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专题11 基因工程
考点概览
考点01 基因工程的基本工具
考点02 基因工程的基本操作程序
考点03 基因工程的应用
考点04 基因工程综合
基因工程的基本工具
1、（2025 云南昆明一模）下列实验方法或操作不合理的是（ ）
A．用台盼蓝染液处理动物细胞以检测细胞膜的选择透过性
B．用
15N 标记DNA 并检测其放射性来证明DNA 的半保留复制
C．用二苯胺试剂在沸水浴条件下鉴定提取物中是否含有DNA
D．用抽样检测的方法调查培养液中酵母菌种群数量的变化
【答案】B
【知识点】细胞膜的功能、探究DNA 的复制过程、探究培养液中酵母菌种群数量的变化、DNA 的粗提取
及鉴定的方法
【分析】生物大分子的检测方法：蛋白质与双缩脲试剂产生紫色反应；淀粉遇碘液变蓝；还原糖与斐林试
剂在水浴加热的条件下产生砖红色沉淀；观察DNA 和RNA 的分布，需要使用甲基绿吡罗红染色，DNA
可以被甲基绿染成绿色，RNA 可以被吡罗红染成红色，脂肪需要使用苏丹Ⅲ（苏丹Ⅳ）染色，使用酒精洗
去浮色以后在显微镜下观察，可以看到橘黄色（红色）的脂肪颗粒。
【详解】A、台盼蓝是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的选择透过性。 正常活细胞的细胞膜具有选择透
过性，台盼蓝不能进入细胞，细胞不会被染色；而死细胞的细胞膜失去选择透过性，台盼蓝可以进入细胞，
使细胞被染成蓝色，A 正确；
B、证明DNA 的半保留复制是用15N 标记DNA，然后通过密度梯度离心，根据DNA 分子在离心管中的位
置来判断DNA 的复制方式，而不是检测其放射性。 因为15N 是稳定同位素，不具有放射性，B 错误；
C、DNA 与二苯胺试剂在沸水浴条件下会呈现蓝色反应，所以可以用二苯胺试剂在沸水浴条件下鉴定提取
物中是否含有DNA，C 正确；
D、由于培养液中酵母菌数量众多，逐个计数非常困难，所以常用抽样检测的方法，如血细胞计数板计数
等，来调查培养液中酵母菌种群数量的变化，D 正确。
故选B。
2、（2025 云南曲靖一模）酒精是高中生物学实验中常用的化学试剂，在不同实验中可能有不同的作用，
下列叙述正确的是（ ）
A．“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，酒精只能用来冲洗卡诺氏液
B．“绿叶中色素的提取和分离”实验中可用95%的酒精直接提取色素
C．“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，可用95%的酒精初步分离DNA 和蛋白质
考点01
D．“检测生物组织中的脂肪”实验中，常用50%的酒精使组织细胞相互分离
【答案】C
【知识点】检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质、绿叶中色素的提取和分离实验、低温诱导植物染色体
数目的变化实验、DNA 的粗提取与鉴定的实验设计
【分析】酒精是生物实验常用试剂之一，如检测脂肪实验中需用体积分数为50%的酒精溶液洗去浮色；观
察植物细胞有丝分裂实验和低温诱导染色体数目加倍实验中都需用体积分数为95%的酒精对材料进行解离；
绿叶中色素的提取和分离实验中需用无水酒精来提取色素；果酒和果醋制作实验中可用体积分数为70%的
酒精进行消毒；DNA 的粗提取和鉴定中可以体积分数为95%的冷酒精进一步纯化DNA 等。
【详解】A、在“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，酒精有两个作用，一是用卡诺氏液固定
细胞形态后，用体积分数为95%的酒精冲洗2 次，冲洗卡诺氏液；二是在解离步骤中，使用质量分数15%
的盐酸和体积分数95%的酒精1:1 混合制成解离液进行解离，所以酒精不只是用来冲洗卡诺氏液，A 错误；
B、“绿叶中色素的提取和分离”实验中，若用95%的酒精提取色素，需要加入适量的无水碳酸钠，以除
去酒精中的水分，才能提取色素，不能直接用95%的酒精提取，应该用无水乙醇直接提取色素，B 错误；
C、“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，DNA 不溶于95%的酒精，而蛋白质等杂质可溶于酒精，所以可用
95%的冷却酒精初步分离DNA 和蛋白质，C 正确；
D、“检测生物组织中的脂肪”实验中，常用50%的酒精洗去浮色，而不是使组织细胞相互分离，D 错误。
故选C。
基因工程的基本操作程序
3、（2025 云南丽江一模）“筛选”是生物技术与工程中常用的技术手段。下列叙述错误的是（ ）
A．胚胎移植前，需对通过体外受精或其他方式得到的胚胎进行质量筛选
B．制备单克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生多种抗体的杂交瘤细胞
C．培育转基因抗虫棉时，需从分子水平及个体水平进行筛选
D．发酵生产中，性状优良的菌种可以从自然界中筛选
【答案】B
【知识点】目的基因的检测与鉴定、动物细胞融合与单克隆抗体的制备、胚胎移植技术
【分析】1、单克隆抗体制备的两次筛选：①利用选择培养基筛选得到杂交瘤细胞(去掉未 杂交的细胞以及
自身融合的细胞)；②进行抗体检测，筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
2、胚胎移植前，需对通过体外受精或其他方式得到的胚胎进行质量筛选，此时胚胎应发育到桑葚胚或囊
胚阶段。
3、培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导
入受体细胞、目的基因的 检测与鉴定。
