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专题11 基因工程
考点概览
考点01 基因工程的基本工具和操作程序
考点02 基因工程综合
基因工程的基本工具和操作程序
1、（2025·四川德阳·二模）科研人员利用TALEN 基因编辑技术构建RPE65 基因编辑的家犬，建立
RPE65 基因突变动物模型，TALEN 编辑体系主要由特异性的DNA 识别域和非特异性的FokI 内切核酸酶构
成，DNA 识别域由多个TALE 蛋白连接而成。该系统能对DNA 靶序列进行剪切，造成DNA 双链断裂，诱
导DNA 产生修复，从而达到对基因序列进行改造的目的。下列说法错误的是（ ）
A．TALE 能识别DNA 特异位点，发挥靶向作用
B．FokI 内切核酸酶作用于DNA 的磷酸二酯键
C．可用显微注射的方式将目的基因导入家犬的受精卵
D．受精卵通过有丝分裂形成体积增大的桑葚胚
2、（2025·四川雅安·二模）科学的方法及正确的操作是生物学实验成功的关键，下列说法正确的是（
）
A．在淀粉和淀粉酶反应体系中加入蛋白酶可加速淀粉水解
B．用模型建构的方法研究DNA 的结构和种群数量变化规律
C．可采用五点取样法选取样方调查城市街道上树木的种群密度
D．鉴定DNA 时，在溶有DNA 的酒精溶液中加入二苯胺试剂后并沸水浴加热
3、（2025·四川宜宾·二模）如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物
1-4 在含有目的基因的DNA 上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindIII 在质粒上的识别位
点如乙图所示。以下叙述错误的是（ ）
考点01
A．PCR 过程完成4 轮循环，理论上至少需加入引物30 个
B．过程①中不能同时使用限制酶EcoRI 和BamHI 切割质粒
C．在氨苄青霉素培养基上生长的大肠杆菌就是此过程制备的工程菌
D．若已经合成了图甲所示4 种引物，应选择引物1 和4 扩增目的基因
4、（2025·四川成都石室中学·二模）将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。
如图表示利用含目的基因的DNA 分子和Ti 质粒构建基因表达载体的过程，图中
表示氨苄青霉素抗
性基因，
表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别序列如表所示。下列叙
述正确的是（ ）
A．利用PCR 扩增目的基因时，应该选择引物2 和引物3 并在引物3'端添加相应酶切位点
B．为使目的基因与质粒高效重组，选用KpnⅠ和HindⅢ比选用KpnⅠ和SmaⅠ效果更好
C．为将表达载体导入农杆菌，可以使用离心法或PEG 融合法处理受体细胞
D．成功导入目的基因的杨树细胞既具有氨苄青霉素抗性，又有新霉素抗性
5、（四川省宜宾市第三中学·二模）红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当
今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO 来源极为有限，目前临床使用的
红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO）。其简要生产流程如图，下列
相关叙述正确的是（ ）
A．过程①用到的工具酶有DNA 聚合酶、限制酶和DNA 连接酶
B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程
C．检测重组细胞是否转录出EPO 的mRNA 常用分子杂交技术
D．用乳腺生物反应器生产EPO 可将人EPO 基因导入哺乳动物体细胞获得
6、（四川省乐山第一中学 二模）实验结果产物能成功检出用阳性（+）表示，无法检出用阴性（一）表
示。假阳性是指检查结果是阳性，但实际是阴性；假阴性则与之相反。某流感患者进行甲型病毒检测，下
列可导致假阳性结果的是（ ）
A．抗原检测—单克隆抗体保存温度过高
B．抗体检测—患者半年内接种过甲流疫苗
C．核酸检测—PCR 扩增时变性温度设置过低
D．核酸检测—病毒发生变异与RCR 引物不匹配
7、（2025·四川达州·二模）为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30 蛋白基因
（p30）与白喉毒素无毒突变基因（CRM197A）的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1 为质粒
构建、疫苗生产以及效果测试示意图。请回答下列问题：
(1)完成图1 的过程②需要向反应体系中加入 酶。利用PCR 技术扩增p30-CRM197A 融合基因时，
需要向反应体系中添加的引物是 （选填图中的F1~F4）。
(2)选用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用 处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中
