养，
得到如图3 所示的结果（空圈表示与图2 对照无菌落的位置）。
第三步：选出图2 培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的农杆菌。其中图2 中的菌落
（填数字）表示含重组质粒的农杆菌。
41．（2025·浙江·三模）番茄细菌性斑疹病是番茄种植产业中较严重的病害，具有发病迅速、防治难等特
点，主要由丁香假单胞杆菌感染引起。研究发现：植物体内芦丁等类黄酮类次生代谢产物含量增多时可增
强植物对细菌或真菌病害的抗性。而经拟南芥AtMYB11 或AtMYB12 基因（简称A 基因）转化的烟草、
番茄等植株可提高芦丁等物质的合成量。现欲向番茄植株内转入A 基因进而选育出高抗病番茄品系。
抗生素
功能作用
潮霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素
通过抑制核糖体功能达到杀死细菌、动物、植物细胞的效果。
羧苄青霉素
通过抑制细菌细胞壁的形成达到杀死细菌的效果；
可分解生成生长素类物质，刺激植物愈伤组织的形成与增殖。
(1)目的基因的获取。一般情况下目的基因片段越小，重组效率和导入效率均越高。从拟南芥提取的A 基因
长度约为3000bp，若要提高目的基因与质粒重组效率，可以 获取A 基因。
(2)目的基因的扩增与重组质粒的构建。若获取的A 基因无上述限制性内切核酸酶识别序列，PCR 扩增A
基因时，需在两种引物的 端（填“5′”或“3′”）添加相应的识别序列。为成功选育出高抗病番茄品系，
构建重组质粒应选择 酶对图示质粒进行切割。
(3)重组质粒的导入。将农杆菌放入低温、低浓度的 溶液中处理以改变细胞膜的通透性，使之成为感
受态细胞。再在低温条件下与重组质粒混合，以低温条件处理的作用是 ，然后进行短暂的热刺激处
理，使外源重组质粒转入农杆菌细胞。将转化后的农杆菌置于摇床慢速培养一段时间，其目的是使农杆菌
从感受态恢复正常状态，从而 。因此，在培养基中加入 ，才能初步选出导入重组质粒的大量
农杆菌。
(4)农杆菌与番茄细胞共培养与筛选。根据表格信息，将农杆菌与番茄细胞共培养一段时间后，番茄外植体
培养基要加入 （抗生素）以杀灭农杆菌。之后培养过程中培养基中加入 以筛选出含有A 基因
的番茄细胞。
(5)转基因植株的扩增。为了获得更多的A 基因番茄植株，对脱分化形成愈伤组织进行继代培养，影响继代
培养物生成再生植株的因素除培养条件（温度、光照等）、培养基中营养物质和植物生长调节剂的浓度和
配比外，还有 （写出2 点）。
42．（2025·河南·三模）GRF 是一种在植物中广泛存在的特异性转录因子，在植物的生长发育和胁迫响应
过程中发挥着重要作用。BpGRF4 为白桦GRF 基因家族成员，科研人员通过农杆菌转化法获得了白桦过表
达BpGRF4 株系，用以探究BpGRF4 在白桦植株生长发育过程中的作用。
(1)科研人员首先提取野生型白桦的根、茎、叶的总RNA，通过 获得cDNA；然后以获得的
cDNA 为模板通过PCR 获得BpGRF4 基因，利用PCR 扩增BpGRF4 基因时，每次循环需要经过三步，依
次是 ；以根、茎、叶的总RNA 为模板，说明在这三个器官中BpGRF4 的表达量
（填
高
或
低
）。
“
”
“
”
(2)利用PCR 扩增该基因时，加入的一个引物序列是ATGGATTTTGGGGTAGTGGGTT，根据该序列
（填
能
或
不能
）推测出另一个引物的序列，原因是
“
”
“
”
。
(3)科研人员使用T4 DNA 连接酶将获得的BpGRF4 基因片段连接到A 载体限制酶NocI 的酶切位点上，构
建过表达载体，可推测获得的BpGRF4 基因两端有 个限制酶NocI 的酶切位点。将构建的
过表达载体导入农杆菌中，需先用Ca2+处理农杆菌，其目的是 。
(4)利用农杆菌转化法得到过表达BpGRF4 的白桦转基因株系OE-3，科研人员统计了1 树龄的野生型白桦
植株（WT）和1 树龄的OE-3 的表型，结果如图所示，说明BpGRF4 是通过 来促进白桦植
株的生长发育的。将WT 与OE-3 杂交，能否预测子一代的株高？请说明理由： 。
43．（2025·浙江温州·三模）LfcinB 是一种阳性离子抗菌肽，其正电荷数决定其抗菌能力。因其分子量较
小而易被分解，导致其产量低、较难获取。现利用基因工程技术制备LfcinB，以期获得更高效率的生产应
用。回答下列问题：
(1)LfcinB 易导致原核宿主裂解死亡，因此往往需要带负电的蛋白（APBSP）与LfcinB 相连接形成融合蛋
白，以防止这一现象的发生，原因是 。
(2)APBSP-LfcinB 基因片段的合成和扩增。利用PCR 技术获取APBSP-LfcinB 融合基因（获取过程如图1）
并扩增，PCR 时，引物可以 （A．为Taq DNA 聚合酶提供结合位点 B．决定扩增产物大小 C．
决定反应的特异性 D．决定变性时间）。以融合基因表达获得的融合蛋白，为方便除去APBSP 蛋白而仅
获得LfcinB，需在融合蛋白连接处引入甲酸裂解位点（对应的mRNA 序列为5'GACCCA-3'）。因此在
PCR 扩增APBSP 基因时，需在 （填
引物
“
1”或
引物
“
2”）的5'端引入甲酸裂解位点的对应序列，
其在引物中对应的序列为5'- -3'。
(3)重组载体的构建与克隆。所用表达载体（图2）可将M 和N 之间的片段整合到酵母菌的染色体上，其中
M 是甲醇诱导型启动子、Q 是终止子。将酶切的质粒与融合基因连接构建重组质粒，并导入大肠杆菌。将
大肠杆菌接种至含 的LB 培养基中培养和筛选。
(4)重组质粒导入酵母菌。利用图中的限制酶 处理重组质粒，使其线性化，线性化处理的目的可
能是 。在低温条件下，将线性化重组质粒与一种毕赤酵母（甲醇营养型酵母菌，且是组氨酸缺
失突变体）混合，在50%聚乙二醇溶液中进行短暂的 处理，实现对毕赤酵母的转化。然后将其
接种于不含 的培养基，筛选出导入重组质粒的毕赤酵母，
(5)融合蛋白的诱导表达。将所选菌株在液体培养基中连续培养若干天，每隔24 小时在培养基中加入甲醇，
其目的是 。
(6)LfcinB 的分离纯化和检测。将含有融合蛋白的上清液收集至离心管中，加入等体积的甲酸处理一定时间，
收集固形物并用适量溶液溶解后，用 方法对产物进行分离纯化，再进行检测与鉴定。
44．（2025·江苏·三模）病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）是利用病毒载体携带目的基因侵染植物细胞，
在植物细胞中复制产生dsRNA（双链RNA），激活植物自身的基因沉默机制，降解植物目标mRNA 的技
术。叶用莴苣生长到一定时期极易抽薹（茎迅速生长），从而导致莴苣减质减产。研究表明LsMET1 基因
（甲基转移酶1 基因）促进叶用莴苣抽薹，研究人员利用VIGS 尝试使LsMET1 基因沉默来验证该观点，
主要操作如图。请回答下列问题。
(1)过程
反应体系中加入的物质除引物、原料、模板外，还有
①
，下列四种引物中用于过程
的
①
是 。
A．5'GAATTCATGA………………………3' B．5'CTTAAGTTAC………………………3'
C．5'CTGCAGTAGA………………………3' D．5'GACGTCATCT………………………3'
(2)过程
将环状
②
DNA 扩增为线性DNA 的目的是 。
(3)在TRV1、TRV2 质粒中插入双启动子目的是 。过程
将
④
TRV1 质粒和重组质粒导入农杆菌后，
在培养基中应加入 进行筛选。
(4)导入植物细胞的CP-LsMET1-RZ 基因转录后在 催化下，被剪切为CPRNA、LsMET1 RNA、
RZRNA。LsMET1 RNA 诱导内源LsMET1 基因沉默的机制如图2，AGO1 蛋白选择性降解3'端稳定性较低
的一条链。据图分析，向农杆菌中导入TRV1 质粒的目的是 ，激活的RISC 有的能诱导LsMET1
