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专题12 基因工程
1、（2025 届山西省部分学校高三下学期3 月高考考前适应性测试一）人参这种珍贵中药材的药效主要由
人参皂苷发挥作用。科研人员将合成人参皂苷Rh2 的关键酶基因（UGT 和D12H）导入酿酒酵母，实现了
多基因表达，从而实现人参皂苷Rh2 工厂化生产。下图为相关操作流程图，①~④表示过程。下列叙述正
确的是（ ）
A．①需要先将RNA 反转录出DNA，再利用PCR 获取和扩增目的基因
B．②利用PCR 在目的基因上添加酶切位点时，需在引物的3'端引入该位点
C．③是基因表达载体的构建，将目的基因1 连接在启动子1 的上游
D．启动子是一段有特殊序列的DNA 片段，是DNA 聚合酶识别和结合的部位
【答案】A
【分析】基因表达载体中应含有启动子和终止子，才能确保目的基因能顺利启动转录和终止转录。PCR 时
一般需要两种引物，才能将目的片段扩增出来，设计的引物中，同一引物自身和两种引物之间都不能有互
补序列。
【详解】A、由于PCR 的原理是DNA 的半保留复制，因此①需要先将RNA 反转录出DNA，再利用PCR
获取和扩增目的基因，A 正确；
B、②利用PCR 在目的基因上添加酶切位点时，需在引物的5'端引入该位点，若酶切序列添加在引物的
3'端，则会导致引物不能继续延伸，B 错误；
C、③是基因表达载体的构建，据图可知，应将目的基因1 连接在启动子1 的下游，保证能将目的基因1 正
常转录，C 错误；
D、启动子是一段有特殊序列的DNA 片段，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，D 错误。
故选A。
2、（2025 届宁夏回族自治区石嘴山市第一中学高三下学期第一次模拟）2024 年“诺贝尔化学奖”授予
三位科学家，以表彰他们在“计算蛋白质设计和结构预测”方面的贡献。他们开发的预测蛋白质结构的AI
工具AlphaFold 可以通过输入的氨基酸序列信息生成蛋白质空间结构模型，到目前为止，AlphaFold 已经预
测了超过2 亿种蛋白质结构——即几乎所有已知的已编码蛋白质，下列相关有关蛋白质工程的说法正确的
是（ ）
A．AI 算法在蛋白质工程领域应用中，难度最大的是设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列
B．蛋白质工程通过改变氨基酸的空间结构而制造出新的蛋白质
C．该技术有助于科学家探索通过功能设计蛋白质结构，再逆向推导氨基酸序列
D．肽链的盘曲折叠方式复杂，与肽键以及肽链在特定区域形成氢键、二硫键等有关
【答案】C
【分析】蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，
对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。
【详解】A、AI 算法在蛋白质工程领域应用中，难度最大的是无法准确推知蛋白质复杂的高级结构，A 错
误；
B、蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改
造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，B 错误；
C、蛋白质工程的过程是从预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的
脱氧核苷酸序列（基因）。该技术可以通过输入的氨基酸序列信息生成蛋白质空间结构模型有助于科学家
探索通过功能设计蛋白质结构，再逆向推导氨基酸序列，C 正确；
D、由于氨基酸之间能够形成氢键、二硫键等，从而使得肽链能盘曲、折叠，形成具有一定空间结构的蛋
白质分子，而肽键连接的是氨基酸，使氨基酸形成肽链，肽链的盘曲折叠方式复杂，与肽键无关，D 错误。
故选C。
3、（2025 届宁夏银川市第一中学高三下学期第一次模拟）下图为构建基因表达载体和检测受体细胞是否
含有目的基因的过程示意图，其中LacZ 基因控制合成的酶可以分解物质X 产生蓝色物质，使平板上形成
的菌落呈蓝色，否则菌落为白色。图中③过程所用培养基含有氨苄青霉素和物质X。下列叙述错误的是（
）
A．①过程需要使用限制性内切核酸酶和DNA 连接酶
B．实验结果中形成的蓝色菌落中的大肠杆菌含有目的基因
C．③过程使用的培养基中含有氨苄青霉素，属于选择培养基
D．可用
处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态
【答案】B
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、①过程为基因表达载体的构建，使用限制性内切核酸酶和DNA 连接酶，A 正确；
B、标记基因因外源基因的插入而不能表达出相关酶，无法分解物质X，不能产生蓝色物质，故实验结果
中形成的白色菌落中的大肠杆菌含有目的基因，B 错误；
C、③过程使用的培养基中含有氨苄青霉素，使得含有氨苄青霉素抗性基因的微生物能存活而其他微生物
不能存活，属于选择培养基，C 正确；
D、可用Ca2+处理大肠杆菌使其处于能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，从而实现目的基因的转化，
D 正确。
故选B。
4、（青海省名校联盟2024-2025 学年高三第一次联考）Sau3AI 和BamHI 的识别序列及切割位点如表所示。
某DNA 分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4 个和2 个大小不同的片段。下列有关叙述正确的
