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专题15 基因工程
1、（2025 届河南省部分学校高三一模联考）SRY 基因是哺乳动物Y 染色体上具有决定雄性性别作用的
基因片段，常用作对移植前的胚胎进行性别鉴定，其过程如下：先从被测胚胎细胞中提取DNA 片段，然
后设计特异性引物并用胚胎细胞中的DNA 为模板进行PCR 扩增，最后用特异性探针(是一段带有检测标记，
能与目的基因互补的核苷酸序列)对扩增产物进行检测，该鉴定方法被称为SRY-PCR 法。下列对该方法的
分析，错误的是( )
A. 设计特异性引物和探针时需要用到SRY 基因的核苷酸序列
B. 扩增SRY 基因时，当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链
C. 当温度下降到72℃左右时，两种特异性引物会与互补的DNA 链结合
D. 用特异性探针对扩增产物进行检测时，若结果呈阳性，则检测个体为雄性
【答案】C
【解析】
【分析】由题干信息分析可知，用SRYA 特异性探针对扩增产物进行检测，若形成杂交带，则说明其含有
SRY 基因（位于Y 染色体上的性别决定基因），则胚胎的性别为雄性，若出现阴性反应，没有出现杂交带，
则胚胎为雌性。
【详解】A、SRY 基因是哺乳动物Y 染色体上具有决定雄性性别作用的基因片段，因此设计特异性引物和
探针时需要用到SRY 基因的核苷酸序列，A 正确；
B、扩增SRY 基因时，当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，B 正确；
C、当温度下降到50℃左右时，两种特异性引物通过碱基互补配对会与两条单链的DNA 链结合，C 错误；
D、用SRY 特异性探针对扩增产物进行检测，若形成杂交带，即呈阳性，则说明其含有SRY 基因，则胚胎
的性别为雄性，D 正确。
故选C。
2、（2025 届河南省新高中创新联盟高三下学期模拟卷一） 下表是几种限制酶的识别序列及切割位点
（Y=C 或T，R=A 或G）。下列相关叙述正确的是（ ）
限制酶
HindⅡ
AluⅠ
BamHⅠ
Sau3AⅠ
识别序列及切割
位点
5'-
GTY↓RAC-3'
5'-
AG↓CT-3'
5'-
G↓GATCC-3'
5'-
↓GATC-3'
A. 限制酶切割一次需切断2 个磷酸二酯键，增加2 个游离的磷酸基团
B. 一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C. AluⅠ切割后的DNA 片段只可用E.coliDNA 连接酶连接
D. BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
【答案】A
【解析】
【分析】限制酶的特点：识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的位点进行切割，切割后可能形成黏性末
端或平末端。
【详解】A、限制酶切割一次需切断2 个磷酸二酯键，形成2 个新的游离的磷酸基团，A 正确；
B、一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列，如HindⅡ，B 错误；
C、用AluⅠ切割得到
是平末端，可用T4DNA 连接酶连接起来，C 错误；
D、BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ不能识别并切割重组片段，而Sau3AⅠ可识别并
切割重组片段，D 错误。
故选A。
3、（2025 届河南省郑州市郑东新区高三一模） 味精为有鲜味的物质，学名谷氨酸钠，是人们日常生活
中常用的调味品。谷氨酸是谷氨酸棒状杆菌有氧发酵的产物，是味精生产过程中不可缺少的关键环节。下
列相关叙述错误的是（ ）
A. 将淀粉和水调成淀粉乳，调节pH，加入淀粉酶搅拌可分解为葡萄糖
B. 发酵液经蒸煮、冷却后接种谷氨酸棒状杆菌进行发酵，需通入无菌空气
C. 通过辐射诱变处理可定向获得谷氨酸高产菌种，提高谷氨酸的产量
D. 将含有谷氨酸脱氢酶基因的重组质粒导入谷氨酸棒状杆菌可用Ca2+处理
【答案】C
【解析】
【分析】环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。如谷氨酸的发酵生产：
在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N－乙酰谷氨酰胺。
【详解】A、淀粉酶在适宜条件下可以将淀粉分解成葡萄糖，A 正确；
B、谷氨酸是谷氨酸棒状杆菌有氧发酵的产物，属于有氧发酵，需要不断通入无菌空气，B 正确；
C、通过辐射诱变处理可诱发谷氨酸棒状杆菌发生变异，但是变异是不定向的，C 错误；
D、通过基因工程将目的基因导入原核细胞可用Ca2+处理，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的
生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中，D 正确。
故选C。
4、（2025 届河南省驻马店市驿城区高三上学期一模） 将人抗体基因插入噬菌体DNA，然后让该噬菌体
感染大肠杆菌，表达的抗体可能和病毒蛋白以融合蛋白的形式，附着在噬菌体表面，也可能通过大肠杆菌
分泌出去。下列叙述错误的是（ ）
A. 可从人的B 细胞中获取总RNA，通过逆转录PCR 技术扩增出抗体基因
B. 为防止抗体被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞
C. 在把抗体基因导入受体细胞过程中，必须用Ca2+处理大肠杆菌
D. 通过该方法生产的抗体具有灵敏度高、特异性强的特点
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤有：
（1）目的基因的获取，方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建，该步骤是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止
子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞，根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定有抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
分析题意可知，该过程中利用噬菌体DNA 为载体，将抗体基因插入其中，然后让噬菌体侵染大肠杆菌，
通过目的基因的表达以获得相应的抗体。
【详解】A、人体中B 细胞的种类繁多，为获得相应的抗体基因，可提取人体B 细胞中的总RNA，通过逆
转录获得目的基因，再通过PCR 技术扩增，最后筛选出目的基因，A 正确；
B、对于大肠杆菌来说，目的基因表达的抗体属于外来蛋白质，会被蛋白酶分解，因此应选择蛋白酶缺陷
型的大肠杆菌做为受体细胞，B 正确；
C、由题意可知，以噬菌体DNA 为载体，插入目的基因形成重组噬菌体，利用噬菌体的特性感染大肠杆菌，
将目的基因运进受体细胞中，不需要用Ca2+处理大肠杆菌，C 错误；
D、利用该方法生产的抗体种类单一、纯度高，因而具有灵敏度高、特异性强的特点，D 正确。
故选C。
5、（河南省名校联盟2025 届高三第六次联考一模）实验小组从苏云金芽孢杆菌中提取Bt 毒蛋白，注射
到小鼠体内使小鼠产生相应的抗体，再从转基因抗虫棉中提取蛋白质电泳分离后和抗体杂交，然后加入带
有特殊标记的抗体以显示出杂交带，具体过程如图所示，下列说法错误的是（ ）
A. 从转基因抗虫棉中分离出的蛋白质相当于抗原
B. 二抗可能是带有放射性同位素标记的一抗的抗体
C. 若未显示出杂交带，则说明目的基因未导入受体细胞
D. 图示操作的目的是检测转基因棉花是否产生Bt 毒蛋白
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A 、从转基因抗虫棉中分离出的蛋白质能与小鼠产生的抗体发生特异性结合，所以该蛋白质相当
于抗原，A 正确。
B 、由图可知，二抗是与一抗结合的，且带有特殊标记，所以二抗可能是带有放射性同位素标记的一抗的
抗体，B 正确。
C 、若未显示出杂交带，有可能是目的基因导入了受体细胞，但目的基因没有表达，而不是目的基因未导
入受体细胞，C 错误。
D 、图示操作是通过抗原 - 抗体杂交技术来检测转基因棉花是否产生了 Bt 毒蛋白，D 正确。
故选C。
6、（2025 届河南省创新发展联盟高三下学期春季模拟检测）.羊乳价格比牛乳价格高。为防范市场上以
牛乳冒充羊乳销售的行为，研究人员以羊乳asl-酪蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确
的是（ ）
A. 利用抗asl-酪蛋白的单克隆抗体可以检测羊乳中是否掺杂了牛乳
B. 经高温破坏抗原结构的灭活病毒可诱导B 细胞与骨髓瘤细胞融合
C. 将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔可大量生产单克隆抗体
D. 杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖需要提供95％空气+5％CO2的混合气体
【答案】C
【解析】
【分析】在单克隆抗体的制备过程中，需要先给小鼠进行免疫，给小鼠注射特定的抗原，然后从小鼠的脾
脏中取出B 淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合；第一次是选择出杂交瘤细胞，第二次是选择能产生所需抗体的
杂交瘤细胞；杂交瘤细胞的特点是既能无限增殖又能产生专一抗体；单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏
度高、能大量制备；动物细胞培养时，首先应保持无菌、无毒的环境中；需要加入血清或血浆等天然成分；
二氧化碳的作用是维持培养液的pH 稳定。
【详解】A、羊乳中含有asl-酪蛋白，因此利用抗asl-酪蛋白的单克隆抗体不能检测羊乳中是否掺杂了牛乳，
A 错误；
B、灭活是指用物理或化学手段 使病毒或细菌失去感染能力，但 并不破坏它们的抗原结构，B 错误；
C、将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔或在体外培养均可大量生产单克隆抗体，C 正确；
D、杂交瘤细胞在体外培养增殖需要提供95％空气+5％CO2的混合气体，D 错误。
故选C。
7、（2025 届河南省多地高三下学期3 月模拟联考） 内皮抑素是一种效果良好的新型抗癌药物，由胶原
XⅧ（广泛存在于肝脏中）降解产生。我国科学家研制出含转入内皮抑素基因的双歧杆菌口服液，口服
后，双歧杆菌在肠道定植、繁殖，其产生的内皮抑素活性片段在双歧杆菌死亡裂解后被吞噬、转运到肿瘤
组织发挥作用。下列叙述正确的是（ ）
A. 若要利用逆转录的方法合成内皮抑素基因，应从肌肉组织细胞中提取mRNA，因为肌肉细胞代谢旺盛
B. 利用PCR 技术扩增内皮抑素基因时，引物的设计不需要依据该基因的脱氧核苷酸序列
C. 使内皮抑素基因能在双歧杆菌中稳定存在并能表达和遗传，最关键的步骤是构建基因表达载体
D. 口服含转入内皮抑素基因的双歧杆菌口服液属于体内基因治疗
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，从而使目的基因在受体细胞中稳定存在、遗传和表达。
【详解】A、因为内皮抑素由胶原XⅧ降解产生，胶原XⅧ广泛存在于肝脏中，所以应从肝脏细胞中提
取mRNA，A 错误；
B、利用PCR 技术扩增内皮抑素基因时，需要根据内皮抑素基因的脱氧核苷酸序列设计并合成引物，引物
与模板链结合后才能进行DNA 的扩增，B 错误；
C、使内皮抑素基因能在双歧杆菌中稳定存在并能表达和遗传，最关键的步骤是构建基因表达载体，C 正
确；
D、基因治疗是对患者的缺陷基因进行取代或修补，口服含该基因的双歧杆菌口服液（基因不能直接被吸
收），不属于体内基因治疗，D 错误。
故选C。
8、（2025 届河南省名校学术联盟高三下学期模拟冲刺）研究表明，组蛋白H3 赖氨酸4 甲基转移酶
（SMYD3）能通过使染色体组蛋白H3K4 发生甲基化来促进细胞增殖，具有促进牛体细胞重编程的作用，
shRNA 能下调其作用。为探讨其在猪体细胞核移植过程中的重编程作用，研究者进行有关实验（见图，
Fbs 是成纤维细胞；GFP 表达的绿色荧光蛋白可发出绿色荧光）。下列叙述正确的是（ ）
A. 利用Ca2+处理Fbs，可增大其吸收质粒的效率
B. 在传代培养猪卵母细胞时，要定期更换培养液
C. SMYD3 使囊胚染色体组蛋白甲基化来影响转录
D. 只能用shRNA 基因替换SMYD3 基因作为实验对照
【答案】C
【解析】
【分析】将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的
胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理是动物细胞的
细胞核具有全能性。
【详解】A、Fbs
动物细胞，使用显微注射法可促进质粒进入细胞，A 错误；
B、传代培养可以增加细胞的数量，但卵母细胞已经在进行减数分裂无法进行传代，只能在培养基中促进
其分裂至减数分裂Ⅱ中期，B 错误；
C、由题意可知SMYD3 能通过使染色体组蛋白H3K4 发生甲基化，来促进细胞增殖，这表明SMYD3 使囊
胚染色体组蛋白甲基化来影响转录，C 正确；
D、图示为实验组的过程，其对照组为向猪Fbs 注入空白质粒或者含shRNA 基因-GFP 基因的质粒，D 错误。
故选C。
9、（2025 届河南省豫西北教研联盟（洛平许济）高三下学期3 月二模）. 科研人员构建了可表达J-V5 融
合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5；该
重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水
平，结果如图乙所示。下列分析错误的是（ ）
A. 作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点
B. 为检测J 基因是否插入到图甲所示的位置，需用引物F1 和R1 进行PCR
C. 若J 基因转录的模板链位于b 链，则引物F2 与图甲中a 链相应部分的序列相同
D. 图乙中，条带1 的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了J-V5 融合蛋白
【答案】B
【解析】
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】A、作为基因表达载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性
基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，
而且要易从供体细胞分离出来，图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位
点、标记基因、复制原点等，A 正确；
B、据图甲可知，引物F1 能与J 基因左端序列配对，引物R2 能与终止子序列配对，因此推测为检测J 基因
是否插入到图甲所示的位置，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1 和R2，B 错误；
C、b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该
是3’-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向
肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F2 是后引物，在右侧，所以其配对的单链是3’-5'的
b 链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同，C 正确；
D、据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是J-V5 融合蛋白。抗
J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的蛋白不是由重组质粒上的
融合的J 基因表达的，D 正确。
故选B。
10、（2025 届河南省安阳市多校联考高三调研考试（一模））基因工程中，可利用报告基因（如增强绿
色荧光蛋白基因，EGFP 基因）与目的基因相连形成融合基因，用于鉴定目的基因是否在受体细胞中表达。
为培育抗冻的转基因番茄品种，研究人员设计了四种引物将多毛番茄的CBF1 基因与EGFP 基因通过融合
PCR 技术进行融合，如下图所示。回答下列问题：
（1）PCR 反应中引物的作用是使________从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。为使CBF1 基因与EGFP 基
因成功连接，应使引物R1 和F2________。
（2）利用重叠PCR 构建融合基因时，第一轮PCR 产生的DNA 链①～⑧中，________（填“能”或“不
能”）选取①和⑧进行组合。继续进行PCR 扩增后，产生的子链⑨～⑫中，子链相互连接后不利用引物即
可进行扩增的组合是________，理由是_________。
（3）引物F1 和R2 含有限制酶NcoI、BstEⅡ识别的序列，在引物中添加这两种限制酶识别序列的目的是
________。
【答案】（1） ①. DNA 聚合酶 ②. 末端的部分序列互补配对
（2） ①. 不能 ②. ⑩⑪ ③. DNA 子链的延伸方向是从5'端至3'端，⑩与⑪组合后互补配对片
段的游离末端均为3'端，可以起到引物的作用
（3）使融合基因两端带有这两种限制酶的识别序列，在构建基因表达载体时，使用这两种限制酶处理融
合基因，可产生不同的黏性末端，防止融合基因自身环化
【解析】
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复
制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR 反应条件需要脱氧核苷酸、
耐高温的DNA 聚合酶、含Mg2+的缓冲液、一对引物等。
【小问1 详解】
DNA 聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA 链；根据题图可知，R1 末端序列对应
DNA 片段和F2 末端序列对应DNA 片段互补，则二者能连接形成局部双链，再以两条链互为模板便可继续
扩增出融合基因，能使CBF1 基因与EGFP 基因成功连接，因此引物R1 和F2 末端序列应互补。
【小问2 详解】
根据题图信息可知，需要通过PCR 过程使图中CBF1 左端添加NcoⅠ酶识别序列，EGFP 右端添加BstEⅡ酶
的识别序列，图中①和⑧进行组合，融合基因左端和右端没有成功添加相关限制酶的识别序列，因此不能；
图中⑨链式引物R1 序列所在单链，从右至左为5'→3',则⑩链从左至右方向为5'→3'，同理，⑪链从右至左
方向为5'→3'，⑫链从左至右方向为5'→3'端，因此子链延伸方向是5'端到3'端，⑩和⑪链相互连接后，可
以以这两条长链互为模板，沿着⑩链的3'端从左至右延伸，同时沿着⑪的3'端从右至左延伸，两条链即可
起到引物的作用，也可作为子链延伸的模板。
【小问3 详解】
在引物F1 中添加NcoⅠ的识别序列可使CBF1 基因左端添加NcoⅠ识别序列，引物R2 添加BstEⅡ识别序列，
可使EGFP 基因右端添加BstEⅡ识别序列，进而扩增形成的融合基因两端有不同的限制酶识别序列，在以
融合基因为目的基因构建基因表达载体时，使用这两种限制酶处理融合基因，可产生不同的黏性末端，防
止融合基因自身环化。
11、（2025 届河南省安阳市高三一模） 外泌体是一种大小为30~100mm 的细胞外膜囊泡，尤其在癌症的
诊断及治疗等领域发挥重要作用。研究人员构建了含有近红外荧光蛋白iRFP682 基因和外泌体标记蛋白
CD63 基因的表达载体。载体构建过程中用到的限制酶的切割位点及部分过程如下图所示（AmpR表示氨苄
青霉素抗性基因）。请回答下列问题：
（1）为将CD63-iRFP682 基因与质粒进行准确和高效地连接，对CD63-iRFP682 基因、质粒分别用
________、________酶进行切割。基因表达载体中启动子的功能是________。
（2）PCR 扩增CD63-iRFP682 基因的过程中，设计的引物序列为________、________。若将该基因片段扩
增6 次，则消耗_______个引物分子。
（3）将构建好的基因表达载体通过适当的方式导入癌细胞。癌细胞培养过程中的pH 为______。检测该基
因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是_______。
（4）将目的基因导入大肠杆菌，提取其体内蛋白质注入兔子体内，进一步提取兔子体内的抗体，再与提
取的转基因癌细胞外泌体中的蛋白质进行杂交，然后进行电泳。若CD63-iRFP682 基因在癌细胞内表达，
电泳结果会出现特异性条带，此过程依据的原理是_______。
【答案】（1） ①. BamH I 和EcoR I ②. Bgl Ⅲ和EcoR I ③. 能与RNA 聚合酶结合，驱动转录
（2） ①. 5，-TCCTCCGGATCC-3， ②. 5，-AGATCTGAATTC-3， ③. 126
（3） ①. 7.2-7.4 ②. 在近红外灯下观家细胞是否出现红色荧光
（4）抗原-抗体杂交
【解析】
【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；启动子：启动转录，终止子：终止转录。
【小问1 详解】
NotI 位于目的基因内部，用Not I 会破坏目的基因，不能选，为了避免目的基因及质粒自连，选用不同的
黏性末端的酶来切目的基因和质粒，故切割质粒的酶只能选为Bgl Ⅲ和EcoR I。由于BamH I 和Bgl Ⅲ产
生的的黏性末端相同，不能选Bgl Ⅲ，因此选用BamH I 和EcoR I 来切割目的基因。启动子具有调控基因
转录的功能，能与RNA 聚合酶结合，驱动转录。
【小问2 详解】
引物是人们根据已知的DNA 序列人工合成的两段核苷酸序列，一个引物与目的基因3，一端的一条DNA
模板链互补，另一个引物与目的基因另一3，端的另一条DNA 模板链互补，即引物为5，-
TCCTCCGGATCC-3，、5，-AGATCTGAATTC-3，；采用PCR 技术扩增CBHⅡ基因时需要根据CBHⅡ基因
两端的碱基（核苷酸）序列设计2 种引物，假设DNA 复制6 轮，子代DNA 共有2n+1条链，因亲代DNA 的
两条母链不需要引物，故需要引物2n+1-2=27-2=126 个。
【小问3 详解】
动物细胞培养的pH 为7.2-7.4，因此癌细胞培养过程中的pH 为7.2-7.4；含有近红外荧光蛋白iRFP682 基因
能表达出红外荧光蛋白，因此检测该基因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是在近红外灯下观家
细胞是否出现红色荧光。
【小问4 详解】
若CD63-iRFP682 基因在癌细胞内表达，会形成相应的蛋白质，该蛋白质作为抗原注入兔子体内，会使兔
子分泌相应的抗体，而该抗体会与该蛋白质发生抗原-抗体结合反应，形成特异性条带。
12、（2025 届河南省部分学校高三一模联考） 酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工
及生物燃料生产等。FLO 基因表达的FLO 蛋白可提高发酵中乙醇的产量，且FLO 蛋白量与乙醇产量呈正
相关。实验人员将FLO 基因与超表达启动子(能够显著提高基因的转录效率)连接以构建超表达载体(如图1
所示)，然后转入酿酒酵母细胞，以期获得高产乙醇的酿酒酵母品系。回答下列问题：
（1）采用酒精可将酿酒酵母细胞中的DNA 粗提取出来，其原理是___________，再通过PCR 扩增可获得
FLO 基因。
（2）图1 所示FLO 超表达载体中绿色荧光蛋白基因的作用是___________。
（3）实验人员根据超表达载体序列设计了图1 所示的引物1 和引物2.若所选用的引物越短，则会导致其特
异性___________(填“越低”或“越高”)。用引物1 和引物2 对非转基因酿酒酵母A 和转FLO 基因酿酒酵
母候选品系B 进行PCR 检测，扩增产物的电泳结果如图2 所示，M 为标准参照物。其中，样品1 为本实验
的对照组，其作用是___________，样品2 有特异性扩增产物，表明___________。
（4）提取转基因酿酒酵母候选品系B 的FLO 基因转录所得的mRNA，以该mRNA 逆转录的DNA 为模板，
加入引物1 和引物2 进行扩增，___________(填“能”或“不能”)得到图2 中样品2 所示条带，理由是
___________。
【答案】（1）DNA 不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质等可溶于酒精
（2）作为标记基因，便于筛选含有目的基因（FLO 基因）的受体细胞
（3） ①. 越低 ②. 用于对比确定转基因酿酒酵母候选品系B 中是否成功转入FLO 基因 ③. 酿
酒酵母候选品系B 成功转入了FLO 基因
（4） ①. 不能 ②. 以mRNA 逆转录得到的DNA 不含基因两端的调控序列，因此该DNA 不含与
引物1 和2 结合的碱基序列
【解析】
【分析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术。DNA 复制的前
提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。