DNA 分子的生理状态。图1 中培养导入重组质粒的大肠杆菌时，采用的接种方法是 。
(3)筛选时，科研人员挑选了5 个菌落，提取质粒后加入BamHI、HindⅢ酶切、电泳，结果如图2：
①可初步判断 号菌落的质粒中含有p30-CRM197A 融合基因。
p30
②
基因和CRM197A 基因 （填“含”或“不含”）BamHI 和HindⅢ酶切位点，理由是
。
(4)科研人员在检测上述菌落时发现某个菌落同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，出现此现象的可能原
因有：
①有些大肠杆菌同时导入了空载质粒和融合基因表达质粒：
②导入空载质粒的大肠杆菌和导入触合基因表达质粒的大肠杆菌在接种时未分散开，导致 。
(5)为检测融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30 蛋白、p30-CRM197A 融合蛋白分别注入小鼠体内，一段
时间后检测抗体含量，结果如图3 所示。据此可判定融合蛋白疫苗效果更好，依据是 。
8、（2025·四川广安·二模）干旱胁迫是限制作物产量和品质的一个重要影响因素。科研人员通过转基因
技术将大肠杆菌的耐旱基因（mtlD）整合进玉米基因组，增强了玉米的抗旱性。据图回答问题。
限制
酶
识别序列及切割位点
（5'→3'）
BamHI
G↓GATCC
BclI
T↓GATCA
SmaI
CCC↓GGG
(1)可采用PCR 技术扩增目的基因，PCR 扩增的原理是 。在反应体系中除加入模板、dNTP、含
Mg2+的缓冲液外，还需要加入 。
(2)为了保证mtlD 基因正确连接到质粒中以构建重组质粒，在设计mtlD 基因的引物时，应在两种引物的
5'端分别添加 限制酶的识别序列，请据此设计转录模板链的引物5'- -3'（含12 个碱基序列）。
酶切后的目的基因片段和质粒通过 （填“EcoliDNA 连接酶”、“T4DNA 连接酶”或“E-coliDNA
连接酶或T4DNA 连接酶”）进行连接。
(3)为检测mtlD 基因是否成功插入质粒中，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaI 和 进行双酶切，
通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现 个条带，则说明插入成功。
(4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，请写出鉴定方法 。
9、（2025·四川成都·二模）相分离是蛋白质具有的一种物理特性，是驱动细胞内各类无膜凝聚体形成的
重要机制。研究人员将未知蛋白与不具有相分离特性的Cry2 蛋白相连，如果未知蛋白具有相分离特性，
则在蓝光照射下会发生凝聚，从而开发出检测蛋白是否有相分离特性的工具。FUS 蛋白作为经典的相分离
蛋白，经常用作实验对照。为了探究X 蛋白是否具备相分离特性，科学家需要构建能同时表达Cry2 蛋白
和X 蛋白的重组质粒，质粒中LacZ 基因编码产生的β—半乳糖苷酶可以分解X—gal 产生蓝色物质，使菌
落呈现蓝色，否则菌落为白色。图1 表示质粒的结构，图2 表示含有目的基因的DNA 片段，其中P1、
P2、P3 表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题：
(1)构建重组质粒的过程中需要用到E．coli DNA 连接酶，该酶的作用是将具有 的DNA 片段连接起
来。据图1 分析，应选用四种限制酶中的 和 切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达
出Cry2 蛋白和X 蛋白。
(2)已知X 蛋白基因转录得到的mRNA 前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG
之前加入
序列，会显著提高基因的表达效率。利用PCR 技术获取X 蛋白基因时，为保证
X 蛋白基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1 外，还需要选择引物 （填“P2”或“P3”），
并在该引物5 端增加碱基序列5´- -3´
(3)通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA 片段区分开来，该技术所依据的原理是 。对PCR 产物进行
电泳检测，结果显示除X 蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为减
少非特异性条带的产生，可适当 （填“提高”或“降低”）PCR 中复性过程的温度。
(4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将重组质粒与经
处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接
种到含有四环素和X-gal 的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为 的菌落为目标菌落，原因
是 。