是（ ）
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHI
G↓GATCC
Sau3AI
↓GATC
A．两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同
B．能被Sau3AI 识别的DNA 位点均能被BamHI 识别
C．该DNA 分子上有2 个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点
D．该DNA 分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ共同切割后可形成6 个片段
【答案】C
【分析】限制酶主要从原核生物中分离纯化出来。特异性：能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序
列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。
【详解】A、BamHI 和Sau3AI 两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC，A 错误；
B、分析表格可知，BamHI 的识别序列为GGATCC，Sau3AI 的识别序列为GATC，由此可知，能被BamHⅠ
识别的序列中包含了被Sau3AI 识别的序列，所以能被BamHⅠ识别的序列也一定能被Sau3AI 识别，但能被
Sau3AI 识别的DNA 位点不一定能被BamHI 识别，B 错误；
C、分析题意，某DNA 分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4 个和2 个大小不同的片段，由此
可知，该DNA 分子上有2 个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点，C 正确；
D、该DNA 分子上有4 个Sau3AI 的酶切位点，有2 个BamHI 的酶切位点，但是BamHI 识别序列中包含
Sau3AI 的识别序列，所以同时用两种酶共同处理，不会形成6 个大小不同的DNA 片段，D 错误。
故选C。
5、（陕西省西安中学2024—2025 学年高三下学期一模考试）下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”和
“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象有关
B．鉴定DNA 时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．选用植物细胞提取DNA 时，研磨后用滤纸进行过滤
D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
【答案】A
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是：（1）DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓
度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出，从
而达到分离的目的。 （2）DNA 不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可
以将蛋白质和DNA 进一步分离。
【详解】A、在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象有关。凝胶的浓度越
大，DNA 分子越大，DNA 分子的迁移速率越慢，DNA 构象也影响迁移速率，A 正确；
B、鉴定DNA 时，应先将丝状物溶解在2mol/L 的NaCI 溶液中，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴，B 错误；
C、选用植物细胞提取DNA 时，研磨后用纱布进行过滤，C 错误；
D、DNA 分子带负电荷，在电场的作用下，向着与它所带电荷相反的电极移动，故琼脂糖凝胶加样孔一端
朝向电泳槽的负极，D 错误。
故选A。
6、（2025 届山西省高三下学期考前适应性测试启航（一模））碱基编辑系统是一种新型基因修饰技术，
通过在双链造成单切口后对碱基进行单一碱基的精准替换，提高单碱基编辑的精确性及效率，为家畜育种
的精确基因修饰提供了一种更简单、更有效的方法。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）能将G-C 碱基对替换为A-
T 碱基对，作用模式如图。请回答下列问题：
（1）CBE 的作用原理是 。欲将G-C 碱基对最终替换为A-T 碱基对，丙还需要复制
次。
（2）肌肉生长抑制素（MSTN）可抑制肌细胞的增殖与分化。科研人员利用碱基编辑工具成功改变哈萨克
羊MSTN 基因，使终止密码子提前出现，显著增加了肌肉纤维的直径和数量，获得改良品种。
①用改造后的基因构建表达载体时，还需要在该基因的上游和下游分别添加 和 ，
使用的工具酶有 ；构建的表达载体通过 的方式导入哈萨克羊的 中。
②改造后的MSTW 基因表达的蛋白质肽链比MSTN 要 （填“长”或“短”），失去其应有
的功能。
【答案】（1） 基因突变 2
（2） 启动子 终止子 限制酶和DNA 连接酶 显微注射 受精卵 短
【分析】1、动物细胞培养：在动物细胞的培养液中需加入有机盐、无机盐、维生素、激素、氨基酸、核
苷酸及血清（两盐、两素、两酸、一血清 ），以保证细胞的正常生命活动。
