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高考共鸣点13 特殊PCR 技术、双标记基因技术、基因编辑
技术
热点1 特殊PCR 技术
题型一 重叠延伸PCR 技术
(1)以上操作中哪些引物应含有拟突变位点？
提示 引物2 和引物3。
(2)过程②和③，应分别选择哪些引物？
提示 过程②时需选择引物1 和引物2，过程③时需选择引物3 和引物4。
(3)经过过程④获得的杂交DNA 有2 种，都可以经过过程⑤获得目的基因吗？
提示 过程④获得的杂交DNA 有2 种，一种是两条链的3′端部分碱基互补，如
题图所示，一种是两条链的5′端碱基互补，即
，由于DNA 聚合酶
能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，故只有题图中的杂交DNA 可经过过程
⑤获得目的基因。
(4)为获得大量目的基因序列，应在突变后的基因中加入哪两种引物？
提示 引物1 和引物4。
拓展 两个引物均从内部扩增，在某一引物引入突变位点
若两个引物均从内部扩增，其中一个引物引入突变位点，则至少第3 次扩增后才
可获得双链等长的突变DNA 片段，n 轮扩增后可获得2n－2n 个突变DNA。
题型二 大引物PCR 技术
大引物PCR 需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、
常规上游引物和常规下游引物。
题型三 反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列
反向PCR 技术是根据DNA 片段中间的已知序列设计引物，扩增已知序列两侧的
未知序列的思路是：先从未知序列的两侧把DNA 切成片段，然后通过DNA 连
接酶将DNA 片段环化；再利用已知序列的两端设计引物，只不过引物相对于已
知序列是反向配置的，所以子链反向延伸(如图)。
反向PCR 可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA 片段。
题型四 巢式PCR
首先将目标的DNA 模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到
其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段
(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR 扩增
的产物进行第二轮PCR 扩增。 由于第二套引物位于第一轮PCR 产物内部，而非
目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目
的片段。 这种巢式PCR 扩增确保第二轮PCR 产物几乎或者完全没有引物配对特
异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如下图所示。
[例1] (2026·河南名校联盟)常见PCR 只能扩增两引物之间的DNA 序列，要扩增
已知DNA 序列两侧的未知DNA 序列，可用反向PCR 技术。反向PCR 技术扩增
的原理如图所示。 下列叙述错误的是( )
A.酶切阶段，L 中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B.环化阶段，可选用E.coli DNA 连接酶或T4 DNA 连接酶
C.图中引物，应选择引物1 和引物4，且二者间不能互补配对
D.PCR 扩增，将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链结合
答案 D
解析 在酶切阶段，已知序列L 中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不
然会将已知序列L 切断，造成序列识别混乱，A 正确；T4 DNA 连接酶或E.coli
DNA 连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA 连接
酶或T4 DNA 连接酶，B 正确；PCR 过程需要两种引物，能分别与目的基因两条
链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应
选择引物1 和引物4，且二者间不能互补配对，C 正确；PCR 扩增中，将温度调
至72 ℃的目的是耐高温的DNA 聚合酶将4 种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则
合成新的DNA 链，D 错误。
[例2] (2026·湖南长沙一中联考)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个
或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR 定点突变常用
来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮
PCR 反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮
PCR 扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A.第一轮PCR 过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR 复性的温度
B.PCR 扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
C.第一轮PCR 的产物的两条DNA 链作为第二轮PCR 所用的引物
D.将某蛋白质的第21 位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程
答案 C
解析 为了使两轮PCR 反应在同一支试管中进行， 引物设计时应考虑不同的复
性温度，第一轮PCR 过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR 复性的温度，A
正确；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则产物需具备启动子和终止子，诱导
基因转录和翻译，B 正确；除了第一轮产物作为第二轮PCR 扩增的大引物外，
第二轮PCR 仍需加入另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C 错误。
[例3] (2026·广东茂名调研)水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科
研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水
蛭素第47 位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、
AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2 和3 的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1) 由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过
来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为 才能达到目的。
引物2 的突变位点(突起处)应设计为 (假设引物为单链DNA)。
(3)在第一阶段获得2 种具有重叠片段DNA 的过程中，引物1、引物2 组成的反
应系统和引物3、引物4 组成的反应系统中均进行一次复制，共产生 种
DNA 分子。该阶段必须将引物1、2 和引物3、4 置于不同反应系统中，这是因
为
__________________________________________________________________。
(4)利用重叠延伸PCR 技术还可以将两个不同来源的DNA 片段拼接起来。有人
想利用该技术把基因M 和N 拼接在一起，设计基因M 的引物M1、M2，基因N
的引物N1、N2。在设计这4 种引物时，特别要注意的问题是
__________________________________________________________________。
答案 (1)改造基因(或基因定点突变) (2)T－A 或C－G A 或G (3)3 引物2
和3 中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会因相结合而失去作用
(4)M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
解析 (2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A 或C－G，
对应的密码子由AAU 变成AAA 或由AAC 变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨
酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制，则会产生3 种不同的DNA 分子，因为
引物1 和4 产生的DNA 分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR
技术成功的关键。拼接基因M 和N 时，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、
M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。
热点2 双标记基因载体与蓝白斑筛选
1.利用双标记基因与影印接种技术筛选
双标记技术使用两个标记基因(如两个不同的抗性基因)，在构建重组表达载体时，
将目的基因插入其中一个标记基因内，导致该标记基因无法正常表达，失去抗性，
而空载体具有两种抗性，由此区分空载体和重组表达载体。
但由于构建成功的载体失去一种抗性，在含相应抗生素的选择培养基中反而会被
淘汰，所以需要一种特殊的影印培养法(也叫印章法)，对失去抗性的受体菌进行
筛选，原理如下。
2.利用蓝白斑显色法筛选
蓝白斑筛选是另一种双标记技术，通过破坏一个和色素有关的基因，判断目的基
因是否导入载体，在操作上更加方便，原理如下。
蓝白斑筛选利用β－半乳糖苷酶基因作为第二个标记基因，β－半乳糖苷酶基因
(LacZ)编码β－半乳糖苷酶，β－半乳糖苷酶可以催化无色的X－gal 分解产生蓝
色的产物，使菌落呈现蓝色。如果目的基因破坏LacZ，则菌落呈白色，从而筛
选出转化成功的细胞。
注：上图固体培养基中添加了X－gal 和氨苄青霉素。
[例1] (2025·安徽卷，15)质粒K 中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠
杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，
如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因
在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( )
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落
数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌
株
C.因质粒K 中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白
的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K 经酶切后自身环化并导入了
大肠杆菌
答案 C
解析 提高大肠杆菌转化效率的常用方法是使用氯化钙(或Ca2＋)处理细胞，使其
处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，可增加筛选平板上白色和蓝
色菌落数，A 正确；若筛选平板中仅含卡那霉素，目的基因成功插入的重组质粒
导入的大肠杆菌以及目的基因未插入成功的质粒K 导入的大肠杆菌在平板上均
为白色菌落，故无法判断哪个是含目的基因的菌株，B 正确；因质粒K 中含两个
标记基因，筛选平板中长出的白色菌落应为含目的基因的菌株，能否表达相应蛋
白，需进一步检测，C 错误；如果筛选平板上蓝色菌落明显偏多，说明大量没有
插入目的基因的质粒K 导入了大肠杆菌，推测原因可能是酶切后的载体发生自
身环化并导入了大肠杆菌，D 正确。
[例2] (2026·江西临川一中模拟)不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的
差异。MCS 是一段含多种限制酶切割位点的DNA 序列，广泛用于插入不同外源
启动子，但MCS 自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检
测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动
子的LacZ 基因和质粒p 构建出质粒p－LacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。
回答下列问题。
注：LacZ 基因编码产物为β－半乳糖苷酶。EcoR Ⅰ、Sac Ⅱ、Bgl Ⅱ、Xba
Ⅰ、Sph Ⅰ、BamH Ⅰ为相应限制酶可识别并切割的位点。箭头表示基因转录方
向。
(1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶 切割
质粒p－LacZ，然后将MCS 与p－LacZ 连接构建成质粒p01。在此基础上对
MCS 序列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。
(2)将质粒p01～p06 分别与LacZ 基因缺失菌株混合后接种至含 的液体
培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28 ℃和37 ℃条件下
培养后进行β－半乳糖苷酶活性测定，结果(如图乙)表明，应选择质粒