【小问1 详解】
DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质等物质溶于酒精，利用这一原理，可以将酿酒酵母细胞中的DNA 粗提取
出来。
【小问2 详解】
绿色荧光蛋白基因表达形成的蛋白质在一定条件下能出现绿色荧光，将绿色荧光蛋白基因与FLO 基因连接
在一起，通过检测受体细胞在一定条件下是否能发出绿色荧光，从而检测受体细胞是否导入FLO 超表达载
体，因此FLO 超表达载体中绿色荧光蛋白基因的作用是作为标记基因，便于筛选导入目的基因（FLO 基
因）的受体细胞。
【小问3 详解】
由于其他DNA 序列也可能含有与所用较短的引物能互补配对的碱基序列，因此所用的引物越短，引物特
异性越低。
本实验的对照组中以非转基因的酿酒酵母A 细胞基因组DNA 作为PCR 模板，而在实验组中以转FLO 基因
酿酒酵母细胞基因组DNA 作为模板，样品1 为本实验的对照组，其作用是用于对比确定转基因酿酒酵母
候选品系B 中是否成功转入FLO 基因。通过与样品1 对比可知，样品2 有特异性扩增产物，说明两引物间
FLO 基因已整合到酵母细胞的基因组中。
【小问4 详解】
若以该mRNA 为模板逆转录形成DNA，则形成的DNA 只包含基因的编码区，而图2 中样品2 所示条带是
在引物1 和2 的作用下形成的DNA 片段，包含FLO 基因及两侧的调控序列，由于以该mRNA 逆转录的
DNA 为模板，引物1 和2 不能与之结合，因此电泳后不能得到图2 中样品2 所示条带。
13、（2025 届河南省洛阳市三校联考一模）随着世界人口的不断增长，粮食紧缺问题也日益严重起来，
为了缓解眼前的危机，转基因技术开始应用于粮食生产的领域。随着转基因植物商业化推广，转基因植物
的生物安全问题一直是人们争议的焦点，其中筛选标记基因是安全风险来源之一，因此作物转基因后删除
选择标记基因具有重要的意义。有报道发现，雌激素诱导的CRE/loxP 重组系统可以利用在加有雌激素的
条件下CRE 酶定位定向地删除转基因作物中位于2 个loxP 位点中的基因，使得2 个loxP 位点重组为1 个
loxP 位点。如下图：
回答下列问题：
（1）对转基因农作物进行安全评估不需要的是（ ）
A. 标记基因的安全性问题
B. 所用的启动子、终止子的安全性问题
C. 获得转基因作物的维生素含量
D. 对转基因农作物种植区域的选择
（2）某科研小组利用CRE/loxP 重组系统获得无筛选标记基因的转耐低磷G 基因的大豆，整个实验大体流
程如下图：
①根据GenBank 数据库上发表的某大豆G 基因的cDNA 编码区序列设计上、下游特异性引物，在设计引物
时，应在引物的______端添加特定限制酶的识别序列，其目的是_______。然后提取大豆子叶______为
PCR 模板。
②将氯化钙溶液___________后处理农杆菌，然后将含标记基因的重组Ti 质粒导入农杆菌。为了提高该转
化效率，需要考虑的因素有____________（答出2 点）。
③将无菌大豆子叶进行___________处理后与导入重组Ti 质粒的农杆菌进行共培养，培养适宜时间后，需
要将大豆子叶转移至添加有___________的培养基中进行筛选，获得成功转化的大豆子叶。将此大豆子叶
在相关培养基上进行___________得到大豆苗，并进一步培养获得种子。
④流程最后一步X 是指___________。具体操作是：将消毒的大豆种子接种在含有___________的MS 培养
基中培养一段时间，形成的大豆苗移栽至营养土中，提取大豆苗的___________进行PCR 检测。若仍能扩
增出完整的G 基因___________（“能/不能”）说明标记基因被成功切除，理由是：____________。
【答案】（1）C （2） ①. 5’ ②. 便于目的基因与运载体结合 ③. G 基因 ④. 浸泡
⑤. 氯化钙溶液的浓度、温度 ⑥. 消毒 ⑦. 新霉素 ⑧. 植物组织培养 ⑨. 删除选择标记基
因 ⑩. 雌激素 ⑪. 基因 ⑫. 不能 ⑬. 标记基因是否被切除都G 基因均可表达
【解析】
【分析】基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中
特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA 连接酶，连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键；③
运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有λ 噬菌体衍生物、动植物病毒。
【小问1 详解】
A、转基因植物的生物安全问题一直是人们争议的焦点，其中筛选标记基因是安全风险来源之一，因此作
物转基因后删除选择标记基因具有重要的意义，因此标记基因的安全性问题需要评估，A 不符合题意；
B、所用的启动子、终止子的安全性问题需要评估，B 不符合题意；
C、获得转基因作物的维生素含量不需要安全性评估，C 符合题意；
D、对转基因农作物种植区域的选择要评估，D 不符合题意。
故选C。
【小问2 详解】
①为了不影响子链的正常延伸，在设计引物时，应在引物5'端添加特定限制酶的识别序列，其目的是便于
目的基因与运载体结合，使目的基因能正确扩增；然后提取大豆子叶G 基因为PCR 模板。
②将目的基因导入细菌的方法是钙离子处理法，可将氯化钙溶液浸泡处理，将含标记基因的重组Ti 质粒导
入农杆菌。为了提高该转化效率，需要考虑的因素有氯化钙溶液的浓度、温度等。
③将无菌大豆子叶进行消毒处理后与导入重组Ti 质粒的农杆菌进行共培养，培养适宜时间后，需要将大豆
子叶转移至添加有新霉素的培养基中进行筛选，获得成功转化的大豆子叶。将此大豆子叶在相关培养基上
进行植物组织培养得到大豆苗，并进一步培养获得种子。
④流程最后一步X 是指删除选择标记基因，具体操作是：将消毒的大豆种子接种在含有雌激素的MS 培养
基中培养一段时间，形成的大豆苗移栽至营养土中，提取大豆苗的基因进行PCR 检测。由于标记基因是否
被切除都G 基因均可表达，因此能扩增出完整的G 基因不能说明标记基因被成功切除。
14、（2025 届河南省洛阳市三校联考一模）葡萄是两性花植株。无核葡萄品质优良，但抗寒性差，中国
野生山葡萄具有较强抗寒性。回答下列问题：
Ⅰ．利用中国野生山葡萄培育抗寒无核葡萄品种
（1）人工杂交。研究者对无核种子败育型（经过授粉受精，胚和胚乳一段时间后停止发育）葡萄植株进
行___、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的___，完成杂交。
（2）胚离体培养。杂交后7-10 天，剪取子房经75%乙醇或___消毒后，用___多次冲洗，用解剖针将其剥
开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。
Ⅱ．利用基因工程技术对抗寒相关D 基因的功能展开相关研究
（3）科研人员利用pG 载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4 基因的酵母AH109 菌株中，如下图
所示。GAL4 基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109 菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只
有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。
①为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的___组，此外还需额外添加___，通过显色反
应做进一步验证。
A 组：加色氨酸和组氨酸
B 组：不加色氨酸和组氨酸
C 组：加组氨酸，不加色氨酸
D 组：加色氨酸，不加组氨酸
②实验结果表明抗寒相关D 基因编码的蛋白质具有转录激活功能，完善实验分组及预期实验结果。
对照组1：酵母菌导入pG-GAL4 重组载体，实验结果：有菌落，变蓝。
对照组2：酵母菌导入___，实验结果：___。
实验组：酵母菌导入___，实验结果：___。
（4）将抗寒相关D 基因导入无核葡萄植株中，研究者常构建含D 基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，
用含___的培养基筛选愈伤组织，用PCR 方法筛选出___植株，72 小时___诱导培养，检测植株中D 蛋白的
含量以判断抗寒能力。
【答案】（1） ①. 去雄 ②. 成熟花粉
（2） ①. 次氯酸钠或氧化汞 ②. 无菌水
（3） ①. B ②. X-a-gal ③. pG 载体 ④. 无菌落，不变蓝 ⑤. pG-D 重组载体 ⑥.
有菌落，变蓝
（4） ①. 除草剂 ②. 含D 基因阳性 ③. 低温
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建： 是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞： 根据受体细胞不同，导入的方法也不—样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【小问1 详解】
葡萄植株在开花前进行去雄、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的成熟花粉，完成杂交。
【小问2 详解】
胚离体培养。杂交后7-10 天，剪取子房经75%乙醇或次氯酸钠或氧化汞消毒后，用无菌水多次冲洗，用解
剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。
【小问3 详解】
①依据题干信息，AH109 菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，为了能够筛选得到重组酵母，重组的载体中
含有编码色氨酸合成酶的基因和具有转录激活功能的Va 基因，AH109 菌株的基因中含有HIS3 基因可以编
码组氨酸合成酶，所以若重组成功，就可以合成色氨酸和组氨酸，所以培养基配方中无需添加色氨酸和组
氨酸，即B 组；若用显色反应进行验证，依据题干信息，MEL1 基因可以编码α-半乳糖苷酶，可分解X-α-
gal 产生蓝色物质，所以培养基中需额外添加X-α-gal。②依据图示信息，实验分为三组：对照组1 是导入
pG-GAL4 重组载体，对照组2 是只导入PG 载体，实验组是导入pG-Va 重组载体，对照组1 导入pG-GAL4
重组载体，含有MEL1 基因、HIS3 基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落；对照组2
只导入PG 载体，无菌落接种，且不含有MEL1 基因，所以不会出现蓝色物质，也无菌落生长；实验组导
入pG-Va 重组载体，也含有MEL1 基因、HIS3 基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落。
【小问4 详解】
构建了含D 基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，用农杆菌转化法进行转染。后续的实验操作（即目的基
因的检测与鉴定）为：用含除草剂的培养基筛选愈伤组织，用PCR 方法筛选出含D 基因阳性植株，72 小
时低温诱导培养，检测植株中D 蛋白的含量以判断抗寒能力。
15、（2025 届河南省洛阳市三校联考一模）回答下列（一）、（二）小题：
（一）葡萄柚汁多且营养丰富，在减肥、美容养颜、降低胆固醇、增强发质等方面都有功效，其鲜果和加
工品都深受消费者喜爱。
（1）柚子皮富含果胶，欲从柚子皮上分离纯化高产果胶酶的菌种，可在超净台上用接种环刮取柚子皮
（腐烂并长有霉菌）表面的菌体，用_________法将菌体接种到_________培养基上筛选纯化。
（2）以葡萄柚为原料采用混合菌发酵技术制作柚子醋的过程：葡萄柚去皮→榨汁→接种→果酒发酵→果
醋发酵→柚子醋。发酵过程中接种的是_________菌，需提供的氧气条件是_________，影响其产物风味的
因素除温度等环境因素外还有_________（至少写两点）。
（3）利用固定化细胞技术发酵效率更高，因为与固定化酶技术相比，该技术对酶活性的影响更小，原因
是_________。
（4）发酵结束后，发酵液常需进行_________处理，若滤液浑浊，可采取静置沉淀、加热或_________等
物理方法获得澄清果醋。
（二）新冠疫情威胁着人类的生命健康，疫苗的研制及病毒的检测在疫情防控中起着重要作用。新冠病毒
表面的S 蛋白是主要的病毒抗原。我国研发的腺病毒载体疫苗已获批上市。
（5）HEK 细胞是一种特殊的人胚胎肾源细胞，在该细胞中，质粒I 和质粒Ⅱ可进行同源重组，形成含S
蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒。对获得的重组腺病毒除用PCR 检测S 蛋白基因外，还需用_________方