2、胚胎移植：一般将胚胎培养到桑葚胚或囊胚时期即可进行移植，在移植之前可以进行胚胎性别鉴定确
定胚胎性别，也可以进行胚胎分割，增加胚胎数目，但是注意在分割时需要将胚胎的内细胞团均等分割，
保证分割后胚胎发育正常。
【详解】（1）依据题意可知，胞嘧啶碱基编辑器（CBE）将G-C 碱基对替换为A-T 碱基对，说明在基因
结构中发生了碱基对的替换，属于基因突变；CBE 精准替换时，先将G-C 碱基对中的C 置换成U，即丙图
所示，接着进行复制时，碱基U 对应碱基A，再复制一次，碱基A 对应碱基T，最终将G-C 碱基对彻底替
换为A-T 碱基对，所以还需要复制2 次。
（2）①通过CBE 改造的基因即为目的基因，构建基因表达载体时，需要在目的基因的上游添加启动子和
下游添加终止子，需要使用的工具酶有限制酶和DNA 连接酶。基因表达载体导入动物体内常用显微注射
法导入受精卵中。
②利用碱基编辑工具成功改造了哈萨克羊MSTN 基因，结果使该基因转录来的mRNA 在翻译时提前遇到
终止密码子，导致其表达蛋白的肽链变短，蛋白结构发生改变，导致哈萨克羊的肌肉纤维的直径和肌纤维
数量增加，获得改良哈萨克羊新品种。
7、（2025 届山西省临汾市高三适应性训练考试（一））强启动子能驱动基因的持续转录。某科研团队欲
通过转基因技术培育出过量表达W 蛋白的转基因大豆。在过量表达W 基因重组质粒的构建中，含W 基因
的DNA 片段以及Ti 质粒的限制酶酶切位点如下图所示，请回答下列问题。
（1）通过PCR 技术可获取W 基因，进行PCR 时加入TaqDNA 聚合酶的作用是 、实际操作中要加
入的原料为4 种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）而不是脱氧核苷酸，其原因是 。
（2）强启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，能被 识别并结合，驱动基因的持续转录。在过量表
达W 基因载体构建时，应优先选用的限制酶是 和 。
（3）农杆菌侵染大豆细胞时，可将W 基因转移到大豆细胞中的原因是 。将转化的大豆愈伤组织进
行植物组织培养时，培养基中需加入抗生素 ，筛选出成功转化的愈伤组织、诱导其形成胚状体，最
终获得转基因大豆植株。
（4）对转基因大豆植株进行鉴定时发现，有些植株虽有W 基因，但没有W 蛋白。造成该现象的原因可能
有 （写出一点即可）。
【答案】（1） 催化合成DNA 子链 dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料
（2） RNA 聚合酶 HindⅢ ScaⅠ
（3） W 基因插入了Ti 质粒的T-DNA 中，农杆菌侵染大豆细胞后，将Ti 质粒上的T-DNA 转移到被
侵染的大豆细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA 上 氨苄青霉素
（4）强启动子片段在转化过程中丢失（或断裂），使W 基因无法表达（或者W 基因的部分碱基发生了甲
基化修饰，抑制了基因的表达）
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）TaqDNA 聚合酶可以催化合成DNA 子链。dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料，所以
实际操作中要加入的原料为4 种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）而不是脱氧核苷酸。
（2）RNA 聚合酶能识别启动子，启动转录过程。在构建基因表达载体时，要想使W 基因在玉米植株中超
量表达，切割目的基因时需要把强启动子和W 基因连在一起切割下来，因此需要用到HindⅢ切割，另一
种酶可以用PruⅠ或者ScaⅠ，在质粒中，PruⅠ识别序列在HindⅢ识别序列的左侧，终止子在右侧，如果用
PruⅠ切割，目的基因和质粒连接后，目的基因不在启动子和终止子之间，将来无法转录，因此在构建基因
表达载体时，应优先选用的限制酶是HindⅢ和Sca I。
（3）W 基因插入了Ti 质粒的T-DNA 中，农杆菌侵染大豆细胞后，将Ti 质粒上的T-DNA 转移到被侵染的
大豆细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA 上，所以农杆菌侵染大豆细胞时，可将W 基因转移到大豆
细胞中。据图可知，利用Ti 质粒的T-DNA 可将目的基因（W 基因）转移到玉米细胞，T-DNA 中含有标记
基因氨苄青霉素抗性基因，标记基因的作用检测受体细胞中是否含有目的基因，因此培养基中需加入氨苄
青霉素，能在此环境中生存的玉米即为转基因玉米。
（4）若强启动子片段在转化过程中丢失（或断裂），使W 基因无法表达（或者W 基因的部分碱基发生了
甲基化修饰，抑制了基因的表达），则可能会导致转基因大豆植株虽有W 基因，但没有W 蛋白。
8、（2025 届山西省吕梁市孝义市高三第一次模拟考试）苯丙酮尿症是单基因遗传病，科学家将正常基因
D 导入该病患者的细胞，以治疗该病。图甲为A、B、C 三种质粒，图乙为含有目的基因D 的DNA 片段，
图丙为重组载体的示意图。Ap 为氨苄青霉素抗性基因，Tc 为四环素抗性基因，LacZ 为蓝色显色基因，其
表达产物可以将无色化合物Xgal 转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，EcoRⅠ（0．6Kb）、PvuⅠ（0．8Kb）为
限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。回答下列问题：