(5)为了确认X 蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所
含基因的差异分别是 、 。
10、（2025·四川雅安·二模）CRISPR-Cas9 是一种源自细菌抵御噬菌体的基因组编辑技术。CRISPR 是细
菌基因组中的一段特殊DNA 序列，Cas9 是一种能够切割DNA 双链的核酸内切酶。在基因编辑过程中，通
过引导RNA（sgRNA）将Cas9 引导到目标DNA 序列位置，然后Cas9 对目标DNA 进行切割。为研究
AtTPST 基因在拟南芥中的功能及其对植株发育的影响，科研人员利用CRISPR-Cas9 基因组编辑技术构建
敲除载体，通过农杆菌转化法将敲除载体转入拟南芥中，获得靶基因敲除的株系。
(1)利用CRISPR-Cas9 技术敲除AtTPST 基因的核心工作是 ，该过程需要用到的工具酶有 。
(2)CRISPR-Cas9 基因组编辑技术中，科研人员是依据 的部分序列来设计sgRNA。现已知某sgRNA
的局部序列为5'-UCCAGAAUC-3'，则其识别序列为 。
(3)科研人员将Cas9 基因和sgRNA 基因插入到Ti 质粒的 区域，目的是 。
(4)CRISPR-Cas9 基因组编辑技术在定点编辑基因时存在一个大的弊端，有很大概率会造成一些非目的基因
序列的错误剪接和编辑，请分析其原因可能是 。
(5)结合Cas9 的蛋白结构，科学家们通过一系列的点突变实验，发现同时突变Cas9 的第10 位和第840 位氨
基酸，可以完全破坏Cas9 的核酸酶功能不影响Cas9 识别sgRNA-DNA 复合体的功能，这个cas9 被称为
dCas9。据图分析，当dCas9—sgRNA 复合物结合到DNA 的目标位点后，会使转录被阻断的原因是
。
11、（2025 届四川省攀枝花三中 二模）PCR 技术是一种用于放大扩增特定的DNA 片段的分子生物学
技术，其最大的特点是能将微量的DNA 大幅增加。
I.如果已知一小段DNA 的序列，可采用PCR 的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图1
（以EcoRI 酶切为例）所示。
(1)步骤Ⅱ中所用的DNA 连接酶的作用是催化形成 ，从而形成环状DNA。
(2)步骤Ⅲ中的复性温度设定是成败的关键，温度过高会破坏 的碱基配对。
(3)若下表所列为已知的DNA 序列和设计的一些PCR 引物，步骤Ⅲ选用的PCR 引物必须是 （填
数字“①、②、③、④”）。
DNA 序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
PCR 引物
5′-AACTATGCGCTCATGA-3′
①
5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′
②
5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③
5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′
④
(4)新冠病毒核酸定性检测原理：先以病毒RNA 为模板利用 酶合成cDNA，再通过PCR 技术扩
增相应的DNA 片段，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为
阳性。此方法为RT-PCR 技术。
(5)如果探针是带有荧光标记的，即为“实时荧光RT-PCR 技术”。在PCR 反应体系中，加入的荧光探针与
模板DNA 的某条链互补结合，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。当子链
延伸至探针处，探针被TaqDNA 聚合酶降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光（如图
2 所示）。即每扩增1 个DNA 分子，就有1 个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全
同步。
①若最初该反应体系中只有1 个DNA 分子模板，进行第4 次循环时，需要消耗荧光探针 个。
②检测时，荧光强度一般要达到或超过阈值才能确诊。若检测出现假阴性，推测可能的一个原因
。
基因工程综合
1、（2025·四川德阳·二模）为了培育既抗除草剂（草甘膦），又抗冻的烟草植株，科学家将抗草甘膦基
因（Aro 基因，存在EcoRI 酶切位点）和抗冻基因（Cor 基因，存在Bell 酶切位点）采用融合PCR 技术
（原理如下图所示）连接起来构建为Aro-Cor 融合基因并进行了扩增，再将融合基因导入烟草细胞培育既
抗除草剂又抗冻的转基因烟草，过程如下。请分析回答：
(1)在将Aro 基因和Cor 基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2 和引物3 的碱基序列 （填“相
考点02
同”或“不相同”），变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需要添加引