法检测S 蛋白。
（6）使用非洲绿猴肾（Vero）细胞进行病毒培养扩增，然后将病毒灭活，再经过一系列处理得到灭活疫
苗。
经灭活的病毒保留了抗原成分，能诱导机体产生免疫应答。
①非洲绿猴肾（Vero）细胞培养通常需在合成培养基中加入_________。
②把新冠病毒毒株接种于Vero 细胞培养液，在适宜条件下培养，细胞出现病变时收获_________（填“细
胞培养液”或“Vero 细胞”），纯化后灭活。
（7）若机体接种腺病毒载体疫苗前感染过腺病毒，可能会减弱疫苗的免疫效果，其原因是_________。
（8）为能更早地在人群中发现病例，除核酸检测外，利用抗原检测试剂盒可居家自行检测。抗原检测试
剂盒的制备：取新冠病毒免疫过的动物B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经_________、克隆等途径获得单
克隆抗体，该单抗作为_________用于病毒抗原检测试剂盒。抗原检测虽然快速，但是检出率不及核酸检
测，原因是核酸检测有一个_________的过程，因此哪怕只有少量的病毒核酸也能被发现。
【答案】（1） ①. 划线分离 ②. 以果胶为唯一碳源的固体
（2） ①. 酵母菌和醋杆菌 ②. 先通氧一段时间，再保持无氧条件，最后再持续通氧 ③. 菌种，
发酵时间，柚子的品种及成熟度等
（3）固定化细胞由于保证了细胞的完整性，酶的环境改变小
（4） ①. 过滤 ②. 离心
（5）抗原-抗体杂交 （6） ①. 动物血清 ②. 细胞培养液
（7）感染过腺病毒的机体内存在相应的抗体和记忆细胞
（8） ①. 筛选 ②. 探针 ③. 扩增
【解析】
【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA 重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微
生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导入
活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：
①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其
中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【小问1 详解】
划线分离是分离纯化菌种的常用方法，通常用接种环将菌种在培养基上进行划线而分离；要分离纯化高产
果胶酶，需要以果胶为唯一碳源的固体培养基。
【小问2 详解】
葡萄柚去皮→榨汁→接种→果酒发酵→果醋发酵→柚子醋，该过程中存在酵母菌进行的果酒发酵和醋杆菌
进行的果醋发酵，因此发酵过程中接种的是酵母菌和醋杆菌；酵母菌是兼性厌氧菌，醋杆菌是好氧菌，先
进行果酒发酵，再进行果醋发酵，因此先通氧一段时间，再保持无氧条件，最后再持续通氧；菌种、发酵
时间、柚子的品种及成熟度、温度、pH 等都会影响柚子醋的风味。
【小问3 详解】
固定化细胞由于保证了细胞的完整性，酶的环境改变小，因此与固定化酶技术相比，固定化细胞技术对酶
活性的影响更小。
【小问4 详解】
发酵结束后，常需要过滤除去发酵渣；离心分离生物分子是最常用的生化分离方法，使比重不同的物质进
行分离，若滤液浑浊，可采取静置沉淀、加热或离心等物理方法获得澄清果醋。
【小问5 详解】
抗原-抗体杂交可以检测目的基因是否表达，若表达了目的蛋白，则加入与目的蛋白结合的物质，会形成抗
原-抗体杂交带。
【小问6 详解】
培养动物细胞时，为了尽可能模拟体内环境，常需要在培养基中加入动物血清；病毒没有独立的新陈代谢
能力，需要依赖于细胞，且当病毒增殖到一定数量时使细胞裂解，细胞出现病变时收获细胞培养液（存在
病毒），纯化后灭活，可得到灭活疫苗。
【小问7 详解】
腺病毒是疫苗基因的载体，感染过腺病毒的机体内存在相应的抗体和记忆细胞，若机体接种腺病毒载体疫
苗前感染过腺病毒，可能会减弱疫苗的免疫效果。
【小问8 详解】
取新冠病毒免疫过的动物B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，可能得到B 细胞+B 细胞融合体、骨髓瘤+骨髓瘤
细胞融合体、B 细胞+骨髓瘤细胞融合体，因此要经过筛选才能得到杂交瘤细胞（B 细胞+骨髓瘤细胞融合
体）；单克隆抗体可作为病毒抗原的探针，与抗原结合，呈现特定的现象，用于检测抗原或病毒的有无；
抗原检测虽然快速，但是准确度没有核酸检测高，若病毒含量（抗原含量）少时容易出现误判，核酸检测
耗时较长，也更复杂，但是准确度高，核酸检测时会进行PCR 扩增，哪怕只有少量的病毒核酸也能被发现。
【点睛】本题主要考查发酵及疫苗制备，要求学生有一定
理解分析能力。
16、（2025 届河南省新高中创新联盟高三下学期模拟卷一）啤酒酿造中葡聚糖等物质会增加啤酒的粘度，
极易堵塞过滤装置，影响生产。某实验室采用转基因技术构建表达葡聚糖酶基因（GluZ）的工程酵母菌，
赋予了该酵母菌降解啤酒中葡聚糖的能力。图1 为实验中使用的质粒YE 的结构示意图，其中PGK 是酵母
菌的特异性启动子，ADH 为终止子，KnaMX 是遗传霉素抗性基因。MFα 是酵母菌特有的信号肽基因（信
号肽在分泌型蛋白的表达中具有重要作用），GluZ 需与MFα 连接形成融合基因，进而表达出分泌型蛋白。
融合基因的结构及相应限制酶的识别序列如图2 所示。回答下列问题：
（1）质粒YE 上PGK 的作用是_______。图1 中质粒YE 结构示意图未标出的必要元件是_______。
（2）为使MFα 与GluZ 连接形成融合基因，引物R1与引物F2的5´端都引入了NotI 的酶切序列。利用PCR
检测融合基因是否形成，可选用图2 中引物_______对连接产物进行扩增。
（3）对融合基因和质粒YE 分别酶切并连接后得到重组质粒，将重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，检
测发现融合基因（图3）转录、翻译出的蛋白质中只有信号肽的氨基酸序列（转录、翻译过程正确），请
结合图3，分析原因可能是：_______（已知终止密码子是UGA、UAG、UAA）。
（4）科研人员对（3）中的问题进行修正后，重新构建了重组质粒，将重组质粒导入酵母菌细胞中进行表
达，检测发现融合基因转录、翻译出的融合蛋白质中信号肽的氨基酸序列正确，而GluZ 对应的氨基酸序
列却与葡聚糖酶不同。请继续结合图3 分析原因可能是：_______，具体修改方案是在扩增GluZ 使用的引
物F2的3´端_______（填“增加”或“减少”）1 个碱基。
【答案】（1） ①. RNA 聚合酶识别和结合的位点，启动基因编码区的转录 ②. 复制原点
（2）F1、引物R2 （3）MFα 基因编码链中存在TAG，转录后会形成终止密码子UAG，使翻译到此结
束
（4） ①. GluZ 基因编码链的第一个碱基与NotI 识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致
mRNA 的密码子被错位读取 ②. 增加
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
质粒YE 上PGK 是启动子，其作用是RNA 聚合酶识别和结合的位点，启动基因编码区的转录。图1 中质
粒YE 图谱未标出的必要元件是复制原点。
【小问2 详解】
引物应连接在模板连的3´端，耐高温的DNA 聚合酶只能从引物的5'→3'方向延伸DNA 链。利用PCR 检
测融合基因是否形成，可选用图2 中引物
引物
对连接产物进行扩增。
【小问3 详解】
对融合基因和质粒YE 分别酶切并连接后得到重组质粒，将重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，检测发
现融合基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的蛋白质中却只有信号肽的氨基酸序列，分析图3 融合基因
编码链的序列，发现在MFα 编码序列对应的最后三个碱基是UAG，属于终止密码子，翻译至此时翻译终
止，故翻译产物中只有信号肽的氨基酸序列。
【小问4 详解】
科研人员对（3）中的问题进行修正后，即删除MFα 编码序列的最后三个碱基，然后重新构建了重组质粒，
将重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，检测发现融合基因转录、翻译出的融合蛋白质中信号肽的氨基酸
序列正确，而GluZ 对应的氨基酸序列却与葡聚糖酶不同。分析图3 可知GluZ 基因编码链的第一个碱基与
NotⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA 的密码子被错位读取，具体修改方案是在扩增
GluZ 使用的引物
的
端增加1 个碱基。
17、（2025 届河南省新乡市高三一模）聚合酶链式反应（PCR），可用于目的基因的获取和扩增及目的
基因的检测等步骤中，另外利用PCR 技术还可以在目的基因两端添加某序列，相关过程如图所示。回答下
列问题：
（1）PCR 的每次循环一般分为三步，其中______所需的温度最高；PCR 能获取特定目的基因的关键是
______。
（2）β 链的______端为5'端，依据是引物与其模板链的方向______（填“相同”或“相反”），而DNA
聚合酶从引物的3'端开始沿______的方向延伸子链。
（3）为便于PCR 扩增的目的基因与表达载体连接，需要通过引物设计添加限制酶B 的酶切位点（如图中
过程①和②）；连接引物Ⅰ与序列X 需要用到______酶，至少需要经历______次循环才能得到含限制酶B
的酶切位点的双链产物。
（4）用于鉴定目的基因的PCR，______（填“能”或“不能”）利用图中引物Ⅰ和引物Ⅲ达到目的。
【答案】（1） ①. 变性 ②. 引物与目的基因特异性结合
（2） ①. 左 ②. 相反 ③. 5'→3'
（3） ①. T4DNA 连接酶 ②. 2
（4）不能
【解析】
【分析】PCR 扩增：目的基因DNA 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链
DNA 为模板，在DNA 聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次。
【小问1 详解】
PCR 扩增的每一次循环分为三个步骤，分别是变性、退火、延伸，变性的温度一般是90~95℃，退火的温
度一般是50~60℃，延伸的温度约72℃，因此变性所需的温度最高。PCR 扩增DNA 聚合酶发挥作用时需
要引物与两条DNA 模板链复制起始段互补配对成小段双链，因此PCR 能获取特定目的基因的关键是引物
与目的基因特异性结合。
【小问2 详解】
在DNA 合成过程中，DNA 聚合酶只能从引物的3'开始延伸子链，引物和模板链是反向互补的，结合图示
可知，子链的延伸方向是从右往左，说明β 链的左端为5'端。DNA 复制的方向是从子链的5'→3'，因此
DNA 聚合酶从引物的3'端开始沿5'→3'的方向延伸子链。
【小问3 详解】
引物和序列X 均为单链DNA，两个DNA 片段之间通过磷酸二酯键相连，需要用T4DNA 连接酶。第一次
循环时，引物和序列X 结合延伸形成单链，第二次循环时，以第一次形成的单链为模板，引物再次结合延
伸形成双链，所以至少需要经过2 次循环才能得到含限制酶B 的酶切位点的双链产物。
【小问4 详解】
引物Ⅰ结合的位点位于目的基因的外部，使用该种引物进行扩增，扩增的不一定是目的基因；引物Ⅲ结合
的位点位于目的基因的内部，使用该种引物扩增，扩增的仅是基因的部分片段，而不是完整的目的基因，
因此无法利用引物Ⅰ和引物Ⅲ进行PCR 扩增鉴定目的基因。
18、（2025 届河南省郑州市郑东新区高三一模） 几丁质酶可以催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的
水解，从而抑制真菌的生长繁殖，提高植物的抗真菌能力。通过基因工程将几丁质酶基因转入杨树体内，
可增强其抵抗真菌的能力。回答下列问题：
（1）为了便于目的基因与Ti 质粒的连接，在利用PCR 技术扩增目的基因时，需要在引物的____端（填
“5”或“3”）增加特定的限制酶切割位点。在两种引物上增加不同限制酶识别序列的主要目的是____（答
出两点即可）。
（2）受体农杆菌细胞在导入重组Ti 质粒前，需要先用Ca2+处理，其目的是____。形成的重组Ti 质粒需要
先导入农杆菌细胞，再侵染杨树的愈伤组织，理由是____。
（3）外植体（幼嫩的茎段）经过_____形成愈伤组织。在愈伤组织形成的过程中，导致外植体被污染的原
因可能是____（答出一点即可）。
（4）目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，首先需要通过分子水平的检测，其次，
还需要进行____水平的鉴定。
【答案】（1） ①. 5'