（1）科学家将正常基因D 导入该病患者的细胞中常用的方法是 。图甲中三种质粒适宜作为载体的
是质粒 （填字母），与另外两种质粒相比，其优点是 。
（2）获取目的基因D 时应选择乙图中 限制酶对其所在的DNA 进行切割。如果仅知道D 基因首尾的
部分核苷酸序列，可根据D 基因已知核苷酸序列合成引物，利用 技术扩增目的基因。
（3）将目的基因D 和甲图中相应质粒连接后，得到图丙中三种重组质粒。为选出正向连接的重组质粒，
使用 限制酶对重组质粒完全酶切后，进行电泳分析，若电泳图谱中出现长度为 Kb 的两条带，
则为正向连接的重组质粒。
（4）利用自身不含LacZ 基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，若要在已转化的含重组质粒、已
转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是 。
【答案】（1） 显微注射法 B 有标记基因，复制原点不会被限制酶切割
（2） PvuI PCR
（3） EcoRI 1．2kb 和5．5kb
（4）在含有氨苄青霉素和X-gal 的培养基上培养，形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞
【分析】分析题图可知，目的基因只能用PvuⅠ进行切割，质粒A 上有复制原点以及EcoRⅠ、PvuⅠ两种限制
酶限制酶切位点，无标记基因，不能进行目的基因的检测；质粒B 含有EcoRⅠ、PvuⅠ两种酶切位点、氨苄
青霉素抗性基因和蓝色显色基因，而且相应的限制酶切割后，可以保留氨苄青霉素抗性基因的完整性；质
粒C 中含有氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因以及EcoRⅠ、PvuⅠ两种限制酶限制酶切位点，但是PvuⅠ
的酶切位点位于复制原点，目的基因插入会导致重组质粒不能进行复制。
【详解】（1）科学家将正常基因D 导入该病患者的细胞中常用的方法是显微注射法，基因工程操作的核
心步骤是基因表达载体的构建。图甲中三种质粒适宜作为运载体的是质粒B，因为质粒B 含有EcoRⅠ、
PvuⅠ两种酶切位点、氨苄青霉素抗性基因和蓝色显色基因，而且相应的限制酶切割后，可以保留氨苄青霉
素抗性基因的完整性。与另外两种质粒相比，其作为载体的优点是有标记基因，复制原点不会被限制酶切
割。
（2）获取目的基因D 时应选择乙图中的PvuI 对其所在的DNA 进行切割，因为目的基因两端存在酶切位
点。如果仅知道D 基因首尾的部分核苷酸序列，根据D 基因已知核苷酸序列合成引物，利用PCR 扩增目
的基因。
（3）由于EcoRI 在目的基因和质粒上都有酶切位点，为选出正向连接的重组质粒，使用EcoRI 对质粒完
全酶切后，进行电泳分析。质粒B 中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0．2Kb，若是正向连
接载体，重组质粒中2 个EcoRⅠ酶切点之间的距离是0．2+1=1．2Kb，重组质粒长度为：2．7+4=6．
7Kb，故EcoRⅠ酶切后，正向连接载体的情况下，电泳图谱中出现长度为1．2kb 和5．5kb 两条带。
（4）要筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是在含有氨苄青霉素和X-gal 的培养基上培养，形成
白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。
9、（2025 届宁夏回族自治区石嘴山市第一中学高三下学期第一次模拟）亚洲玉米螟、黏虫是造成我国玉
米减产的主要害虫。我国科研人员通过图示过程将Bt 基因（能够控制合成Bt 毒蛋白）转入玉米细胞培育
出了抗虫转基因玉米。回答下列问题：
（1）用PCR 扩增下面的Bt 基因的DNA 片段：5'-GACCTGTGGAAGC．．．．．．CATACGGGATTG-3'
3'-CTGGACACCTTCG．．．．．．GTATGCCCTAAC-5'供选择的引物有：①5'-GACCTGTGGAAGC-3' ②
5'-CTGGACACCTTCG-3'
5'-GTTAGGCATAC-3'
5'-CAATCCCGTATG-3'
③
④
共四种，应选择________（填字
母）。
A．①②
B．②③
C．③④
D．①④
（2）据图分析，为确保目的基因能够与Ti 质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti 质粒，科研人员应
选用限制酶 切割Ti 质粒和含Bt 基因的DNA 片段。在获得重组Ti 质粒后，可将其加入经
处理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 成为转基因玉米植株。
（3）为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员首先利用 法检测Bt 基因是否成功翻译：在进行
个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，
多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3：1 和
15：1 两种情况。出现15：1 的原因是 。
（4）某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片
时，棉铃虫并没有被杀死，这说明 ，为此，科学家对棉花植株中的Bt 毒蛋白基因进行了修饰，结
果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt 毒蛋白基因的修饰属于 。