mRNA 降解，有的不能诱导LsMET1 mRNA 降解，其原因是 。
(5)研究人员测定了LsMET1 表达量和抽墓（茎生长）状况，结果如图3。该实验结果与预期是否一致，并
说明理由。 。
45．（2025·河南·三模）科研人员利用农杆菌介导的喷花法（即将农杆菌悬浮液用微型喷壶均匀喷洒于棉
花柱头和花药等器官上）将海岛棉中控制纤维发育良好的目的基因GbHCT 与草铵麟除草剂抗性基因导入
陆地棉Y1169 中（如图），研究棉花株高、有效铃数等农艺性状的改变与目的基因GbHCT 插入的关系。
回答下列相关问题：
(1)GbHCT 基因包括GbHCT13、GbHCTI5 两种，首先用PCR 技术对基因分别扩增，扩增两基因时均需要
引物，引物的作用是 ，该过程中为激活参与反应的酶需在缓冲液中添加 。
(2)利用BglⅡ与BstEⅡ对pCAMBIA3301 载体进行双酶切的优点是 。用PCR 技术扩增GbHCT 基
因时，对目的基因的引物的操作是 。
(3)研究人员将带有pCAMBIA3301－GbHCT 重组载体的农杆菌菌液通过喷花法转化到棉花中，其原理是
。在幼苗期对每株植株的同一叶片涂抹大田适用的草铵麟除草剂，该操作的目的是 ，
此时草铵膦除草剂抗性基因属于 。
(4)下表为两个转基因棉花品系农艺性状与非转基因陆地棉Y1169 对照组之间的比较。
品系
株高
有效果枝
数
有效铃
数
转
GbHCT13
85.10
11.10
14.96
转
GbHCT15
83.35
12.78
17.14
Y1169
79.70
9.30
9.20
据此得出的实验结论是 。
46．（2025·四川内江·三模）2-苯乙醇（2-PE）具有令人愉悦的玫瑰香气，常作为添加剂而广泛地应用于
食品、化妆品和医药领域。酿酒酵母生产2-PE 过程中，支路基因ARO8 的表达会损耗中间代谢物而导致
2-PE 产量不高。科研人员欲使用CRISPR/Cas9 基因编辑技术（CRISPR/Cas9 系统编码的sgRNA 可引导
Cas9 蛋白切割目的基因）对尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母进行编辑处理，以降低由ARO8 基因导致的中间产
物损耗来提高2-PE 产量。生产过程如图1：
注：1.BclⅠ识别序列5'-TGATA-3'，SmiⅠ识别序列为5'- TTTAAA-3'，EcoRⅠ识别序列为5'- GAATTC-3'；
2.URA3 基因表达产物可指导合成尿嘧啶，但当培养基中含有5-氟乳清酸（5-FOA）时，尿嘧啶可将5-
FOA 转化为有毒的5-氟尿嘧啶而抑制细胞生长。
回答下列问题：
(1)构建基因表达载体。人工合成sgRNA 对应的DNA 片段时，应根据 基因的部分已知碱基序列
等设计。据图分析可知，为保证sgRNA 对应的DNA 片段正确插入质粒1 中，在进行PCR 扩增时需在该
DNA 片段上下游分别添加 限制酶的识别序列，再用 连接。基因表达载体除了图示组
成外，还需要有 。
(2)基因表达载体的扩增。在含有 的培养基上筛选培养导入重组质粒的大肠杆菌，提取质粒。
(3)导入受体细胞。用质粒2 转化尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母，在 的平板上筛选成功导入质粒的
酿酒酵母。Cas9 蛋白在sgRNA 引导下切割ARO8 基因实现对ARO8 基因的敲除。实现敲除后，为避免质
粒残留带来后续影响，研究人员将获得的单菌落多次传代，随后稀释涂布在含有 的平板上，筛选
并获得不再含有质粒2 的菌落。
(4)表达水平检测。为验证ARO8 基因的缺失对2-PE 合成的影响，研究人员对2-PE 发酵产量进行了检测，
结果如图2.实验结果说明 。
47．（2025·青海西宁·三模）北京大学贾桂芳课题组、美国芝加哥大学何川课题组、贵州大学宋宝安课题
组将水稻转入肥胖基因（FTO 基因），单株产量提高了三倍。科研人员构建含肥胖基因的重组质粒，主要
技术流程如图所示。图中HindⅢ、BamHI、PstI、XhoI 和EcoRI 表示限制酶，NptⅡ为卡那霉素抗性基因。
请回答下列问题：
(1)获取FTO 基因时，需要先从细胞中提取 ，再通过逆转录过程获得cDNA，进而通过PCR 扩增
FTO 基因；引物的作用是 。
(2)PCR 的产物可通过电泳鉴定，如果待测FTO 基因片段的泳道出现杂带，原因可能是复性时温度偏
（填
高
或
低
），导致
“
”
“
”
。
(3)构建重组质粒时，先将Bt 基因替换为FTO 基因。扩增FTO 基因前，要在两种引物的5'端加入图示限制
酶 的识别序列。过程
构建重组质粒选用的酶是
②
。
(4)常用 法将FTO 基因导入水稻细胞，转化后的细胞在培养基上培养。配制培养基时，除了营养
物质和激素外，还需要的物质是 。
48．（2025·河南郑州·三模）2，3 一丁二醇是一种在食品工业、医药行业等诸多领域具有广泛应用价值的
化合物，常用产气肠杆菌进行生产。产气肠杆菌发酵产生2，3—丁二醇的同时，也会生成乳酸、甲酸、乙
酸等多种副产物，影响产量。回答下列问题。
(1)对产气肠杆菌进行纯培养时，下列接种过程的正确排序是 。培养过后，若在培养基中观察到不
同形态的菌落，原因可能是 。
(2)已知P 基因（位于拟核DNA 分子中）与产气肠杆菌发酵过程中副产物的生成有关。研究人员拟用如下
图所示的流程构建重组质粒，随后将其转入产气肠杆菌体内用以敲除P 基因（敲除后的P 基因将被有关的
酶降解），请完善相关步骤。
要得到步骤
所示的重组质粒，应采用引物
①
③
和 对上述片段进行PCR 扩增。
用限制酶
②
处理PCR 产物，并用XholⅠ对质粒进行酶切。
将酶切后的
③
PCR 产物和质粒进行连接后得到如下重组质粒。
组成该质粒的结构还必须包括
④
（答出2 点即可）等。
(3)将经上述流程获得的重组质粒导入产气肠杆菌并进行筛选，随后采用不同引物组合对筛选后的菌株进行
PCR 扩增，电泳检测结果如下图所示。其中，P 基因已被敲除的有 。为检测该基因工程是否取得
成功，最终应进行的操作为 。
49．（2025·福建三明·三模）我国是世界上最大的水稻生产国，水稻的栽培历史源远流长。在水稻育种方
面，转基因技术已成为新品种培育的一条崭新途径，研究人员运用基因工程技术进行转基因水稻的研究。
图1 是研究人员利用T-DNA 将目的基因导入水稻的一条染色体DNA 局部示意图。
注：
图中灰色部分为带有目的基因的
①
T-DNA 片段。
酶切位点及引物
②
2-5 位于T-DNA 末端区域。
回答下列问题：
(1)由于该T-DNA 长度过长，PCR 无法扩增完整序列，为检测植株是否含有目的基因，应选取的引物是
（从引物2~引物5 中选择），进行PCR 及电泳检测，得到结果，如图2。其中，1 和2 分别为野生型和已
知转基因植株作为对照， 为转基因植株。
(2)反向PCR 技术是一种用于扩增已知序列侧翼未知DNA 序列的技术。为进一步确定含目的基因的T-DNA
插入染色体的具体位置，研究人员利用图2 转基因植株2 的染色体DNA 检测，流程如图3。
通过过程
、
获得环状
Ⅰ
Ⅱ
DNA 后，过程
应选取图
Ⅲ
1 中的引物 扩增。为了验证T-DNA 的定位，
根据过程
测序结果设计引物
Ⅳ
6，选取引物3 和6，以植株2 的染色体DNA 为模板，进行PCR 扩增，电泳
结果获得扩增产物，说明植株2 的T-DNA 整合在 区域。利用引物3 和6 检测其他转基因植物，电
泳结果显示仅部分转基因植物有PCR 扩增产物，则说明 。
(3)对植株2 自交所得子代植株DNA 进行PCR 检测，得到结果如图4。结合图1 推测：子代PCR 时除了使
用了引物2 和6 组合外，还使用了引物 组合，根据PCR 结果可以确定 为所需纯合转基因
植株。
