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专题11 基因工程
考点概览
考点01 基因工程的基本工具
考点02 基因工程的基本操作程序
考点03 基因工程的应用
考点04 基因工程综合
基因工程的基本工具
1．(24-25 高三下·河南湘豫联考·二模)下列关于传统或现代生物技术的叙述，正确的是（ ）
A．DNA 的粗提取与鉴定实验中可利用DNA 不溶于酒精的特点来提纯DNA
B．当果酒发酵结束后，只需打开瓶盖，盖上一层纱布，即可进行果醋发酵
C．克隆动物的培育过程使用了体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
D．通过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白
基因工程的基本操作程序
2．(24-25 高三下·河南部分学校·二模)结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，与癌变相关的基因有多个，其
中就包含原癌基因A。研究人员利用DNA 重组技术将突变的原癌基因A 克隆到质粒载体上，用于后续
癌症发生机制和癌症治疗的研究。下列说法错误的是（ ）
A．为保证原癌基因A 正确连入，质粒载体上最少需要2 个限制酶切割位点
B．原癌基因A 过量表达而导致相应蛋白质活性过强，就可能引起细胞癌变
C．可利用Ca²⁺转化法将质粒载体导入大肠杆菌或癌细胞内
D．可利用洋葱DNA 粗提取实验的部分步骤提取导入大肠杆菌内的质粒载体
3．(24-25 高三下·河南洛平许济·二模)科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该
质粒的部分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5；该重组质粒在受体细胞内正确表达
后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。下列分
析错误的是（ ）
考点01
考点02
A．作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点
B．为检测J 基因是否插入到图甲所示的位置，需用引物F1 和R1 进行PCR
C．若J 基因转录的模板链位于b 链，则引物F2 与图甲中a 链相应部分的序列相同
D．图乙中，条带1 的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了J-V5 融合蛋白
4．(24-25 高三下·河南信阳高级中学·二模)科学研究中，若已知一种药物或疗法有效，则可将其设置为阳性
对照，以检测新药物或疗法的有效性。下列关于各实验的叙述，错误的是（ ）
A．检测过敏原的实验中，常以组胺注射至皮下作为阳性对照组
B．探究某种新药是否能治疗1 型糖尿病，以给糖尿病模型鼠注射胰岛素作为阳性对照
C．利用PCR 和电泳确认目的基因是否导入成功，阳性对照组样品是目的基因片段
D．探究内环境中是否存在缓冲物质，分别以自来水、肝匀浆作为阳性对照组和实验组材料
基因工程的应用
5．(24-25 高三下·河南天一大联考·二模)人乳头瘤病毒（HPV）可导致子宫颈癌，HPV 的L1 蛋白在多种类
型的HPV 中均存在，接种二价疫苗对高危型病毒HPV16 与HPV18 的保护效果均达到100%。下列相关
叙述正确的是（ ）
A．免疫防御功能降低使持续感染HPV 的女性易患子宫颈癌
B．HPV 疫苗可以诱导机体中的浆细胞活化并分泌HPV 抗体
C．二价疫苗的保护效果完全取决于机体中相应抗体的水平
D．利用基因工程生产HPV 的L1 可作为HPV 疫苗的设计思路
基因工程综合
6．(24-25 高三下·河南天一大联考·二模)木糖醇作为一种重要的功能性甜味剂，在食品和医药领域应用广泛。
同源重组法是构建基因表达载体的重要方法，其原理是带有相似序列的DNA 分子之间可以发生同源重
组。某科研小组先将质粒线性化后，分别对木糖醇脱氢酶基因（XDH）、绿色荧光蛋白基因（GFP）
和线性化载体进行PCR 扩增（通过引物引入同源序列），再将得到的目的基因片段和线性质粒片段进
行同源重组，构建表达载体，其过程如图所示，回答下列问题：
考点03
考点04
注：图中“→”表示PCR 引物；条纹或颜色相同的序列表示同源序列或相同序列；KanR表示卡那
霉素抗性基因。
(1)利用同源重组法构建基因表达载体的过程中，环状质粒经 处理后可获得线性化的质粒，