【答案】（1）D
（2） XbaⅠ和HindⅢ Ca2+ 植物组织培养
（3） 抗原-抗体杂交 在两对同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因
（4） Bt 毒蛋白基因没有成功表达 基因重组
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。目的基因的检测与鉴定包括分子水平上的检测与个体水平
上的鉴定两种方式。
【详解】（1）PCR 引物应分别与待扩增片段两端的互补链3′端结合，且引物序列与其结合处应保持“正
向一致”。Bt 基因的DNA 片段的上链（5′→3′）是GACCTGTGGAAGC…CATACGGGATTG，对应的下链
（3′→5′）是CTGGACACCTTCG…GTATGCCCTAAC。前向引物通常与上链5′端相同序列（①），后向引
物则与上链3′端互补且方向为5′→3′（④），应选①和④。
故选D。
（2） 据图分析，在构建目的基因表达载体外，由于BamHⅠ能将目的基因切割，因此不能用BamHⅠ切割，
因此对于目的基因的左侧只能用XbaⅠ切割，而右侧HindⅢ和EcoRⅠ是目的基因和终止子近侧共有的限制
酶，但目的基因的左侧有EcoRⅠ的识别序列，因此目的基因右侧需要用HindⅢ切割，因此，为确保目的基
因能够与Ti 质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti 质粒，科研人员应选用限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割
Ti 质粒和含Bt 基因的DNA 片段；在获得重组Ti 质粒后，可将其加入经Ca2+处理（使其处于易于吸收周
围环境DNA 分子的状态）的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经植物组织培养成为转基因玉米植株，该
操作的原理是植物细胞的全能性。
（3）翻译的产物是蛋白质，由于抗原与抗体的结合具有特异性，故为检测转基因玉米是否培育成功，可
在分子水平条件下，科研人员首先利用抗原—抗体杂交法检测Bt 基因是否成功翻译；在进行个体生物学水
平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的
子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3 1∶和15 1∶两种情况。
其中15 1∶为9 3 3 1
∶∶∶的变式，说明目的基因转入了两条具有非同源染色体的两条染色体上，即在两对同源染
色体的各一条染色体上转入了抗虫基因，进而通过自交产生了性状分离比为15 1∶的后代表现。
（4） 科学家最初做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，
棉铃虫并没有被杀死，这说明Bt 毒蛋白基因没有成功表达；为此，科学家对棉植株中的Bt 毒蛋白基因进
行了修饰，结果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt 毒蛋白基因的修饰是蛋白质
工程的应用，是第二代基因工程，其原理是基因重组。
10、（青海省大通县2024—2025 学年高三第一次检测）光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作
用。为探讨玉米中光敏色素基因A（含大约256 个碱基对）在棉花种质资源中的利用价值，研究人员将A
基因转入到棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒上相关限制酶
的酶切位点如图甲所示，电泳检测结果如图乙所示。回答下列问题：
（1）操作过程中需要用到的工具有 ，构建表达载体时应选用 这两种限制酶处
理质粒。
（2）为保证通过mRNA 逆转录获得的光敏色素基因A 和质粒的充分连接，一般需要在该基因上、下游引
物的 端分别添加酶切位点。一般在这两部位添加不同的酶切位点，主要目的是 。
（3）A 同学认为仅由图乙电泳结果不能确定1、3、4 号转基因棉花均培育成功，理由是 。
（4）在生物学领域，对光敏色素进行分子改造使用的技术是蛋白质工程。获得光敏色素分子的基本途径
为： →设计预期的光敏色素的分子结构→推测应有的 →找到相对应的脱氧核苷
酸序列。
【答案】（1） 限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA 连接酶和载体 BclI 和HindⅢ
（2） 5' 使DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连
（3）由图乙可知1、3、4 号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体
水平上的鉴定
（4） 预期的光敏色素的功能 氨基酸序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取；2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步
骤；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）该操作需借助基因工程才能实现，因此操作过程中需要用到的工具有限制性内切核酸酶、
DNA 连接酶和载体。由图可知：构建基因表达载体时，应选用BclI 和HindⅢ这两种限制酶，若用
BamHI，则目的基因会产生相同的末端而出现自身环化的现象且破坏标记基因。