50．（2025·重庆·三模）甲硫氨酸作为必需氨基酸之一，是动物饲料中必不可少的添加剂。某科研小组以
蜡样芽孢杆菌EN34 为材料生产甲硫氨酸，但是产量不高。已知metI 基因、metK 基因与甲硫氨酸的合成和
分解有关，metI 基因指导合成的酶R 可催化M 转化为甲硫氨酸，metK 基因指导合成的SAM 合成酶可催化
甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。回答下列问题：
(1)甲硫氨酸是蜡样芽孢杆菌EN34 的 （填
初生
或
次生
）代谢物。若要提高蜡样芽孢杆菌
“
”
“
”
EN34 生产甲硫氨酸的产量，从调控metI 基因与metK 基因表达的角度分析，应该进行的操作是 。
(2)该小组构建了含有某种强启动子（P43）和metI 基因的基因表达载体，相关过程如图1 所示。该过程需
要用到的工具酶除图中的 HindⅢ和EcoRⅠ外，还有 。metI 基因表达时，以 （填“a”或
“b”）链为转录的模板。科研中常用 （填离子）处理蜡样芽孢杆菌 EN34，有利于将 pEB03-P43-
metI 表达载体导入其中。
(3)该小组利用基因敲除技术（通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失）敲除蜡样芽孢杆菌 EN34
的metK 基因后，将其相关DNA 片段及野生型菌株的相关片段用PCR 技术扩增，再进行电泳处理，结果
如图2 所示。分子在电泳过程中的迁移速率与 答出2 点）等有关，据图2 推测，该过程敲除基因
的原理是 。
51．（2025·甘肃白银·三模）玉米又称棒子、苞米、苞谷等，是我国重要的粮食作物之一。研究玉米的光
合作用速率和培育玉米新品种均具有重要的意义。玉米在早期光合作用的过程中会产生大量可溶性糖，可
溶性糖在淀粉合成酶的作用下转化为淀粉，使玉米籽粒呈糯性。研究发现，与野生型相比，玉米的CST1
基因缺失突变体光合作用速率下降。回答下列问题：
(1)科研人员对玉米叶片的气孔开放程度进行检测，结果如图1 所示，
据图分析，突变型玉米光合作用速率下降的原因可能是 。
(2)科研人员培育出超量表达P 蛋白的转基因玉米，以提高玉米的营养价值。利用Ti 质粒构建的基因表达载
体如图2 所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。将萌发的玉米种子的胚芽尖端割伤，有利于种子吸
收酚类化合物。
在构建基因表达载体时，图
①
2 中切割目的基因的DNA 片段应选用的限制酶是 。同时用农杆菌侵
染玉米叶片外植体，其目的是 ，但科研人员在实验中发现，玉米等单子叶植物无法分泌酚类化合
物，导致农杆菌难以感染，为了提高转化的成功率，可将萌发的玉米种子的胚芽尖端割伤，然后在伤口处
，最后再置于农杆菌液中进行浸泡。
为了检测
②
P 蛋白基因是否整合到玉米细胞的染色体DNA 上，初步检测时最好在培养基中加入 。
52．（2025·甘肃甘南·三模）shRNA 表达载体产生的shRNA 会形成发卡结构，其中单链结构由loop 序列
区编码后产生环形，而双链结构被RNaseⅢ类似酶Dicer 剪切成为siRNA，siRNA 可与靶基因表达产生的
mRNA 结合，导致mRNA 被降解从而诱导靶基因沉默。利用该技术同时干扰植物甲KatB 基因和KatC 基
因的表达，研究人员设计了shRNA 表达载体，KatB 和KatC 转录模板链部分序列和shRNA 表达载体的示
意图如图1、2 所示。回答下列问题:
(1)表达载体的RB 和LB 分别是T - DNA 的右边界和左边界，其中表示终止子的序列是 。目的基因
用限制酶XhoⅠ和SpeⅠ处理后可定向插入6×UAS 的下游，原因是两者切割DNA 产生的 不同。
(2)HPT 表达的酶使细胞对抗生素
潮霉素
——
B 具有抗性。重组质粒转入受体菌后，培养液中添加一定量
的潮霉素B，目的是 、 。
(3)为达到更高的干扰效率，目的基因
的序列与
①
KatB 和KatC 基因 （填图中的区域）的序列一致。
的编码链
①
5'～3'序列与
的
②
序列相同，理由是 。
(4)导入重组质粒的植物甲进行转化并用DEX 诱导目的基因表达，检测基因的表达情况结果如图所示。植
株M 和N 的表达情况不同，其原因可能是 。
53．（2025·江西·三模）海洋中含有丰富的几丁质，科研工作者从红树林虾场土壤中筛选到一株能够分解
几丁质的放线菌橙黄小单孢菌，通过设计特异性引物F（含限制酶 MfeⅠ的酶切位点）和R（含限制酶
HindⅢ的酶切位点），以橙黄小单孢菌的基因组DNA 为模板进行PCR，克隆得到一个几丁质酶基因
Machi3，并成功在大肠杆菌中表达。请回答下列有关问题：
(1)进行PCR 时，除了特异性引物和模板外，还要添加 （至少填2 项），PCR 产物通过琼
脂糖凝胶电泳验证后，再对目的片段进行回收。
(2)将测序正确的Machi3 和pET-28a 质粒（见图1）用 进行酶切,回收目的基因片段和
酶切质粒，用 连接构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌细胞中，对重组菌体
进行培养，分离提纯重组几丁质酶。
(3)将重组几丁质酶液分别与α-几丁质、胶体几丁质、虾壳粉、淀粉、纤维素、不同脱乙酰度的壳聚糖（脱
乙酰度50%、70%、80%、85%、90%、95%）进行反应,在最适反应温度和pH 条件下,测定重组几丁质酶的
酶活力（结果如图2），根据结果分析，其中 是重组几丁质酶的最适底物，推测壳聚糖脱乙酰
度与重组几丁质酶水解效率的关系是 。
54．（2025·黑龙江齐齐哈尔·三模）烟草是喜温植物，对温度较敏感，不同温度对烟草品质和产量的影响
不同。温度低于13℃，烟草无法生长，所以在烟草植株生长的前期和中期，如遇低温天气，则会造成烟草
减产。科学家将陆地棉抗寒基因（GhSAD2 基因）导入烟草，提高烟草的低温防御能力，回答下列问题：
（注：ori：复制原点；CaMV35S：启动子；GUS：报告基因，可将X-葡萄糖苷转化成蓝色物质）
(1)基因工程中可用PCR 技术获取和扩增目的基因，其原理是 ，反应体系中需加入：模板（烟草
DNA 或cDNA）、引物、原料、 、缓冲液和Mg2+等，Mg2+的作用是
(2)为保证GhSAD2 基因正向插入载体，需要在引物1 的 端加入限制酶 序列。扩增出的目的
基因和pBI121 载体经XbaI 和SmaI 双酶切后得到的片段，可用 连接。
(3)将导入GhSAD2 基因和GUS 基因的双基因表达载体pBI121-GhSAD2-GUS 导入农杆菌，可向培养基中
加入 物质，在恒温培养箱中培养直至菌落特征稳定，挑取 色（填
蓝色
或
白色
）菌落
“
”
“
”
，
经扩大化培养后侵染烟草。
(4)为检测GhSAD2 基因是否成功导入并整合到烟草染色体DNA，提取12 株长势较好的转基因烟草植株的
叶肉细胞DNA，用引物1 和引物2 进行PCR 扩增并电泳检测，结果如图2.根据电泳结果，含pBI121-
GhSAD2-GUS 基因表达载体的农杆菌侵染烟草植株的转化率约为 。
（注：M 为分子大小参照物；1-12 为转GhSAD2 基因烟草PCR 产物；13 为pBI121-GhSAD2-GUS 基因表
达载体PCR 产物；14 为野生型烟草PCR 产物）
(5)低温对植物的伤害首先发生在细胞膜上，会破坏细胞膜的流动性，导致电解质渗出，影响外界溶液的电
导率。为检测转基因烟草是否表现出抗寒性状，将野生型烟草和转GhSAD2 基因烟草分别置于4℃环境中，
48h 后测定其导电率，结果如图3.结果显示转基因烟草具有抗寒性状，理由是 。
（注：CK 为野生型植株；T1、T2为转GhSAD2 基因植株）
55．（2025·陕西安康·三模）某萝卜品种是雌雄同花植物，其储藏根长形（R）对圆形（r）为显性，长形