②. 避免目的基因自身的环化、目的基因与质粒的反向连接、目的基因片
段的任意连接
（2） ①. 使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 ②. 农杆菌在自然条件
下通过转化作用可将其所含Ti 质粒上的T-DNA 转移、整合到宿主细胞染色体DNA 上
（3） ①. 脱分化 ②. 培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操
作要求 （4）个体生物学
【解析】
【分析】1、几丁质是真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶水解几丁质后导致真菌结构被破坏从而无法正常
生命活动减少对植物的侵害；
2、若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是：
质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因便于筛选，质粒中含有复制原点
等。
【小问1 详解】
利用PCR 技术扩增目的基因时，在耐高温的DNA 聚合酶作用下，将游离的脱氧核苷酸加到引物的3'端，
所以要添加限制酶酶切位点，应该加在引物的5’端。
在两种引物上增加不同限制酶识别序列的主要目的是避免目的基因自身的环化、目的基因与质粒的反向连
接、目的基因片段的任意连接。
【小问2 详解】
用Ca2+处理受体细胞，使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的感受态生理状态。
农杆菌转化法原理是农杆菌在自然条件下通过转化作用可将其所含Ti 质粒上的T-DNA 转移、整合到宿主
细胞染色体DNA 上，所以形成的重组Ti 质粒需要先导入农杆菌细胞，再侵染杨树的愈伤组织。
【小问3 详解】
植物组织培养先将外植体经过脱分化形成愈伤组织，再经过再分化形成完整植株。
植物组织培养过程要求进行严格的无菌操作，若外植体消毒不彻底，培养基、接种工具灭菌不彻底；操作
过程不符合无菌操作要求，都可能导致导致外植体被污染。
【小问4 详解】
目的基因的检测与鉴定包括分子水平和个体水平检测与鉴定。
19、（河南省名校联盟2025 届高三第六次联考一模）蜘蛛丝被称为“生物钢”，其韧性是钢铁的5 倍，
可制成防弹背心、人造韧带、假肢等。蚕丝蛋白和蛛丝蛋白（MiSp）在结构上有一定的相似性，蚕丝蛋白
的主要成分有丝素重链（FibH）、丝素轻链（FibL）等，其中FibH 约占蚕丝蛋白含量的70%以上。实验
小组分别利用两种方案，构建能表达MiSp 的转基因家蚕。方案1：用FibH 基因的启动子、MiSp 基因和红
色荧光蛋白基因等构建重组基因表达载体，并用其转染家蚕受精卵，如图1 所示；方案2：敲除家蚕体内
FibH 基因的编码区，同时保留其上下游完整的调控序列，定点整合含MiSp 基因和红色荧光蛋白基因的
DNA 片段，如图2 所示。回答下列问题：
（1）图1 所示的基因表达载体中红色荧光蛋白基因的作用是___________；一般利用__________法将载体
导入家蚕受精卵中。
（2）比较两种方案，结果发现方案1 获得的转基因家蚕所结的茧中MiSp 含量仅占0.3%～3%，方案2 获
得的转基因家蚕所结的茧中MiSp 含量占比达35.2%，推测两种方案获得的转基因家蚕在MiSp 含量占比上
存在明显差异的原因可能是__________。
（3）科研人员发现，若将MiSp31 号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝的韧性可提高50%，根据这一研究结
果，可通过__________工程对MiSp 进行改造，并培育生产韧性更强的蛛丝的家蚕，请用文字和箭头写出
相关流程：__________。
【答案】（1） ①. 作为标记基因，用于筛选含有重组载体的受精卵 ②. 显微注射
（2）方案1 未清除家蚕体内的FibH 基因，家蚕仍可大量表达FibH，而方案2 敲除了FibH 基因，使家蚕
不再表达FibH，而是主要表达MiSp，故方案2 获得的转基因家蚕所结茧中MiSp 占比较高
（3） ①. 蛋白质 ②. 预期MiSp 功能（提高蛛丝韧性）→设计预期的MiSp 结构（或将31 号位的
色氨酸替换为酪氨酸）→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→通过基因修饰或基因合
成，对MiSp 基因进行改造→导入家蚕细胞并培育出能生产韧性更强蛛丝的家蚕
【解析】
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生
物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA 分子水平上
进行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人
工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终
止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体
细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通
道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态
细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目
的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1 详解】
在基因表达载体构建中，红色荧光蛋白基因在这里作为标记基因。标记基因的作用是用于筛选含有重组载
体的受精卵。当受体细胞（家蚕受精卵）含有重组基因表达载体时，由于红色荧光蛋白基因的存在，可通
过检测荧光信号来确定哪些细胞成功导入了载体。
一般利用显微注射法将载体导入家蚕受精卵中。
【小问2 详解】
方案1 未清除家蚕体内的FibH 基因，家蚕仍可大量表达FibH，而方案2 敲除了FibH 基因，使家蚕不再表
达FibH，而是主要表达MiSp，故方案2 获得的转基因家蚕所结茧中MiSp 占比较高。
【小问3 详解】
根据题意，若将 MiSp31 号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝的韧性可提高 50%，这属于对蛋白质结构的
改造，可通过蛋白质工程对 MiSp 进行改造，并培育生产韧性更强的蛛丝的家蚕。相关流程预期MiSp 功
能（提高蛛丝韧性）→设计预期的MiSp 结构（或将31 号位的色氨酸替换为酪氨酸）→推测应有的氨基酸
序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→通过基因修饰或基因合成，对MiSp 基因进行改造→导入家蚕细胞
并培育出能生产韧性更强蛛丝的家蚕。
20、（2025 届河南省创新发展联盟高三下学期春季模拟检测）.. 水蛭素（Hirudin）可预防和治疗血栓。
研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47 位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。如图表示改造Hirudin 基因及构
建基因表达载体的过程。回答下列问题：
（1）图中利用PCR 引物在Hirudin 基因内部引入碱基对的_______（填“增添”“缺失”或“替换”），需要在
______（填引物）中设计特定的碱基，从而对Hirudin 基因进行改造以获得改良的Hirudin 蛋白，这种技术
操作属于______工程。
（2）根据图中质粒pCLY11 的限制酶识别和切割位点，为使质粒pCLY11 与Hirudin 改良基因高效连接，
应选用_______对pCLY11 进行酶切。质粒pCLY11 中neor的作用是_______。
（3）若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用_______处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周
围环境中DNA 分子的生理状态。培养基中应加入新霉素，经过培养、筛选获得工程菌株，所选的工程菌
菌落应呈_______。
（4）若利用乳腺生物反应器生产改良的Hirudin 蛋白，请写出简要操作步骤：_______。
【答案】（1） ①. 替换 ②. 引物2 和引物3 ③. 蛋白质
（2） ①. XmaⅠ和BglⅡ ②. 作为标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞
（3） ①. Ca2+（或CaCl2） ②. 白色
（4）将Hirudin 改良基因与乳腺中特异表达基因的启动子等调控元件重组，通过显微注射的方法导入哺乳
动物的受精卵中，培育出转基因动物，通过转基因动物分泌乳汁来生产Hirudin 蛋白
【解析】
【分析】蛋白质工程是指根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。目的基因的
获取可以从基因文库中提取，可以使用PCR 进行扩增获得。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直
接使用DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。
【小问1 详解】
从图中可以看出，利用PCR 引物在Hirudin 基因内部引入碱基对，改变了基因的碱基序列，属于碱基对的
替换，因为引物与模板链互补配对进行扩增，要在基因内部引入特定碱基对实现替换，需要在引物2 和引
物3 中设计特定的碱基，这种通过对基因进行改造从而获得改良蛋白质的技术操作属于蛋白质工程，它是
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计，然后通过基因修饰或基因合成，对现
有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。
【小问2 详解】
Hirudin 改良基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶Xma I 和Bgl Ⅱ切
割产生的黏性末端能与Hirudin 改良基因的黏性末端碱基互补，要想把Hirudin 改良基因与质粒pCLY11
（运载体）拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶Xma I 和Bgl Ⅱ
切割，质粒pCLY11 中neor 是新霉素抗性基因，其作用是作为标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞，
在含有新霉素的培养基中，只有含有重组质粒（含有neor）的细胞才能存活。
【小问3 详解】
若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用Ca2+（或CaCl2）处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸
收周围环境中DNA 分子的生理状态，即感受态。由于重组质粒构建时破坏了mlacZ 基因（表达产物会使
细胞呈蓝色，否则细胞呈白色），所以所选的工程菌菌落应呈白色。
【小问4 详解】
利用乳腺生物反应器生产改良的Hirudin 蛋白的简要操作步骤： ①将Hirudin 改良基因与乳腺中特异表达
基因的启动子等调控元件重组在一起； ②通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中； ③将受精卵
送入母体内，使其生长发育成转基因动物； ④从转基因动物的乳汁中提取改良的Hirudin 蛋白。
21、（2025 届河南省多地高三下学期3 月模拟联考）. 水稻基因组中的B 基因仅在体细胞和精子中正常
表达，在卵细胞中不能转录。为研究B 基因表达对卵细胞的影响，科研人员设计了如图所示的实验。回答
下列问题：
（1）构建表达载体时，将水稻B 基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc 基因拼接成B—Luc 融合基因，其目
的是________。表达载体中潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为______，可用于筛选含有表达载体的
水稻细胞。启动子是_______识别和结合的部位，能驱动基因转录。
（2）图中①过程常采用感受态细胞法，是利用________处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境