（2）DNA 合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，酶切位点应设置在扩增序列的外侧，这样酶切时不会
破坏目的基因的序列，因此应添加在引物的5'端，加入不同的限制酶酶切位点，在酶切后会形成不同的末
端，从而保证DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连。
（3）光敏色素基因A 含大约256 个碱基对，由图乙可知1、3、4 号均成功导入光敏色素基因A，但转基因
棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定。
（4）在生物学领域，对光敏色素进行分子改造使用的技术是蛋白质工程。获得光敏色素分子的基本途径
为：预期的光敏色素的功能→设计预期的光敏色素的分子结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱
氧核苷酸序列。
11、（青海省名校联盟2024-2025 学年高三第一次联考）酵母菌中的lacZ 报告基因的转录需要激活因子
GAL4 的参与，GAL4 由两个结构功能相互独立的DNA 结合域（BD）和转录激活域（AD）构成。BD、
AD 只有通过特定途径结合在一起，才能激活转录。为研究某两种蛋白质之间能否特异性地相互作用，科
学家通过基因工程将这两种蛋白分别与酵母菌中的BD、AD 制成融合蛋白，通过lacZ 报告基因的表达情
况来进行分析，这就是酵母双杂交技术。科学家预测A 蛋白可与DSI 基因的表达产物DS1 蛋白相互作用，
并利用酵母菌杂交技术对此进行了探究，原理如图1 所示。回答下列问题：
（1）进行酵母双杂交技术时， （填“需要”或“不需要”）将酵母菌原有的BD-AD 结合途径阻断。
若目标蛋白A 能与DS1 相互作用，则 ，继而启动下游lacZ 报告基因的表达。
（2）结合图2 及表1 信息可知，若将DSI 基因连入载体pGBKT7（含表1 中4 种限制酶的识别位点），可
选择限制酶 对两者进行酶切，以降低酶切产物间的自身环化比例，之后再利用 酶连接DS1 基因
与BD 基因，构建BD-DS1 表达载体。
限制
酶
NdeI
EcoRI
SmaI
SalI
识别
序列
5′-CA↓TATG-3′
3′-GTAT↑AC-5′
5′-G↓AATTC-3′
3′-CTTAA↑G-5′
5′-CCC↓GGG-3′
3′-GGG↑CCC-5′
5′-G↓TCGAC-3′
3′-CAGCT↑G-5′
表1
（3）构建AD-A 表达载体后，将不同载体共导入酵母菌细胞，相关实验处理如表2 所示。若lacZ 报告基
因表达，则相关酵母菌菌落使用X-gal 物质染色后呈蓝色，否则呈白色。结合酵母双杂交技术的原理可知，
表中I、Ⅱ处的载体应为 。实验组结果为蓝色，说明 。
组别
共导入的表达载
体
预测结
果
对照组
1
BD-DS1
AD
白色
对照组
2
I
Ⅱ
白色
实验组
BD-DS1
Ⅱ
蓝色
表2
【答案】（1） 需要 BD 与AD 会结合在一起
（2） EcoRI 和SalI DNA 连接
（3） BD、AD-A A 蛋白是能与DS1 蛋白相互作用的蛋白质
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
2、切割目的基因和载体时采用双酶切可以防止酶切产物的自身环化。
【详解】（1）若目标蛋白A 能与DS1 相互作用，则AD 和BD 会结合，启动lacZ 报告基因的转录。故需
要将酵母菌原有的BD-AD 结合途径阻断，保证AD 和BD 结合是由于目标蛋白A 能与DS1 相互作用。
（2）DS1 基因两端有EcoRI 和SalI 的酶切位点，故需选择限制酶EcoRI 和SalI 对两者进行酶切，再利用
DNA 连接酶连接DS1 基因与BD 基因。
（3）若lacZ 报告基因表达，则相关酵母菌菌落使用X-gal 物质染色后呈蓝色，实验组呈蓝色，故II 是
AD-A。对照组2 是白色，则I 是BD。实验组结果为蓝色，说明LacZ 基因表达了，BD-DS1 与AD-A 结合，
即A 蛋白是能与DS1 蛋白相互作用的蛋白质。
【点睛】本题结合图解，考查基因表达、遗传规律应用及基因工程的相关知识，要求考生重点识记基因工
程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中的相关细节，能结合题中和图中信息准确答题，属于考纲理解和
应用层次的考查。
12、（2025 届陕西省宝鸡市高三一模）单宁酶可以水解单宁酸为没食子酸，降低茶汤中单宁酸含量，解
决茶饮料“冷后浑”问题和果汁类饮料除涩问题。我国科学家在土壤中筛选出能分泌单宁酶的黑曲霉
Lys117，利用基因工程对其进行改造，提取单宁酶基因与强表达组件（强表达启动子和信号肽编码序列）
组装，最终实现单宁酶的高产。回答下列问题：
（1）黑曲霉Lys117 的分离筛选：将土样稀释适量倍数后，采用涂布平板法接种于含有溴酚蓝（溴酚蓝在
单宁酸环境中为蓝紫色，在没食子酸环境中为黄色）的选择培养基上。该选择培养基按物理性质分属于
培养基。根据选择培养基出现 （填现象）作为挑取单宁酶产生菌的标志。
（2）单宁酶基因扩增：利用PCR 技术扩增单宁酶基因时，若P1、P2、P3、P4 表示引物结合部位（如图
所示），应选择的引物对为 （填P1、P2、P3、P4）；35PCR 反应会重复循环多次，每次要经历变
性、复性和 三步。
（3）与强表达组件组装后的基因与Ti 质粒重组：该过程是基因工程的核心步骤，称为 。利用农杆
菌的Ti 质粒作为载体的原因是 ，与目的基因导入植物细胞类似。已知信号肽可将蛋白质引导到一种
具膜的细胞器内继续加工，则该细胞器是 。