【详解】A、胚胎移植前，需对通过体外受精或其他方式得到的胚胎进行质量筛选，挑取质量好，活性强
的胚胎进行培养或保存，可以提高胚胎移植成功的概率，A 正确；
B、制备单克隆抗体时，在筛选出杂交瘤细胞后，需要进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选就可获得
足够数量的能分泌所需抗体的细胞。上述筛选过程中涉及的抗体检测属于分子水平的筛选，因此，制备单
克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞，B 错误；
C、培育转基因抗虫棉时，在将目的基因导入受体细胞后，需要从分子水平上鉴定目的基因（Bt 基因）是
否成功导入、稳定存在和表达，还需要通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来从个体水平上确定Bt 基因是否
考点02
赋予了棉花抗虫特性和评估其抗性程度，从而筛选出有较好抗虫特性的转基因抗虫棉。所以，培育转基因
抗虫棉时，需从分子水平及个体水平进行筛选，C 正确；
D、用于发酵工程的性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得，
D 正确。
故选B。
4、（2025 云南昆明一模）检测甲流病毒（遗传物质为RNA）最常见的方法是实时荧光定量PCR，原理是
在PCR 反应体系中加入与某条模板链片段互补的荧光探针，其两端有荧光分子（R）和淬灭剂（Q）。当
探针完整时，R 不发出荧光，否则R 发出荧光，具体过程见下图。下列叙述正确的有几项（ ）
①该PCR 扩增是直接以甲流病毒的遗传物质作为模板进行的
②此荧光探针是以甲流病毒遗传物质序列合成的短DNA 单链，本身不发出荧光
③耐高温的DNA 聚合酶可能还有水解荧光探针的作用，使R 发出荧光
④检测到的荧光强度与反应体系中扩增出的DNA 分子数成正比
A．3 项
B．2 项
C．1 项
D．0 项
【答案】A
【知识点】PCR 扩增的原理与过程
【分析】PCR 原理：在高温作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链
的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原
因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。PCR 反应过程：变性→复性→延伸。
【详解】①甲流病毒为 RNA 病毒，欲用 PCR 检测需先经逆转录形成 cDNA，再以此为模板进行扩增，
不能直接以 RNA 为模板，①错误；
②探针是依据甲流病毒的序列合成的短的DNA 单链，结合图示可知，荧光探针含有荧光分子，当探针完
整时，R 不发出荧光，故该探针本身不发光，②正确；
③耐高温的DNA 聚合酶可能还有水解荧光探针的作用，使R 发出荧光，③正确；
④随着 PCR 产物量的增加，被水解释放的荧光分子也相应增多，荧光强度与扩增出的 DNA 分子数成正
比，④正确。
故选A。
5、（2025 届云南省保山市腾冲市第八中学高三一模）SRY 基因是哺乳动物Y 染色体上具有决定雄性性别
作用的基因片段，常用于对移植前的胚胎进行性别鉴定，其过程如下：以胚胎细胞中提取的DNA 为模板
进行PCR 扩增获得SRY 基因，再用特异性探针（是一段带有检测标记，能与目的基因互补的核苷酸序
列）对扩增产物进行检测，该鉴定方法被称为SRY-PCR 法。下列叙述错误的是（ ）
A．粗提取DNA 时，利用了DNA 不溶于酒精，蛋白质溶于酒精的原理
B．设计引物和探针时都需要用到SRY 基因的核苷酸序列
C．扩增SRY 基因过程中，当温度降到50℃左右时，开始合成新的DNA 链
D．用特异性探针对经变性处理的扩增产物进行检测，若结果呈阳性，则检测个体为雄性
【答案】C
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、DNA 的粗提取及鉴定的方法、基因表达载体的构建、目的基因的检
测与鉴定
【分析】由题干信息分析可知，用SRYA 特异性探针对扩增产物进行检测，若形成杂交带，则说明其含有
SRY 基因（位于Y 染色体上的性别决定基因），则胚胎的性别为雄性，若出现阴性反应，没有出现杂交带，
则胚胎为雌性。
【详解】A、粗提取DNA 的原理是DNA 在酒精中沉淀，而蛋白质溶解，A 正确；
B、引物和探针的设计需要基于SRY 基因的序列，这样才能在后面进行碱基互补配对，B 正确；
C、扩增SRY 基因时，当温度下降到50℃左右时，两种特异性引物通过碱基互补配对会与两条单链的
DNA 链结合，DNA 链的合成发生在延伸阶段，温度通常在72℃左右，C 错误；
D、用SRY 特异性探针对扩增产物进行检测，若形成杂交带，即呈阳性，则说明其含有SRY 基因，则胚胎
的性别为雄性，D 正确。
故选C。
6、（2025 届云南省保山市腾冲市第八中学高三一模）PCR 仪实际上是一个温控设备，能在每次循环的3
个步骤间进行温度切换，主要过程如图所示，图中a、b、c 表示过程。下列叙述正确的是（ ）
A．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高PCR 复性的温度
B．耐高温的DNA 聚合酶能与引物结合，并从引物的5＇端连接脱氧核苷酸
C．每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同
D．PCR 循环过程控制的温度高低关系为a>b>c
【答案】C
【知识点】PCR 扩增的原理与过程
【分析】PCR 原理：在高温作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链