中DNA 分子的生理状态。②过程中，农杆菌侵染水稻愈伤组织，使T-DNA 整合到水稻细胞的_________
上。鉴定筛选水稻幼苗时，检测指标除了幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还可以检测_____。
（3）若转基因植株中B 基因在卵细胞中正常表达，与野生型相比，其受精能力可能发生改变。为验证这
一推测，可进行杂交实验：让转基因植株作母本，野生型植株作父本进行杂交，同时设置_________作为
对照，统计并比较_________。
【答案】（1） ①. 便于检测B 基因在卵细胞中的表达情况 ②. 标记基因 ③. RNA 聚合酶
（2） ①. Ca2+ ②. 染色体DNA ③. 是否有荧光
（3） ①. 野生型植株作母本，野生型植株作父本的杂交实验 ②. 两组实验的子代数量
【解析】
【分析】图中①表示将目的基因导入农杆菌，②表示采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，之后再
采用植物组织培养技术获得转基因植株。
【小问1 详解】
荧光素酶Luc 基因表达
产物可通过特定方法检测，将水稻B 基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc 基因拼
接成B—Luc 融合基因，就能通过检测荧光来判断B 基因在卵细胞中是否表达以及表达情况。潮霉素抗性
基因和卡那霉素抗性基因作为标记基因，使含有表达载体的水稻细胞能在含有潮霉素或卡那霉素的培养基
中存活，可用于筛选。启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，只有结合后才能驱动基因转录。
【小问2 详解】
采用感受态细胞法将表达载体导入农杆菌时，通常利用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环
境中的DNA 分子的生理状态。农杆菌中的Ti 质粒上的T—DNA 可转移至受体细胞，并整合到水稻细胞的
染色体DNA 上。因为构建了B—Luc 融合基因，所以除了检测幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还能通
过检测是否有荧光（或荧光强度）来判断融合基因是否表达，进而判断B 基因的表达情况。
【小问3 详解】
为验证转基因植株中B 基因在卵细胞中正常表达时其受精能力可能发生改变的推测，可让转基因植株作母
本，野生型植株作父本进行杂交，同时设置野生型植株作母本，野生型植株作父本的杂交实验作为对照，
通过统计并比较两组实验的子代数量，如果两组子代数量有明显差异，就可以说明转基因植株卵细胞的受
精能力发生了改变。
22、（2025 届河南省开封市等3 地高三下学期二模） 出地盐碱化是农业生态环境退化的重大问题之一。
选育耐盐碱的优良品种可以保鞭国家粮食安全、提高土地利用效率和促进农业可持续发展、研究人员尝试
将OsCYP2 耐盐基因导入水稻中，以开发耐盐水稻新品种。回答下列问题。
（1）在本研究中，OsCYP2 耐盐基因属于______，获得后可通过______技术进行扩增。
限制
酶
识别序列
BamH
Ⅰ
5'-G↓GATCC-3'
XhoⅠ
5'-
G↓TCGAG-3'
PstⅠ
5'-
G↓TGCAG-3'
EcoRⅠ
5'-G↓AATTC-3'
SalⅠ
5'-G↓TCGAC-3'
（2）已知OsCYP2 耐盐基因的模板链为甲链，构建基因表达载体时，为了保证OsCYP2 耐盐基因与Ti 质
粒进行正确的拼接，需要用______酶处理OsCYP2 耐盐基因，用______酶处理Ti 质粒，再用DNA 连接酶
连接。
（3）利用Ti 质粒将OsCYP2 耐盐基因导入水稻细胞的方法是______。
（4）检测OsCYP2 耐盐基因在水稻细胞中是否稳定存在时，可用重组酶聚合酶扩增技术（简称RPA）进
行检测。RPA 技术主要依赖重组酶uvsX、单链结合蛋白Gp32、链置换DNA 聚合酶Bsu，其中重组酶
uvsX 能够在37℃-42℃时解开双链DNA.RPA 反应开始的时候，重组酶uvsX 结合单链DNA（引物），形
成核酸蛋白复合体，这些复合体能够扫描（识别）与引物序列互补的目标双链DNA.接着，核酸蛋白复合
体侵入
端位点使DNA 双链打开。单链结合蛋白Gp32 与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶uvsX
离开寡核苷酸的3'端，降解后被DNA 聚合酶利用。之后，链置换DNA 聚合酶Bsu 结合在核酸蛋白复合体
的游离3'端，进行子链延伸。以上步骤循环进行，就可以实现DNA 的指数增长。其过程如图所示。
①用RPA 技术检测时，引物应与______相同。
②相对于PCR 而言，RPA 技术具有______、仪器依赖性低等突出优点，利于现场检测和即时诊断。
③通过优化______，可以进一步提高RPA 技术的特异性和灵敏性。
【答案】（1） ①. 目的基因 ②. PCR
（2） ①. Pst Ⅰ和Sal Ⅰ ②. Xho Ⅰ和Pst Ⅰ （3）农杆菌转化法
（4） ①. OsCYP2 耐盐基因两侧的特异性碱基序列 ②. 反应条件温和 ③. 引物设计和反应条件
【解析】
【分析】目的基因的检测与鉴定：分子水平检测目的基因是否插入转基因生物的DNA 用PCR 技术；检测
目的基因是否转录出了mRNA 用PCR 技术；检测目的基因是否翻译出蛋白质用抗原-抗体杂交，个体水平
检测目的是否表现出相应的特性。
【小问1 详解】
在基因工程中，目的基因是指人们想要研究或利用的基因，本题中要将OsCYP2 耐盐基因导入水稻中，所
以OsCYP2 耐盐基因属于目的基因。而获得目的基因后，可通过 PCR（聚合酶链式反应）技术进行扩增，
PCR 技术能在体外快速大量扩增特定 DNA 片段。
【小问2 详解】
已知OsCYP2 耐盐基因的模板链为甲链，构建基因表达载体时，为保证目的基因与载体正确拼接，需要用
限制酶切割目的基因和载体，使其产生相同的黏性末端或平末端。根据图中限制酶的识别序列可知， Xho
Ⅰ和Sal Ⅰ 切割后产生的粘性末端相同，且要把目的基因插入到T-DNA 上，要保证拼接正确，需要用 Xho Ⅰ
和Pst Ⅰ酶处理Ti 质粒，用Pst Ⅰ和Sal Ⅰ处理OsCYP2 耐盐基因，再用DNA 连接酶连接。
【小问3 详解】
利用Ti 质粒将OsCYP2 耐盐基因导入水稻细胞的方法是农杆菌转化法。
【小问4 详解】
①用RPA 技术检测时，引物的作用是与目标DNA 序列结合，以便后续进行DNA 的扩增等操作，所以引物
应与目的基因OsCYP2 耐盐基因两侧的特异性碱基序列相同，才能准确识别并结合到目标双链 DNA 上，
从而启动后续的扩增反应。
②PCR 技术一般需要在较高温度（如 90 - 95℃进行变性等操作），而RPA 技术在37∘C−42∘C 就能进行反
应，所以相对于PCR 而言，RPA 技术具有反应条件温和仪器依赖性低等突出优点，较低的反应温度使得其
在一些对设备要求不高的现场检测和即时诊断场景中更具优势。
③引物的设计和反应条件对于PCR 和RPA 等扩增技术都非常关键。合适的引物可以准确地与目标 DNA
序列结合，避免非特异性扩增等问题。所以通过优化引物设计，可以进一步提高 RPA 技术的特异性和灵
敏性。引物的特异性决定了能否准确扩增目标基因，灵敏性则影响着对低浓度目标基因的检测能力。
23、（2025 届河南省名校学术联盟高三下学期模拟冲刺） 牛可卡因—苯丙胺调节转录肽（CART）参与
摄食和体重调节、激素内分泌调节、感觉处理以及药物成瘾等相关生理功能。研究者在牛CART 基因的启
动子的﹣475bp～+22bp（转录起点为+1，下游为+，上游为﹣）处连接上pGL3 系列萤火虫荧光素酶基因
（LUC 基因）的编码区，并与牛CART 基因编码区拼接成融合基因（见图2；图1 则是相关基因结构；
LUC 可催化荧光素氧化发光）。
回答下列问题：
（1）结合图1、图2 可知，为实现融合蛋白的表达，研究者需剔除相关基因的某些片段，则剔除的片段及
其剔除的理由分别是______（答出1 种即可）。
（2）图2 所示实验的目的是______。
（3）牛CART 基因编码区是不连续的，其中含2 个非编码序列（内含子），内含子在转录后被剪切掉才
能形成mRNA，大肠杆菌没有该剪切机制。为保证融合基因能在大肠杆菌中形成融合蛋白，研究者在构建
上述融合基因时采用反转录PCR（RT - PCR），则验证融合基因的产生是不同RNA 剪接后逆转录产生而
非基因组DNA 融合而成的步骤是______。
（4）在生产融合蛋白时，研究者利用BamHI 分别处理含融合基因的DNA 片段和大肠杆菌质粒（如图3，
Ampr、Tetr分别是氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因），则培养基中添加的抗生素情况是______（填
“先用含四环素的培养基，后用含氨苄青霉素的培养基”或“先用含氨苄青霉素的培养基，后用含四环素
的培养基”），此外，培养基上还需包含的一般成分有______。
注：二次使用抗生素时，采用微生物影印法进行接种，该接种方法是一种在微生物学研究中广泛应用的技
术，主要用于在一系列培养皿的相同位置上接种并培养出相同的菌落，以便于后续的筛选和分析。
【答案】（1）剔除LUC 启动子，理由：保证mRNA 的转录是由牛CART 启动子启动的；剔除LUC 编码
区中可编码终止密码子的序列，理由：保证融合蛋白同时含有LUC 蛋白和CART；剔除LUC 终止子，理
由：保证融合基因中LUC 编码区和牛CART 编码区是连续的
（2）通过检测融合蛋白的荧光强度来筛选牛CART 基因启动子的活性片段
（3）以融合基因的两端序列来设计PCR 引物、利用PCR 扩增融合基因、对扩增产物进行凝胶电泳
（4） ①. 先用含氨苄青霉素的培养基，后用含四环素的培养基 ②. 碳源、氮源、无机盐、水、
（琼脂）
【解析】
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受
体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
由图可知，该融合蛋白的左侧是LUC，右侧是CART，这两种蛋白质是直接相连成融合蛋白的，因此融合
基因中LUC 编码区中不能含有编码终止密码子的序列和LUC 终止子序列，且该融合基因要处于牛CART
基因的启动子和终止子之间，因此研究者需剔除的片段及理由是：剔除LUC 启动子，以保证mRNA 的转
录是由牛CART 启动子启动的；剔除LUC 编码区中可编码终止密码子的序列，以保证融合蛋白同时含有
LUC 蛋白和CART；剔除LUC 终止子，以保证融合基因中LUC 编码区和牛CART 编码区是连续的。
【小问2 详解】
由图2 可知，不同融合基因的差别在于牛CART 启动子片段的长度，通过检测荧光强度来反映实验结果，
这表明该实验是要来确定LUC 的活性，活性高则荧光强，因此图2 实验的目的是：通过检测融合蛋白的荧
光强度来筛选牛CART 基因启动子的活性片段。
【小问3 详解】
真核生物的基因内部有内含子，该序列在转录后会被剪切掉才能产生mRNA，而通过mRNA 逆转录形成的
DNA 则不含有内含子，大肠杆菌没有该剪切机制。若该融合基因的产生是不同RNA 剪接后逆转录产生，
则PCR 扩增后的DNA 片段较小，若该基因的产生是基因组DNA 融合获得的，则PCR 扩增后的DNA 片段
较大，这两种DNA 片段用凝胶电泳可以区分开来，因此可通过PCR 和凝胶电泳来鉴定该基因的产生来源，
所以该实验的步骤是以融合基因的两端序列来设计PCR 引物、利用PCR 扩增融合基因、对扩增产物进行
凝胶电泳。
【小问4 详解】
该实验使用了限制酶BamHⅠ分别处理含融合基因的DNA 片段和大肠杆菌质粒，则融合基因插入的部位是
质粒上的Tetr内部，若插入成功，则重组质粒上的Tetr结构被破坏，但Ampr结构正常，因此在含氨苄青霉
素的培养基上，含重组质粒和含空白质粒的细菌都能够存活，在含氨苄青霉素的培养基上会出现这两种细
菌的菌落；若没有成功插入融合基因，则含空白质粒的细菌质粒上的Tetr和Ampr结构均正常，携带空白质
粒或者携带自身环化空白质粒的细菌，在含四环素的培养基上能够存活，而含重组质粒的细菌则不能存活，
因此该实验使用的培养基的抗生素添加情况是：先用含氨苄青霉素的培养基将含空白质粒和含重组质粒的
细菌选择出来，再用微生物影印法将这两种菌落转移到含四环素的培养基上，存活的细菌为含空白质粒的
细菌，不存活的细菌则为目的菌株，可在含氨苄青霉素培养基上选取。该实验所使用的培养基除含抗生素
外，还含有碳源、氮源、水、无机盐等成分。
24、（河南省部分名校2024-2025 学年高三下学期3 月联考） 研究人员利用一种从某生物体内分离出的
抗盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，培育出了抗盐碱大豆，使大豆能在盐碱地中
正常生长，提高了大豆的产量。下图为培育流程，其中①～⑥为不同过程，其中AmpR为氨苄青霉素抗性