物，其原因是 。为保证构建的Aro-Cor 融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物1 和引物4 侧
连接 的限制酶识别序列。
(2)上述培育转基因烟草过程中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是 ，将农杆菌和烟草细胞按比例
充分混匀，3 天后转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因是 。
(3)植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的 的微量有机物。在培育转基
因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分析，在初
次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的 来观察其对细胞发育的影响。
2、（2025·四川南充·二模）水孔蛋白作为细胞水分跨膜运输的主要通道蛋白，参与植物的生长及逆境适
应过程。为研究天山雪莲水孔蛋白基因（S 基因）在低温适应过程中的作用机制，研究人员利用基因工程
将S 基因导入番茄细胞获得转基因番茄。请回答下列问题：
(1)研究人员设计了携带限制酶位点的特异性引物P1 和P2。在PCR 时，引物P2 将与S 基因 （填
“A 链”或“B 链”）的3'端结合；若经过5 次循环，得到同时含有引物P1 和P2 的DNA 有 个。
(2)构建重组质粒时，不能用限制酶EcoR I 切割大肠杆菌质粒，原因是 ；切割后再用DNA 连接酶
将具有相同 的S 基因和质粒切口连接起来。
(3)通过农杆菌转化法将目的基因导入番茄细胞，在愈伤组织阶段取部分细胞提取总DNA 进行PCR 和凝胶
电泳，此操作的目的是 。
(4)研究人员将转基因番茄和野生型番茄分别放置在0℃和25℃的培养箱中处理8h，结束后采样测定抗逆生
理指标（结果见下图2）。据此推测S 基因表达显著提高番茄抗寒性的机制是 。
注：丙二醛为植物在遭受逆境下发生膜脂过氧化的产物
3、（2025·四川绵阳·二模）CRISPR/Cas9 基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具
sgRNA/Cas9 来源于原核细胞，包括具有导向功能的sgRNA 和行使DNA 双链切割功能的Cas9 蛋白，技术
原理如图甲所示。回答下列问题：
I.某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231 细胞、Lenti-CAS9-sgRNA 质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺
癌细胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，以研究该基因在细胞中的作用，为乳腺癌的治疗提供理论支持。
(1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9 蛋白基因如图乙，故只需要根据 基因的
部分序列人工合成sgRNA 基因即可。
(2)构建表达载体。人工合成的sgRNA 基因如图丙，需要通过 扩增，为了确保酶切后能正确
连接到质粒上（相应酶切序列如图丙），需在引物1 的5'端加上碱基序列 ，引物2 的5'端加
上碱基序列 。
(3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA 基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的
乳腺癌MDA-MB-231 细胞。感染后用 筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目
的是 。
(4)检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d 后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。
检测特定蛋白质的原理是 。
Ⅱ、其他应用
(5)敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工
具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与 相同的序列。
(6)对基因或染色体定位跟踪。将Cas9 基因改造成Cas9i 基因（表达的Cas9i 蛋白丧失切割功能），并与绿
色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i 基因—GFP 基因—终止子—，
最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP 荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9 基
因的技术属于 （填“基因工程”“蛋白质工程”“酶工程”）。