的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原
因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
【详解】A、若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低PCR 复性的温度，以便引物与模板链结合，A
错误；
B、耐高温的DNA 聚合酶能与引物结合，并从引物的3＇端连接脱氧核苷酸，B 错误；
C、每次循环解旋后的两条单链分别与两种引物结合，故每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同，C
正确；
D、PCR 循环过程，a 为解旋需90℃以上，b 为复性，温度需下降至50℃左右，c 为延伸，需上升到72℃
左，因此PCR 循环过程控制的温度高低关系为a>c>b，D 错误。
故选C。
7、（2025 云南红河一模）马铃薯块茎在储存和运输过程中极易受损，导致大量褐变甚至发黑。马铃薯多
酚氧化酶（PPO）是导致马铃薯发生褐变的关键酶类，在PPO 基因家族中St32 基因在马铃薯块茎中的表达
占主导地位。研究人员利用RNAi 技术，构建了可抑制马铃薯褐变的RNAi 表达载体，获得了可以不表达
PPO 的转基因马铃薯。回答下列问题：
(1)RNAi 是指个体将导入的目的基因在体内加工合成出相应的双链RNA 片段，并结合到目的基因对应的
mRNA 模板上，使该基因在个体中不表达或表达降低的一种技术。在构建RNAi 表达载体时，应选择的目
的基因是 ，原因是 。
(2)将目的基因导入植物受体细胞常用的方法是农杆菌转化法，因为农杆菌中含有 结构，其作用
是 。
(3)转基因食品对人体是否产生影响这个话题一直备受争议，因此本研究在RNAi 的基础之上加入了Gene-
Deletor 技术。该技术是一项外源基因清除技术，利用特定条件激活重组酶FLP 的合成，通过识别并切割
LF 位点，将插入该位点之间的外源基因全部删除，获得符合转基因安全条例的新种质。结合题图及以上信
息分析，目的基因应该插入在下图中 （填“①”或“②”或“③”）位置，为保证转基因食品
安全，转基因马铃薯在食用前应进行 处理，原因是 。
【答案】(1) St32 基因 St32 基因是导致马铃薯发生褐变的主要基因
(2) Ti 质粒 农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA 转移到被侵染的细胞，并将其整合
到该细胞的染色体DNA 上
(3)
①
冷藏 冷藏处理可以激活启动子PCL 启动FLP 基因的表达，从而产生重组酶FLP，
FLP 可以特异性识别并切割LF 位点，将外源基因删除
【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、筛选、获取合适的目的基因
【分析】基因工程：按照人们的意愿，把一种一种生物的某个基因提取出来，加以修饰，然后导入到另外
一种生物的细胞中，定向的改造生物的遗传性状。
【详解】（1）马铃薯多酚氧化酶（PPO）是导致马铃薯发生褐变的关键酶类，在PPO 基因家族中St32 基
因在马铃薯块茎中的表达占主导地位，所以应选择的目的基因是St32 基因。
（2）农杆菌侵染植物细胞后，因为农杆菌中含有Ti 质粒结构，能将Ti 质粒上的T-DNA 转移到被侵染的
细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA 上。
（3）目的基因应该插入在启动子与终止子之间，应该插入在下图中①位置。因为冷藏处理可以激活启动
子PCL 启动FLP 基因的表达，从而产生重组酶FLP，FLP 可以特异性识别并切割LF 位点，将外源基因删
除，所以为保证转基因食品安全，转基因马铃薯在食用前应进行冷藏处理。
8、（2025 云南昆明一模）苜蓿是一种耐旱性较强的牧草，推测苜蓿的Mfhb-1 基因参与抗旱应答，为进一
步研究该基因功能，通过农杆菌转化法将Mfhb-1 基因转入到二倍体植物拟南芥的野生型植株中，所用载
体见下图。组成型启动子可高效地启动目的基因在植物各种组织中的表达，但常会阻碍植物的生长发育。
诱导型启动子可在特定环境条件下诱导目的基因的表达。回答下列问题。
限制酶
BclⅠ
SacⅠ
BamHⅠ
PstⅠ
SmaⅠ
识别序列和酶切位
点
T↓GATCA
GAGCT↓C
G↓ATCC
CTGCA↓G
CCC↓GGG
(1)用载体1 构建含Mfhb-1 基因的表达载体，可以成功转化拟南芥，但会出现抑制抗性芽生长和抗性植株
生根的现象，推测
35S 启动子属于 启动子。若要将载体1 中的启动子替换为Rd29A 启动子，需要用
酶切割载体1、2，并用 （填“E.coliDNA”或“T4DNA”）连接酶进行连接。
(2)通过农杆菌转化法，研究者成功的将Mfhb-1 基因整合到拟南芥的一条染色体上，这些植株自交，F1中
Mfhb-1 基因纯合植株的概率是 。
(3)研究者采用RT-PCR 技术对Mfhb-1 基因纯合植株进行转录情况鉴定，首先分别提取拟南芥Mfhb-1 基因
纯合植株和野生型植株的 作为模板，经逆转录获得cDNA，再以cDNA 作为模板进行PCR 扩增，扩
增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如下图，2 号泳道加入的样品是基因表达载体中Mfhb-1 基因的PCR 产
物，则纯合植株和野生型植株的RT-PCR 扩增产物分别加入 泳道。
(4)为进一步研究转入拟南芥的Mfhb-1 基因表达产物的功能，还需在个体水平开展的研究是 。