萝卜与圆形萝卜杂交，所得子代全为椭圆形。该萝卜品种在栽培过程中容易感染霜霉病菌，从而影响萝卜
的产量和品质。实验人员从某种微生物细胞内提取到抗霜霉病基因T，并将该基因导入椭圆形萝卜中，获
得了两种椭圆形抗病萝卜品系P1 和P2（每种萝卜品系中只导入了一个抗霜霉病基因T）。为了确认抗霜
霉病基因T 插入的位置，通过PCR 检测P1 和P2 自交后代F1每株个体的相关基因电泳条带组成，结果如图
1、2 所示（各种情况均在图中展示）。不考虑基因突变和互换，回答下列问题：
(1)从微生物细胞中提取DNA 时需要加入蛋白酶，其作用是 。以从微生物细胞中提取的mRNA 为
模板合成DNA，以DNA 为模板进行PCR 扩增得到抗霜霉病基因T，以上过程涉及的关键酶是 。
(2)通过PCR 扩增基因R、r、T 时，需要设计引物，一般来说，设计的引物长度越短，引物特异性越
（填
强
或
弱
）。
“
”
“
”
PCR 的缓冲液中一般都要加入Mg2+，目的是 。
(3)根据图1 可知，抗病萝卜品系P1 中基因T 插入的染色体是 ，该品系自交所得F1①②③代表的植
株表型及比例为 。
(4)抗病萝卜品系P2 自交后代结果表明基因R/r 与基因T 位于 （填
同源染色体
或
非同源染色
“
”
“
体
）上，图
”
2 中
代表的植株在
②
F1中所占的比例为 。
56．（2025·安徽·三模）玉米是我国种植面积最大、总产量最高的作物，但在生产上，玉米常因感染禾谷
镰孢菌患玉米茎腐病，使得产量大大减少。研究发现植物LOBI 基因在响应病原侵染中具有重要作用，为
探究玉米中的LOBI 基因是否具有相同作用，某研究团队将玉米中的LOBI 基因连接到强启动子上，并通
过下列途径获得转基因玉米植株，回答下列问题:
(1)步骤
农杆菌转化法的原理是
③
:农杆菌细胞内含有 质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，该质粒
上的 可以转移到被侵染的细胞，并且 。
(2)步骤
在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是
①
和 ，使用双酶
切的优点在于 。
(3)步骤
将浸泡过含有农杆菌溶液的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，需要用到的植物激素有
④
，
除此之外培养基中需加入 ，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米
植株。
57．（2025·重庆·三模）基因工程中的启动子实际包含了基本启动子和增强子两个基因元件，基本启动子
本身不足以启动基因表达（图A），只有基本启动子上游或下游存在增强子时，才能开启转录（图B）。
科学家想要捕获斑马鱼体内的增强子，制作了
增强子侦察元件
，包含了基本启动子、报告基因和终止
“
”
子（图A），并把侦察元件转入受精卵，侦察元件会随机插入基因组中。
(1)增强子是 （有/没有）遗传效应的DNA 片段。根据图C 分析，为了捕获增强子，筛选后代的标准
是 。
(2)筛选具有某种特征的后代后，将其基因组随机打断成较大的碎片，并纯化分离。为了将其中具有报告基
因的碎片挑选出来，可以采用PCR 技术检测，应选用的引物组合（图D 中挑选）是 。电泳结果若有
条带，则说明电泳结果所对应的DNA 碎片含有 。
(3)为了对增强子测序，需要大量的含增强子的DNA 序列。将选出的碎片环化处理，并选择引物组合（图
D 中挑选） 进行PCR。再对扩增产物进一步测序，即可获得增强子DNA 序列。
(4)人类已经完成斑马鱼全基因组测序，实验方法可以改进。研究者对图A 所示侦察元件进行了改造，期望
改造后的元件随机插入基因组后，在
侦察
增强子的同时，也造成该增强子原本所调控的基因发生突变
“
”
，
失去功能。研究者找到能表达报告基因的个体，分析突变基因，对照全基因组序列，即可快速定位增强子
位置获取增强子序列。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 。
58．（2025·河北沧州·三模）作物抗性的提高和产量的提高往往难以兼顾，在不损失作物产量的前提下，
提高其抗逆性是一个长期性的挑战。我国科学家利用逆境诱导型启动子OsNAC6 调控水稻锌指蛋白在高盐
胁迫下的表达，实现了作物在干旱条件下的产量提升。回答下列问题：
(1)高盐胁迫下， 才可以与OsNAC6 结合，进而合成锌指蛋白。下图为OsNAC6 与锌指蛋白基因融
合后的结构及相应限制酶切割位点示意图，其转录的模板链为a 链，则在体外扩增融合序列时，应选用的
引物是 ，1 个融合序列在体外扩增n 次需要 个引物。
(2)利用图2 所示质粒构建基因表达载体，欲通过荧光定量分析锌指蛋白基因的表达情况，则需在图1 融合
序列上游和下游引物的 （填“3'”或“5'”）端分别添加限制酶 对应的序列，并选用XhoI 和
MunI 切割质粒来得到所需黏性末端，这样做的目的是 （答出2 点）。
限制酶
识别序列
XhoI
5'-C↓TCGAG-3'
3'-GAGCT↑C-5'
MunI
5'-C↓AATTG-3'
3'-GTTAA↑C-5'
SalI
5'-G↓TCGAC-3'
3'-CAGCT↑G-5'
EcoRI
5'-G↓AATTC-3'
3'-CTTAA↑G-5'
NheI
5'-G↓CTAGC-3'
3'-CGATC↑G-5'
(3)将重组质粒导入水稻体细胞常用的方法是 。为检测重组质粒是否导入水稻细胞，研究人员进行
了如下实验：
组别
项目
A
B
C
D
细胞类
型
非转基因细
胞
转基因细胞
非转基因细
胞
转基因细胞
培养液
正常培养液
①
荧光检
测
的处理应为
①
。若检测结果为 ，则说明导入成功。
59．（2025·黑龙江大庆·三模）胶原蛋白广泛应用于食品、医疗、美容等领域。利用基因工程生产的胶原
蛋白组织相容性极好，对细胞生长及伤口愈合等都有显著效果，是现代生物医药材料的开发重点。科学家
将编码胶原蛋白的基因SUMO-hCOL1A 1 导入大肠杆菌中构建基因工程菌，过程如图。请回答以下问题：
(1)从组织细胞中提取胶原蛋白mRNA，通过 过程获得cDNA，该cDNA 中 （填
含有
“
”
或
不含有
）终止子。
“
”
(2)为了能对基因SUMO-hCOL1A 1 与质粒pET21a（+）进行双酶切，以构建重组质粒pET21a（+）-
SUMO-hCOLIA 1，采用PCR 技术扩增基因SUMO-hCOL1A 1 时，应将 （填限制酶）识别序列加
在引物的 （填“5'”或“3'”）端。
(3)构建重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1 时，目的基因会与质粒上长度为150bp 的片段发生置换。
质粒pET21a（+）和重组质粒pET21a（+）-SUMO-hCOL1A 1 在HindⅢ酶切后获得的片段如下表所示（每
种片段各1 个）：
质粒类型
pET21a（+）
pET21a（+）-SUMO-hCOL1A1
酶切获得片段
1800bp、3750bp
550bp、2200bp、4050bp
则基因SUMO-hCOL1A 1 上有 个HindⅢ的酶切位点，该基因长度为 bp。
(4)将重组质粒导入先用 处理的大肠杆菌中，并接种在含氨苄青霉素的培养基中培养。
(5)为验证基因工程菌是否构建成功，提取上述基因工程菌质粒，利用（2）中的限制酶对其进行双酶切，
产物进行电泳，结果如下图。初步分析可知，基因工程菌的构建 （选填
成功
或
不成功
）
“
”
“
”
，
理由是 。
60．（2025·青海海东·三模）小白鼠的红眼对黑眼为显性，分别由等位基因R/r 控制，其长尾和短尾由另一