基因，AluI、SmaI、HindⅢ和PstI 为限制酶。根据所学知识，回答下列问题：
（1）利用PCR 技术可获取大量目的基因，PCR 反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA
链上，设计两种引物的碱基序列时，要避免________；扩增时，需先加热至90～95℃，再冷却至55～
60℃，再加热至70～75°℃，进行系列温度调整的目的分别是_________。
（2）不用限制酶AluI 切割抗盐碱基因的原因是__________。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，选择
SmaI 和PstI 比只选择PstI 的优点是___________（答出两点）。
（3）图中②表示__________。诱导组织细胞脱分化的是__________号培养基。若要利用AmpR筛选出含重
组质粒的农杆菌，需要的操作是_________。利用Ti 质粒，通过农杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈
伤组织细胞的理论依据是_____________。
【答案】（1） ①. 两种引物的碱基序列互补配对 ②. 加热使 DNA 变性后解旋为单链；冷却复性
使引物结合到模板DNA 链上；再加热促进热稳定DNA 聚合酶发挥作用，开始子链的延伸。
（2） ①. Alu Ⅰ切割会破坏抗盐碱基因 ②. 防止目的基因和质粒反向连接\防止目的基因、质粒自
身环化
（3） ①. 将目的基因导入农杆菌细胞 ②. 3 ③. 在培养农杆菌的培养基内添加氨苄青霉素
④. 农杆菌中 Ti 质粒上的T-DNA 能转移并整合至植物细胞染色体DNA 上
【解析】
【分析】据图分析，图示为利用基因工程和细胞工程培育抗盐碱大豆的过程，其中①表示构建基因表达载
体：②表示将目的基因导入农杆菌细胞；③表示筛选含有目的基因的农杆菌；④表示脱分化形成愈伤组织
的过程；⑤⑥表示幼苗培育成成体的过程。
【小问1 详解】
DNA 分子是由两条反向平行的链构成，且都作模板，其上碱基序列互补，因此要避免两种引物的碱基序列
互补配对；
扩增时，需先加热至90～95℃，再冷却至55～60℃，再加热至70～75°℃，进行系列温度调整的目的分别
是：加热使 DNA 变性后解旋为单链；冷却复性使引物结合到模板DNA 链上；再加热促进热稳定DNA 聚
合酶发挥作用，开始子链的延伸。
【小问2 详解】
据图可知，抗盐碱基因中包含了Alul 限制酶识别序列，若用限制酶Alul 切割则会破坏抗盐碱基因；
选择Smal 和Pstl 两种限制酶分别切割抗盐碱基因和质粒，抗盐碱基因与质粒各自能形成不能互补配对的两
个黏性末端，同时抗盐碱基因与质粒之间的黏性末端又能互补配对，相比只选择Pstl 一种酶进行切割的优
点是可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基因和质粒自身环化。
【小问3 详解】
图中②表示将目的基因导入农杆菌细胞；
据图分析，3 号培养基可诱导组织细胞脱分化形成愈伤组织；
质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故含重组质粒的农杆菌具有抗氨苄青霉素的特性，所以为了筛检成功导
入重组质粒的农杆菌，1 号培养基需要加入氨苄青霉素;
Ti 质粒上的T-DNA 具有可转移的特性，当农杆菌侵染大豆愈伤组织细胞时，农杆菌中Ti 质粒上的T-DNA
包括插入其中的目的基因可转移并整合至受体细胞染色体DNA 上。
25、（河南省部分学校2024-2025 学年高三下学期2 月联合性检测） 3-甾酮-9α-羟基化酶（KSH）是制备
甾体类药物的重要酶，其两个亚基KshA 和KshB 分别由基因MSMEG_5925 和基因MSMEG_6039 控制合
成。某科研小组从耻垢分枝杆菌的DNA 中通过PCR 方法分离出上述两种基因并构建了重组质粒，过程如
图所示。回答下列问题：
（1）图示PCR 扩增过程中，发生碱基互补配对
阶段是________（填序号），A、B 引物的设计需以基因
MSMEG_5925 和MSMEG_6039 的________为依据，而复性温度的设计与引物的________（答一点）有关。
（2）构建中间质粒时，先提取质粒pNIT 并利用限制酶________切割后对片段进行电泳，为了能在波长为
300nm 的紫外灯下检测出DNA 分子，需要在琼脂糖溶液中加入适量的________并混匀。
（3）构建表达质粒pNIT 一Mksh 时，科研人员在两个目的基因之间引入了SD（核糖体结合位点）序列和
间隔序列（CGGAGGAATCACTTCGCA）。SD 序列是原核生物mRNA 上的一段特定核苷酸序列，位于起
始密码子AUG 上游，其主要作用是提供核糖体结合位点，以确保________，从而提高翻译效率。间隔序
列的存在则可以避免______，确保它们能独立地被转录和翻译。
（4）将上述表达质粒导入大肠杆菌细胞中，涂布于含________的培养基中培养，挑取单菌落扩增目的基
因，_________（填“阳性”或“阴性”）菌落即为构建成功的工程菌。
【答案】（1） ①. ②③ ②. 两端的核苷酸（或碱基）序列 ③. 碱基G+C 的含量（碱基组成）
和长度
（2） ①. NdeI 和EcoRI ②. 核酸染料
（3） ①. mRNA 能被核糖体正确识别并结合 ②. 两个基因在表达时的相互干扰
（4） ①. 卡那霉素 ②. 阳性
【解析】
【分析】基因工程：目的基因的筛选与获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的
检测与鉴定。
【小问1 详解】
PCR 扩增过程中，复性阶段引物与模板结合发生碱基互补配对，延伸阶段子链与母链结合发生碱基互补配
对，图中对应的阶段是②③。A、B 引物的设计需依据基因MSMEG_5925 和MSMEG_6039 各自两端的核
苷酸序列，而复性温度的设计与引物碱基G+C 的含量（碱基组成）和长度有关。
【小问2 详解】
构建中间质粒时，先提取质粒pNIT 并利用限制酶NdeI 和EcoRI 切割后对片段进行电泳，为了能在波长为
300nm 的紫外灯下检测出DNA 分子，需要在琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料并混匀。
【小问3 详解】
根据题意，SD 序列的主要作用是提供核糖体结合位点，确保mRNA 能被核糖体正确识别并结合，从而提
高翻译效率。间隔序列的存在则可以避免基因MSMEG_5925 和MSMEG_6039 在表达时的相互干扰，确保
它们能独立地被转录和翻译。
【小问4 详解】
将表达质粒导入大肠杆菌细胞中，涂布于含卡那霉素的培养基中培养，挑取单菌落扩增目的基因，阳性菌
落即为构建成功的工程菌。
26、（河南省部分学校2024-2025 学年高三下学期阶段测试（五）） MAP30 蛋白具有抗pvx 病毒的功能，
为培育高效表达该基因的马铃薯新品种，科研团队构建重组质粒，利用农杆菌转化法将MAP30 基因导入
马铃薯细胞内，如图1 所示。根据所学知识回答下列问题：
（1）分析图1 可知，构建基因表达载体时宜选择_____酶识别并切割MAP30 基因和质粒。已知MAP30 基
因转录形成的mRNA 碱基序列为5'-UCAACGCUA……GUCGACUCG-3'，请写出利用PCR 扩增MAP30 基
因时所用的2 种引物序列：_____（各写6 个碱基即可）。
（2）G 蛋白和V 蛋白是转录激活因子，UAS 是诱导型启动子，据图2 判断UAS 启动子需要在_____条件
下被激活。质粒中含有5 个UAS 启动子，其作用可能是______。
（3）构建G-V-UAS 基因表达载体时采用仅在马铃薯叶片中驱动转录的启动子，可提高_____。要探究增
加转入的食品安全性，原因可能是MAP30 基因的数量是否会影响转基因马铃薯对除草剂A 的抗性程度，
请写出简要的实验思路：______。
【答案】（1） ①. XbaⅠ和HindⅢ ②. 5'-TCAACG-3'和5'-CGAGTC-3'
（2） ①. G 蛋白和V 蛋白结合 ②. 增加RNA 聚合酶的结合位点，从而提高MAP30 基因的转录效
率，合成更多的mRNA，进而增加MAP30 蛋白的表达量
（3） ①. 该启动子可使MAP30 基因仅在马铃薯叶片中表达，而在人食用的部位不表达 ②. 将含
不同数量的MAP30 基因的表达载体分别转入马铃薯细胞中，并分别培育获得转基因马铃薯植株，分别喷
洒等量适宜浓度的除草剂A，观察比较植株的生长状况
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基
因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
为避免目的基因与质粒反向拼接，同时要避免破坏目的基因，并且将目的基因插入启动子和终止子之间，
构建基因表达载体时宜选择XbaⅠ和HindⅢ两种限制酶。已知MAP30 基因的mRNA 序列为5'-
UCAACGCUA……GUCGACUCG-3'，则模板链的序列为5'-CGAGTC……CGTTGA-3'，互补链的序列为5'-
TCAACG……GACTCG-3'。由于引物是根据目的基因两端的碱基序列设计的，且引物的延伸方向是5'端
→3'端，所以利用PCR 扩增MAP30 基因时所需一对引物的序列为5'-TCAACG-3'、5'-CGAGTC-3'。
【小问2 详解】
据图2 可知，G 蛋白和V 蛋白结合后，该复合体可与UAS 启动子结合并将其激活。启动子是RNA 聚合酶
识别并结合的部位，可驱动目的基因转录，质粒中含有5 个UAS 启动子可增加RNA 聚合酶的结合位点，
从而提高目的基因的转录效率，合成更多的mRNA，进而增加MAP30 蛋白的表达量。
【小问3 详解】
构建G-V-UAS 基因表达载体时采用仅在马铃薯叶片中驱动转录的启动子，可使MAP30 基因只在马铃薯叶
片中表达，而在人食用的部位不表达，使食用部分不含外源基因，提高了食品安全性。在探究增加转入的
MAP30 基因的数量是否会影响转基因马铃薯对除草剂A 的抗性程度的实验中，自变量是MAP30 基因的数
量，因变量是转基因植株对除草剂A 的抗性程度的差异。因此应将含不同数量的MAP30 基因的表达载体
分别转入马铃薯细胞中，并分别培育获得转基因马铃薯植株，分别喷洒等量适宜浓度的除草剂A，观察比
较植株的生长状况。
27、（河南省部分重点高中九师联盟2024-2025 学年高三下学期2 月开学考试） 科研人员利用RT-PCR
技术获得的TaPRX-2A 基因构建的基因表达载体，成功培育出TaPRX-2A 基因能过表达的转基因耐盐玉米。
在培育过程中，所用的 Ti 质粒中的限制酶识别位点、标记基因等如图所示。其中，HindⅢ、PstⅠ、
EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ表示限制酶；AmpR为氨苄青霉素抗性基因，表达产物对氨苄青霉素有抗性；
LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；终
止子和启动子均能在玉米根细胞中调节基因表达。回答下列问题：
（1）用RT-PCR 技术扩增获得TaPRX-2A 基因的过程需要先经_______过程得到cDNA，再根据cDNA 设
计相应的引物，引物的作用是______。
（2）在构建含TaPRX-2A 的cDNA 的表达载体时，宜选用限制酶______对质粒和TaPRX-2A 的cDNA 进行
处理，将TaPRX-2A 的cDNA 插入质粒中相应酶切位点之间的原因是______（答两点）。
（3）获得转基因玉米时，先将含TaPRX-2A 的cDNA 的表达载体转入农杆菌，筛选含重组质粒的农杆菌
与玉米细胞共培养后，利用______技术将含TaPRX-2A 的cDNA 的受体细胞培养为转基因玉米。在这个过
程中，筛选含重组质粒的农杆菌时，需要在完全培养基中添加_______，挑选______色菌落。
【答案】（1） ①. 逆转录 ②. 使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
（2） ①. PstⅠ、EcoRⅠ ②. TaPRX-2A 的cDNA 不含启动子和终止子；需要玉米细胞的启动子和终
止子调节TaPRX-2A 的cDNA 表达；Ti 质粒的T-DNA 能转移并整合到受体细胞的染色体DNA 上
（3） ①. 植物组织培养 ②. 氨苄青霉素、X-gal ③. 白
【解析】
【分析】1、PCR 反应进行的条件：引物（PCR 引物为DNA 片段，细胞内DNA 复制的引物为一段RNA
链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
2、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。启动子是RNA 聚合酶特异性识别和结合
