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热点聚焦 PCR 技术及应用
热点1 PCR 引物归类分析
1．引物的设计
(1)(2020·山东，25 节选)通过PCR 技术可在总cDNA 中专一性地扩增出Wx 基因的cDNA，
原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 引物是根据Wx 基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx 基因的cDNA 特异性
结合)
(2)(经典高考题)设计引物时需要避免引物之间发生__________，而造成引物自连。同理也要
避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且________的
引物需要设定更高的复性温度。
答案 碱基互补配对 G、C 含量高
[命题延伸] 判断与填充
(1)PCR 技术中，提高复性的温度能有效减少反应非特异条带的产生(2021·湖北，16)( √ )
(2)科学设计引物是PCR 能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C 含量过高，会
造成PCR 的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是引物与模板链结合过于紧密，变性时
引物不易与模板链脱离
( 影响变性
) 。若对PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两
个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是引物过短导致引物的特异性下降。
[提醒] (1)PCR 引物的设计原则
①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不
适于Taq DNA 聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。
②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4 个碱基的互补，以免形成发夹状结构
(如图)，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4 个碱基的互补，尤其应避免3′端的互补重
叠以防形成引物二聚体(如图所示)。
(2)引物与复性温度
①复性温度：复性温度高，扩增特异性强；复性温度低，扩增效率高。
②引物：a.引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度。
b．引物GC 含量越高，越容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。
2．引物的修饰
(1)(2022·山东，25 节选)某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶识别并
降解，药物A 可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治疗该病的机理，
需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P 和FLAG－PΔ。PΔ 是缺失特定氨基酸序列的P，
FLAG 是一种短肽，连接在P 或PΔ 的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG 抗体的介质结合，
但不影响P 或PΔ 的功能。
①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的引物
需满足的条件是_________________________________________________________
________________________________________________________________________，
为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序
列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。
②PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合基因，
如图所示，其中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合
基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因
对应的氨基酸序列与P 不同。据图分析，出现该问题的原因是______________________
________________________________________________________________________。
修改扩增P 基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 ①能与P 基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 5′端 ②P 基
因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA
的密码子被错位读取 在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1 个碱基
解析 ①引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩
增P 基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA 聚合酶延
伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加
在引物的5′端。②融合基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基
酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同，说明P 基因翻译时出错。由图可看出，
在转录出的mRNA 中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P 基因对应的第一个碱基构
成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoR Ⅰ识别序列
3′端添加1 个碱基，使其碱基数目加上FLAG 的碱基数目为3 的倍数，这样能保证P 基因
转录出的mRNA 上的读码框不改变，能够正常翻译。
(2)(2021·天津，16 节选)研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产
生乳酸的工程菌株。如图为构建表达载体时所需的关键条件。
在设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列时，为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核
生物偏好的GTG 转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设
计引物1 和2。其中引物1 的5′端序列应考虑________________和________________。
答案 包含BamHⅠ的识别序列 将GTG 改为ATG
[思维延伸] 引物的结合方向和引物的数量计算
1．引物的结合方向
如图为X 蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：
扩增X 蛋白基因所需的引物序列是____________________________________________
________________________________________________________________________；
________________________________________________________________________。
答案 5′ATGCCGTAAGTCCTAC3′