对等位基因M/m 控制。现用一只红眼长尾雄鼠和一只黑眼短尾雌鼠作亲本杂交，F1中红眼长尾：黑眼短尾：
红眼短尾：黑眼长尾约为1：1：1：1。不考虑X、Y 同源区段，回答下列问题：
(1)F1的实验结果能否说明R/r、M/m 的遗传遵循自由组合定律？说明理由： 。
(2)若长尾对短尾为显性，则两对等位基因位于染色体中的情况可能为 。
(3)经检测，现已确定短尾对长尾为显性，兴趣小组将F1红眼短尾雌雄鼠相互交配，若子代出现 ，则
两对等位基因位于两对常染色体上。
(4)平滑肌细胞（SMC）是哺乳动物血管壁的重要组成部分，其功能产生障碍会导致主动脉瘤的发生。研究
人员为开发特异性标记血管SMC 的方法，开展了相关研究。为获得血管SMC 被特异性标记的工具鼠并用
于研究，研究人员进行了下列实验，利用转基因技术分别获得含一个CE 基因的转基因A 鼠、含一个Stop
基因和一个tdT 基因的转基因B 鼠（CE 基因所在染色体和Stop、tdT 基因所在染色体为非同源染色体），
将A 鼠和B 鼠杂交，如图所示。
A
①
鼠和B 鼠杂交后获得同时含有以上三种基因的CE 杂合小鼠C，其所占比例为 。
在外源药物
②
T 的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核中，Cre 重组酶能导致loxP 位点间的
序列丢失。根据题意，用药物T 饲喂小鼠C 后，可观察到SMC 。
61．（2025·四川成都·三模）酵母细胞中的转录因子GAL4，含有与DNA 结合的BD 蛋白和激活DNA 转录
的AD 蛋白，二者在空间上接近时，才能激活相关基因的转录。利用该原理(如图甲)，可以研究两种蛋白
质(“诱饵
蛋白和
猎物
蛋白
”
“
”
)是否具有相互作用。通过构建基因表达载体将
诱饵
蛋白与
“
”
BD 融合、
猎物
蛋白与
“
”
AD 融合，如果
猎物
蛋白与
诱饵
蛋白能相互作用，在酵母菌细胞中形成
诱饵蛋
“
”
“
”
“
白
猎物蛋白
复合物时，
—
”
AD 与BD 在空间上接近，就可以激活相关基因(这个被激活的、能显示
诱
“
饵
和
猎物
相互作用的基因称之为
报告基因
”
“
”
“
”)的转录。为了探究植物细胞中钙调蛋白(CaM)是否与
激酶(CDPK1)相互作用，科研人员利用图乙所示的质粒和目的基因构建基因表达载体，图乙中限制酶的识
别序列依次为
Ⅲ
、
Ⅰ
、
Ⅰ
、
Ⅴ
。回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR 扩增CaM 基因，PCR 是根据DNA 的原理在体外大量扩增目的基因的技术。
为了使扩增后的CaM 基因经相关限制酶切割后能够准确插入图乙的AD 质粒中，所用引物的5'端需要分别
添加序列为5' - - 3'和5' - - 3'。
(2)该研究除了构建CaM - AD 重组质粒外，还需要构建另一种重组质粒(简称X 重组质粒)，该重组质粒需
要保证插入的 基因与BD 质粒中的 基因能正确表达出所需要的融合蛋白。两种重组质粒构建
好后，需要将它们导入 (填“1”或“2”)个酵母菌细胞中进行表达。
(3)组氨酸、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤是酵母菌生存必需的营养物质，该实验用的酵母菌由于基因异常不能
合成上述营养物质。研究人员将AD 质粒、BD 质粒、CaM - AD 重组质粒、X 重组质粒按照不同组合导入
这种缺陷酵母菌(“＋
代表
导入
－
代表
未导入
”
“
”“
”
“
”)，再接种到相应的平板上培养，一段时间后观
察到的菌落情况如图丙所示。
已知BD 质粒中含有控制亮氨酸合成的基因，根据图丙中菌落情况推测，报告基因为控制营养物质
合成的基因。实验结果显示CaM 与CDPK1 (填
能
或
不能
“
”
“
”)相互作用，理由是 。该实
验设置第二组和第三组的作用是 。
62．（2025·湖北·三模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞
中PA 的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA 结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白
（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA 变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA 含量。无缝克隆技术
连接DNA 片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。
注：bar 为草胺膦抗性基因；Kanr 为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5 核酸外切酶沿 （填“5′→3′或“3′→5′”）的方向水解DNA 形成黏性末端。
(2)过程
两个片段复性后存在一段
缺口
的原因是过程
形成的黏性末端
②
“
”
①
（填
大于
等于
或
“
”“
”
小于
）互补配对的区段（同源序列），过程
所需的酶有
“
”
③
。
(3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有____。
A．不受限制酶酶切位点的限制
B．不会引入多余碱基，不会出现移码突变
C．操作相对简单，成功率高
D．不需要使用PCR 技术扩增目的基因
(4)PCR 扩增PABD 基因时需依据 的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的片段的所用的引物F1
和R2 可对应下表中的 （填序号）。
①
5′-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3′
②
5′-
AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3′
③
5′-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3′
④
5′-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3′
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有 的MS 培养基上进
行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，了
解PA 的分布和含量。
63．（2025·江苏常州·三模）水稻是全球最重要的粮食作物之一，提高其光合作用效率对于保障粮食安全
具有重要意义。近年来，科学家们通过基因工程技术将蓝藻中的相关基因导入水稻，以提高其光合效率和
产量。回答下列问题：
(1)扩增目的基因。研究人员需要根据 序列设计引物；在PCR 反应前，在微量离心管中加入原料、酶
等成分后离心，其目的是 ；适当提高退火温度可以提高PCR 扩增的特异性，原因是 。
(2)构建并鉴定重组质粒。表达载体与含目的基因的DNA 片段如图1 所示，据图分析，用一种限制酶与
DNA 连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是 。完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶
（填“E”或“B”或“H”或“X”）进行完全酶切并电泳，电泳时需要根据 的移动掌控电泳进程，电泳
结果如图2 所示：图2 中出现结果
的原因是
Ⅰ
，出现结果
、
的原因是
Ⅱ
Ⅲ
。最后，根据电泳结
果，筛选出正确的重组质粒。