【答案】(1) 组成型 SmaⅠ和SacⅠ T4DNA
(2)1/4
(3) 总RNA（RNA） 3、1
(4)比较分析Mfhb-1 基因纯合植株和野生型植株的抗旱能力
【知识点】基因分离定律的实质和应用、PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测
与鉴定
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：分
子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目的
基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体
水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）由题干信息可知，组成型启动子可高效地启动目的基因在植物各种组织中的表达，但常会
阻碍植物的生长发育。结合题意，用载体1 构建含Mfhb-1 基因的表达载体，可以成功转化拟南芥，但会出
现抑制抗性芽生长和抗性植株生根的现象，推测35S 启动子属于组成型启动子。若要将载体1 中的启动子
替换为Rd29A 启动子，一般选择载体1 和载体2 上都有的限制酶切位点，且一般选择双酶切法，同时还要
考虑启动子插入的方向，因此结合题图，需要用SmaⅠ和SacⅠ酶切割载体1、2。SacⅠ酶切后会形成黏性末
端，SmaⅠ酶切后会形成平末端，T4DNA 连接酶即能连接黏性末端，又能连接平末端，而E.coliDNA 连接
酶只能连接黏性末端，因此选择T4DNA”连接酶进行连接。
（2）通过农杆菌转化法，研究者成功的将Mfhb-1 基因整合到拟南芥的一条染色体上，假设Mfhb-1 基因
用M 表示，则这些植株的基因型为Mm，自交后产生的F1 的基因型及其比例为MM：Mm：mm=1:2:1，
F1 中Mfhb-1 基因纯合植株（MM）的概率为1/4。
（3）逆转录是以RNA 为模板合成DNA 的过程，因此研究者采用RT-PCR 技术对Mfhb-1 基因纯合植株进
行转录情况鉴定，首先分别提取拟南芥Mfhb-1 基因纯合植株和野生型植株的总RNA 作为模板，经逆转录
获得cDNA。结合题意并分析电泳结果可知，2 号泳道加入的样品是基因表达载体中Mfhb-1 基因的PCR 产
物，比较可得3 号泳道为纯合植株的RT-PCR 扩增产物，野生型植株中不含Mfhb-1 基因，因此在电泳过程
中未显示为条带，对应1 号泳道。
（4）为进一步研究转入拟南芥的Mfhb-1 基因表达产物的功能，还需在个体水平开展的研究是比较分析
Mfhb-1 基因纯合植株和野生型植株的抗旱能力。
基因工程的应用
9、（2025 云南红河一模）据研究，W 基因在植物发育和逆境应答过程中发挥重要作用。研究人员将W 基
因的启动子（PW）与GUS 基因相连，构建拟南芥PW-GUS 融合植株（GUS 为报告基因，其表达产物可催
化无色底物变蓝），用无色底物处理拟南芥幼苗的根，探究W 基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平，下列
叙述错误的是（ ）
A．扩增W 基因启动子需2 种引物，并在引物3'端加入酶切位点
B．PW 和GUS 基因进行双酶切后，可通过T4 DNA 连接酶连接
C．培养拟南芥无菌苗的MS 固体培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌
D．通过观察根蓝色深浅确认W 基因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平
【答案】A
【知识点】无菌技术、PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因—
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成
蛋白质—抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、扩增W 基因启动子需2 种引物，并在引物5'端加入酶切位点，因为子链的延伸是在引物的3
＇开始的，A 错误；
B、PW 和GUS 基因进行双酶切后，可通过T4 DNA 连接酶连接，因为该连接酶可以连接平末端，也可连
接黏性末端，B 正确；
C、为了避免杂菌污染，培养拟南芥无菌苗的MS 固体培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌，C 正确；
D、题意显示，GUS 为报告基因，其表达产物可催化无色底物变蓝，因而可通过观察根蓝色深浅确认W 基
因在拟南芥缺铁胁迫中的表达水平，D 正确。
故选A。
10、（2025 云南昆明一模）利用敲除特定基因的模型小鼠进行实验，能够大幅提高实验数据的可靠性。
Cre-LoxP 系统是常用的基因敲、除工具，它由Cre 蛋白和LoxP 序列两部分组成，Cre 蛋白可识别双链
DNA 分子中特定的LoxP 序列，当DNA 分子上存在两个同向LoxP 序列时，Cre 蛋白可将两个LoxP 序列之
间的DNA 序列剪除，切口连接形成的环化产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的，示意图如下。
考点03
(1)Cre 蛋白的作用类似于基因工程中使用的 ，该酶切断的化学键是 。
(2)细胞膜上的CD36 蛋白在脂质代谢中有重要作用。为进一步研究CD36 蛋白的功能，研究者用Cre-Lox
系统构建在肝细胞中特异性敲除CD36 基因的小鼠，并对敲除结果进行检验，部分流程见下图。Alb 是添
