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专题17 基因工程
考点概览
考点01 基因工程的原理
考点02 基因工程的应用
基因工程的原理
1．（2024·四川眉山·一模）Cre-Loxp 系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre 酶能根
据两个Loxp 的方向删除或倒置位于两个Loxp 序列间的基因，如图1 所示。现使用Cre-Loxp 系统构建
TK 基因缺失的病毒毒株，为研发该病毒的疫苗提供候选毒株，构建过程如图2 所示，下列分析错误的
是（ ）
考点01
A．图1 中Gene 两端需含有两个相同的碱基序列
B．位于RFP 基因两端的Loxp 序列方向相反
C．Cre 酶处理之前，应初步筛选出有红色荧光基因的病毒
D．Cre 酶在图2 过程中的具有限制酶和DNA 连接酶的功能
【答案】B
【分析】Cre-Loxp 系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre 酶能根据两个Loxp 的
方向删除或倒置位于两个Loxp 序列间的基因，结合图1，说明GENE 两端需含有两个相同的碱基序列，
以便Cre 酶进行识别。
【详解】A、由图1 判断Cre 酶删除或倒置位于两个Loxp 序列间的基因时，需识别相应的序列，所以
GENE 两端需含有两个相同的碱基序列，A 正确；
B、要通过Cre 酶删除RFP 基因，根据图1 可知，RFP 基因两端的Loxp 序列方向应该相同，B 错误；
C、RFP 基因可表达出红色荧光蛋白，根据红色荧光蛋白表达情况可筛选出TK 基因被替换为红色荧光
基因的病毒，C 正确；
D、限制酶能对DNA 特定位点进行切割，DNA 连接酶能连接黏性末端和平末端，Cre 酶在处理重组基
因片段时具有限制酶和DNA 连接酶的功能，D 正确。
故选B。
2．（2024·四川德阳·一模）绿叶海蜗牛是一种软体动物，它可以通过进食藻类并吸收其叶绿体化为己用。
在绿叶海蜗牛的染色体中，还包含了一些特殊的藻类所特有的核基因，它们的功能是修复和保持叶绿
体持续发挥作用，使余生无需进食。下列叙述错误的是（ ）
A．两种生物之间的关系是互利共生，且都以DNA 作为遗传物质
B．绿叶海蜗牛不论是在光照条件还是黑暗条件都可以合成ATP
C．叶绿体要发挥正常功能需要细胞核和叶绿体共同编码蛋白质
D．采用PCR 手段可以从海蜗牛的核DNA 中克隆出藻类的核基因
【答案】A
【分析】分析题干可知，绿叶海蜗牛细胞内除含有一般动物细胞所含结构外，还含有动物细胞没有的
结构叶绿体。
【详解】A、绿叶海蜗进食藻类并吸收其叶绿体化为己用，两种生物属于捕食关系，不属于互利共生关
系，A 错误；
B、绿叶海蜗牛在光照条件可以进行光合作用和呼吸作用，黑暗条件可以进行呼吸作用，都可以合成
ATP，B 正确；
C、由题干信息“在绿叶海蜗牛的染色体中，还包含了一些特殊的藻类所特有的核基因，它们的功能是
修复和保持叶绿体持续发挥作用”可知叶绿体要发挥正常功能需要细胞核和叶绿体共同编码蛋白质，C
正确；
D、绿叶海蜗牛的染色体中含有藻类所特有的核基因，因此采用PCR 手段可以从海蜗牛的核DNA 中克
隆出藻类的核基因，D 正确。
故选A。
3．（2024·四川内江·一模）下列有关“DNA 的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．可以选择洋葱、香蕉、菜花或猪血等作为实验材料粗提取DNA
B．向处理后的滤液中加入体积相等的、预冷的酒精可使DNA 析出
C．利用DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同可使DNA 析出
D．与“检测生物组织中的还原糖”实验相比，二者均需要水浴加热
【答案】A
【分析】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适
当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原
理，可以初步分离DNA 与蛋白质。DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L 的
NaCl 溶液。在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA 的试
剂。
【详解】A、猪是哺乳动物，猪血中的红细胞没有细胞核，不能作为实验材料粗提取DNA，A 错误；
B、DNA 不溶于冷酒精，向处理后的滤液中加入体积相等的、预冷的酒精可使DNA 析出，B 正确；
C、DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L 的NaCl 溶液，向溶解有DNA 的
2mol/L 的NaCl 溶液中加蒸馏水稀释，溶液中会析出DNA，C 正确；
D、用斐林试剂检测还原糖需水浴加热，用二苯胺检测DNA 也需要水浴加热，D 正确。
故选A。
4．（2024·四川内江·一模）如图表示利用新冠病毒包膜表面的S 蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2 是酵母
菌的蔗糖转化酶基因，其表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n 分
别是启动子和终止子。下表中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列
叙述错误的是（ ）
限制
酶
BamH I
Nhe I
Nco I
Sph I
Sau3A I
识别
序列
和酶
切位
点
A．过程①所需的酶是逆转录酶和DNA 聚合酶
B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3A I 和Nco I
C．据图推测，目的基因S 转录的模板链最可能是b 链
D．SUC2 可作标记基因，对导入B 的酵母菌进行筛选
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、
启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不
一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、过程①是经RNA→DNA，该过程需要逆转录酶，此后由单链DNA 成为双链DNA，需要
DNA 聚合酶，A 正确；
B、②过程为对DNA 进行切割形成黏性末端，需要两种限制性内切酶，从黏性末端可看出是识别序列
分别为5'-GATC-3'、5'-CATG-3'，因此选用的两种酶分别是NheI、NcoI，B 正确；
C、结合质粒上限制酶酶切位点可知，目的基因的a 链位于重组质粒的内侧，b 链位于外侧，转录方向
为m→n，且转录只能从模板链的为3'端开始，因此a 链是模板链（3'→5'方向与m→n 相同），C 错误；
D、SUC2 是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利
用，SUC2 可作标记基因，培养基需以蔗糖为唯一碳源，对导入B 的酵母菌进行筛选，D 正确。
故选C。
5．（2024·四川内江·一模）如图表示利用新冠病毒包膜表面的S 蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2 是酵母
菌的蔗糖转化酶基因，其表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n 分
别是启动子和终止子。下表中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列
叙述错误的是（ ）
限制酶
BamHⅠ
NheⅠ
NcoⅠ
SphⅠ
Sau3AⅠ
识别序
列和酶
切位点
A．过程①所需的酶是逆转录酶和DNA 聚合酶
B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3AⅠ和NcoⅠ
C．据图推测，目的基因S 转录的模板链最可能是b 链
D．SUC2 可作标记基因，对导入B 的酵母菌进行筛选
【答案】C
【分析】转录、复制、翻译都是从模板链的3'端开始，因此新合成链的方向均为5'→3'。质粒作为基因
的载体，与目的基因形成重组质粒时，需要形成相同的黏性末端，才能重新组合。DNA 复制是从母链
的3'端开始，即引物的5'端，限制酶序列应加在新合成的基因的外侧，因此应在引物的5'端加入合适的
限制酶识别序列。
【详解】A、过程①表示RNA
DNA 双链的过程，其中需经过RNA
DNA 单链
DNA 双链，
所以过程①所需的酶是逆转录酶和DNA 聚合酶，A 正确；
B、②过程为对DNA 进行切割形成黏性末端，需要两种限制性核酸内切酶，从黏性末端可看出是识别
序列分别为5'-G↓GATCC-3'/5'-↓GATC-3'、5'-C↓CATGG-3'，因此选用的两种酶分别是NheI/Sau3A Ⅰ、
NcoI，B 正确；