（4）重组Ti 质粒导入目的菌并检测：将重组Ti 质粒用特定方法导入黑霉菌Lys117 后，记为Lys117+，可
依据选择培养基中的 ，最终鉴定出高产单宁酶的黑霉菌。
【答案】（1） 固体 黄色圈
（2） P2 与P3 延伸
（3） 基因表达载体的构建 农杆菌的Ti 质粒上的T 一DNA（可转移的DNA）可转移至受体细
胞，井整合到受体细胞染色体的DNA 上 内质网
（4）黄色圈的大小
【分析】基因工程基本操作步骤，需要经历四步：目的基因获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受
体细胞、目的基因检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
【详解】（1）根据题干“将土样稀释适量倍数后，采用涂布平板法接种于含有溴酚蓝（溴酚蓝在单宁酸
环境中为蓝紫色，在没食子酸环境中为黄色）的选择培养基上“可知该培养基按物理性质分属于固体培养
基：由题干单宁酶可水解单宁酸为没食子酸，溴酚蓝在单宁酸环境中为蓝紫色，在没食子酸环境中为黄
色”可知：若培养基上有单宁酶产生菌的存在，因其会分泌单宁酶，可以水解单宁酸为没食子酸，含有溴
酚蓝的培养基上会出现以该菌为中心的黄色圈，黄色圈越大，则该处单宁酶产生菌的量越多。
（2）PCR 技术的原理为DNA 半保留复制，子链延伸方向为5'端一3'端，结合图示，故应选择引物P2 与
P3。PCR 反应会重复循环多次，每次要经历变性、复性、延伸三步。
（3）基因工程基本操作步骤，需要经历四步：目的基因获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体
细胞、目的基因检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤：利用农杆菌的Ti 质粒质粒
作为载体的原理是：农杆菌的Ti 质粒上的T 一DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，井整合到受体
细胞染色体的DNA 上；根据题干“已知信号肽负责把蛋白质引导到不同的具膜细胞器内，可推测信号肽
会引导肽链转移到内质网继续合成与加工，利于单宁酶的正常合成与分泌。
（4）本实验的目的是筛选出高产单宁酶的黑霉菌，Lys117+中单宁酶表达量的高低可以通过黄色圈的大小
来筛选，最终鉴定出高产单宁酶的黑霉菌。
13、（2025 届陕西省渭南市高三一模）酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的
技术平台。土壤中存在产PG 酶（增大蛋白质的溶解性）的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效
生产PG 酶的方案，流程如图1 所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2 所示。回答下列问
题：
（1）过程①应用了PCR 技术，利用PCR 技术扩增时，需要 种引物，引物的作用是 。一
般还需要往PCR 反应缓冲液中加入Mg2+，其原因是 。PCR 反应过程可在PCR 扩增仪中自动完成，
而后常用 来鉴定PCR 的产物。
（2）完成过程②需要先将PG 酶基因与pPIC9K 质粒重组，这个过程称为 。据图分析，该过程中最
好选择限制酶 切割。
（3）结合图中过程③分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是 。过程④中将重组质粒酶切后，
整合在酵母菌染色体上。
（4）研究人员最终选择酵母菌作为重组质粒的受体细胞来生产PG 酶，原因是酵母菌含有 （答出2
种）等细胞器，可将肽链进行加工为分泌蛋白，便于提取。获得的酵母菌将用于发酵工程，发酵工程的中
心环节是 。
【答案】（1） 2 使DNA 聚合酶能从引物的3°端开始连接脱氧核苷酸 DNA 聚合酶需要
Mg2+激活 琼脂糖凝胶电泳
（2） 基因表达载体的构建 BgII 和NotI
（3）利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间内可获取大量的重组质粒
（4） 内质网和高尔基体 发酵罐内发酵
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）利用PCR 技术扩增时，DNA 聚合酶不能从DNA 链的一端直接开始合成子链，需要在反应
体系中添加2 种引物，分别与两条模板链结合，使DNA 聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
DNA 聚合酶需要Mg2+激活，故一般还需要往PCR 反应缓冲液中加入适量的Mg2+。PCR 反应过程可以在
PCR 扩增仪中自动完成，PCR 的产物的分子量大小等不同，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物。
（2）过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在此之前需要先构建基因表达载体，即将PG 酶基因与
pPIC9K 质粒重组。在构建基因表达载体时，需要用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶分别切割质
粒和目的基因，根据图1 和图2 分析，PG 酶基因两端序列分别含有BgII 和NotI 识别位点，故最好选择限
制酶BgII 和Notl 切割能产生和目的基因相同的末端。
（3）大肠杆菌繁殖速度快，将重组质粒导入大肠杆菌内，短时间内可获取大量的重组质粒。