5′TGATCTACGGCTTACA3′
解析 书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板
链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，
3′端在左侧，引物序列为5′TGATCTACGGCTTACA3′。同理推测另外一条引物的序列。
2．引物的数量计算
(1)如图：一个DNA 分子进行了n 次扩增，则：
①子代DNA 分子中等长链的DNA 分子数为________个；
②子代DNA 分子中不等长链的DNA 分子数为________个；
③子代DNA 分子中含模板链的DNA 分子数为________个；
④子代DNA 分子中含引物1(或2)的DNA 分子数为________个；
⑤复制过程中共需引物________个；
⑥第n 次复制需要引物________个。
(2)已知引物1 及引物2 之间的序列为目的序列，若引物与DNA 的结合位点如图所示，在第
________轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。
答案 (1)①2n－2n ②2n ③2 ④2n－1
⑤2n＋1－2 ⑥2n (2)2
1．通过对多种植物研究表明，钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成可
以更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1 基因，通过基因工
程将Ers1 基因反向连接在启动子后，筛选转入反义Ers1 基因的草莓，达到延长储藏期的效
果。在使用相关技术获得DNA 后，需要通过PCR 技术进行扩增Ers1 基因(如图)。为使目的
基因与质粒连接，在设计PCR 引物扩增Ers1 基因时需添加限制酶XhoⅠ(识别序列为5′—
CTCGAG—3′)的识别序列。已知Ers1 基因左端①处的碱基序列为—TTCCAATTTTAA—，
则其中一种引物设计的序列是5′________________3′。在PCR 体系中，加入的dNTP 可
提供______________。
答案 —CTCGAGTTCCAATTTTAA— 原料和能量
解析 图中有磷酸基团连接处为5′端，－OH 连接处为3′端，由题意得，Ers1 基因左端
①处的碱基序列为5′－TTCCAATTTTAA－3′，故可设计引物5′－TTCCAATTTTAA－
3′，在设计PCR 引物扩增Ers1 基因时需添加识别序列为5′－CTCGAG－3′的限制酶
XhoⅠ识别序列，故其中一种引物设计的序列是5′－CTCGAGTTCCAATTTTAA－3′。在
PCR 体系中，dNTP(脱氧核苷三磷酸)在反应过程中可以提供原料(合成 DNA 的脱氧核苷
酸)和能量(dNTP 水解会释放能量)。
2．研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维素薄膜。蛋白T7RNAP
是一种噬菌体RNA 聚合酶(T7RNAP 的N 端或C 端单独存在时不能发挥作用，二者结合可
形成完整的T7RNAP)，nMag 和pMag 是在蓝光环境下能够相互结合的两种光敏蛋白。研究
人员通过PCR 技术获得融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因连接，构建成基因表
达载体，然后将其导入受体菌，获得了所需的工程菌。研究人员利用PCR 技术实现编码
T7RNAP N 端的基因下游序列与编码nMag 的基因上游序列的无缝连接，获得编码T7RNAP
N 端－nMag 的融合基因，由图可知，引物2 的5′ 端9 个碱基序列为
5′__________________3′
，
如
此
设
计
引
物
2
的
目
的
是
_________________________________________。用同样的方法获得编码pMag－T7RNAP C
端的融合基因。
答案 —CCTGCACCT— 使T7RNAP N 端基因的下游添加与nMag 基因的上游相同的序列
解析 观察题图，要实现编码T7RNAP N 端的基因下游序列与编码nMag 的基因上游序列的
无缝连接，引物 2 的5′端 9 个碱基序列应包含nMag 基因的上游序列(从图中可知)，所
以为5′－CCTGCACCT－3′。如此设计引物 2 的目的是使T7RNAP N 端基因的下游添加
与nMag 基因的上游相同的序列，从而获得融合基因。
3．(2025·聊城二模)大豆中转录调控因子Y 蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表
达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y 基因并将其下游终止密
码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因(GFP)进行拼接获得融合基因。成功表
达的Y－GFP 融合蛋白可用于Y 蛋白调控机理的研究。研究中首先要对Y 基因进行PCR 扩
增。PCR 反应要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中一般需要加入Mg2 ＋，其原因是
__________________________。如图所示Y 基因序列为转录的____________________(填
“模板链”或“非模板链”)。已知EcoRⅠ识别序列为5′－GAATTC－3′，BamHⅠ识别
序列为5′－GGATCC－3′，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y 基
因正确接入载体并成功表达出Y－GFP 融合蛋白，Y 基因下游扩增引物应为5′－
____________－3′(包括添加的限制酶识别序列，共写12 个碱基)。
答案 DNA 聚合酶需要Mg2＋激活 非模板链 GGATCCATGTTC
解析 由于DNA 聚合酶需要Mg2＋激活，因此缓冲液中一般需要加入Mg2＋。转录出来的信
使RNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG 应该跟模板链TAC 是互补配对的，跟非
模板链ATG 是相同的，题图中Y 基因单链部分的左端起始位置是ATG，刚好跟信使RNA
的起始位置是相同的，故图中所示Y 基因序列为转录的非模板链。据题图分析可知，Y 基
因上面没有EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，所以要扩增Y 基因时，引物的5′端要加上
EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y
基因单链部分是非模板链，所以Y 基因是从左到右与载体部分连接。故在Y 基因的左端连
接EcoR Ⅰ的识别序列，Y 基因的右端连接BamH Ⅰ的识别序列。即Y 基因的下游扩增引
物上面应该添加BamH Ⅰ的识别序列，再根据“在获得Y 基因并将其下游终止密码子对应
序列剔除”可知，Y 基因下游最右端的三个碱基转录为终止密码子，故这三个碱基要剔除，
所以为使Y 基因正确接入载体并成功表达出Y－GFP 融合蛋白，Y 基因的下游扩增引物应为
5′－GGATCCATGTTC－3′。
热点2 常用PCR 技术及原理
1．实时荧光定量RT－PCR 技术检测病毒核酸
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR 鉴定。实时荧光PCR 扩增目的基因，需额外
添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，
不产生荧光。在PCR 过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA 聚合酶水解，R 与Q
分离后，R 发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR 检测某病毒感染时，检测到
的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct 值)越小，说明病毒核酸浓度越