并在 的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是
__________________________________________________________________。
(3)β－半乳糖苷酶可以分解X－gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)
筛选得到的质粒(记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A 和B 的
活性，试写出简要的实验思路：
__________________________________________________________________。
答案 (1)Sac Ⅱ、Bgl Ⅱ (2)氯霉素 p06 28 ℃ 在28 ℃条件下，β－半乳
糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小 (3)将pR 空质粒、pR－
A、pR－B 分别导入LacZ 基因缺失菌株中，并接种到含有X－gal 的培养基上，
在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落蓝色深浅
解析 (1)MCS 为包含多种限制酶切割位点的DNA 序列，用于插入不同外源启
动子，但MCS 自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测
造成干扰，质粒p－LacZ 上的LacZ 基因不含启动子，产物为β－半乳糖苷酶，
可用于检测MCS 启动下游基因表达的活性，因此，要将MCS 插入质粒p－LacZ
中LacZ 基因的上游，为保证MCS 正确插入，应选择双酶切，即选择Sac Ⅱ、
Bgl Ⅱ限制酶切割质粒p－LacZ。(2)重组质粒含有氯霉素抗性基因，可用于筛选
出成功转入重组质粒的菌株，即需要在含氯霉素的液体培养基中培养；分析图乙，
不同质粒和不同温度下β－半乳糖苷酶活性不同，质粒p06 在28 ℃时，β－半乳
糖苷酶活性最低，说明MCS 自身序列启动下游基因表达的干扰最小，在此基础
上插入外源启动子进行活性检测最灵敏。(3)本实验的目的是利用固体培养基初
步比较外源启动子A 和B 的活性，将外源启动子A 和B 分别插入质粒pR 中，检
测β－半乳糖苷酶活性，β－半乳糖苷酶可分解X－gal 产生蓝色物质，使菌落呈
蓝色，该酶活性越强，菌落蓝色越深，因此，可通过检测菌落蓝色深浅表示该酶
活性大小。
热点3 基因编辑技术及其应用
1.基因组编辑的含义
对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。
2.应用最广泛的技术——CRISPR/Cas9 技术
(1)CRISPR/Cas9 组分及功能
短链RNA(sgRNA、向导RNA)
作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，
与目的基因中希望被编辑的DNA 序列结合
细菌的核酸酶Cas9
与短链RNA 结合，切割与向导RNA 结合的
DNA，使DNA 双链断裂
(2)CRISPR/Cas9 技术的主要应用
利用CRISPR/Cas9 技术可以实现基因的敲除、特异突变的引入和定点转基因等。
[例] (2026·西安高新一中质检)CRISPR/Cas9 是目前应用最广泛的基因组编辑技术，
能对DNA 分子中的基因进行编辑，引入人们想要的基因或破坏已有的基因。使
用该技术，需要向待编辑的细胞中加入以下主要组分：人工合成的向导RNA 和
一种来自细菌的核酸酶Cas9 蛋白。其原理是向导RNA 与DNA 分子中希望被编
辑的序列通过碱基互补配对结合后，Cas9 蛋白再结合上去将与向导RNA 结合的
DNA 进行切割，使DNA 双链断裂，过程如下图所示。回答下列问题：
(1)据图推测Cas9 蛋白切断的化学键是 。
(2)当DNA 双链断裂后，可导入目的基因，目的基因的导入往往需要利用基因工
程方法构建基因表达载体，基因表达载体上除了含有目的基因和标记基因，还必
须有
(写出两项即可)。
(3)目的基因在与载体结合前需要用PCR 技术进行大量扩增，该过程需要Taq
DNA 聚合酶，该酶与普通DNA 聚合酶相比，特点是 。获得PCR 产物
后，常用 法对PCR 产物进行鉴定。
(4)与传统的限制酶切割基因技术相比，CRISPR/Cas9 基因编辑技术的明显优点
是__________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
答案 (1)磷酸二酯键 (2)启动子、终止子、复制原点 (3)耐高温 琼脂糖凝胶
电泳 (4)定点编辑基因，实验操作更加精准、高效
解析 (1)由图可知，Cas9 蛋白切断的化学键是核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)基
因表达载体上除了含有目的基因和标记基因，还必须有启动子、终止子、复制原
点。(3)目的基因在与载体结合前需要用PCR 技术进行大量扩增，该过程需要
Taq DNA 聚合酶，与普通DNA 聚合酶相比，其特点是耐高温。获得PCR 产物后
常用琼脂糖凝胶电泳法对PCR 产物进行鉴定。(4)利用CRISPR/Cas9 基因编辑技
术将目的基因导入受体细胞，可使目的基因精确定点敲入，实验操作更加精准、
高效。
强化练4 特殊PCR 技术、双标记基因技术、基因编辑技术
(时间：30 分钟 分值：40 分)
【对点强化】
热点1 PCR 定点突变技术
1.(2026·湖南长郡中学联考)反向PCR 是一种通过已知序列设计引物对未知序列
(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割
B.过程②需要使用DNA 连接酶，形成磷酸二酯键
C.过程③PCR 体系需要添加耐高温的DNA 聚合酶和解旋酶
D.该技术可检测T－DNA 整合到植物染色体DNA 的位置
答案 C
解析 过程③即PCR 扩增，PCR 技术中DNA 解旋是在高温下实现的，不需要加
入解旋酶，C 错误。
2.(2026·江苏无锡模拟)重叠延伸PCR 可实现定点基因诱变，其操作过程如图所
示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是( )
A.过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B.过程①至少需要3 轮PCR 才能得到图中所示PCR 产物
C.过程②的产物都可以完成延伸过程
D.若过程④得到16 个突变基因则需要消耗15 个通用引物RP2
答案 D
解析 两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A 错误；
过程①至少需要2 轮PCR 才能得到图中所示PCR 产物，B 错误；过程②获得的
产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C 错误；若
过程④得到16 个突变基因，则产生16 个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)