加在Cre 编码序列上游的特异性启动子，它的作用是 。③中Cre 阳性-Flox 杂合小鼠肝细胞中
表达的蛋白质有 （填“CD36 蛋白”“Cre 蛋白”或“CD36 蛋白和Cre 蛋白”）。符合要求的
肝特异性CD36 基因敲除小鼠最早可在子 代出现。
(3)能说明在肝细胞中特异性敲除CD36 基因的小鼠构建成功了的证据有___________。
A．小鼠不同组织中提取的DNA 可检测到Cre 序列
B．小鼠肝细胞中CD36 基因的mRNA 含量基本为零
C．在小鼠肝细胞提取物中检测不到CD36 蛋白
D．在小鼠肝脏、心肌和肾脏组织提取物中CD36 蛋白含量无明显差异
【答案】(1) 限制性内切核酸酶 磷酸二酯键
(2) 作为RNA 聚合酶识别和结合的部位，只在肝细胞中驱动Cre 编码序列转录 CD36 蛋白和Cre
蛋白 二
(3)BC
【知识点】基因工程的操作程序综合
【分析】基因工程的基本步骤：（1）获取目的基因（从基因组文库中获取或、利用PCR 技术扩增目的基
因）；（2）基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；（3）将目的基因导入受体细胞（植物、动
物、微生物）；（4）目的基因的检测与鉴定 （DNA 分子杂交技术,分子杂交技术、抗原抗体杂交）。
【详解】（1）Cre 蛋白可将两个LoxP 序列之间的DNA 序列剪除，类似于基因工程中使用的限制性内切核
酸酶；该酶切断的是磷酸二酯键。
（2）启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。它是RNA 聚
合酶识别和结合的部位，只在肝细胞中驱动Cre 编码序列转录；
Cre 蛋白可将两个LoxP 序列之间的DNA 序列剪除，结合图示可知，③中Cre 阳性-Flox 杂合小鼠肝细胞中
有Alb-Cre 编码序列可以编码Cre 蛋白，Cre 蛋白可以剪切两个LoxP 序列之间的CD36 基因，③中Cre 阳
性-Flox 杂合小鼠肝细胞中有CD36 基因可以表达CD36 蛋白，故③中Cre 阳性-Flox 杂合小鼠肝细胞中表达
的蛋白质有CD36 蛋白和Cre 蛋白；符合要求的肝特异性CD36 基因敲除小鼠最早可在子二代中出现，其
中只有Alb-Cre 编码序列和Lox P-CD36 基因-Lox P 序列，相当于获得了肝特异性CD36 基因敲除目标小鼠。
（3）A、在肝细胞中特异性敲除CD36 基因的小鼠构建成功，说明只需要在肝细胞中表达Cre 基因，不同
组织中提取的DNA 可检测到Cre 序列不能说明其只在肝脏细胞中表达，A 错误；
B、小鼠肝细胞中CD36 基因的mRNA 含量基本为零，说明CD36 基因被剪切，B 正确；
C、在小鼠肝细胞提取物中检测不到CD36 蛋白，说明CD36 基因被敲除，C 正确；
D、在小鼠肝脏、心肌和肾脏组织提取物中CD36 蛋白含量无明显差异，说明CD36 基因未在肝脏细胞中被
敲除，D 错误。
故选BC。
基因工程综合
11、（2025 云南大理一模）利用基因工程技术，可以让哺乳动物批量生产药物。目前，科学家已经在牛、
山羊等转基因动物中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。如图
为培育转基因山羊生产人β-酪蛋白的流程图，据此回答下列问题：
(1)过程①构建重组人β-酪蛋白基因表达载体时，科学家需将人β-酪蛋白基因与山羊乳腺中特异性表达的基
因的 等调控元件重组在一起，目的是 。
(2)科学家将构建成功的重组人β-酪蛋白基因表达载体通过显微注射法导入山羊的受精卵而不是体细胞中，
主要原因是 。
(3)过程②应选用 时期的胚胎进行移植，过程③可使用 技术扩大转基因山羊群体。
(4)过程④中，人β-酪蛋白基因能在山羊体内表达获得人β-酪蛋白，从遗传方面分析，原因是
（答出2 点即可）。
考点04
【答案】(1) 启动子 让人β-酪蛋白基因只在山羊乳腺细胞中特异性表达
(2)受精卵比体细胞更易实现全能性，发育成转基因动物个体
(3) 桑葚胚/囊胚 胚胎分割/动物细胞核移植
(4)人与山羊遗传物质均是DNA；人与山羊共用一套密码子（遗传密码）；人与山羊的基因表达时都遵循
中心法则；人与山羊的DNA 结构相似（基本相同）
【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、胚胎移植技术
【分析】据图分析，图示为培育转基因山羊生产人酪蛋白的流程图，其中①表示构建基因表达载体的过程，
是基因工程的核心步骤；②表示胚胎移植、妊娠分娩获得转基因山羊；③表示转基因山羊繁殖产生更多的
转基因山羊群；④表示从转基因山羊获得人β-络蛋白的过程。
【详解】（1）为了让人β-酪蛋白基因只在山羊的乳腺细胞中特异性表达，故在构建基因表达载体时，需
将人β-酪蛋白基因与山羊乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，再通过显微注射的方
法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生
产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
（2）将目的基因导入动物细胞最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，受精
卵的全能性相较于体细胞更容易实现，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。
（3）胚胎移植一般选择发育到桑葚胚或囊胚阶段的胚胎进行移植，③可表示胚胎分割或动物细胞核移植
技术，这两种技术均可以得到多个遗传性状相同的个体，在③过程中可以应用。