高。
2．PCR 定点突变——重叠延伸PCR 技术
重叠延伸PCR 技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2 和3，突起
处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA 片段，再
在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸
PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47 位的天冬酰胺(密码子为
AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如
图：
3．PCR 定点突变——大引物PCR 技术
大引物PCR 需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游
引物和常规下游引物。第一轮PCR 利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完
整的含有突变位点的DNA 片段；第二轮PCR 利用第一轮扩增产物中的一条DNA 链作为下
游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA 片段。原理如图：
4．反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA 的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR 技术。
原理是：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA 连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得
了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA 分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向
的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序
列。原理如图：
5．巢式PCR
首先将目标的DNA 模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相
似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种
产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR 扩增的产物进行第二轮PCR 扩增。由于
第二套引物位于第一轮PCR 产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，
因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR 扩增确保第二轮PCR 产物几乎或者
完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图：
1．(2023·山东，25 节选)科研人员构建了可表达J－V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，
该质粒的部分结构如图所示：
构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅
用一对引物，应选择图中的引物______________。
答案 F1 和R2(或F2 和R1)
解析 据图可知，引物F1 与R2 或F2 与R1 结合部位包含J 基因的碱基序列，因此为了确定
J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图中的引
物F1 和R2 或F2 和R1。
2．(2019·江苏，33 节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟
设计引物进行PCR 鉴定。如图所示为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，
PCR 鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落
的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是____________________________________________。
答案 乙和丙 目的基因反向连接
解析 如图所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp 片段，反向连接则不会
出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450 bp 片段。若采用
引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp 片段。
3．(不定项)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR 反应体系中，分别再加入一种少
量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP 或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷
酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；
若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测
序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．上述PCR 反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′CTACCCGTGAT3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为G
答案 AC
解析 利用双脱氧测序法时，PCR 反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入
一种引物，A 正确；电泳时，产物的DNA 片段越大，迁移速率越慢，B 错误；根据题图可
知，对照个体PCR 子链的测序结果为5′CTACCCGTGAT3′，该序列与对照个体双链
DNA 分子中模板链的互补链的序列相同，而患者该段序列为5′CTACCTGTGAT3′，对比
可知，患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T，C 正确，D 错误。
[模型构建] “双脱氧法”基因测序原理解读
(1)双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR 延伸所需的3′OH，因此每当DNA 链加入分子
ddNTP 时，延伸便终止。(2)每一次DNA 测序是由4 个独立的PCR 反应组成的，4 个PCR 反
应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA 聚合酶，唯一不同的是4 个反应体系分别加入不同
的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR 反应后，在反应体系中就形成了大
量起始点相同、终止点不同的DNA 片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同
位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。(4)双脱氧法原理示意图：
1．如图为利用重叠延伸PCR 的方法在蛋白a 基因中部引入定点突变(A/T 碱基对变为G/C)的
过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D 与蛋白a 基因的两端完全配对，引物B、C