C、结合质粒上限制酶酶切位点可知，目的基因的上链位于重组质粒的内侧，下链位于外侧，转录方向
为m→n，且转录只能从模板链的为3'端开始，因此上链（a 链）是模板链（3'→5'方向与m→n 相同），
C 错误；
D、SUC2 是酵母菌的蔗糖转化酶基因，SUC2 作为B 上的标记基因，可以对导入B 的酵母菌进行筛选，
D 正确。
故选C。
6．（2024·四川内江·一模）转Bt 基因抗虫棉可以有效杀死棉铃虫，其原理是Bt 基因表达的产物Bt 抗虫蛋
白能与棉铃虫肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，使细胞膜穿孔，导致棉铃虫死亡。下列相关叙述
错误的是（ ）
A．转Bt 基因抗虫棉的培育利用的原理是基因重组
B．Bt 基因在抗虫棉细胞中表达需要经过转录和翻译过程
C．培育转基因抗虫棉时，导入Bt 基因的受体细胞不能是棉花的叶肉细胞
D．若棉铃虫肠道上皮细胞表面特异性受体发生改变，可能会影响抗虫效果
【答案】C
【分析】基因工程操作的步骤为提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与表达。
【详解】A、转Bt 基因抗虫棉的培育利用的是转基因技术，原理是基因重组，A 正确；
B、基因的表达包括转录和翻译，因此Bt 基因在抗虫棉细胞中表达需要经过转录和翻译过程，B 正确；
C、植物的体细胞也具有全能性，因此培育转基因抗虫棉时，导入Bt 基因的受体细胞可以是棉花的叶
肉细胞，C 错误；
D、根据题意可知，Bt 基因表达的产物Bt 抗虫蛋白能与棉铃虫肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，
使细胞膜穿孔，导致棉铃虫死亡，因此若棉铃虫肠道上皮细胞表面特异性受体发生改变，可能会影响
抗虫效果，D 正确。
故选C。
7．（2024·四川内江·一模）转Bt 基因抗虫棉可以有效杀死棉铃虫，其原理是Bt 基因表达的产物Bt 抗虫蛋
白能与棉铃虫肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，使细胞膜穿孔，导致棉铃虫死亡。下列相关叙述
错误的是（ ）
A．转Bt 基因抗虫棉的培育利用的原理是基因重组
B．Bt 基因在抗虫棉细胞中表达需要经过转录和翻译过程
C．培育转基因抗虫棉时，导入Bt 基因的受体细胞不能是棉花的叶肉细胞
D．若棉铃虫肠道上皮细胞表面特异性受体发生改变，可能会影响抗虫效果
【答案】C
【分析】基因工程的工具是限制酶、DNA 连接酶和运载体；抗虫鉴定时用虫食用棉花，观察其存活情
况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性。
【详解】A、转Bt 基因抗虫棉的培育过程，利用的是转基因技术，其原理是基因重组，A 正确；
B、Bt 基因在抗虫棉细胞中表达需要经过Bt 基因
mRNA
Bt 抗虫蛋白的过程，B 正确；
C、培育转基因抗虫棉时，导入Bt 基因的受体细胞可以是棉花的叶肉细胞，C 错误；
D、若棉铃虫肠道上皮细胞表面特异性受体发生改变，则Bt 抗虫蛋白就不能与其结合，进而不会使细
胞膜穿孔，棉铃虫不会死亡，影响抗虫效果，D 正确。
故选C。
8．（2024·四川内江·一模）下列有关“DNA 的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．可以选择洋葱、香蕉、菜花或猪血等作为实验材料粗提取DNA
B．向处理后的滤液中加入体积相等的、预冷的酒精可使DNA 析出
C．利用DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同可使DNA 析出
D．与“检测生物组织中的还原糖”实验相比，二者均需要水浴加热
【答案】A
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是：
DNA
①
的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点
可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出，从而达到分离的目的；
DNA
②
不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA 进
一步分离；
DNA
③
对于酶、高温和洗涤剂的耐受性，蛋白酶能水解蛋白质，但是不能水解DNA，蛋白质不能耐受
较高温度，DNA 能耐受较高温度洗涤剂能瓦解细胞膜，但是对DNA 没有影响；
④在沸水浴的条件下DNA 遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，没有DNA，因此猪血不能作为提取DNA 的材料，A
错误；
B、DNA 不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA
进一步分离，因此向处理后的滤液中加入体积相等的、预冷的酒精可使 DNA 析出，B 正确；
C、当NaCl 溶液浓度低于0.14mol/L 时，随着NaCl 溶液浓度增加，DNA 的溶解度降低；当NaCl 溶液
浓度高于0.14mol/L 时，随着NaCl 溶液浓度增加，DNA 的溶解度升高，因此利用DNA 在不同浓度的
NaCl 溶液中溶解度不同可使DNA 析出，C 正确；
D、“检测生物组织中的还原糖” 实验需要水浴加热，而 “DNA 的粗提取与鉴定” 实验中鉴定
DNA 时需要水浴加热，二者均有需要水浴加热的步骤，D 正确。
故选A。
9．（2024·四川内江·一模）如图表示利用新冠病毒包膜表面的S 蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2 是酵母
菌的蔗糖转化酶基因，其表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n 分
别是启动子和终止子。下表中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列
叙述错误的是（ ）
限
制
酶
BamHⅠ
NheⅠ
NcoⅠ
SphⅠ
Sau3AⅠ
识
别
序
列
和
酶
切
位
点
5'-G↓GATCC-3'
5'-G↓CTAGC-3'
5'-C↓CATGG-3'
5'-GCATG↓C-3'
5'-↓GATC-3'
A．过程①所需的酶是逆转录酶和DNA 聚合酶
B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3AⅠ和NcoⅠ
C．据图推测，目的基因S 转录的模板链最可能是b 链
D．SUC2 可作标记基因，对导入B 的酵母菌进行筛选
【答案】C
【分析】转录、复制、翻译都是从模板链的3'端开始，因此新合成链的方向均为5'→3'。质粒作为基因
的载体，与目的基因形成重组质粒时，需要形成相同的黏性末端，才能重新组合。
【详解】A、过程①表示RNA→DNA，是逆转录，需要逆转录酶和DNA 聚合酶，A 正确；
B、②过程为对DNA 进行切割形成黏性末端，需要两种限制性内切酶，因目的基因的黏性末端序列分
别为5'-GATC-3'、3'-GATC-5'，然后结合表格中给出的限制酶的识别序列和酶切位点，确定选用的两种
酶分别是Sau3AⅠ、NcoI，B 正确；
C、结合质粒上限制酶的酶切位点可知，目的基因a 链位于图中重组质粒的内侧，b 链位于外侧；而转
录方向为m→n，为确保转录产物从5'→3'延伸，因此转录只能从模板链的为3'端开始，因此a 链是模板
链，C 错误；
D、SUC2 作为B 上的标记基因，可以对导入B 的酵母菌进行筛选，D 正确。
故选C。
10．（2024·四川泸州·一模）天然的T4 溶菌酶（A0）来源于T4 噬菌体，在食品防腐、医药工业等方面有
广泛应用，但热稳定性较差。为提高该酶的热稳定性，研究人员将T4 溶菌酶（A0）第3 位上的异亮
氨酸替换为半胱氨酸，该处的半胱氨酸可与第97 位半胱氨酸间形成二硫键，从而获得热稳定性高的
T4 溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（ ）
A．A1 热稳定性较A0 高的原因与氨基酸之间形成的化学键有关
B．根据A1 的氨基酸序列，就能准确推出相应的脱氧核苷酸序列
C．工业化生产中A0 的合成需经过基因的表达过程，A1 则直接合成
D．将A0、A1 分别与底物混合后，再置于相同的高温环境中以检测活性
【答案】A
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基
因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
【详解】A、研究人员将T4 溶菌酶（A0）第3 位上的异亮氨酸替换为半胱氨酸，使该处的半胱氨酸可
与第97 位半胱氨酸间形成二硫键，从而提高了热稳定性，所以A1 热稳定性较A0 高的原因与氨基酸
之间形成的化学键（二硫键）有关，A 正确；
B、由于密码子的简并性，根据A1 的氨基酸序列，不能准确推出相应的脱氧核苷酸序列，B 错误；