（4）人β-酪蛋白基因能在山羊体内表达获得人β-酪蛋白，从遗传方面分析，原因是人与山羊在遗传机制
上有一些相似性，如遗传物质均是DNA；共用一套遗传密码（密码子）；基因表达时都遵循中心法则；人
与山羊的DNA 结构相似（基本相同）等。
12、（2025 云南丽江一模）B 基因存在于水稻基因组中，其在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转
录。为研究B 基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B 基因的转基
因植株。请回答下列问题：
(1)从水稻体细胞中提取总RNA，在 酶的催化下构建cDNA 文库，进而获得B 基因编码蛋
白的序列。
(2)融合基因必须连接到T-DNA 中的启动子和终止子之间，其中启动子是 识别并结合的
位点。表达载体中卡那霉素抗性基因的作用是 。
(3)用Ca2＋处理农杆菌，使细胞处于一种 的生理状态，然后将重组的基因表达载体导入其中。
(4)步骤③是植物组织培养过程中的 ，组织培养过程依据的原理是 。
(5)个体水平可以通过 筛选出能表达B 基因的转基因植株。
(6)从步骤②到步骤③需要更换新的培养基，其原因是 。
【答案】(1)逆转录
(2) RNA 聚合酶 作为标记基因，检测B-Luc 融合基因是否成功导入（农杆菌）
(3)能吸收周围环境中DNA 分子
(4) 再分化 植物细胞的全能性
(5)检测加入荧光素后该植株卵细胞中是否发出荧光
(6)诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化形成试管苗所需的生长素和细胞分裂素的比例不同
【知识点】遗传信息的转录、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、植物组织培养技术综合
【分析】基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、
目的基因的检测与鉴定。基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、 DNA 连接酶、运
载体。基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
【详解】（1）从水稻体细胞中提取总RNA，以RNA 为模板，在逆转录酶的催化下构建cDNA 文库，进而
获得B 基因编码蛋白的序列。
（2）转录的起点是启动子，启动子是RNA 聚合酶识别并结合的位点。构建的重组质粒上含有卡那霉素抗
性基因，将重组质粒导入农杆菌，为确定农杆菌是否接纳了重组质粒，可以通过在培养基中添加卡那霉素，
卡那霉素抗性基因作为标记基因，检测B-Luc 融合基因是否成功导入（农杆菌）。
（3）为了使农杆菌更好的接纳重组质粒，通常用Ca2＋处理农杆菌，增大其通透性，使细胞处于一种能吸
收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后将重组的基因表达载体导入其中。
（4）水稻愈伤组织是一种相对未分化的细胞，通过③再分化过程形成水稻幼苗。组织培养过程依据的原
理是植物细胞的全能性。
（5）水稻B 基因和Luc 基因融合基因导入植物卵细胞，Luc 基因编码的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，
因此从个体水平可以通过检测加入荧光素后该植株卵细胞中是否发出荧光筛选出能表达B 基因的转基因植
株。
（6）②为脱分化形成愈伤组织的过程，③为愈伤组织再分化形成水稻幼苗的过程，两个过程所需的生长
素和细胞分裂素的比例不同，因此从步骤②到步骤③需要更换新的培养基。
13、（2025 届云南省保山市腾冲市第八中学高三一模）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业
领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S 在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子
较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S 序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S 启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN 克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S 的优质大豆品种YZ。根据题19
图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制
酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳
时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农
杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ 所得再生植株YZ-1 的种子变大。同时将从TL 克隆的“启动子T+基因
S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2 的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN 较TL 种
子大的原因是 。