的DNA 序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。终止子是给予
RNA 聚合酶转录终止信号的DNA 序列。
【小问1 详解】
逆转录是以mRNA 为模板，在反转录酶的作用下，按照碱基互补配对原则，合成与mRNA 互补的DNA 链，
即cDNA。用RT-PCR 技术扩增获得TaPRX-2A 基因的过程需要先提取细胞组织中的mRNA，经逆转录得
到cDNA。引物与模板结合后，DNA 聚合酶可以从引物的3'端开始合成新的DNA 链，从而启动DNA 的扩
增过程。
【小问2 详解】
在构建含TaPRX-2A 的cDNA 的表达载体时，首先要保证不破坏标记基因，第二要防止质粒自身环化和目
的基因的反向连接（确保目的基因与质粒正向连接），第三要保证不含启动子的目的基因连在启动子与终
止子之间。TaPRX-2A 的cDNA 不含启动子和终止子，所以需要玉米细胞的启动子和终止子调节TaPRX-2A
的cDNA 表达，且要保证Ti 质粒的T-DNA 能转移并整合到受体细胞的染色体DNA 上，由图可知宜选用限
制酶PstⅠ、EcoRⅠ对质粒和TaPRX-2A 的cDNA 进行处理。
【小问3 详解】
获得转基因玉米时，先将含TaPRX-2A 的cDNA 的表达载体转入农杆菌，筛选含重组质粒的农杆菌与玉米
细胞共培养后，利用植物组织培养技术将含TaPRX-2A 的cDNA 的受体细胞培养为转基因玉米。重组质粒
中含有的抗性基因是AmpR基因（氨苄青霉素抗性基因），因此在这个过程中，筛选含重组质粒的农杆菌
时，需要在完全培养基中添加氨苄青霉素，又因为LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生
蓝色物质，使菌落呈现蓝色，所以完全培养基中还应添加X-gal，并且挑选白色菌落作为目标菌落。
28、（河南省项城市2024-2025 学年高三下学期3 月联考） 科研人员通过将温度诱导启动子及其阻遏元
件进行优化整合，构建了新型链霉菌温度诱导基因表达调控系统，如下图所示（所用不同限制酶的酶切位
点不同）。回答下列问题：
（1）图中TmsR 和tsp 的基本组成单位分别是______。
（2）构建图A 表达系统时，以小白链霉菌基因组DNA 为模板，用______（填“tmsRF/tspR”“tmsRR/
tspF”“tmsRR/tspR”或“tmsRF/tspF”，F、R 分别表示左右引物）扩增含有tmsR 和tsp 的DNA 片段。
（3）获得上述片段后用XbaⅠ酶切备用，人工合成neo 片段并用EcoRⅠ酶切，将两片段同时连入经______
酶切的质粒中，得到重组质粒，导入小白链霉菌中得到重组菌株，在含______的固体平板上进行培养并筛
选。
（4）在37℃条件下培养时，TmsR 不能与tmsO 结合，导致______，菌株正常生长；而在28℃培养时，
TmsR 与tmsO 结合，进而使菌株不能生长。若TmsR 含量不够，则可能存在一定程度的渗漏，即部分平板
上出现生长菌株。图B 为对该表达系统进行的初步改造，将PtmsR替换成强启动子PhrdB，推测这一替换的意
义是______。推测图C 中在tsp 附近增加tmsO 位点的作用是______。
【答案】（1）氨基酸、核苷酸
（2）tmsRF/tspR
（3） ①. XbaⅠ和EcoRⅠ ②. 卡那霉素
（4） ①. 基因正常表达 ②. 提高TmsR 的表达量 ③. 增强TmsR 对tsp 的调控作用
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
分析题意，TmsR 是一种蛋白质，其基本组成单位是氨基酸；tsp 是启动子，其本质是一个基因片段，其基
本组成单位是核苷酸。
【小问2 详解】
分析题意，本过程要求扩增含有tmsR 和tsp 的DNA 片段，根据引物设计的原则，且F、R 分别表示左右引
物，即F 表示正向引物，R 表示反向引物，故正确的引物组合应该是tmsRF/tspR。
【小问3 详解】
由题意可知，获得上述片段后用XbaⅠ酶切备用，人工合成neo 片段并用EcoRⅠ酶切，XbaⅠ和EcoRⅠ是两种
不同的限制酶，故质粒也需要用这两种酶进行双酶切，以获得相同的黏性末端，以便与两个片段连接；由
于neo 是卡那霉素抗性基因，因此筛选培养基中应含有卡那霉素。
【小问4 详解】
在37℃时，TmsR 不能与tmsO 结合，因此基因表达不会被抑制，导致基因正常表达，菌株正常生长；在
28℃时，TmsR 与tmsO 结合，抑制基因表达，菌株不能生长；结合图B 可知，将P_tmsR 替换成强启动子
P_hrdB，可以提高TmsR 的表达量，从而增强温度诱导的调控效果。在tsp 附近增加tmsO 位点，可以增强
TmsR 对tsp 的调控作用，进一步精确控制基因表达。
29、（河南省驻马店市2024-2025 学年高三下学期2 月质量检测） 某研究小组提取大肠杆菌K—12 株的
基因组，通过PCR 扩增得到HT 基因（一侧带有BamH I 和EcoR I 双酶切位点），构建P2—HT 重组质粒
并融合从HIV 中分离的gP41 基因（编码HIV 抗原蛋白），实现了HT 基因和gp41 基因的融合表达，相关
过程如图所示。回答下列问题：
（1）用K—12 菌株基因组扩增HT 基因时，PCR 反应体系中一般需添加dNTP，其作用是______（答1
点）。若所用引物过长，则会导致退火温度______（填“过高”或“过低”）。引物
______（填“3＇”或“5
＇”）端还需添加限制酶的识别序列。
（2）获得的PCR 产物常通过______法进行鉴定。该操作中需将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具并插入合
适大小的梳子，其目的是______。
（3）MCS 是质粒上存在的一个人工合成的DNA 片段，其上有多个酶切位点，人工添加MCS 的意义是
______。质粒P2 的MCS 上至少有______种酶切位点。
（4）用P2—HT—gP41 质粒转化处于______生理状态的大肠杆菌，并涂布于含______的LB 平板上培养，
挑取单菌落用于后续实验操作。
【答案】（1） ①. 作为原料；提供能量 ②. 过高 ③. 5＇
（2） ①. （琼脂糖凝胶）电泳 ②. 形成加样孔
（3） ①. 提供多个限制酶切割位点，利于目的基因精准和灵活插入 ②. 3
（4） ①. 能吸收周围环境中DNA 分子 ②. 卡那霉素
【解析】
【分析】1、基因工程表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终
止子和标记基因等。实验设计遵循实验设计遵循对照原则、单一变量原则和无关变量相同且适宜原则。
2、PCR 技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶；PCR 的操作过 程：
①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解 开)；
低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【小问1 详解】
在PCR 反应体系中，dNTP（脱氧核苷三磷酸）一方面作为合成DNA 的原料，参与新DNA 链的合成；另
一方面，dNTP 水解时能释放能量，为反应提供能量。 引物过长，其与模板DNA 的碱基互补配对程度高，
结合更加牢固，需要更高的温度才能使引物与模板分离，所以会导致退火温度过高。 在PCR 扩增中，
DNA 聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA 链，所以引物的3'端必须与模板DNA 精确配对，而5'端相对
灵活，因此引物的3'端需与模板链互补配对，在5'端还需添加限制酶的识别序列。
【小问2 详解】
获得的PCR 产物通常通过琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。因为不同大小的DNA 片段在凝胶中的迁移速率不
同，从而可以根据条带的位置等判断PCR 产物的情况。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具并插入合适大
小的梳子，是为了在凝胶冷却凝固后形成加样孔，用于后续添加PCR 产物等样品。
【小问3 详解】
MCS（多克隆位点）上有多个酶切位点，人工添加MCS 可以提供多个限制酶切割位点，这样在进行基因
工程操作时，能够更精准、灵活地将目的基因插入到质粒中，方便构建重组质粒。从图中可以看到，P2 -
HT 重组质粒构建过程中用到了BglⅡ、BamHⅠ和EcoRⅠ三种限制酶，所以质粒P2 的MCS 上至少有3 种酶
切位点。
【小问4 详解】
用P2 - HT - gp41 质粒转化大肠杆菌时，需要将大肠杆菌处理成能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，
即感受态细胞。从图中可知，质粒上含有卡那霉素抗性基因（Kan），所以涂布在含卡那霉素的LB 平板上
培养，只有成功导入重组质粒的大肠杆菌才能在该平板上生长，从而可以筛选出含有重组质粒的大肠杆菌
单菌落用于后续实验操作。
30、（河南省驻马店市重点高中联考2024-2025 学年高三下学期3 月月考） 研究发现，酶A 能催化半纤
维素降解，使棉纤维长度变短。为培育转基因长绒棉花品种，科研人员构建了酶A 基因反义基因表达载体
（目的基因反向连接到载体中），过程如图所示，其中SmaI、NotI、HindIII 和BamHI 为酶切位点（四种
限制酶切割后黏性末端不同）。回答下列问题：
（1）大量获取酶A 基因的常用方法为_________，该方法的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶
中DNA 分子的迁移速率与凝胶的__________等有关。若酶A 基因两侧的碱基序列如下，请从①~④中选择
获取酶A 基因的引物组合__________。
5'-GAAGTCCTCT……ACGACGAACC-3'
3'-CTTCAGGAGA……TGCTGCTTGG-5'
①5'-GAAGTCCTCT-3'②5'-GGTTCGTCGT-3'
③5'-AGAGGACTTC-3'④5'-ACGACGAACC-3'
（2）图中构建的基因表达载体，使用的限制酶为_________时，构建出的基因表达载体既有正义基因表达
载体（目的基因正向连接到载体中）也有反义基因表达载体，原因是__________。可通过限制酶切割所产
生的DNA 片段长度区分上述两种载体，所选限制酶应为__________。
（3）利用农杆菌转化法将构建的反义基因表达载体导入棉花细胞，应先将反义基因表达载体导入
__________中，该过程利用的原理是农杆菌Ti 质粒上的__________可转移到被侵染的细胞中。反义基因表
达载体导入受体细胞后，通过抑制__________过程来影响酶A 基因的表达，进而影响棉绒的长度。
【答案】（1） ①. PCR ②. 浓度、DNA 分子的大小和构象 ③. ①②
（2） ①. SmaI ②. 使用同一种限制酶切割目的基因和质粒，黏性末端相同，目的基因与载体既可
正向连接也可反向连接 ③. NotI
（3） ①. 农杆菌 ②. T-DNA ③. 翻译
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体
构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
获取酶A 基因的常用方法为PCR 扩增技术 ，该方法的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中
DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。若酶A 基因两侧的碱基序列如下，
根据碱基互补配对原则以及引物的方向性可知，扩增酶A 基因需要的引物组合为①②
【小问2 详解】
基因工程的核心步骤是基因表载体的构建，图中构建基因表达载体时，根据目的基因两侧的限制酶种类，
以及质粒中相关的限制酶的种类可推测，该过程中使用的限制酶为Sma I，由此构建的基因表达载体既有
正义基因表达载体也有反义基因表达载体，因为目的基因和质粒的切割用的是相同的限制酶，使用一种限
制酶切割目的基因和质粒后，目的基因与载体既可正向连接也可反向连接，为此可通过限制酶切割所产生
的DNA 片段长度区分上述两种载体，所选限制酶为Not I，因为目的基因中有限制酶Not I 的识别序列，用
该酶切割正义表达载体和反义表达载体可获得不同长度的DNA 片段。
【小问3 详解】
利用农杆菌转化法将构建
反义基因表达载体导入棉花细胞，应先将反义基因表达载体导入农杆菌中，该
过程利用的原理是农杆菌Ti 质粒上的T-DNA 可转移到被侵染的细胞中。反义基因表达载体导入受体细胞
后，通过抑制翻译过程来影响酶A 基因的表达，进而影响棉绒的长度。