C、A0 和A1 都是蛋白质，在工业化生产中都需经过基因的表达过程合成，C 错误；
D、检测酶活性时，应先将酶和底物分别置于相同的高温环境中一段时间后再混合，若先混合再置于
高温环境中，在升温过程中酶就可能已经发挥作用了，D 错误。
故选A。
11．（2024·四川泸州·一模）GajA 酶存在于某些细菌中，与细菌防御病毒侵染有关。细菌中正常浓度的
ATP 会抑制GajA 酶的活性，病毒侵入后高强度的复制、转录会激活GajA 酶，激活的GajA 酶可对病
毒核酸进行切割，抑制病毒增殖。下列有关叙述错误的是（ ）
A．病毒入侵后激活的GajA 酶的空间结构会发生改变
B．病毒的入侵会显著升高细菌细胞中ATP/ADP 的值
C．GajA 酶被激活的原因可能是ATP 水解产物浓度增加
D．被激活的GajA 酶能破坏病毒核酸分子的磷酸二酯键
【答案】B
【分析】酶具有专一性，限制酶可识别特定序列，切割特定位点，分析题意可知，GajA 酶属于限制酶。
【详解】A、病毒入侵后， GajA 酶被激活，既由抑制状态变为激活状态，激活的GajA 酶的空间结
构会发生改变，A 正确；
B、病毒的入侵会导致ATP 消耗增多，会降低细菌细胞中 ATP/ADP 的值，即病毒的入侵会显著降低
细菌细胞中ATP/ADP 的值，B 错误；
C、依据题干信息，正常浓度的 ATP 会抑制 GajA 酶的活性，当高强度的转录消耗大量 ATP，ATP
水解产物浓度增加，激活 GajA 酶，即GajA 酶被激活的原因可能是ATP 水解产物浓度增加，C 正确；
D、依据题干信息，激活的 GajA 酶能对外来病毒的核酸进行切割，核苷酸之间通过磷酸二酯键进行
连接，故激活的 GajA 酶能破坏病毒核酸分子的磷酸二酯键，D 正确。
故选B。
12．（2024·四川巴中·一模）研究人员为寻求炎症性疾病的高敏感检测方法，以重组S100A8 蛋白作为免疫
抗原，制备了抗S100A8 蛋白的单克隆抗体。下图是重组S100A8 蛋白的制备过程，结合下表4 种相关
限制酶的识别序列和切割位点，可知切割质粒的限制酶为（ ）
（注：S100A8 蛋白是炎症反应时高度表达的一种蛋白质，可作为炎症性疾病诊断的重要标志物。）
HindⅢ
NcoⅠ
BglⅡ
XhoⅠ
5＇-A↓AGCTT-3＇
5＇-C↓CATGG-3＇
5＇-A↓GATCT-3＇
5＇-C↓TCGAG-3＇
A．Hind III 和NcoⅠ
B．BglⅡ和XhoⅠ
C．NcoⅠ和XhoⅠ
D．HindⅢ和BglⅡ
【答案】C
【分析】大多数限制酶的识别序列由6 个核苷酸组成，能够识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，
并且使每一条链特定部位的磷酸二酯键断开。
【详解】依据题干信息，S100A8 蛋白基因经切割后所产生的黏性末端为5'CATG3'、5'TCGA3'，依据
表格中限制酶的识别序列，可知，HindⅢ产生的黏性末端为5'AGCT3'，NcoⅠ产生的黏性末端为
5'CATG3'（与目的基因一端的粘性末端能碱基互补），BglⅡ产生的黏性末端为5'GATC3'，XhoⅠ产生
的黏性末端为5'TCGA3'（与目的基因另一端的粘性末端能碱基互补），为了确保目的基因和质粒的正
向连接，防止自身环化，故应选择两种能产生不同的黏性末端的限制酶，所以可选NcoⅠ和XhoⅠ进行
切割质粒，C 正确，ABD 错误。
故选C。
13．（2024·四川成都·一模）某环状DNA 分别用限制酶1 和限制酶2 完全切割后进行扩增产物的琼脂糖凝
胶电泳，结果如图所示（注：KB 表示千碱基对数，M 代表标准对照）。下列叙述错误的是（ ）
A．该DNA 总长度不可能为14KB
B．该DNA 上至少有两个酶1 的切割位点
C．该DNA 上至少有1 个酶2 的切割位点
D．同时用酶1 和酶2 切割该DNA，电泳结果至少呈现两条带
【答案】A
【分析】据图分析，这是一个环状DNA，用限制酶1 和限制酶2 完全切割后进行扩增产物的琼脂糖凝
胶电泳。电泳结果显示有7KB、6KB 和1KB 三种条带。限制酶1 切割后有6KB 和1KB 两种条带，限
制酶2 切割后有7KB 这一种条带。
【详解】A、限制酶2 切割后有7KB 这一种条带，若限制酶2 切割后有两条7KB，则DNA 总长度可
能为14KB，A 错误；
B、该DNA 是环状DNA，经限制酶1 切割后产生了两个条带，说明至少有两个切割位点，B 正确；
C、若环状DNA 总长度为最少7KB，限制酶2 切割后有7KB 这一种条带，则该DNA 上至少有1 个酶
2 的切割位点，C 正确；
D、限制酶1 切割后产生了6KB 和1KB 两个条带，若酶2 切割酶1 产生的6Kb 片段，产生1KB 和
5KB 的片段，则切割产物电泳后出现两个条带，D 正确。
故选A。
基因工程的应用
1．（2024·四川攀枝花·一模）In-Fusion 技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端
构建与线性化质粒末端相同的DNA 序列（即同源序列，通常为15-20bp），然后用In-Fusion 酶处理即
可实现无缝连接。它的操作步骤大致为：①质粒线性化；②PCR 扩增出两端含线性化质粒同源序列的
目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion 酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入
受体细胞。请回答下列问题：
(1)图示过程利用了PCR 技术，该技术需要一对特异性引物，引物是指 。PCR 扩增出大量两
端含线性化质粒同源序列的目的基因后，常采用 来鉴定产物。
(2)过程②经过 轮循环即可初步得到符合要求的目的基因片段。图中的同源序列1、2 中的碱
基序列一般不同，如果它们的碱基序列相同，则会导致 和 。
(3)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞，则目的基因导入受体细胞前需要用
Ca2+处理，其目的是 。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果，在含氨苄青霉素的液体培养基中
培养一段时间后，分别用 法和稀释涂布平板法进行计数，若计数结果分别是A、B，则致死
率= 。
【答案】(1) 一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 琼脂糖凝胶电泳
法
(2) 三 目的基因或线性化质粒自身环化 目的基因反向连接
(3) 使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 显微镜计数 （A-
B）/A×100%
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子
考点02
和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）图示过程利用了PCR 技术，该技术需要一对特异性引物，引物是指一小段能与DNA 母
链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在PCR 扩增出大量两端含线性化质粒同源序列的目的基因
后，常采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定产物，通过电泳可以根据DNA 片段的大小将其分离，从而判断是
否得到了预期大小的目的基因产物。
（2）根据DNA 的半保留复制的特点，可知PCR 前两轮循环产生的4 个DNA 分子的两条链均不等长，
第三轮循环产生的DNA 分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，至少经过3
轮循环可得到符合要求的目的基因片段。过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列
1、2 中的碱基序列一般不同，这样设计的好处是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因
的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达，如果它们的碱基序列相同，则会导致目的基因或
线性化质粒自身环化和目的基因反向连接。
（3）用Ca2+处理大肠杆菌的目的是使大肠杆菌细胞处于感受态，以便目的基因能够更容易地进入细
胞。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果，在含氮苄青霉素的液体培养基中培养一段时间后，分别用显
微镜直接计数法和稀释涂布平板法进行计数，若计数结果分别是A、B，则致死率=（A-B）/
A×100%。
2．（2024·四川眉山·一模）马铃薯在加工过程中，颜色会逐渐变成褐色，称为褐变。研究发现，多酚氧化
酶（PPO）是导致马铃薯褐变的关键因素，而StPOT32 基因是影响PPO 合成的重要基因。研究者利用