PCR 扩增目的产物片段的过程中，图中引物 的 端应含有质粒的同源序列，以便进行
同源重组。
(2)据图分析，引物F2-F 和F1-R 的碱基序列应具有的特点有 。PCR 扩增线性化质粒的过程中所
用的引物组合是 ；向PCR 产物片段和线性载体的混合体系中加入重组酶的作用可能是
。
(3)实验小组检测大肠杆菌中是否导入重组质粒时，会先挑取单个菌落，再通过热处理使细菌的细胞壁
和细胞膜裂解，并直接以菌体热解后暴露的DNA 为模板进行PCR 扩增，这种技术称为菌落PCR 技
术。与常规PCR 相比，菌落PCR 的优点和缺点是 （各列举1 例）。
7．(24-25 高三下·河南新乡·二模)培育稳定且抗病能力强的番茄新品种是稳产高产的重要途径。番茄代谢产
生的H2O2是一种重要的抗病信号分子，可被体内的过氧化氢酶清除。现采用CRISPR/Cas9 基因编辑技
术敲除番茄过氧化氢酶基因，过程如图1 所示。获取的突变体可作为分析番茄的抗病性和产量的遗传
材料。回答下列问题：
(1)常用PCR 快速扩增目的基因，PCR 反应体系需含 （至少答2 种）等成分。常采用
来鉴定PCR 的产物。
(2)CRISPR/Cas9 由gRNA 和Cas9 蛋白两大部分组成，gRNA 由crRNA 和tracrRNA 组成，其中crRNA
约有20 个碱基，含有与靶基因片段配对的序列，能引导Cas9 切开靶基因所在双链DNA，随后细胞
中的酶将断裂上下游两端的序列连接起来，实现对基因的编辑。番茄过氧化氢酶基因CRISPR/Cas9
敲除突变体载体构建过程如图2 所示，其中“某序列”是指 。为了确保“某序列”能正
确连接到Ti 质粒上，相应的限制酶识别序列和切割位点如表所示，需在“某序列”的引物1 的5′端
加上碱基序列 ，引物2 的5′端加上碱基序列 。
限制酶
识别序列和切割位点
BglⅡ
5′A↓GATCT3′
NheⅠ
5′G↓CTAGC3′
(3)制备过程中利用了农杆菌Ti 质粒的T-DNA，原因是T-DNA 具有 的特点。
(4)植物组织培养常用MS 培养基，该培养基中加入适量的蔗糖的作用是 。可在MS 培养基中
添加 （填激素及比例）用于诱导愈伤组织。
8．(24-25 高三下·河南安阳·二模)科研人员常利用λ-Red 同源重组酶系统进行基因敲除、敲入等操作，其原
理是λ-Red 同源重组酶系统将一段携带同源序列的标记基因与特定靶序列进行同源重组，使靶基因被
标记基因置换下来，如图所示。回答下列问题：
(1)将pKD46 载体导入大肠杆菌时需用 Ca2+处理大肠杆菌，目的是 。检测大肠杆
菌是否含有pKD46 载体时，可依据pKD46 载体中的 的特性。
(2)PCR 时，HA1 和HA2 是依据 （填“靶基因”或“NPTⅡ”）两侧的碱基序列而设计的。
(3)与构建基因表达载体相似，λ-Red 同源重组酶系统可将标记基因插入特定 DNA 片段中。据图分析，
二者的不同之处是 。
(4)检测靶基因是否敲除成功时，科研人员采取了以下两种方法：
PCR
①
。提取过程Ⅱ处理后大肠杆菌中的 DNA 分子，依据靶基因的序列设计引物进行PCR，用
方法检测 PCR 结果，若 ，则说明基因敲除成功。
②培养基培养。从培养基成分角度，简要描述检测思路： 。
9．(24-25 高三下·河南湘豫联考·二模)科研人员根据获得的红花转录因子基因（CtWRI1）的cDNA 序列设
计引物，通过PCR 获得CtWRI1 编码序列，并通过烟草遗传转化对其功能进行研究。图甲为实验过程
中使用的Ti 质粒图谱及T-DNA 结构，其中Rifr代表利福平抗性基因，bar 代表除草剂抗性基因，LB 和
RB 分别代表T-DNA 的左边界和右边界。图乙为不同限制酶的酶切序列和CtWRI1 的结构及转录方向。
回答下列问题：
(1)为了将CtWRI1 编码序列与图甲中的Ti 质粒正确连接，构建引物F 和引物R 时应在 端分别
添加 的识别序列，通过酶切和连接后可获得连接产物。
(2)CtWRIl 转录的模板链的序列为：5'-TTAGCCT……TACCGACAT-3'，请写出引物R 的前10 位碱基序
列：：5'- -3'。
(3)通过 法将CtWRII 编码序列导入烟草细胞，利用含 的培养基对烟草细胞进行初步筛
选，再通过 技术获得转基因烟草。可以通过 等技术从分子水平上检测烟草细胞的
染色体DNA 上是否插入了CtWRI1 编码序列。
(4)科研人员测定野生型烟草（WT）和转基因烟草中CtWRI1 的相对表达量、脂肪酸合成基因的相对表
达量和种子含油量，结果见图丙。据图丙分析，转基因烟草种子含油量增加的可能原因是
。
10．(24-25 高三下·河南郑州·二模)棉花是重要的经济作物，但其生长易受杂草和棉铃虫的侵害，从而造成