64．（2025·江苏盐城·三模）持续和大量施用有机磷化合物会严重威胁人畜健康及生态环境，科研人员从
邻单胞菌中发现甲基对硫磷水解酶基因mpd，其表达产物MPD 能够高效水解无色的甲基对硫磷并且生成
亮黄色的对硝基苯酚。将mpd 导入枯草芽孢杆菌制备优质菌种，构建表达载体的主要过程如下图所示，请
回答下列问题:
(1)过程
采用重叠延伸
①
PCR 的方法获得启动子PytkA 与信号肽SPnprB 的融合基因，除了图示的条件外，
扩增PytkA 时还需要的条件还有 ，设计引物R2 的依据有 。P2、R1 对应于下面的4 个引物
中的 。最终要获得大量PytkA＋SPnprB 融合片段，需要用图中引物 进行PCR。
a.5′GCGGGATCCTTTTTTGTGACG—3′
b.5′－GAAAGGTGATGGCATGCGCAACTTGACCAAG－3′
c.5′－CTTGGTCAAGTTGCGCATGCCATCACCCTTTC－3′
d.5′－GCGCTGCAGCTGAGGCCATG－3′
(2)过程
构建表达载体时，需要用
③
酶切PytkA＋SPnprB＋mpd 融合片段与载体1，再用DNA 连接酶
连接，将重组表达载体导入处于感受态的大肠杆菌，接种于含有 的培养基中37℃培养。
(3)提取构建成功的表达载体，导入枯草芽孢杆菌，需要接种于含有 的培养基，出现 ，说明
得到能成功表达的细胞。
(4)研究人员进一步用A、B 两种不同的启动子构建表达载体，探究它们对菌体增殖和mpd 基因表达的影响，
结果如图2，实际生产中应采用 ，理由是 。
65．（2025·陕西安康·三模）疫霉菌感染会造成辣椒严重减产，水杨酸（SA）可以抵御疫霉菌感染。科研
人员测定了辣椒叶片中的SA 含量，结果如图1 所示。P 酶催化合成SA，H 蛋白能促进P 基因表达P 酶。
回答下列问题：
(1)红光可作为一种 作用于光敏色素，进而调控植物的生长发育。据图5 分析，两种不同光处理后，
辣椒感染程度低的是 （填
白光
或
红光
）处理组，理由是
“
”
“
”
。
(2)科研人员推测H 蛋白通过特异性结合P 基因的启动子来促进P 基因表达，为验证上述推测，科研人员开
展相关研究，实验组部分过程如图2 所示。结果显示，与对照组相比，实验组转基因植株荧光强度更高。
质粒1 上的甲、质粒2 上的乙分别是 （填“H”或“P”）基因的启动子、 （填“H”或“P”）
基因。
(3)结合以上研究，请提出一种减少疫霉菌感染造成的减产的措施： 。
66．（2025·甘肃白银·三模）抗菌肽（AMPs）作为抗生素替代物，具有广谱抗菌活性及不易使细菌产生耐
药性等优点。研究者欲利用改造后的大肠杆菌（工程菌）生产AMPs。回答下列问题：
(1)用PCR 扩增目的基因M 时，设计的特异性引物有 种。
(2)AMPs 也会抑制大肠杆菌，造成组成型表达（持续表达）目的基因M 的大肠杆菌最大种群数量偏低，限
制了AMPs 产量。研究者在大肠杆菌基因组DNA 中插入N 和C 基因，使质粒上目的基因M 的表达受到红
光控制。红光调控目的基因M 表达的原理如图所示。
N 和C 基因表达应为 （填
组成型表达
或
红光诱导型表达
）。据图阐述红光调控目的基因
“
”
“
”
M
的表达过程： 。
(3)为避免工程菌泄漏污染环境，研究者利用阻遏蛋白基因和调控元件，使工程菌在红光和蓝光同时照射时，
激活致死基因G 表达，从而诱导工程菌死亡。完善工程菌生产AMPs 步骤。
在黑暗条件下培养工程菌至种群数量达到最适值（
①
K 值）。
② 照射至AMPs 浓度在培养液中达到适宜浓度（生产需求量）。
③ ，避免工程菌泄漏。
67．（2025·四川成都·三模）
生物钢
是一种蛛丝蛋白，其强度是钢的
“
”
45 倍，且有蚕丝般的柔软和光泽，
在纺织、医疗等多领域具有广阔的应用前景。科学家从蜘蛛中获取蛛丝蛋白基因并将其植入山羊体内，使
得羊奶中含有蛛丝蛋白，再利用特殊的纺丝技术，将羊奶中的蛛丝蛋白纺成丝。回答以下问题：
注：
图
①
1 为蛛丝蛋白基因DNA 片段结构示意图；
图
②
2 是基因工程中所使用的载体示意图，图中
KpnⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ均表示相应限制酶识别位点；
蛛丝蛋白基因转录的模板链位于
③
b 链（图3 中标识b 链
碱基序列）。
(1)为使目的基因与载体正确连接，利用PCR 技术获取和扩增蛛丝蛋白基因时所需要的两种引物的序列分
别为 、 （注意标明
端和
端）。
(2)若要构建A 山羊乳腺生物反应器，则受体细胞常选择 ，同时结合基因表达载体结构组成分析，载
体中P 应为 ，其功能是 。
(3)研究人员发现，若将蛛丝蛋白31 号位的色氨酸替换为酪氨酸（注：色氨酸的密码子为UGG：酪氨酸的
密码子为UAC 和UAU）；蛛丝韧性可提高50%。研究人员欲利用大引物PCR 技术对蛛丝蛋白基因进行定
点诱变（过程见图3），则拟突变位点对应的基因结构为 （标明
端和
端）。第一次PCR 的产物
DNA 中碱基序列与b 链 （填
相同
或
互补
）的链作为第二次
“
”
“
”
PCR 所用的引物。与X 射线诱变
相比，该突变技术的优点是 （答出一点即可）。
(4)培育转基因山羊涉及的生物工程技术包括 （答出两种），为检测转基因山羊是否成功表达蛛丝蛋
白基因，请写出检测思路： 。
68．（2025·陕西·三模）同源重组基因敲除技术是将同源DNA 片段导入受体细胞，利用同源 DNA 片段
的互换，用其他DNA 片段在原有位置替代靶基因，从而实现基因的敲除。米曲霉产生的曲酸具有抗菌性、
抗氧化性等抗逆能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组基因敲除技
术成功敲除了米曲霉3.042 菌株中的msn2 基因，获得高产的g-5 菌株。其部分机理如图1 所示（bp 表示碱
基对）。
(1)构建基因敲除框需要的工具酶有 ，将基因敲除框导入米曲霉细胞常用的方法是 。
(2)科研人员选取进行基因敲除操作后的3 个菌落，分别提取其DNA，选择图中引物 进行PCR 扩增，
电泳结果如图2 所示。根据1 号菌落电泳结果可得出的结论是 。为进一步验证3 号菌落为目的菌落，
需要选择图中引物 重复上述操作。
(3)米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关，tpsⅠ基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。推测
tpsⅠ基因表达产物与曲酸合成的关系是 。为验证该推测，可采用的实验方法是 ，预期实验结果
是 。
69．（2025·辽宁·三模）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究小组拟将胰凝乳蛋白酶
抑制剂（StPinlA）的基因插入胰蛋白酶抑制剂（NaPI）基因的表达载体中，并对棉花进行共同转化，使其
在棉花细胞中表达NaPI-StPinlA 融合蛋白，从而获得转基因植株，过程如图1 所示。回答下列问题：
限制酶
识别序列及切割位
点
BamHI
5'-G↓GATCC-3'
EcoRI
5'-G↓AATTC-3'
HindIII
5'-A↓AGCTT-3'
DraIII
5'-CAC↓GTG-3'
StuI
5'-AGG↑CCT-3'
(1)扩增StPinlA 基因时，可选择图1 中的一对引物是 ，StPinlA 基因上无限制酶的识别序列，为了
使扩增后的StPinlA 基因能够与Ti 质粒上的NaPI 基因正确连接，用PCR 技术扩增StPinlA 基因时，需要设
计合适的加端引物，依据图1 及表的信息推测，引物E-F 包含的碱基序列为5'- （写出12 个碱基
序列）-3'。
(2)为了使连接后的重组基因NaPI-StPinlA 能够表达出融合蛋白，设计时应考虑剔除NaPI 基因中的终止子