RNA 干扰技术和外源基因清除等技术获取符合转基因生物安全，且抗褐化能力强的转基因马铃薯。请
分析回答：
(1)导致马铃薯褐变的PPO，其合成需要经历相关基因的 阶段。
(2)研究发现，在dsRNA 干扰下，马铃薯褐变受到抑制，推测dsRNA 能 （选填“促进”或“抑
制”）StPOT32 基因的表达。为得到dsRNA，研究者以StPOT32 基因作为干涉靶点，使用StPOT32 基
因的片段StPPOi 与含有patatin 的P9286 质粒构建RNA 干扰载体，如图1 所示，StPPOi 上游的patatin
的作用是 。
(3)研究者使用PCR 技术验证RNA 干扰载体是否成功构建时，需要设计相关引物，请在图2 的4 个引
物中选出相关引物 （填图中序号）。
(4)为检验dsRNA 干扰效果，研究者对三组马铃薯块茎的PPO 活性进行检测，结果如图3 所示，其中
B 组所用的材料为 。
(5)研究者构建RNA 干扰载体所用的P9286 质粒中含有外源基因清除系统，并用冷诱导启动子驱动。
当该系统激活时，会清除两个融合识别位点LF 之间的序列，这样操作的意义是 。
【答案】(1)转录和翻译
(2) 抑制 能启动StPPOi 在马铃薯块茎中特异性表达
(3)②和③
(4)转入P9286 空载体的马铃薯
(5)可获取符合转基因生物安全的马铃薯，避免外源基因带来转基因食品安全隐患
【分析】1、基因工程：按照人们的意愿，把一种一种生物的某个基因提取出来，加以修饰，然后导
入到另外一种生物的细胞中，定向的改造生物的遗传性状。
2、基因工程操作的工具：
（1）基因的“剪刀”——限制酶：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的切点
上切割DNA 分子；
（2）基因的“针线”——DNA 连接酶：在具有相同黏性末端的DNA 分子之间形成磷酸二酯键，将
两个DNA 片段连接起来；
（3）基因的运载体：常用的有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
【详解】（1）多酚氧化酶（PPO）是蛋白质，合成过程需要经历基因的转录和翻译阶段。
（2）StPOT32 基因是影响PPO 合成的重要基因，多酚氧化酶（PPO）又是导致马铃薯褐变的关键因
素。褐变受到抑制，说明StPOT32 基因的表达受到抑制，所以dsRNA 应该抑制StPOT32 基因的表达。
图1 中注明patatin 是马铃薯块茎中特异性表达的启动子，说明patatin 能启动StPPOi 在马铃薯块茎中
特异性表达。
（3）构建成功的RNA 干扰载体应包含patatin 和StPPOi 序列。研究者使用PCR 技术验证RNA 干扰载
体是否成功构建时，设计的引物要能扩增出patatin 和StPPOi 序列，所以图2 中应选择引物②和③。
（4）图3 中转入RNA 干扰载体成功的马铃薯的PPO 酶活性低于非转基因马铃薯（野生型马铃薯），
还应排除P9286 质粒对PPO 酶活性的影响，保证dsRNA 干扰效果只与质粒中目的基因的表达有关，
所以B 组所用材料为转入P9286 空载体的马铃薯。
（5）冷诱导启动子驱动基因表达，会清除两个融合识别位点LF 之间的序列，即清除了导入马铃薯的
外源基因，可获取符合转基因生物安全的马铃薯，避免外源基因带来转基因食品安全隐患。
3．（2024·四川内江·一模）犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）感染引起的多种动物共患的高度接触
性传染病，具有高发病率、高死亡率的特点。F 蛋白是CDV 的一种表面膜蛋白，制备抗CDV 的F 蛋白
的单克隆抗体对CD 的检测与治疗具有重要意义，科研人员对其展开了相关研究，部分操作流程如下。
回答下列问题：
(1)F 蛋白抗原的制备：
①利用下列引物（引物中含酶切位点）扩增F 蛋白基因（基因长度771bp）
上游引物CDV-F-F：5'-CCGGAATTCATAGCTTTACATCAGTCAAA-3'
下游引物CDV-F-R：5'-CCGCTCGAGAGCACAATTTGCAACGATA-3'
此过程中引物的作用是 。
②利用pET-28a 质粒与扩增的F 蛋白基因构建基因表达载体。
结合上述信息，若构建基因表达载体时，目的基因和质粒均采用两种限制酶切割，则应该选择的限制
酶是 。
③将目的基因导入大肠杆菌，转化后的大肠杆菌应采用含有 的培养基进行筛选。若从该培养
基上分离出某大肠杆菌，提取其质粒，利用上述两种酶切割后进行电泳，其结果如图（M 为标准样
品），则说明该大肠杆菌导入的是 （填“目的基因未插入成功的”或“重组”）质粒。
④将成功导入重组质粒的大肠杆菌进行超声裂解，对裂解后的菌液进行离心、纯化，获得CDV 重组F
蛋白。
(2)抗CDV 的F 蛋白的单克隆抗体制备，其流程如图所示：
①取已免疫小鼠的脾脏组织剪碎，用 处理后，加入培养液可制成B 淋巴细胞悬液。诱导B 淋
巴细胞与骨髓瘤细胞融合常用的化学试剂是 ，该过程依据的原理是 。
②经HAT 培养基筛选的杂交瘤细胞，通过96 孔板克隆化培养，可利用 技术检测并筛选出特
异性杂交瘤细胞，注入到小鼠腹腔内增殖，待小鼠腹腔臌胀时收集腹水，离心、纯化获取大量抗CDV
的F 蛋白的单克隆抗体。
(3)结合以上信息，请尝试给“单克隆抗体”下定义。即单克隆抗体是指 。
【答案】(1) 使DNA 聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 EcoRI、XhoⅠ 卡那霉
素 重组
(2) 胰蛋白酶或胶原蛋白酶 聚乙二醇 细胞膜具有一定的流动性 抗原-抗体杂交
(3)由单一杂交瘤细胞克隆产生的只识别一种抗原的特异性抗体
【分析】基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和
目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）①由于DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3'端开始连接脱氧核苷酸延伸
DNA 链，因此PCR 中需要加入合适的引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3'端结合。
②据题干图分析可知，在构建基因表达载体时，需要选择适当的限制酶来切割目的基因和质粒。根据
题目中给出的引物序列，可以观察到上游引物含有EcoRI 的酶切位点（GAATTC），而下游引物含有
XhoI 的酶切位点（CTCGAG）。因此，为了构建基因表达载体，应该选择EcoRI 和XhoI 这两种限制
酶来切割目的基因和质粒。
③将目的基因导入大肠杆菌后，为了筛选出成功导入目的基因的大肠杆菌，应采用含有卡那霉素的培
养基进行筛选。卡那霉素是一种抗生素，能够杀死未导入质粒或导入的质粒不含卡那霉素抗性基因的
大肠杆菌。若从该培养基上分离出某大肠杆菌，并提取其质粒，利用上述两种酶切割后进行电泳，观
察到与标准样品M 相同的电泳条带，则说明该大肠杆菌导入的是重组质粒，即目的基因已成功插入质
粒中。
（2）①在制备抗CDV 的F 蛋白的单克隆抗体的过程中，首先需要从小鼠的脾脏组织中获取B 淋巴细
胞。为此，需要将脾脏组织剪碎并用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，以分散细胞并去除细胞间的连接物
质。然后加入培养液制成B 淋巴细胞悬液。诱导B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合常用的化学试剂是聚乙
二醇（PEG）。该过程依据的原理是细胞膜具有一定的流动性，当两种细胞在适当的条件下接触时，
它们的细胞膜可以发生融合形成一个杂交瘤细胞。
②经HAT 培养基筛选的杂交瘤细胞需要通过96 孔板克隆化培养进一步筛选。为了检测并筛选出特异
性杂交瘤细胞，可以利用抗原-抗体杂交技术。该技术利用抗原与抗体之间的特异性结合来检测杂交瘤
细胞是否产生了针对CDV 的F 蛋白的特异性抗体。将筛选出的特异性杂交瘤细胞注入到小鼠腹腔内
增殖，待小鼠腹腔臌胀时收集腹水，离心、纯化获取大量抗CDV 的F 蛋白的单克隆抗体。
（3）结合以上信息分析可知，单克隆抗体是指由单一杂交瘤细胞克隆产生的只识别一种抗原的特异
性抗体。
4．（2024·四川内江·一模）黄芩素（BAI）目前被证实是具有低毒性、高效性的潜在的安全抗肿瘤药物之
一。MicroR-NA-7-5p（某微小RNA，简写为miR-7）被认为是肿瘤抑制因子，在胃癌、肝癌等癌症中
表达下调。研究发现，BAI 可能通过调控miR-7 来对人胃癌细胞自噬产生影响。回答下列问题：
(1)为探究BAI 通过miR-7 来调控人胃癌细胞自噬可能的机制，研究人员先将人胃癌细胞悬液均分为两
组，一组作对照，另一组用适宜浓度的BAI 处理，然后置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2
恒温培养箱中培养，从细胞中提取总RNA，经有关酶处理后，利用PCR 技术实时定量荧光检测miR-7
相对表达量，结果如图1.