【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）
(2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接
（反向链接）
(3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S 片段 PCR
(4)品种DN 的基因S 上游启动子效应比TL 强，使得基因S 表达量更高，种子更大
【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、基因工程的操作程序综合
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息
所学知识
信息加工
启动子的基本组成
单位
基因的结构
启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，
用于启动DNA 的转录，是一段DNA 片段，
其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸
电泳时，对照样品
除指示分子大小的
PCR 及琼脂糖凝胶
电泳
电泳可以分离不同大小的DNA 片段，用限
制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有
标准参照物外，还
应有哪些成分
“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空
载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分
子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空
载体片段和“启动子D+基因S”片段
检测转入是否成功
的技术
检测目的基因是都
导入受体细胞的方
法
在分子水平上检测目的基因是否转入成功可
通过PCR 等技术检测受体细胞的DNA 上是
否插入目的基因或目的基因是否转录出
mRNA
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA 的转录，是一段DNA 片段，其基
本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
（2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA 序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶
EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；
②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，
形成的DNA 片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单
向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
（3）①DNA 电泳可以分离不同大小的DNA 片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动
子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，
还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；
②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR 等技术检测受体细胞的DNA 上是否插入目的基因
或目的基因是否转录出mRNA。
（4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1 导入的目的基因为取自品种DN 的“启动子D＋基因S”
序列，再生植株YZ-2 导入的目的基因为取自品种TL 的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息
“两品种中基因S 序列无差异”可推测：品种DN 的基因S 上游的启动子D 的效应强于品种TL 的
启动子T，启动子D 使基因S 表达量更高，因而种子更大。
14、（2025 届云南省保山市腾冲市第八中学高三一模）Apoe（载脂蛋白E）在脂质运输中发挥重要作用，
为探究Apoe 在小鼠血脂代谢中的作用，研究人员采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除了Apoe 基因中的片
段1 和片段2（如图甲），构建了Apoe 敲除模型小鼠。CRISPR/Cas9 由sgRNA（单链向导RNA）和Cas9
蛋白两大部分组成，sgRNA 由crRNA 和tracrRNA 组成，其中crRNA 含有与靶基因片段配对的序列，能引
导Cas9 切开靶基因所在双链DNA，随后细胞将断裂上下游两端的序列连接起来，实现对基因的编辑（图
乙）。构建Apoe 敲除模型小鼠过程见图丙。请回答相关问题。
(1)CRISPR/Cas9 系统中的Cas9 具有与基因工程工具中 相似的功能。要敲除Apoe 基因中的片段1 和
片段2，改造的crRNA 中应含有识别 个靶位点的序列，设计这些识别序列时需要注意 （答出
2 点）。
(2)质粒px330 是常用的哺乳动物基因编辑质粒，对构建的重组质粒需要用PCR 技术扩增并检测，目的是
。获得重组质粒后，用 法导入受体细胞。