序列、 及NaPI 基因中终止密码子对应的碱基序列，剔除NaPI 基因中终止密码子对应的碱基序列
的目的是 。
(3)将构建好的重组Ti 质粒导入农杆菌中进行转化，并将农杆菌涂布在含有 的固体培养基上，从
而选择出生长正常的菌落中的农杆菌与棉花的叶肉细胞共培养。在愈伤组织阶段取部分细胞提取总DNA
进行PCR 和凝胶电泳，此操作的目的是 ，取细胞A、 B、C、D 中的DNA 扩增后的电泳结果如图
2 所示，其中成功导入重组基因NaPI-StPinlA 的细胞是 。
70．（2025·四川南充·三模）乙偶姻是一种天然存在于多种食品中的化合物，常被用作食品添加剂和防腐
剂。当前，生物法制备乙偶姻主要以糖类为底物，从微生物发酵液中提取乙偶姻，其代谢途径如图1。
为了得到高产乙偶姻的菌株，科学家构建了budC 基因敲除的枯草芽孢杆菌，构建流程如图2。
注：1）F1、F2、R1、R2表示引物，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因，Tetr为四环素
抗性基因。2）同源重组是指两个DNA 分子的相同区域之间发生的交换和重组。
(1)PCR 过程中，每次循环可分为 三步，扩增budC 基因下游片段时引物中需分别添加 的酶切
位点。
(2)为筛选出目的菌株（即含有完整重组质粒的枯草芽孢杆菌），请完善以下内容：
序
步骤内容
结果及结论
1
将经图中
处理的枯草芽孢杆菌接种到含氨苄青霉素
③
的培养基上培养，一段时间后，培养基上出现单菌
落。
，说明该单菌落的
菌株即为目的菌株。
2
将 培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生
长。
(3)为检测枯草芽孢杆菌budC 基因敲除是否成功，研究人员提取（2）小题筛选出的枯草芽孢杆菌的5 个菌
株的基因组，然后用引物F1和R2进行扩增并电泳，结果如图3。根据电泳结果能判断budC 基因敲除成功，
原因是 。
(4)将budC 基因敲除成功的枯草芽孢杆菌经过优化后投入到工厂中进行乙偶姻的生产，请在图4 中补充发
酵产乙偶姻的基本步骤 、 。
71．（2025·浙江嘉兴·三模）在水稻品种改良中，CRISPR-Cas9 基因编辑技术具有重要价值。技术路线主
要步骤是：选择目标基因
设计
→
sgRNA→构建sgRNA-Cas9 复合体
转移到水稻细胞内。在
→
sgRNA 的引导
下，对目标基因进行编辑。已知：野生型水稻易感病（基因型为aaBB）；基因A 使水稻抗稻瘟病；基因
B 介导感病反应信号途径；A/a、B/b 两对基因独立遗传。回答下列问题：
(1)获得抗稻瘟病水稻的方法之一是导入A 基因，以期获得基因型为 的纯合水稻。也可以通过
基因B 介导的感病反应途径来获得抗稻瘟病水稻。
(2)科研人员首先设计一段与 互补的sgRNA，构建sgRNA-Cas9 复合体，对野生型水稻进行基因敲除，
将获得的水稻（P）种植，表现为易感稻瘟病。让其自交，F1中大部分易感稻瘟病，少部分抗稻瘟病。亲
本（P）的基因型是 （注：原有基因被敲除后，在原有基因字母右上方写上“-”表示，如a-、B-）。
(3)利用基因编辑技术敲除水稻相关基因，该过程会导致水稻的遗传多样性 。从进化的角度讲，这种
变异为生物进化提供了 。在基因编辑过程中，可能会出现对非目标基因进行了编辑，最可能的原因
是 。
(4)基因编辑产物可能会通过杂交转移到其他植物，这种现象属于 （填
遗传漂变
或
基因漂
“
”
“
移
），这种基因污染可能导致生物多样性降低，因此我们必须在创新与
”
之间寻求平衡。
72．（2025·四川达州·三模）启动子包括不同类型、其中组成型启动子可以高效地启动目的基因在植物各
种组织中的表达、但带会阻碍植物的生长发育、诱导型启动子可在特定环境条件下诱导目的基因的表达。
沙冬青脱水素基因（AmDHN 某因）能使梢株具有较强的抗旱作用。科研人员通过构建AmDHN 基因表达
载体、以培育耐旱苔药新品种。请分析并回答下列问题：
限制酶
识别序列和切割位
点
Bcll
T↓GATCA
Sac l
GAGCT↓C
BamH1
G↓GATCC
Pst 1
CTGCA↓G
Sma 1
CCC↓GGG
(1)用如图所示载体1 构建含AmDHN 目的基因的表达载体，可以成功转化苜蓿，但会出现抑制芽生长和植
株生根的现象，推测
35S 启动子属于 启动子，其基本组成单位是 ，能识别
35S 启动子的酶是
。
(2)为了弥补这一缺陷，科研人员将载体1 中的
35S 启动子替换成诱导型的Rd29A 启动子，得到载体2。载
体2 除启动子外其他部分均与载体1 相同。下图是科研人员用PCR 技术扩增AmDHN 基因时所设计的引物，
根据引物的碱基序列及限制酶的识别序列分析，将AmDHN 基因与载体2 正确连接应选用的限制酶是
，酶切后再利用 酶将AmDHN 基因拼接到载体2 的切口处。
上游引物P1：5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3'
下游引物P2：5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3'
(3)拼接好的重组载体应先转入 中，再转化苜蓿。在苜蓿培养基中添加 筛选转化成功的愈伤组
织，再通过 过程获得苜蓿植株。
(4)为检测转基因苜蓿中AmDHN 基因的转录水平，挑选10 株转基因植株幼苗，平均分成2 组，分别将幼
苗根系用自来水和等量20%PEG 溶液处理8h，20%PEG 处理的目的是 。8h 后利用逆转录PCR 和电
泳技术检测AmDHN 基因和MtActin 基因（一种骨架蛋白基因，在各种细胞中表达都相对恒定）的表达水
平，结果如下图所示，结果表明 。
蛋白质工程
一、单选题
1．（2025·安徽·三模）蛋白质组指某个时刻，某个组织、器官或个体中所有蛋白质的集合。中国科学家率
先倡导并领衔了人类第一个器官（肝脏）国际蛋白质组计划（HLPP），构建了人类第一个器官（肝脏）
蛋白质组图谱，有利于揭示肝病的发病机制和病理过程，可发现新型诊断标志物、治疗和创新药物，全面
提高疾病防治水平。下列叙述正确的是（ ）
A．肝细胞中的核糖体、线粒体均直接参与蛋白质的合成过程
B．特定时间、空间的蛋白质组能够表征人体是否处于某种疾病状态
C．肝脏与其他器官蛋白质组图谱有差异的原因是基因组图谱有差异
D．人体每个器官都拥有一张蛋白质组图谱，且保持终身不变
2．（2025·浙江·三模）人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用下图所示的PCR 技术改造人胰岛素
基因。下列说法错误的是（ ）
A．改造前后人胰岛素基因热稳定性基本不变
B．PCR 过程经过2 轮循环即可得到目标基因
C．图中两条子链的方向不同由引物不同决定
D．通过电泳检测PCR 产物不能确定基因是否改造成功
3．（2025·四川成都·三模）某团队为提升猪α 干扰素(PoIFN－α)的抗病毒活性，针对其8 个关键氨基酸位
点进行改造，构建突变体PoIFN－α 8s。测序显示，改造后的DNA 非模板链序列第5 位点由“TAC”突变为
“TGC”，导致编码的氨基酸由酪氨酸变为半胱氨酸，其余位点突变未改变氨基酸种类。下列分析错误的
是（ ）
A．提升猪α 干扰素的抗病毒活性是通过改造基因来完成的
B．密码子AUG、ACG 决定的氨基酸依次是酪氨酸、半胱氨酸
C．第5 位点突变可能导致猪α 干扰素的空间结构发生改变
D．其余位点突变未改变氨基酸种类与密码子的简并性有关
考点03
4．（2025·黑龙江大庆·三模）据统计，每年全球约10 万人死于蛇毒。眼镜蛇毒液中的三指毒素（3FTxs）
本质为蛋白质，可与人体的烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰正常的神经传导，迅速引发肌肉瘫痪、呼吸衰竭