①混合气体中CO2的主要作用是 ，上述“有关酶”是指 。
②分析实验结果，可得出的结论是适宜浓度的BAI 。
(2)有研究表明，BAI 通过调控miR-7 表达量对人胃癌细胞自噬的影响，可能与PI3K/AKT/mTOR 信号
通路相关，该通路最终可通过激活mTOR 来抑制细胞自噬的发生，而PI3K、AKT、mTOR 三种蛋白
质需通过磷酸化被激活。在上述实验的基础上，研究人员又将人胃癌细胞分为对照组、miR-7 组
（miR-7 表达增强组）及BAI 组进行了实验，并测得其PI3K、AKT、mTOR 蛋白的磷酸化水平，结果
如图2.
①结合图2 实验结果可知：BAI 是通过 ，进而促进细胞自噬。
②激烈的细胞自噬会引起细胞凋亡而抑制肿瘤细胞的增殖。但有人认为，细胞自噬可能会促进肿瘤细
胞的生长，请结合所学知识，简述该观点的合理性： 。
(3)综上分析，BAI 抗肿瘤的机制可能是 。
【答案】(1) 维持培养液的pH 逆转录酶、DNA 聚合酶 促进人胃癌细胞的miR-7 表达
(2) 促进miR-7 表达，降低PI3K、AKT、mTOR 蛋白的磷酸化水平，使mTOR 的激活受阻
肿瘤细胞可通过细胞自噬获得生长所需的物质和能量
(3)BAI 通过促进miR-7 表达，抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，进而促进细胞自噬来抑制癌细胞的增殖
【分析】细胞自噬是细胞在基因的调控下通过降解自身结构或物质，使细胞存活的自我保护机制，对
更新某些细胞器、保障细胞代谢、维持细胞稳态有重要作用。
【详解】（1）①动物细胞培养需要满足以下条件：①无菌、无毒的环境；②营养；③温度：36.5℃
±0.5℃；④气体环境：95%空气+5%CO2，其中CO2的主要作用是维持培养液的pH。PCR 是扩增DNA
的一项技术，从细胞内提取的总mRNA 需要在逆转录酶的作用下形成DNA，再通过DNA 聚合酶进行
DNA 扩增，因此上述“有关酶”是指逆转录酶、DNA 聚合酶。
②根据图1 可知，BAI 组的miR-7 相对表达量明显高于对照组，因此可说明适宜浓度的BAI 能促进人
胃癌细胞的miR-7 表达。
（2）①研究发现，BAI 可能通过调控miR-7 来对人胃癌细胞自噬产生影响。由图2 可知，与对照组相
比，BAI 组PI3K、AKT、mTOR 蛋白的磷酸化水平明显降低，而miR-7 表达增强组的PI3K、AKT、
mTOR 蛋白的磷酸化水平高于BAI 组，但低于对照组，因此可说明BAI 是通过促进miR-7 表达，降低
PI3K、AKT、mTOR 蛋白的磷酸化水平，使mTOR 的激活受阻，进而促进细胞自噬。
②处于营养缺乏条件下的细胞，通过细胞自噬可以获得维持生存所需的物质和能量，由于肿瘤细胞可
通过细胞自噬获得生长所需的物质和能量，故细胞自噬可能会促进肿瘤细胞的生长。
（3）根据题意可知，有研究表明，BAI 通过调控miR-7 表达量对人胃癌细胞自噬的影响，可能与
PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关，该通路最终可通过激活mTOR 来抑制细胞自噬的发生，而PI3K、
AKT、mTOR 三种蛋白质需通过磷酸化被激活。结合图2 可知，BAI 抗肿瘤的机制可能是BAI 通过促
进miR-7 表达，降低PI3K、AKT、mTOR 蛋白的磷酸化水平，进而抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，从而
促进细胞自噬来抑制癌细胞的增殖。
5．（2024·四川泸州·一模）基因编辑技术可实现对特定DNA 片段的敲除、加入等。新一代基因编辑技术
CRISPR Cas9 用特殊的引导序列sgRNA 将基因剪刀-Cas9 酶精准定位到所需修饰的基因上进行编辑，如
图1。水稻的OsSWEET11 基因（位于11 号染色体上）是被白叶枯病菌广泛利用的感病基因，利用
CRISPR Cas9 技术可实现对水稻OsSWEET11 基因的“敲除”，培育出抗白叶枯病菌的优良植株。图2
是利用农杆Ti 质粒构建的表达载体。
请分析回答：
(1)由图1 可知，Cas9-sgRNA 复合体相当于基因工程中的 酶，根据靶序列设计的sgRNA 中相应
序列是5＇-ACG······UCG-3＇，可知Cas9-sgRN 复合体切割的靶序列是5＇- -3＇。
(2)操作过程中需将图2 的表达载体导入农杆菌，该表达载体中的目的基因是 。让已含表达载
体的农杆菌感染野生型水稻愈伤组织，可实现对愈伤组织细胞中OsSWEET11 基因的“敲除”，表达
载体中潮霉素抗性基因作为标记基因，其作用是 。
(3)将转基因的愈伤组织进行培养，获得甲、乙、丙植株，在个体水平上对甲、乙、丙进行抗白叶枯病
菌的鉴定，方法是 。如果显示甲植株感病，乙植株不感病，丙植株感病程度介于两者之间，
从基因剪刀-Cas9 酶对细胞目的基因“敲除”的数量考虑，猜测丙植株感病情况的原因是： 。
【答案】(1) 限制 GCT......GCA
(2) Cas9 - sgRNA 复合体对应的基因 筛选出导入表达载体的愈伤组织细胞
(3) 用白叶枯病菌感染甲、乙、丙植株，观察它们的发病情况 丙植株的部分细胞中的
OsSWEET11 基因被Cas9 酶敲除，而还有部分细胞中的该基因未被敲除。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：现在常用PCR 技术扩增获取目的基因，
此外还可以从基因文库中或通过人工合成获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，
基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据
受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）由题意可知，利用CRISPR/Cas9 技术可实现对水稻OsSWEET11 基因进行“敲除”，
即Cas9-gRNA 相当于基因工程中使用的限制酶，其作用是识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并
且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。设计gRNA 时，根据靶序列按碱基互补配对原则进行设
计，已知sgRNA 中相应序列是5＇-ACG······UCG-3＇，可知Cas9-sgRN 复合体切割的靶序列是5＇-
GCT......GCA-3＇。
（2）操作过程中需将图2 的表达载体导入农杆菌，该表达载体中的目的基因是Cas9 - sgRNA 复合体
对应的基因，让已含表达载体的农杆菌感染野生型水稻愈伤组织，可实现对愈伤组织细胞中
OsSWEET11 基因的“敲除”，表达载体中潮霉素抗性基因作为标记基因，检测目的基因是否正常表
达，以筛选出转入表达载体的愈伤组织。
（3）将转基因操作后的愈伤组织进行培养，获得甲、乙、丙三棵植株，在个体生物学水平上对这三
棵植株进行抗白叶枯病菌的鉴定，即进行个体生物学鉴定，用适量的白叶枯病菌同时去侵染三棵植株，
观察感病情况，结果显示甲植株感病，乙植株不感病，丙植株感病程度介于两者之间，从CRISPR/
Cas9 基因编辑技术对细胞目的基因“敲除”的数量角度考虑，上述结果说明，甲植株的OsSWEET11
基因被全部定点敲除，乙植株的OsSWEET11 基因未实现定点敲除，而丙植株的感病情况说明其中的
OsSWEET11 基因被切除了一个，相当于是杂合子即丙植株的部分细胞中的OsSWEET11 基因被Cas9
酶敲除，而还有部分细胞中的该基因未被敲除。
6．（2024·四川成都·一模）研究发现，蛋白酶抑制剂（一种蛋白质）可抑制害虫胰蛋白酶活性，从而使害
虫不能正常消化食物以达到抗虫的目的，因此蛋白酶抑制剂基因转化方式成为作物抗虫育种的新途径。
某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）基因转入棉花，获得了转基因棉花植株，其部分操作流程如下
图所示。已知EcoR I 和BamH I 是两种限制酶。回答下列问题：
(1)利用PCR 技术扩增NaPI 基因时，要添加 酶，该酶需要在反应的缓冲液中添加 （填一种
无机盐离子）来激活。
(2)基因工程的核心步骤是该图中的 （填序号）。利用农杆菌转化法时需要将NaPI 基因插入到Ti
质粒的T-DNA 上，原因是 。
(3)在分子水平上，研究团队可用 （写出1 种即可）技术检测NaPI 基因在棉花愈伤组织细胞中的
整合，然后经过基因表达的检测，筛选出能合成胰蛋白酶抑制剂的棉花细胞，再通过 技术，即
可得到转基因抗虫植株。
(4)研究发现，胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）也能起到抗虫的效果。研究团队做了相关实验（“对
照”指的是非转基因棉花），得到如下图所示的实验结果：
据图分析，研究团队的实验思路是：将NaPI 基因和StPinlA 基因 ，然后检测虫体质量及每株棉