通用引物，而需要通用引物RP2 的数量为30÷2＝15(个)，D 正确。
3.(2026·四川成都七中诊断)不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单
链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR 中加入的一对引物中含量较少
的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为
1∶100 ，PCR 反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链
DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关
说法错误的是( )
A.用不对称PCR 方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列
B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA 的量
C.最后大量获得的ssDNA 与图中乙链的碱基序列一致
D.因为双链DNA 和单链DNA 的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
答案 C
解析 不对称PCR 中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限
制性引物能与乙链碱基互补配对，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序
列一致，C 错误。
热点2 含有目的基因的受体细胞的筛选
4.(2026·陕西西安五校联考)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程
如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β－半乳糖苷酶基因编码产生的
β－半乳糖苷酶可分解X－gal 产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。
下列叙述错误的是( )
A.将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA 连接酶
B.需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的状态
C.将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌可正常表达该目的基因
D.在含X－gal 的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落
答案 C
解析 目的基因两侧含有限制酶Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ的识别序列，将目的基因插入
质粒中时，需要用到限制酶Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ切割目的基因和质粒，再用DNA 连
接酶将目的基因和质粒连接在一起，A 正确；将目的基因导入受体细胞时，需要
用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的状态，B 正
确；将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动
子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C 错误；在含X－gal 的培
养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，β－半乳糖苷酶基因编码产生的β－半
乳糖苷酶可分解X－gal 产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，D 正确。
热点3 基因编辑技术及其应用
5.(2025·甘肃卷，21)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯
白色病斑)由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用
CRISPR－Cas9 基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被
白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼
胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如下图)。回答下列问题。
(1)CRISPR－Cas9 重组Ti 质粒构建完成后，可通过 (方法)将该质粒转入
植物细胞，并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的
细胞，需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ，对其消毒时需依
次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分
裂素，原因是_________________________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用 技术检测目
标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与
野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较 来验证抗病性。
(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为
__________________________________________________________________。
答案 (1)农杆菌转化法 Ti 质粒上的T－DNA 潮霉素 (2)外植体 次氯酸钠
生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 (3)PCR
病斑的大小(或病斑面积、发病情况等合理答案) (4)对感病基因SWEET 的启动
子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻
解析 (1)将重组Ti 质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti 质
粒上的T－DNA(可转移DNA)能够整合到植物细胞的染色体DNA 上。利用农杆
菌侵染植物细胞，从而将重组Ti 质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细
胞，由于重组Ti 质粒上含有潮霉素抗性基因(HygR)，所以需要在植物组织培养的