(3)Apoe 是高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的组成部分，胆固醇需与Apoe 结合进而形成
HDL-C 或LDL-C 才能在血浆中正常运输，且Apoe 缺失时血浆胆固醇被清除率显著下降。然后和细胞上的
Apoe 受体结合，将胆固醇清除出血液。为探究Apoe 的作用机理，研究者进行相关实验，检测3~4 月龄模
型小鼠血浆的胆固醇指标，结果见图。实验表明Apoe 通过改变血浆中LDL-C 的含量来提高血浆中总胆固
醇水平，得出该结论的依据是 。
注：HDL-C 是高密度脂蛋白胆固醇，LDL-C 是低密度脂蛋白胆固醇；**表示两组之间有显著差异。
【答案】(1) 限制性内切核酸酶（限制酶） 4 确保每一个识别序列只能与特定靶位点结合，
这4 个识别序列识别的4 个靶位点分别位于片段1 和片段2 的上下游序列
(2) 确定改造的crRNA 序列是否正确插入质粒px330 显微注射
(3)Apoe 敲除纯合小鼠的总胆固醇水平高于对照组小鼠，HDL−C 没有显著差异，Apoe 敲除纯合小鼠的
LDL−C 显著高于对照组小鼠
【知识点】基因工程综合
【分析】基因工程的基本操作步骤是获取目的基因、将目的基因导入受体细胞、筛选还有目的基因的受体
细胞、目的基因的表达与检测。
【详解】（1） CRISPR/Cas9 系统中的Cas9 能切开靶基因所在双链DNA，与基因工程中的限制酶相似；
由题意，结合图示可知，如果要将一个外显子从特定序列中删除，由于基因是DNA 有两条链，而1 条
gRNA 只能与一条链结合，所以需要设计2 个gRNA 靶位点，敲出1 号和2 号两个外显子需要设计4 个
gRNA 靶位点；靶位点的设计时需要注意确保每一个gRNA 在小鼠的基因组中仅有一个目的靶点，即每一
个gRNA 序列只能与目的序列结合，避免将其他DNA 片段错误敲除。
（2）PCR 技术可以对目的基因进行大量扩增，扩增后可以进行测序，以确定改造的crRNA 序列是否正确
插入质粒px330；常用显微注射法将目的基因导入动物细胞。
（3）由图可知，Apoe 敲除纯合小鼠的总胆固醇水平高于对照组小鼠，HDL-C 没有显著差异，Apoe 敲出
纯合小鼠的LDL-C 显著高于对照组小鼠，说明Apoe 基因通过提高血浆中LDL-C 的含量来提高血浆中总胆
固醇水平。
15、（2025 云南曲靖一模）某研究团队采用基因工程技术敲除了枯草芽孢杆菌E20 的bdhA 基因，以期提
高发酵产物TTMP 含量，提高酱香酒的香气，研究过程为：（1）构建敲除载体，如下图所示，其中CAT
表示氯霉素乙酰转移酶基因片段（1540bp，该基因表达的产物可使氯霉素失活），HL 表示bdhA 基因的同
源左臂片段（839bp），HR 表示bdhA 基因的同源右臂片段（738bp）；（2）利用同源重组的原理敲除菌
株E20 的bdhA 基因，获得突变体E20-
bdhA
△
菌株，如下图所示，其中P1-P4 为引物；（3）E20-
bdhA
△
菌种的固态发酵及产物检测。
(1)研究人员用HindIII、KpnI 对敲除质粒进行双酶切处理，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，若观
察到 bp 和 bp 的两条条带，则可初步证明敲除质粒构建成功。
(2)为鉴定菌株E20 的bdhA 基因是否成功敲除，应选择合适的引物对菌株E20-
bdhA
△
的基因组DNA 进行
PCR 扩增、产物检测，请写出本实验中可用的一对引物对 。子链延伸的方向一般为5'→3'，原因是
。
(3)根据题目已知信息，筛选突变株时，要在培养基中添加 ，原因可能是 。
(4)在用E20-
bdhA
△
菌种进行固态发酵过程中，要随时检测 、 ，以了解发酵进程。
【答案】(1) 3117 2686
(2) P1 和P4、P3 和P4、P3 和P2 DNA 聚合酶只能够从引物的3’端 开始连接脱氧核苷酸
(3) 氯霉素 突变株枯草芽孢杆菌E20-
bdhA
△
转入氯霉素乙酰转移酶基因，对氯霉素具有 抗性，
在加有氯霉素的培养基上能存活
(4) 微生物数量 产物浓度
【知识点】PCR 扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、发酵工程的基本环节
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）分析题意，CAT 表示氯霉素乙酰转移酶基因片段（1540bp），HL 表示bdhA 基因的同源左
臂片段（839bp），HR 表示bdhA 基因的同源右臂片段（738bp），图示HindIII、KpnI 切成的两段分别包
括（HR＋CAT＋HL）区段和剩余区段，故用HindIII、KpnI 对敲除质粒进行双酶切处理，并将酶切产物进
行琼脂糖凝胶电泳鉴定，若观察到（1540＋839＋738）=3117bp、5803-3117=2686bp 的两条条带，则可初
步证明敲除质粒构建成功。
（2）引物可与模板链的碱基互补配对，对菌株E20-
bdhA
△
的基因组DNA 进行PCR 扩增、产物检测，应
保证一对引物位于该基因的两侧，且方向相反，故据图可知，本实验中可用的一对引物对是P1 和P4、P3
和P4、P3 和P2；不能用P1 和P2 引物，无论目的基因是否替换原有基因，这对引物都能跑出产物。由于
DNA 聚合酶只能够从引物的3’端 开始连接脱氧核苷酸，故子链延伸的方向一般为5'→3'。
（3）结合图示可知，突变株枯草芽孢杆菌E20-
bdhA
△
转入氯霉素乙酰转移酶基因，对氯霉素具有抗性，
在加有氯霉素的培养基上能存活，故筛选突变株时，要在培养基中添加氯霉素。
（4）用E20-
bdhA
△
菌种进行固态发酵过程中，要随时检测微生物数量和产物浓度以了解发酵进程。