铃数。根据实验结果，若想要得到抗虫效果最佳的转基因棉花，你的建议是 。
【答案】(1) 耐高温的DNA 聚合酶 Mg2+
(2)
T-DNA
②
会转移并整合到受体细胞的染色体DNA 上
(3) PCR 植物组织培养
(4) 单独或同时导入棉花 将NaPI 基因和StPinlA 基因同时导入棉花
【分析】由图可知，①②③分别表示PCR 扩增目的基因，构建基因表达载体、将目的基因导入受体细
胞。
【详解】（1）PCR 过程中，镁离子可以激活耐高温的DNA 聚合酶，故需要在缓冲液中加入Mg2+。
（2）基因工程的核心步骤是②构建基因表达载体。棉花细胞通过植物组织培养可得到转基因植株。
（3）根据曲线图和柱形图可知，四组的变量是导入不同基因的转基因棉花，即将NaPI 基因和StPinlA
基因单独或同时导入棉花，然后检测冲个体质量及每株棉铃数，研究发现，同时导入NaPI 基因和
StPinlA 基因的转基因棉花，抗虫效果最佳，且每株棉铃数最多，故应该将NaPI 基因和StPinlA 基因
同时导入棉花，获得转基因棉花。
7．（2024·四川德阳·一模）切块后的马铃薯暴露在空气中易发生酶促褐变，引起色泽，风味，质构等变化，
降低营养价值，甚至存在安全隐患。多酚氧化酶是引起马铃薯酶促褐变的主要酶。研究人员利用
CRISPR/Cas9 基因编辑技术获得多酚氧化酶基因敲除的转基因马铃薯植株。分析回答：
(1)根据图1 分析可知，Cas9 蛋白与SgRNA 形成的复合体的功能相当于基因工程中 酶的功能。
(2)基因敲除表达载体PKSE402 中35SP 是启动子，eGFP 基因编码绿色荧光蛋白，推测eGFP 基因在图
1 中的作用是 。
(3)在实际生产中，多酚氧化酶基因敲除的马铃薯长期无性繁殖后，很容易感染pvx 病毒并将病毒传给
后代，导致作物产量降低，品质变差。请你利用植物细胞具有全能性的原理解决这一问题：
。
(4)进一步研究发现，MAP30 蛋白具有抗pvx 病毒功能，为培育高效表达该基因的马铃薯新品种，科
研团队利用农杆菌转化法将MAP30 基因导入马铃薯细胞内，如图2 所示：
选择Ti 质粒作载体的原因是 ，构建基因表达载体时应选择 识别并切割质粒。从分子水平
上，检测转基因马铃薯是否具有抗病毒的特性，可用 的方法。
【答案】(1)限制
(2)便于目的基因的鉴定和筛选
(3)植物顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒。因此，切取一定大小的茎尖进行组织培
养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。
(4) Ti 质粒上的T-DNA 可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上 XbaI
和HindIII 抗原-抗体杂交
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子
和标记基因等，标记基因可便于重组DNA 分子的筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细
胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基
因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因或检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR 技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-
抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据图1 分析可知，Cas9 蛋白与SgRNA 形成的复合体可以识别并切割DNA，相当于
基因工程中限制酶的功能。
（2）eGFP 基因编码绿色荧光蛋白，可以作为标记基因，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）马铃薯、草莓和香蕉等通常是用无性繁殖的方式进行繁殖的，它们感染的病毒很容易传给后代。
病毒在作物体内逐年积累，就会导致作物产量降低，品质变差。植物顶端分生区附近（如茎尖）的病
毒极少，甚至无病毒。因此，切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从
而获得脱毒苗。
（4）利用农杆菌转化法可以将目的基因导入马铃薯细胞内，农杆菌中含有Ti 质粒，在Ti 质粒中含有
T-DNA，即可转移的DNA，选择Ti 质粒做载体可以将目的基因插到T-DNA 中，Ti 质粒上的T-DNA
可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上。构建基因表达载体时需要将目的基因插
到Ti 质粒的T-DNA 中，为避免目的基因与质粒的反向拼接，同时为了避免破坏目的基因并将其插入
启动子和终止子之间，应选择XbaI 和HindIII 两种限制酶，再用DNA 连接酶连接。检测转基因马铃薯
是否具有抗病毒的特性，从分子水平上，可用抗原-抗体杂交的方法检测转基因马铃薯是否表达出
MAP30 蛋白。
8．（2024·四川绵阳·一模）某科研团队为建立具有红色荧光的转基因小鼠，将红色荧光基因R（左图）插
入表达载体（右图）中，构建基因表达载体。已知图中R 基因的转录方向为从左到右，几种限制酶的
识别序列和切割位点见下表。回答下列问题。
限制酶
BamHI
MfeI
EcoRI
HindⅢ
识别序列和切割位点
G↓GATCC
C↓AATTG
G↓AATTC
A↓AGCTT
(1)使用限制酶 切割含R 基因的DNA 片段，使用限制酶 切割图中的质粒，再用
酶连接成重组质粒。
(2)已知R 基因转录形成的mRNA 序列为5’—UGAACGCUA．.....（中间序列）…..GUCGACUCG—
3’，请写出R 基因进行PCR 扩增时所用的2 种引物序列 、 。（各写出
6 个碱基序列即可）
(3)利用PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA 复制类似（如图所示）。第 轮循环产物
中开始出现目的基因两条脱氧核苷酸链等长的DNA 片段，第4 轮循环后，产物中目的基因两条脱氧
核苷酸链等长的DNA 片段有 个。
(4)科研团队继续研究得到了蓝色荧光转基因小鼠。现将一只红色荧光转基因雌性小鼠（导入1 个R 基
因，未导入的用r 表示）与一只蓝色荧光转基因雄性小鼠（导入1 个B 基因，未导入的用b 表示）作
亲本杂交获得F1，取F1中表型为红蓝荧光的雌、雄小鼠杂交得F2，统计F2表型及比例是红蓝荧光雌性：
红蓝荧光雄性：红色荧光雌性：红色荧光雄性：蓝色荧光雄性：无荧光雄性=6:3:2:1:3:1。据此分析，
控制红色荧光和控制蓝色荧光的基因 （填“是”或“否”）遵循基因自由组合定律，母本的
基因型是 。
【答案】(1) EcoRI、HindⅢ MfeⅠ、HindⅢ DNA 连接
(2) 5′-TGAACG-3′ 5′-CGAGTC-3′
(3) 3 8
(4) 是 bbXRXr
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技
术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基
因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方
法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）BamHⅠ会破坏启动子，EcoRⅠ不在启动子和终止子之间，因此应该选择限制酶MfeⅠ、
HindⅢ切割质粒。若使用MfeⅠ切割含R 基因的DNA 片段，则会破坏目的基因，MfeⅠ的识别序列和
EcoRI 相同，故应选用EcoRI、HindⅢ切割含R 基因的DNA 片段，再用DNA 连接酶连接成重组质粒。
（2）已知mRNA 的序列为5′-UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3′，则CDNA 的序列为
5′-CGAGTCGAC…（中间序列）…TAGCGTTCA-3′，互补链序列为5′-TGAACGCTA…（中间序
列）…GTCGACTCG-3′。由于引物是根据目的基因两端的碱基序列设计的，且引物的延伸方向是5′端
→3′端，所以PCR 扩增时所需一对引物的碱基序列5′-TGAACG-3′、5′-CGAGTC-3′。
（3）由图示可知，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环
产生的四个DNA 分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA 分子存在等长的两条核苷酸链，如
分析中的图示。由于第三轮出现两个等长的DNA，经过第四次复制产生4 个等长的DNA，另外有四