培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti 质粒的细胞才能在含有潮霉素的培
养基上存活。 (2)在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植
体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用
酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和
细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和
细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同
的器官，最终形成再生植株。(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用
PCR 技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR 扩增目标基因的启
动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改
变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通
过比较病斑的大小(或病斑面积、发病情况等)来验证抗病性。如果基因编辑后的
水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。(4)在该研究中，基因编辑
成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET 的启动子区进行定
点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。
【综合提升】
6.(2025·山东卷，25)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，
利用农杆菌转化法将Ti 质粒上的T－DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2
个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发
率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的
Sma Ⅰ对抗除草剂基因X 进行完全酶切，再选择Sma Ⅰ和 对Ti 质粒
进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用
DNA 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行
连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制
酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2 条带，较短的
条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由T－DNA 插入小麦基因组中同一基因导致的，提取
基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA 的基因组片段(图乙)。在此酶切过程
中，限于后续PCR 难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 (填
“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA 中应不含该酶的酶切位点。
需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1 和P2 成功扩增未知序列。PCR
扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2 条片段的未知序列是
否属于同一个基因的操作为 (填“琼脂糖凝胶电泳”
或“测序和序列比对”)。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果
检测到野生型基因， (填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
答案 (1)复制原点 Xba Ⅰ DNA 聚合酶
Sma Ⅰ和Spe Ⅰ 550 (2)4 环化 测序和序列比对 (3)不能
解析 (1)Ti 质粒含有复制原点，使其在农杆菌细胞中能进行自我复制。质粒上
含有的酶切位点有Xba Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和BamH Ⅰ，BamH Ⅰ酶切会破坏
质粒上的终止子，故不能选择BamH Ⅰ对质粒进行酶切。由于目的基因应插入
在启动子和终止子之间，所以应选择Xba Ⅰ和Sma Ⅰ(或Pst Ⅰ和Sma Ⅰ)对Ti
质粒进行完全酶切。由于抗除草剂基因X 使用Sma Ⅰ对其进行完全酶切，两端
均为平末端，为构建基因表达载体，Ti 质粒被Xba Ⅰ或Pst Ⅰ酶切产生的黏性
末端需要被补平，如图表示Xba Ⅰ或Pst Ⅰ酶切产生的黏性末端：
Pst Ⅰ切割质粒得到的黏性末端为
因此用Sma Ⅰ和Xba Ⅰ切割Ti 质粒，然后在DNA 聚合酶作用下补平末端，与
Sma Ⅰ切割得到的目的基因连接。转录时，RNA 聚合酶识别并结合到DNA 上
的启动子区域，随后沿着模板链的3′→5′方向移动，按照5′→3′方向催化合成
mRNA，故转录模板链的3′端所在的一侧为基因的上游，靠近启动子，由图甲中
指示的转录模板链可知，图中抗除草剂基因X 左侧应靠近启动子。正向连接与
反向连接情况如图所示。
可用Sma Ⅰ、Spe Ⅰ对筛选的重组质粒进行酶切，若目的基因正向连接到质粒
上，则可得到一长一短2 条带，短的约为550 bp，若反向连接，也可得到一长一
短2 条带，短的约为200 bp。
(2)一个长度为n 个碱基对的特定识别序列，其在DNA 中随机出现的概率是
(1/4)n，故限制酶识别序列的碱基对数越少，该识别序列在DNA 中出现的概率就
越高。因为后续PCR 难以扩增大片段DNA，所以需要酶切产生相对较小的片段。
识别序列为4 个碱基对的限制酶在DNA 分子中识别位点更多，酶切后产生的片
段相对较小，更有利于后续的PCR 扩增。直接利用引物P1、P2 不能成功扩增图
乙所示DNA 未知序列，若先将该DNA 片段首尾相接成环状，则利用P1、P2 可
成功扩增未知序列。序列相同的DNA 片段属于同一基因，故可通过测序和序列
比对判断2 条片段的未知序列是否属于同一个基因，琼脂糖凝胶电泳只可区分
DNA 片段的大小，不可得知其序列。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含野生型基因的表达载体转入突变植株，如果能
在突变植株内检测到野生型基因，但由于不知道该突变是否为显性突变，故不能
确定该植株的表型是否为野生型。