和组织坏死。2024 年诺贝尔化学奖获得者DavidBaker 教授研究团队用AI 技术结合蛋白质工程获得了热稳
定性高的迷你蛋白（S），可与3FTxs 的关键区域结合，消除毒性。下列说法错误的是（ ）
A．S 在高温下仍能保持折叠结构和活性，更利于运输和存储
B．S 较普通抗体小，组织渗透性强，可快速起效
C．S 与细胞因子、溶菌酶等均属于免疫活性物质
D．S 与3FTxs 高度亲和，可有效阻止毒素与神经递质受体结合
5．（2025·甘肃白银·三模）为提高玉米品质，研究者将赖氨酸的密码子AAA 改造成玉米偏好的密码子
AAG，并将富含赖氨酸（AAG）的蛋白质编码基因导入玉米，使原有的蛋白质编码基因被改造，获得了富
含赖氨酸的转基因玉米。此过程发生的变化有（ ）
A．转基因玉米细胞中基因的表达过程发生改变
B．富含赖氨酸的蛋白质编码基因转录形成的mRNA 增多
C．富含赖氨酸的蛋白质编码基因的核苷酸序列发生改变
D．富含赖氨酸的蛋白质的氨基酸排列顺序发生改变
二、解答题
6．（2025·四川德阳·三模）目前用于治疗人类疾病的单克隆抗体大多数是鼠源单抗，人体对鼠源单抗有一
定的排斥反应。科研人员根据抗体的结构特点对鼠源单抗进行改造，思路如图甲。获得相关基因后，利用
PCR 技术进行融合得到目的基因，将其与乳腺细胞表达载体PBCI 构建形成重组DNA 分子。目的基因，表
达载体PBCI 的结构如图乙所示。请回答下列问题：
注：P1 为山羊乳腺中特异表达的基因启动子，P2 为四环素诱导启动子（必须在四环素存在时才能起作
用）；限制酶Mbol、Xbal、Scal 的识别序列均不相同
(1)图甲所示的抗体改造思路属于 工程的范畴。
(2)构建重组DNA 分子时，应选择限制酶 切割目的基因与PBCI 载体，以便目的基因正确插入
质粒并后续通过荧光检测进行筛选。
(3)通常将重组DNA 分子导入小鼠的 （填细胞名称），在培养液中加入 后，发出 色
荧光的即为目标细胞，再经过 工程获得大量转基因小鼠。
(4)通过 技术和凝胶电泳技术检测小鼠细胞中的目的基因，再通过 技术检测转基因小鼠乳汁中
的改造抗体水平。检测结果发现：目的基因含量正常而相应的mRNA 含量很少，改造抗体水平也较低。结
合题中信息，原因最可能是 。
7．（2025·河南·三模）T4 溶菌酶耐热性差，不利于工业化应用，科研工作者借助PCR 定点突变技术（见
图1）改造T4 溶菌酶基因，并将改造的基因与质粒（见图2）重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的T4
溶菌酶。回答下列问题。
(1)获得耐高温的T4 溶菌酶的过程属于 工程范畴。对T4 溶菌酶基因的改造离不开PCR 技术，该
技术的原理是 。图1 中，由杂交产物延伸形成全长T4 溶菌酶突变基因的过程② （填
需要
或
不需要
）添加引物。
“
”
“
”
(2)研究发现，Taq 酶在PCR 反应结束时，往往会自动在产物的3＇末端添加一个核苷酸“A”，如图2 所示。
先选用特定限制酶对质粒进行酶切，然后使用末端转移酶，在切口处加入一个核苷酸“T”，用DNA 连接
酶就能将目的基因与质粒连接起来。为了达成目的，现有3 种限制酶（酶切位点如图2），应选用
（填酶名称）对质粒进行酶切。但使用该种方法构建重组质粒会遇到插入的目的基因 （
自身环
“
化
或
反向连接
）的问题。
”
“
”
(3)将受体菌接种在含 的培养基上培养，一段时间后，颜色为 色的菌落即为成功导入重组
质粒的受体菌。
三、实验题
8．（2025·湖南常德·三模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高
温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27 位的亮氨酸替换为
天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2）。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了AmyS2
基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1 所示。最终结果表明，与导入质粒B 相比，导入质粒C 的芽孢杆菌
的培养液中更易获得并提纯AmyS2.回答下列问题：
(1)科研人员利用蛋白质工程对淀粉酶（AmyS2）进行了如下改造：预期AmyS2 的功能
设计
→
AmyS2 的结
构
设计
→
AmyS2 的
人工合成
→
AmyS2 基因的 序列
将获得的
→
AmyS2 基因导入芽孢杆菌
生产AmyS2.
(2)根据图2 分析，利用PCR 技术扩增AmyS2 基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 。若
将该基因扩增过程中至少经过 次循环，可获得32 个符合要求的目的基因。
(3)将AmyS2 基因与原始质粒A 构建成质粒B，应选择的限制酶是 ；将质粒B 与信号肽基因构建
成质粒C，应选择的限制酶是 。在工业生产中，使用导入质粒C 的工程菌生产α-淀粉酶时，更容
易从培养液中获取并提纯目标蛋白质，据此推测，信号肽的功能可能是 。
(4)芽孢杆菌细胞内的bp 基因会表达出一种胞外蛋白酶，导致胞外α 淀粉酶被降解。科研人员利用基因编
辑技术敲除芽孢杆菌的bp 基因，构建能高效表达α 淀粉酶的工程菌。利用PCR 技术可以检测bp 基因是否
被成功敲除，请简述实验设计思路： 。
9．（2025·四川眉山·三模）t-PA 蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注
射大剂量的 t-PA 会诱发颅内出血。研究证实，将 t-PA 蛋白第 84 位的氨基酸替换后，能显著降低出血副
作用。请回答下列问题：
(1)获得能显著降低出血副作用的t-PA 改良蛋白的正确顺序是 （选择正确的编号并进行排序）。
t-PA
①
蛋白功能分析和结构设计
借助易错
②
PCR 技术对t-PA 基因进行随机突变
借助定点突变改造
③
t-PA 基因序列
检验
④
t-PA 蛋白的结构和功能
设计
⑤
t-PA 蛋白氨基酸序列和基因序列
利用工程菌发酵合成
⑥
t-PA 蛋白
(2)改造t-PA 基因序列可以利用如图 1 、2 所示的基因定点突变技术。图 1 表示重叠延伸 PCR 技术，
其中第 1 对引物是指 ，两对引物参与的 PCR 过程不能在同一反应系统中进行，原因是 。不
选择产物 A 进一步延伸的原因是 。
(3)图 2 表示 CBE 单碱基编辑系统，该系统由三个元件构成，其中“dCas9 蛋白+胞苷脱氨酶
在
”
sgRNA 的引导下，对结合区域第 4-8 位点的碱基 C 脱氨反应变成 U ，最终实现 C→T 的不可逆编辑。
过程② （发生/未发生）磷酸二酯键的断裂和形成。CBE 单碱基编辑系统将靶位点胞嘧啶脱氨基后，
细胞复制 次，子代 DNA 中靶位点碱基对由C-G 彻底替换成 A-T ，实现单碱基编辑。
(4)图 3 分别表示通过基因定点突变技术获得并酶切后的t-PA 改良基因、质粒 pCLY11 与一些限制酶的识
别序列和酶切位点。要想将t-PA 改良基因与质粒 pCLY11 高效连接，需用限制酶 切割质粒。
(5)LacZ 基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解 X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。将
转化后的大肠杆菌接种在含有 的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的菌落特征是
。