（4）分泌蛋白合成加工过程涉及到的细胞器有核糖体、内质网、高尔基体和线粒体。酵母菌是真核生物，
含有内质网和高尔基体等细胞器，可将肽链进行加工为分泌蛋白，便于提取。获得的酵母菌将用于发酵工
程，发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵。
14、（陕西省西安中学2024—2025 学年高三下学期一模考试）某科研人员将甜蛋白基因导入番茄，可提
高番茄甜味，改善果实品质。如图为甜蛋白基因和Ti 质粒上限制酶切位点示意图。回答下列相关问题：
（1）利用PCR 技术扩增甜蛋白基因时，为了特异性扩增甜蛋白基因序列，需根据 设计引物；
每次循环一般可以分为 、 、 三步。
（2）用限制酶切割含有甜蛋白基因的DNA 片段时，不用限制酶BamHⅠ的原因是 。科研人员
最终选择了限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割质粒和含有甜蛋白基因的DNA 片段，而不是选择限制酶XbaⅠ和
EcoRⅠ的理由是 。
（3）为了让甜蛋白基因进入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA 上，可以将甜蛋白基因插入Ti 质粒
的 中。将基因表达载体导入农杆菌前，需用Ca2+处理农杆菌，其目的是 。为了确
定农杆菌中是否导入基因表达载体，需将农杆菌置于含 的培养基中进行培养，然后用筛选出
来的农杆菌去侵染番茄细胞。
【答案】（1） 甜蛋白基因两端的碱基序列 变性 复性 延伸
（2） 会破坏甜蛋白基因 会导致甜蛋白基因与质粒反向连接，不能表达出甜蛋白
（3） T-DNA 使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态
卡那霉素
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定。
【详解】（1）利用PCR 扩增目的基因时，需要根据目的基因两端的碱基序列设计引物，因此为了特异性
扩增甜蛋白基因序列，需根据甜蛋白基因两端的碱基序列设计引物。
通过PCR 技术可扩增目的基因，PCR 的每次循环一般可以分为变性、复性、延伸三步。
（2）由图可知，限制酶BamH I 切割会破坏甜蛋白基因，不宜使用。在Ti 质粒中，EcoR I 位于Xba I 的左
侧，根据甜蛋白基因转录的方向和Ti 质粒启动子到终止子的方向，应选择限制酶Xba I 和Hind Ⅲ切割质
粒和含有甜蛋白基因的DNA 片段，选择限制酶Xba I 和EcoR I 会导致甜蛋白基因与质粒反向连接，不能
表达出甜蛋白。
（3）Ti 质粒的T-DNA 是可转移的DNA，能够携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体
的DNA 上。将基因表达载体导入农杆菌，需用Ca2+处理，使其成为感受态细胞，提高转化率。分析图形，
质粒中存在卡那霉素抗性基因，因此需在培养基中加入卡那霉素，筛选出成功导入目的基因的农杆菌。
15、（2025 届西北四省（陕西、山西、青海、宁夏）高三下学期一模）抗冻蛋白基因TmAFP 是从黄粉
虫幼虫体内分离得到的基因，其编码的蛋白质具有很强的抗冻活性。科学家成功将TmAFP 基因导入甘薯
中，并使甘薯获得抗冻能力，减少霜冻对甘薯的损害，提高甘薯的产量和质量。如图表示培育抗冻甘薯新
品种的流程以及6 种限制酶的识别序列（箭头表示切割位点）。回答下列问题：
（1）用不同的限制酶切割DNA 形成的片段， （填“不可能”或“有可能”）在DNA 连接酶的作
用下拼接在一起，理由是 （答出2 点）。
（2）分析图示信息，进行①过程前，选择限制酶 切割质粒P1，选择限制酶 切割抗冻蛋白基
因TmAFP，这样可以防止质粒、目的基因自身环化和反向拼接。
（3）图示②～④过程，会发生磷酸二酯键断裂和合成的有 。
（4）在个体水平上鉴定抗冻甘薯植株培育是否成功的方法是 。
【答案】（1） 有可能 不同的限制酶切割 DNA 形成的平末端可以拼接;不同的限制酶切割
DNA 可能形成相同的黏性末端可以拼接
（2） SmaI、XbaI EcoRV、SpeI
（3）③④
（4）将抗冻甘薯植株与普通甘薯植株同时进行低温处理，观察植株的生长情况（2 分）
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）不同的限制酶切割 DNA 形成的平末端或相同的黏性末端，可以拼接，因此用不同的限制
酶切割 DNA 形成的片段，有可能在DNA 连接酶的作用下拼接在一起。
（2）据图分析可知，为使目的基因能表达出蛋白质，目的基因应插入启动子和终止子之间，该位置有三
种酶 SmaI、XbaI 和HindⅢ的识别序列，目的基因的左端要接在靠近启动子的位置，若切制质粒选择
HindⅢ 则不能使目的基因左端接在靠近启动子的位置，而 SmaI 和EcoRV 切割产生平末端，XbaI 和 SpeI
切割产生 相同的黏性末端，因此根据目的基因两端的序列，为了成功得到重组质粒P2，确保TmAFP 基
因插入载体中的方向正确，应选用限制酶 SmaI、XbaI 切割质粒P1，选用限制酶EcoRV、SpeI 切割目的基
因。
（3） 图示②~④）过程中，②过程是根瘤农杆菌从外界环境吸收 DNA，该过程不发生磷酸二酯键的断裂
和合成。 ③过程会发生重组质粒P，与T 质粒重组，该过程会发生磷酸二酯键的断裂和合成；④过程T-
DNA 会整合 到甘薯细胞的染色体 DNA 上，该过程会发生磷酸二酯键的断裂和合成。
（4） 在个体水平上鉴定抗冻甘薯植株培育是否成功的方法是：将抗冻甘薯植株与普通甘薯植株同时进行
低温处理，观察植株的生长情况，即可鉴定抗冻甘薯植株培育 是否成功。