(7)调控基因表达。转录因子M 如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因
转录。要通过sgRNA/Cas9i 工具促进乳腺癌细胞中的X 基因表达，表达载体构建关键部分为：
。
4、（2025·四川成都石室中学·二模）有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，饮用牛奶
后易出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛受精
卵，使获得的转基因奶牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。根据如下操作
流程回答相关问题：
(1)为了获得更多的卵母细胞，在进行①过程前，需要用 处理奶牛A，从输卵管中采集卵母细胞后，
还需要体外培养至 期，才可以进行③过程。通过图中②过程采集的B 奶牛精子不能直接使成熟的卵
细胞受精，常要用化学诱导法对奶牛的精子进行 处理，即用一定浓度的 处理。
(2)⑤过程表示将重组质粒导入受体细胞，常用的方法是 。
(3)⑥过程在移植胚胎前，可以选择发育良好、形态正常的 进行胚胎分割。
(4)外源基因插入奶牛受精卵中的DNA 上后，导致有的受精卵发育成转基因奶牛，有的会死亡。分析导致
受精卵死亡的最可能原因是 。⑦过程的检测结果为 时，说明转基因奶牛D 是符合要求的优质
牛。
5、（2025·四川邛崃市第一中学·二模）马铃薯在加工过程中，颜色会逐渐变成褐色，称为褐变。研究发
现，多酚氧化酶（PPO）是导致马铃薯褐变的关键因素，而StPOT32 基因是影响PPO 合成的重要基因。研
究者利用RNA 干扰技术和外源基因清除等技术获取符合转基因生物安全，且抗褐化能力强的转基因马铃
薯。请分析回答：
(1)导致马铃薯褐变的PPO，其合成需要经历相关基因的 阶段。
(2)研究发现，在dsRNA 干扰下，马铃薯褐变受到抑制，推测dsRNA 能 （选填“促进”或“抑
制”）StPOT32 基因的表达。为得到dsRNA，研究者以StPOT32 基因作为干涉靶点，使用StPOT32 基因的
片段StPPOi 与含有patatin 的P9286 质粒构建RNA 干扰载体，如图1 所示，StPPOi 上游的patatin 的作用是
。
(3)研究者使用PCR 技术验证RNA 干扰载体是否成功构建时，需要设计相关引物，请在图2 的4 个引物中
选出相关引物 （填图中序号）。
(4)为检验dsRNA 干扰效果，研究者对三组马铃薯块茎的PPO 活性进行检测，结果如图3 所示，其中B 组
所用的材料为 。
(5)研究者构建RNA 干扰载体所用的P9286 质粒中含有外源基因清除系统，并用冷诱导启动子驱动。当该
系统激活时，会清除两个融合识别位点LF 之间的序列，这样操作的意义是 。
6、（2025·四川遂宁·二模）A 蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科
研团队利用无缝克隆技术将A 蛋白结合蛋白基因（P 基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS 基因）融合，构建
A 蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥（一种草本植物）进行实验。相关原理、过程及质粒的结
构如图所示。请分析回答：
(1)无缝克隆原理图中，过程①中T5 核酸外切酶沿 的方向水解DNA，其目的是形成 。过程
③所需的酶有 。
(2)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术可实现多个片段的连接，且操作时间短、成功率高。NEB 官方
的无缝克隆线上设计软件强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp。请推测无缝克隆
技术不适合连接小于50bp 小片段的原因： 。
(3)图中利用无缝克隆技术构建GUS-P 融合基因的关键是引物F1与引物 的 端互补。
(4)图中利用双酶切法将融合基因插入Ti 质粒，应选用
限制酶为 。扩增GUS-P 融合基因所需的引
物R1序列（5'→3'）的设计依据为 （填序号：①同源序列②限制酶的识别序列③P 基因的部分序列
④GUS 基因的部分序列）。据图分析，引物R1和F2应分别为下列引物 。
①5'-TAAGTTGTCT……-3' ②5'-CTTGGATGAT……-3'
③5'-TCTGTTGAAT……-3' ④5'-ATTCAACAGA……-3'
(5)利用农杆菌转化法将目的基因导入拟南芥细胞后，进行植物组培。用 对组培苗进行筛选。已知葡
萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc 呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部
位的组织分别加入X-Gluc 进行鉴定，结果如下表所示：
部位
根
茎
叶
完全培养液
蓝
色
浅蓝
浅蓝
缺磷培养液
深
蓝
蓝色
浅蓝
根据上表实验结果分析，该激素最主要的合成部位是 ，该激素的生理作用是 。