虽与蛋白a 基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的
PCR 达到目的。下列叙述错误的是( )
A．PCR1 所用引物应为引物A 和B
B．PCR2 至PCR4 依次以PCR1 至PCR3 的产物为模板
C．PCR3 无需额外加入引物
D．PCR4 的作用是大量扩增突变基因
答案 B
解析 引物与模板的3′端结合，由图PCR1 的产物可知，PCR1 所用引物应为引物A 和
B，A 正确；由图可知，PCR1 和PCR2 均以原始DNA 为模板，PCR3 以PCR1 和PCR2 的产
物为模板，PCR4 以PCR3 的产物为模板，B 错误；由图可知，两条链互为模板和引物，故
PCR3 无需额外加入引物，C 正确；PCR4 的作用是大量扩增突变基因，得到大量的新的蛋
白a 基因，D 正确。
2．荧光定量PCR 是一种定量计算待测样品的初始模板量的方法。在PCR 反应体系中加入
特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA 链中，每扩增一条DNA 链，就有一
个荧光分子形成，通过对扩增反应中的荧光强度进行实时检测，最后通过标准曲线定量计算
初始模板量。如图为某荧光定量PCR 的标准曲线。下列叙述错误的是( )
A．一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA 量呈正相关
B．每个反应管内荧光探针的量相同
C．样品甲的初始模板量大于样品乙
D．荧光强度不再变化时PCR 反应停止
答案 D
解析 在PCR 反应体系中加入特异性的荧光探针，荧光探针可以掺入新合成的DNA 链中，
每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，因此一定范围内，荧光强度与扩增出的DNA
量呈正相关，A 正确；最终各反应管的荧光强度一样，说明每个反应管内添加的荧光探针的
量相同，B 正确；PCR 扩增时，每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，因此DNA
数量越多，荧光强度越大，样品甲达到最大荧光强度所用的循环数小于乙，因此样品甲的初
始模板量大于样品乙，C 正确；荧光强度不再变化可能是因为荧光探针或原料等消耗尽，若
为前者，则PCR 反应仍在进行，D 错误。
3．融合PCR 技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其
过程如图1 所示。图2 是中间载体1 和中间载体2(利用融合PCR 技术构建成)构建成叶绿体
定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过
与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA 上的特定位点上。请据图回答下
列问题：
(1)图1 第一阶段中PCR 至少进行______次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引
物2 与引物3 部分碱基的____________关系使得两DNA 能成功“搭桥”连接起来。
(2)若通过融合PCR 技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计
______种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有__________种。
(3)图2 中需使用________________(填限制酶)和DNA 连接酶将两中间载体构建成定点整合
表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。
答案 (1)2 互补配对 (2)8 6 (3)Spe Ⅰ、Sal Ⅰ 复制原点
解析 (1)分析图1 可知，在第一阶段中，利用PCR 技术进行第一次扩增(循环)，得到的含
有引物2、引物3 的产物，其DNA 双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获
得双链等长的DNA。第二阶段中引物2 与引物3 部分碱基的互补配对关系使得两DNA 能成
功“搭桥”连接起来。(2)图1 显示：通过融合PCR 技术，每一次将两个DNA 片段拼接起来，
需要4 个引物，其中有2 个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR 技术将启动子、
标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8 种引物，其中能够起着“搭桥”作用的
引物有6 种。(3)图2 显示：启动子和终止子的两端分别有Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，叶
绿体同源重组基因1 与2 之间也存在Spe Ⅰ和Sal Ⅰ的识别位点，因此图2 中需使用Spe
Ⅰ、Sal Ⅰ和DNA 连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点整合表达载体
上未标出的结构是复制原点。
4．如果已知一小段DNA 的序列，可采用PCR 方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，
具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题：
(1)如表所列为已知的DNA 序列和设计的一些PCR 引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是
______(从表格引物①②③④中选择，填编号)。
名称
DNA 序列(省略号处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
5′AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT3′
3′TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA5′
引物
①5′AACTATGCGCTCATGA3′
②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′
③5′AGAGGCTACGCATTGC3′
④5′TCATGAGCGCATAGTT3′
(2)对产物测序，经分析得到了片段F 的完整序列。下列单链序列中(省略号处省略了部分核
苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′AACTATGCG……AGCCCTT3′
B．5′AATTCCATG……CTGAATT3′
C．5′GCAATGCGT……TCGGGAA3′
D．5′TTGATACGC……CGAGTAC3′
答案 (1)②④ (2)B
解析 由于已知序列的外侧是未知序列(如图中待扩增的未知序列)，因此无法设计引物。若
要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR 技术。反向PCR
的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA 连接酶将其
连接成环，即图中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，
以环状DNA 两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用Taq DNA 聚
合酶无法将DNA 连接成环的特点，得到链状DNA，即图中Ⅲ扩增过程。(1)采用反向PCR
扩增未知序列，又因子链的延伸方向为5′→3′ ，可根据已知序列3′
AGTACTCGCGTATCAA5′和3′CGTTACGCATCGGAGA5′，设计对应PCR 引物是5′
TCATGAGCGCATAGTT3′和5′GCAATGCGTAGCCTCT3′。(2)对产物测序，得到片段F
的完整序列，因为片段F 是被限制酶EcoR Ⅰ剪切的两端，所以5′端应该是AATTC，对
应F 片段的开头，故选B。