减产。科学家成功构建了抗除草剂和抗虫双价植物表达载体pBI121-Bar/Bt（pBI121 是Ti 质粒，Bar 是
抗除草剂基因，Bt 是抗虫基因），构建过程如下图所示，并通过农杆菌转化法获得了具有两种抗性的
转基因棉花。请回答相关问题。
(1)Ti 质粒pBI121 中的35S 序列属于 （填“启动子”或“终止子”），它的作用是 。据
图分析，Bar 基因插入MCS 序列后，以 （填“α”或“β”）链为模板进行转录。
(2)请仿照图例在下图合适位置中标出MCS 序列被酶切后产生的切口，以保证能成功构建重组质粒
pBI121-Bar 。
(3)检测pBI121-Bar 是否重组成功，通常要用到大肠杆菌，经Ca2+诱导后使其处于能 的状态，
筛选时需向培养基中额外添加 （填物质名称），然后挑选平板上生长的单菌落，利用Bar 基
因两端序列制作的引物进行PCR，并采用 来鉴定PCR 的产物。
(4)pBI121-Bar 与Bt-4AB 成功重组后，需导入农杆菌LBA4404 中，该农杆菌含Vir 基因，酚类物质可以
诱导其表达。Vir 基因表达的产物能识别Ti 质粒的LB/RB 序列，水解 （填化学键）将T-
DNA 剪切下来。
(5)农杆菌与棉花愈伤组织共培养时，T-DNA 发生转移并整合到 。个体水平上检测时，可通过
来确定棉花是否具有抗性及抗性程度。
11．(24-25 高三下·河南部分学校·二模)生长激素制剂是治疗垂体性侏儒症的特效药。人们从450 升大肠杆
菌培养液中提取的生长激素，相当于6 万头动物的全部产量。图1 是通过基因工程将人的生长激素基因
导入大肠杆菌中生产生长激素的过程，图2 是基因工程中所用到的质粒，图3 是通过PCR 获取和扩增
目的基因。请回答下列问题：
(1)图1 通过 过程得到目的基因A 后，通过③过程进行PCR 扩增。图1 中基因工程的核心步骤
是 （填序号）。
(2)若利用图3 过程获取和扩增A 基因，需要选择的一对引物是 。图3 中的基因表达时，
（填“a”或“b”）链作为转录的模板链。
(3)要使A 基因能正确与图2 中的质粒拼接在一起，需要在所选引物的 端分别增加相应的限制
酶的酶切位点。分析图2 和图3，为了防止目的基因的反向连接，可在目的基因的上、下游分别添
加 （填限制酶名称）的识别序列。
(4)科学家将A 基因与乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，导入性染色体组成为 的哺乳动物
受精卵中，然后将其处理并输送入受体动物体内，使其生长发育成转基因动物，若该动物
，则转基因动物培育成功。
12．(24-25 高三下·河南开封·二模)出地盐碱化是农业生态环境退化的重大问题之一。选育耐盐碱的优良品
种可以保鞭国家粮食安全、提高土地利用效率和促进农业可持续发展、研究人员尝试将OsCYP2 耐盐
基因导入水稻中，以开发耐盐水稻新品种。回答下列问题。
(1)在本研究中，OsCYP2 耐盐基因属于 ，获得后可通过 技术进行扩增。
限制酶
识别序列
BamHⅠ
5'-G↓GATCC-3'
XhoⅠ
5'-G↓TCGAG-3'
PstⅠ
5'-G↓TGCAG-3'
EcoRⅠ
5'-G↓AATTC-3'
SalⅠ
5'-G↓TCGAC-3'
(2)已知OsCYP2 耐盐基因的模板链为甲链，构建基因表达载体时，为了保证OsCYP2 耐盐基因与Ti 质
粒进行正确的拼接，需要用 酶处理OsCYP2 耐盐基因，用 酶处理Ti 质粒，再用DNA
连接酶连接。
(3)利用Ti 质粒将OsCYP2 耐盐基因导入水稻细胞的方法是 。
(4)检测OsCYP2 耐盐基因在水稻细胞中是否稳定存在时，可用重组酶聚合酶扩增技术（简称RPA）进
行检测。RPA 技术主要依赖重组酶uvsX、单链结合蛋白Gp32、链置换DNA 聚合酶Bsu，其中重组
酶uvsX 能够在37℃-42℃时解开双链DNA．RPA 反应开始的时候，重组酶uvsX 结合单链DNA（引
物），形成核酸蛋白复合体，这些复合体能够扫描（识别）与引物序列互补的目标双链DNA．接着，
核酸蛋白复合体侵入
端位点使DNA 双链打开。单链结合蛋白Gp32 与被置换单链结合使其稳定。
同时，重组酶uvsX 离开寡核苷酸的3'端，降解后被DNA 聚合酶利用。之后，链置换DNA 聚合酶
Bsu 结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行子链延伸。以上步骤循环进行，就可以实现DNA 的指
数增长。其过程如图所示。
①用RPA 技术检测时，引物应与 相同。