个DNA 通过第四次复制也会分别一个等长的DNA，即总共8 个。
（4）由题意可知，F1中同时表现红蓝荧光的雌、雄小鼠杂交得F2，F2中红蓝荧光雌性：红蓝荧光雄
性：红色荧光雌性：红色荧光雄性：蓝色荧光雄性：无荧光雄性=6：2：3：1：3：1，比例为9：3：
3：1 的变形，因此红色荧光和蓝色荧光基因遵循基因的自由组合定律，且F2中红色荧光雌性占2/16
（1/8），红色荧光雄性占1/16，说明红色荧光在雌雄中的表现不同，说明红色荧光基因位于X 染色体
上，则蓝色荧光基因位于常染色体上，F1红蓝荧光的雌、雄小鼠的基因型分别为BbXRXr、BbXRY，母
本（红色荧光）的基因型是bbXRXr。
9．（2024·四川巴中·一模）巢式聚合酶链式反应（Nested PCR）属于普通PCR 的衍生技术，相较于普通
PCR，巢式PCR 能有效提高产物中目的基因的比例，增加PCR 的灵敏度和特异性。巢式PCR 通常包括
两个连续的扩增反应，每个反应使用不同的一对引物。第一次PCR 用一对外引物进行扩增，其产物会
被用作第二次PCR 的模板，第二次PCR 由一对内引物（结合位点位于外引物对结合点的内部）扩增目
的基因，过程如下图所示。
(1)巢式PCR 反应体系所需的试剂如下，请补齐空白处：
PCR 反应缓冲液（含有MgCl2）
dNTP 混合液（所有四种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP、dGTP）
引物：内引物1，内引物2，外引物1，外引物2
模板 DNA
H2O
其中 PCR 反应缓冲液中Mg2+的作用是 ，相比直接使用4 种脱氧核苷酸，在反应体系中加入
dNTP 的优势有 。
(2)与普通PCR 相比巢式PCR 中设计的引物只是在模板DNA 的结合位置有所差异。进行巢式PCR 前，
根据已知的模板DNA 序列，可设计合成内外引物对，引物设计的要求有 （答出两点即可）；
同时，为方便扩增产物后续的操作，可在引物的 （填“5＇端”或“3＇端”）添加限制性内切
核酸酶位点。
(3)将题（1）中试剂按顺序加入扩增离心管中，按下表参数在PCR 仪中进行扩增：
周期数
变性
复性
延伸
1-30
94℃下30s
50℃下30s
72℃下2.5min
在扩增后对PCR 的产物进行电泳鉴定时发现出现较多的非特异性条带，此时可适当 （填“提
高”或“降低”）复性温度来减少非特异性条带，原因是 。
(4)巢式PCR 可大大提高扩增特异性的原因是 。
【答案】(1) DNA 聚合酶 激活DNA 聚合酶 既可以提供能量，也可以提供原料
(2) 能与DNA 母链碱基互补配对；两种引物之间不能构成碱基互补配对；引物的5'端应具有限制
酶酶切位点 5'
(3) 提高 可以降低非特异性序列与引物之间的杂交效率
(4)巢式PCR 通过两轮PCR 反应，使用两套引物扩增特异性的DNA 片段
【分析】PCR 技术：
①概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术；
②原理：DNA 复制；
③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）；
④方式：以指数的方式扩增，即约2n；
⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸
【详解】（1）依据PCR 反应体系的要求，应具有解旋酶（可用高温替代），模板链，4 种脱氧核苷
酸，DNA 聚合酶，引物等，故①应表示耐高温的DNA 聚合酶，其中Mg2+的作用为激活耐高温的
DNA 聚合酶，相比直接使用4 种脱氧核苷酸，在反应体系中加入dNTP 的优势有在高温条件下会分
dNTP 水解，高能磷酸键断裂，为化学反应（PCR）的进行提供能量，其水解后的产物（脱氧核苷
酸）还可以作用原料。
（2）引物设计的要求是：①能与DNA 母链碱基互补配对；②两种引物之间不能构成碱基互补配对；
③引物的5'端应该有限制酶酶切位点等。所以，为方便扩增产物后续的操作，可在引物的5'端添加限
制酶酶切位点。
（3）若在扩增后对PCR 的产物进行电泳鉴定时发现出现较多的非特异性条带，可适当提高复性温度
来减少该现象，其原因是复性温度的提高可以降低非特异性序列与引物之间的杂交效率。
（4）巢式PCR 通过两轮PCR 反应，使用两套引物扩增特异性的DNA 片段，第二对引物的功能是特
异性的扩增位于首轮PCR 产物内的一段DNA 片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产
物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，也使获得的产物特异性更高。
10．（2024·四川遂宁·一模）老米酒具有悠久的历史，以营养丰富、保健养生而著称。回答下列问题：
老米酒中的原儿茶酸（PCA）具有良好抗菌、抗氧化、抗炎症等作用。生成PCA 的关键酶是烯酰辅酶
A 水合酶（ECH）。为进一步研究 ECH 的结构，研究人员拟将 Ech 基因载入原核高效表达载体，
并将重组质粒转化到大肠杆菌细胞内进行表达，以获得大量的ECH 蛋白。
(1)图1 所示的引物1—4 中，利用PCR 获得 Ech 基因时应选择的两种引物是 。引物核苷酸序列
不宜过短，其原因是 。
(2)Ech 基因和表达载体的限制酶切位点如图1、图2 所示，相关限制酶的识别序列见下表。为使 Ech
基因与载体连接并正确表达，在设计PCR 引物时需在①所选两种引物的5'端分别增加限制酶
（与①中所选的引物顺序一致）的酶切位点相应序列。与单酶切相比，采用双酶切的优点有 。
EcoRⅠ
EcoRⅤ
MboⅠ
NotⅠ
HindⅢ
SacⅠ
5′-
G↓AATTC-3′
3′-
CTTA↑AG-5′
5′-
GAT↓ATC-3′
3′-
CTA↑TAG-5′
5′-
GA↓TC-3′
3′-
CT↑AG-5′
5′-
GC↓GGCCG-3′
3′-
CGCCGG↑CG-5
′
5′-
A↓AGCTT-3′
3′-
TTCGA↑A-5′
5′-
GAG↓CTC-3′
3′-
CTC↑GAG-5′
(3)在 PCR 扩增目的基因的过程中，假设一共进行了n 次循环，含其中一种引物的DNA 分子是
个。
(4)构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
(5)可将转化后的大肠杆菌接种到含 的固体培养基上进行筛选。除选择培养基外，可用于检测转
基因是否成功的生物技术还有 （答出2 种即可）。
【答案】(1) 引物2 和引物3 引物过短，则会导致引物特异性太差，出现非特异性扩增，非
目标产物增多
(2) EcoRI 和HindⅢ 可防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
(3)2n-1
(4)④
(5) 氨苄青霉素、卡那霉素 PCR、抗原一抗体杂交、核酸分子杂交
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技
术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基
因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方
法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）引物需要与模板的3'端结合，利用PCR 获得 Ech 基因时应选择的两种引物是引物2 和
引物3；引物过短，则会导致引物特异性太差，出现非特异性扩增，非目标产物增多，故引物核苷酸
序列不宜过短。
（2）据图可知，基因表达载体上有五种限制酶切位点，其中EcoRⅤ和MboⅠ都会破坏Ech 基因，同
时为了Ech 基因与载体连接并正确表达，因此应选择两种限制酶，而SacⅠ在表达载体上有两个酶切位
点，则只能使用EcoRI 和HindⅢ两种限制酶去切割Ech 基因和表达载体，目的基因上不含有这两种限
制酶切位点，则需要在引物上添加限制酶的识别序列，根据启动子到终止子的方向则引物3 上添加
EcoRⅠ限制酶的识别序列，引物2 上添加HindⅢ限制酶的识别序列；双酶切可防止目的基因和质粒的
自身环化以及目的基因与质粒反向连接，因此双酶切更具优势。
（3）由于PCR 扩增DNA 片段过程经过n 次扩增，形成的DNA 分子数是2n个，单链数为2n+1条，其
中最初两条母链所在的DNA 都只有一种引物，只有2 条单链不含有引物，所以循环n 次，含其中一种
引物的DNA 分子是2n-1 个。
（4）④DNA 连接酶是可以催化DNA 形成磷酸二酯键，而磷酸二酯键是在3'的羟基和5'的磷酸的之间
形成的，因此属于DNA 连接酶底物的是④。
（5）根据表达载体上含有抗氮苄青霉素基因和抗卡那霉素基因这两种标记基因，则应在固体培养基
上添加氮苄青霉素、卡那霉素进行筛选转化后的大肠杆菌，但筛选出的大肠杆菌不一定就含有Ech 基
因，因为含抗生素基因的未重组载体也可转化大肠杆菌，使大肠杆菌在选择培养基上正常生存；检测
目的基因是否成功导入受体细胞并成功表达，可采用PCR 技术、抗原—抗体杂交技术和核酸分子杂交
技术。
11．（2024·四川巴中·一模）我国培育的多年生稻入选《科学》“2022 年度十大科学突破”，多年生稻通
过地下茎无性繁殖，种一次每年能收两季，连续收获四年产量不减，既可以避免年年制种又可以减少
劳动强度。其品种之一“云大107”聚集多年生、稻穗优良等性状，培育过程如图所示：
请回答下列问题：
(1)已知乙、丁的一年生性状是多年生野生稻甲的突变体，多年生对一年生为 （填“显性”、
“隐性”），据图分析乙、丁的一年生性状是否为甲的同一基因突变产生？ ，你作出判断的
依据是 。
(2)稻穗优良性状由D/d、E/e、F/f 基因调控，且三种显性基因同时存在时稻穗性状优良，可达到水稻
高产效应，其中丙的基因型为ddeeff。图中戊与丁首次回交得到的子代中纯合个体所占比例为
，图中最后将选择的多年生稻穗优良栽培新品种进行自交的目的是 。
(3)育种工作者克隆出导致乙一年生性状产生的基因，与多年生基因相比，它在DNA 序列上有一个碱
基对改变，导致突变基因内部出现了一个原基因没有的限制酶X 的酶切位点。据此，检测丙基因型的
实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→ →电泳。丙中杂合子电泳条带数目应
为 条。
【答案】(1) 显性 否 若乙、丁的一年生性状为甲的同一基因突变产生，则丙与丁杂交，
后代会出现一年生性状
(2) 1/8 得到能够稳定遗传的多年生稻穗优良栽培新品种
(3) 限制酶X 处理 3
【分析】1、基因突变是DNA 分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。
2、 电泳的原理是根据DNA 的长度不一，将DNA 进行以条带的形式区分开来。
【详解】（1）根据图中一对相对性状的多年生纯合体甲与一年生纯合体乙杂交，子代全为多年生稻，
可判断多年生对一年生为显性。
据图分析乙、丁的一年生性状不是甲的同一基因突变产生，因为若乙、丁的一年生性状为甲的同一基
因突变产生，则丙与丁杂交，后代会出现一年生性状，而实际的结果是全为多年生性状。
（2）丙的基因型为ddeeff，丁为稻穗优良纯合体，基因型为DDEEFF，两者的子代戊基因型为
DdEeFf，戊与丁首次回交得到的子代中纯合个体（DDEEFF）所占比例为1/2 × 1/2 × 1/2=1/8，图中最
后将选择的多年生稻穗优良栽培新品种进行自交的目的是得到能够稳定遗传的多年生稻穗优良栽培新
品种。
（3）检测丙基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→限制酶X 处理→电泳。
丙中杂合子多年生基因一条带，一年生基因因出现一个限制酶X 的酶切位点会出现2 条带，因此一共
出现电泳条带数目应为3 条。
12．（2024·四川·一模）人们所需要的大部分核酸的碱基对数量远远超过DNA 合成仪可以合成的最长核酸
链的碱基对数量，而这种大片段基因的人工合成则可以利用重叠延伸PCR 的方法（合成过程如图所
示）。据图分析回答下列问题。
(1)利用重叠延伸PCR 人工合成大片段基因，首先需要设计n 条单链寡核苷酸片段作为引物（如图中
P1~P15），合成这些引物的前提是已知 。根据图示分析，相邻近的每2 条引物之间均有15~25bp
的序列 ，若第1 轮循环需要加入引物P6~P9，请在下图中标注出每个引物的位置 。
(2)第1 轮循环 （填“需要”或“不需要”）添加模板；第2 轮循环选择Px 和Py 分别对应引物
。图示多轮循环 （填“能”或“不能”）在同一个PCR 体系中完成，原因是 。
(3)利用重叠延伸PCR 人工合成大片段基因相对于普通PCR 还需要用到 酶；结合上述内容分析
利用该技术合成基因的优势有 。
【答案】(1) 一段目的基因的核苷酸序列 重叠
(2) 需要 P7、P4 不能 引物之间存在重叠区域，在同一个PCR 体系中引物之间会
因为发生碱基互补配对而无法完成PCR 扩增
(3) DNA 连接酶 利用该技术合成基因的优势是可以实现基因的定点突变、定点敲除
【分析】PCR 原理：在高温作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷
酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向
是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。
【详解】（1）
PCR 过程中需要 有一对引物，引物设计的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列；根据图示分析，
相邻近的每2 条引物之间均有15~25bp 的序列存在重叠区域；若第1 轮循环需要加入引物P6~P9，结合
图示可知， 引物的位置可标注如下：
。
（2）PCR 扩增时需要模板，故第一轮循环也需要加入模板；引物需要与模板的3'端结合，结合图示
箭头方向可知，第2 轮循环选择Px 和Py 分别对应引物是P7、P4；由于引物之间存在重叠区域，在同
一个PCR 体系中引物之间会因为发生碱基互补配对而无法完成PCR 扩增，故图示多轮循环不能在同
一个PCR 体系中完成。
（3）利用重叠延伸PCR 人工合成大片段基因需要连接不同的DNA 片段，故相对于普通PCR 还需要
用到DNA 连接酶；结合上述内容分析利用该技术合成基因的优势有利用该技术合成基因的优势是可
以实现基因的定点突变、定点敲除。
13．（2024·四川成都·一模）非洲猪瘟是由ASFV（一种双链DNA 病毒）感染猪引起的烈性传染病。某研
究小组将ASFV 外壳蛋白基因导入猪体细胞中，利用核移植技术培育转基因克隆猪，从而得到自动产
生ASFV 抗体的个体，其过程如图所示。回答下列问题：
(1)获得D 猪的基础技术是 ，取B 猪体细胞进行①过程相对于胚胎细胞难度大，原因
在于 ，步骤③采用的技术手段是 。
(2)B 猪体细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期更换培养液以防止细
胞代谢物积累对细胞自身造成的伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程
称为 。
(3)在导入目的基因之前，需要用双酶切法处理含目的基因的DNA 片段和质粒，其优点是
（答出一点即可）。
(4)利用抗原一抗体杂交技术判断D 猪是否产生ASFV 抗体，使用的抗原物质最好是 。
该抗体也可以使用杂交瘤技术来制备，通常情况下，杂交瘤细胞是由骨髓瘤细胞和
细胞融合获得的。
【答案】(1) 动物细胞培养 动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难 胚胎移植
(2)传代培养
(3)保证目的基因和载体定向连接
(4) ASFV 外壳蛋白 经ASFV 外壳蛋白免疫后的B 淋巴细胞
【分析】哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。由于动物胚胎细胞分化程度低，
表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，因此动物体细胞核移植的难
度明显高于胚胎细胞核移植。而在动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难。
主要原因一方面是供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了
胚胎发育率低；另一方面是对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。
【详解】（1）分析题可知，获得D 猪涉及去核卵母细胞与含有目的基因的细胞的融合，动物细胞工
程的基础是动物细胞培养；取B 猪体细胞进行①过程相对于胚胎细胞难度大，原因在于动物胚胎细胞
分化程度低，表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，因此动物体细
胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植；步骤③表示将早期胚胎移植给C 猪，其技术手段为胚胎移
植。
（2）人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的
细胞培养称为传代培养，所以培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程称为传代
培养。
（3）使用双酶切法可以避免目的基因自身环化、避免载体自身环化、避免目的基因反向连接到载体
上，保证目的基因和载体定向连接。
（4）用抗原—抗体杂交技术判断D 猪是否产生ASFV 抗体，该技术的原理是抗体与抗原的特异性结
合，因此，使用的抗原物质最好是ASFV 外壳蛋白；该抗体若使用杂交瘤技术来制备，杂交瘤细胞应
该由骨髓瘤细胞、经ASFV 外壳蛋白免疫后的B 淋巴细胞融合获得的。