②相对于PCR 而言，RPA 技术具有 、仪器依赖性低等突出优点，利于现场检测和即时诊断。
③通过优化 ，可以进一步提高RPA 技术的特异性和灵敏性。
13．(24-25 高三下·河南洛平许济·二模)我国科研人员利用多种现代生物技术，在猪的体内培育出了一个
“人-猪嵌合中期肾”，且维持到胚胎第28 天（实验过程如图1 所示），该研究实现了世界首例人源化
肾脏异种再生的壮举。回答下列问题。
(1)据图1 分析，在“人源化中肾”的培养过程中，运用了 等动物细胞工程的技术（答出3 点即
可）。
(2)过程②常用的去核方法为 ，所谓的“核”实际上是 。过程③中，获得单细胞悬液时，
猪胚胎剪碎后需用 处理。
(3)过程④运用基因编辑技术（见图2，Cas9 蛋白在向导RNA 引导下，切割目标DNA 双链）敲除成纤
维细胞中的猪肾发育的关键基因SIX1，可以为后续人iPS 细胞的生长和分化提供更合适的生存环境。
下列对于该过程的分析，正确的有 。
A．Cas9 蛋白由相关基因指导在核糖体上合成，向导RNA 可在逆转录酶催化下合成
B．Cas9 蛋白识别并切割SIX1 基因特定位点的磷酸二酯键，其作用方式与限制酶相同
C．向导RNA 的部分序列是根据SIX1 基因设计的，其双链区遵循碱基互补配对原则
D．敲除SIX1 基因的猪胚胎可避免猪细胞与人iPS 细胞竞争肾脏发育的环境
(4)过程⑧中，选用iPS 细胞作为肾脏供体细胞的原因是 。在早期胚胎阶段，猪胚胎的细胞尚未
完全分化成各种类型的细胞和组织，细胞之间的连接较松散，这使得导入的人iPS 细胞较容易在猪
胚胎中整合，胚胎的可塑性也较强，据此判断在构建嵌合胚胎过程中，可在猪胚胎发育至
（填“桑葚胚”或“囊胚”）期注射人源供体细胞。合适的培养基是提高iPS 细胞嵌合能力的关键，
下列有关叙述错误的是 。
A．培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等营养物质
B．为保证体外培养细胞处于无菌、无毒的环境，除无菌操作外，培养液还需定期更换
C．动物细胞应放入含5%CO2培养箱中培养，CO2的主要作用是刺激细胞呼吸
D．维持动物细胞体外生存必须有适宜的温度、pH 和渗透压等环境条件
14．(24-25 高三下·河南信阳高级中学·二模)（一）下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配
方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。
成分
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
指示剂
琼脂
含量（g）
10.0
5.0
5.0
2.0
0.2
12.0
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
(1)若根据用途划分，该培养基属于 培养基。若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培
养基的营养成分必须怎样更改？ 。
（二）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为
研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14 的单克隆抗体，具体方法如下。
回答下列问题：
基因工程抗原的制备
(2)载体和CD14 片段的酶切位点及相应的限制酶识别序列如图1 所示。根据美西螈CD14 基因的核苷酸
序列，合成引物，利用PCR 扩增CD14 片段。用XhoI 和SalI 分别酶切CD14 和载体后连接，CD14
接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA，可进一步用这两种限制酶对CD14 的连接
方向进行鉴定，理由是 。培养能表达CD14 蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
抗CD14 单克隆抗体的制备流程如图2 所示：
(3)步骤①和⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原一抗体杂交原理，需加入 进行专一抗体检测，检
测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14 抗体
(5)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14 抗体，用于检测巨噬细胞。
